Summary
Este trabalho demonstra uma nova abordagem para avaliar a proliferação, diferenciação e potencial de formação de vasos de células-tronco endoteliais vasculares (VESCs) através do transplante de almofada de gordura mamária, seguido de preparação de tecido total para a observação microscópica. Também é apresentada uma estratégia de rastreamento de linhagem para investigar o comportamento de VESC in vivo .
Abstract
As células endoteliais (ECs) são os blocos fundamentais da arquitetura vascular e medem o crescimento vascular e a remodelação para assegurar o desenvolvimento adequado dos vasos e a homeostase. No entanto, os estudos sobre a hierarquia da linhagem endotelial permanecem evasivos devido à falta de ferramentas para obter acesso, bem como para avaliar diretamente seu comportamento in vivo . Para resolver esta deficiência, um novo modelo de tecido para estudar angiogênese usando a almofada de gordura mamária foi desenvolvido. A glândula mamária desenvolve-se principalmente nos estádios pós-natais, incluindo a puberdade e a gravidez, durante os quais a proliferação robusta do epitélio é acompanhada de uma vasta remodelação vascular. As almofadas de gordura mamárias fornecem estímulos angiogênicos espaciais, matriciais e ricos do epitélio mamário em crescimento. Além disso, as almofadas de gordura mamária estão localizadas fora da cavidade peritoneal, tornando-os um local de enxerto facilmente acessível para avaliar o potencial angiogênico de células exógenas. Este trabalho também descreve uma eficiênciaAbordagem de rastreamento nt usando ratos repórter fluorescentes para rotular especificamente a população alvo de células-tronco endoteliais vasculares (VESCs) in vivo . Este método de rastreamento de linhagem, acoplado com o microscópio subseqüente de todo o tecido, permite a visualização direta de células direcionadas e seus descendentes, através das quais a capacidade de proliferação pode ser quantificada e o compromisso de diferenciação pode ser mapeado pelo destino. Usando esses métodos, uma população de receptores de proteína Bipotente (Procr) expressando VESCs recentemente foi identificada em sistemas vasculares múltiplos. Procr + VESCs, dando origem a novas ECs e pericítas, contribuem ativamente para a angiogênese durante o desenvolvimento, homeostase e reparação de lesões. No geral, este manuscrito descreve um novo transplante de almofadas de gordura mamária e técnicas de rastreamento de linhagem in vivo que podem ser usadas para avaliar as propriedades das células-tronco dos VESCs.
Introduction
Durante o desenvolvimento e a homeostase, o crescimento vascular e a remodelação ocorrem fielmente de acordo com o crescimento e reparo de órgãos. A angiogênese descreve a geração de novos vasos a partir de vasos sanguíneos pré-existentes e é considerada uma força importante que medeia essas mudanças vasculares dinâmicas. Cada vaso sanguíneo é revestido internamente com uma camada de células endoteliais (ECs), e eles parecem ser o fundamento da arquitetura do vaso. Durante muito tempo, o mecanismo através do qual o pool da CE é reabastecido durante a homeostase permaneceu obscuro, e os argumentos foram levantados sobre se o turnover vascular é o resultado da proliferação madura da CE ou é o contributo das atividades vasculares das células-tronco / progenitoras. Devido à falta de evidências fisiológicas diretas, a existência e a identidade celular das células-tronco endoteliais vasculares (VESCs) também permaneceram controversas.
Uma das abordagens mais comuns utilizadas para verificar o comportamento das células-tronco é através do transplanProdução de células estaminais putativas em camundongos receptores. Este método mede o potencial de haste de células-tronco candidatas in vivo. O transplante foi aplicado pela primeira vez ao estudo de células-tronco da medula óssea 1 , o que contribuiu para o estabelecimento das características hierárquicas do sistema hematopoiético 2 . No campo endotelial, um tampão da matriz da membrana basal ( por exemplo, matrigel) inserido subcutaneamente sob a pele do flanco foi um ensaio padrão de angiogênese in vivo usado para abordar as capacidades de formação de vasos das CE transplantadas. Múltiplos métodos experimentais, incluindo a formação de colônias em sistemas de cultura 3D e transplante, sugeriram potenciais populações de progenitores EC / VESC 3 , 4 , 5 , 6 . No entanto, uma vez que as EC incorporadas na matriz da membrana basal são relativamente separadas deO tecido circundante, isso não fornece o melhor ambiente de nicho necessário para explorar completamente o potencial angiogênico das células transplantadas. Como resultado, os vasos formados dentro do plugue da matriz são predominantemente capilares e são funcionalmente incomensuráveis.
A glândula mamária se desenvolve pós-natal, com o crescimento mais robusto ocorrido durante a puberdade e a gravidez. No estágio puberal, o epitélio mamário sofre uma expansão rápida, para ocupar toda a almofada de gordura mamária, acompanhada pela remodelação eficiente das estruturas vasculares circundantes. Assim, a glândula mamária oferece um excelente modelo para o estudo da angiogênese. Fornece estímulos angiogênicos espaciais, matriciais e ricos do epitélio mamário em crescimento e, portanto, é um local de enxerto ideal para avaliar o potencial angiogênico de células exógenas. Além disso, a almofada de gordura mamária permite que os vasos exógenos formados se integrem com o sistema de circulação do hospedeiro, permitindo mais fAvaliação uncional e representando uma vantagem sobre o transplante subcutâneo.
Embora os ensaios de cultura e transplante in vitro sejam um modo tão eficaz de investigar as propriedades de regeneração de uma população de células, é sabido que tais ensaios podem estimular a plasticidade à medida que as células são retiradas dos seus habitats nativos e as mudanças podem ser induzidas quando as células são desconectadas de Seu ambiente fisiológico 7 . Portanto, a obtenção de evidência direta in vivo de destino celular é a abordagem chave para avançar a compreensão atual do comportamento das populações endoteliais.
O mapeamento do destino genético ( ou seja, o rastreamento de linhagem in vivo ) é imperativo para a identificação de VESCs e para a investigação de suas propriedades no sistema corporal, pois pode revelar o comportamento de células estaminais in vivo em seu contexto fisiológico e a estabilidade real pode ser Avaliado. Traçados de linhagemNg fornece evidências diretas da persistência a longo prazo ( isto é, auto-renovação) dos VESC candidatos e sua capacidade de produzir tipos de células para o tecido de origem ( ou seja, potência de diferenciação).
Este protocolo descreve uma nova técnica de transplante de almofada de gordura mamária e um método de rastreamento de linhagem para observar a capacidade de geração de vasos de VESCs. Essas técnicas superam as deficiências dos ensaios atualmente disponíveis e fornecem uma nova maneira de avaliar otimamente as propriedades das células-tronco dos VESCs. Essas abordagens são ferramentas eficientes que podem ser usadas para avaliar o comportamento e as propriedades de formação de vasos das populações endoteliais, bem como para determinar a alteração da potência celular vascular dentro de um ambiente patológico.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Instituto de Bioquímica e Biologia Celular de Xangai, Academia Chinesa de Ciências, sob o protocolo aprovado SIBCB-NAF-15-002-S335-003.
1. Isolamento de VESCs da glândula mamária do mouse
- Colheita de glandes mamárias e digestão de tecidos.
- Use ratos repórteres virgens maduros Actin-GFP de 8 semanas de idade, com pesos entre 20 e 25 g, como doadores de tecidos.
Nota: As células originadas pelo doador podem ser facilmente rastreadas pela expressão GFP. - Prepare um meio base de digestão de tecido consistindo em 5% de soro fetal bovino (FBS), 1% de caneta / estreptococo e 25 mM de HEPES em RPMI1640. Filtre a mistura através de um filtro de 0,22 μm para esterilizar e aquecer previamente a 37 ° C num banho de água.
- Sacrifique os camundongos em uma câmara de CO 2 . Dissecar o quarto par de glândulas mamárias inguinais primeiro fazendo uma pele vertical iNcisão na linha média abdominal inferior usando um bisturi (ou tesoura cirúrgica). Retire suavemente a pele de um lado para expor a glândula mamária inguinal usando fórceps. Obtenha a quarta glândula mamária inguinal de ambos os lados e corte-as em pedaços finos em uma placa de Petri de 6 cm usando uma tesoura.
- Meça o peso total do tecido moído e coloque-o em um tubo de 50 mL.
Nota: Certifique-se de que o pedaço de tecido resultante é menor que 1 mm 3 de tamanho para cada peça. Um rendimento típico é de aproximadamente 5.000 VESCs por animal.
- Meça o peso total do tecido moído e coloque-o em um tubo de 50 mL.
- Prepare o meio base de digestão em um tubo de centrífuga com 50 mL de tampão no volume de 10 mL por 1 g de pedaço de tecido. Adicionar colagenase Tipo 3 na concentração de 300 unidades por 10 mL de meio de base de digestão para constituir o tampão de digestão. Misturar uniformemente e adicioná-lo ao pedaço de tecido.
- Coloque horizontalmente o tubo de centrífuga de 50 mL em uma plataforma de balanço e ajuste a velocidade a 100 rpm e a temperatura a 37 ° C. AgitarO tecido mamário durante 2 h. Verifique e aperte manualmente o tubo a cada 20 min para garantir uma digestão adequada.
Nota: O propósito da digestão de tecidos antes de FACS é preparar uma solução de célula única a partir de tecido sólido. Portanto, até o final da digestão, o conteúdo deve ser uma solução espessa sem partes de tecido visíveis.
- Use ratos repórteres virgens maduros Actin-GFP de 8 semanas de idade, com pesos entre 20 e 25 g, como doadores de tecidos.
- Preparação da solução de célula única.
- Após a digestão, completar o tubo de centrífuga de 50 mL com PBS pré-aquecido e estéril e inverter o tubo para misturar uniformemente. Centrifugar o tubo a 200 xg durante 5 min para obter um sedimento celular.
- Remova o sobrenadante e mova o fundo do tubo para soltar o sedimento celular. Adicionar 3 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos (ver Tabela de Materiais) e incubar em uma capa de cultura de tecidos à temperatura ambiente (RT) durante 5 minutos para eliminar os glóbulos vermelhos.
- Adicione 10 mL de PBS estéril e inverta o tubo para misturar uniformemente. Centrifugar o conteúdo de tecido a 200 xg por 5 min e discoE o sobrenadante. Adicionar 3 mL de tripsina pré-aquecida a 0,05% e armazenar o tubo a 37 ° C durante 5 minutos para digerir mais o tecido restante.
- Adicione 3 mL de IMDM pré-aquecido e, em seguida, adicione 100 μL de solução de DNase I (0,25 mg de DNase I diluída em 1 mL de PBS). Armazene o tubo a 37 ° C para separar os filamentos de DNA. Passe a mistura de tecidos através de um filtro de células de 70 μm para obter a solução celular. Enxaguar o filtro duas vezes com 2 mL de PBS + 5% de FBS para neutralizar a digestão enzimática.
- Centrifugar a mistura celular a 200 xg durante 5 minutos para sedimentar as células. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o sedimento celular em 1 mL de PBS + 5% de FBS para coloração de anticorpos.
- Isolamento Procr + VESC baseado em FACS.
- Sujeite a mistura celular obtida do tecido mamário doador com a coloração de anticorpos após os protocolos de rotina publicados 8 .
Nota: Os seguintes anticorpos foram utilizados: anti-mouseLinhagem de sangue-FITC, CD31 anti-rato (PECAM1) -PECY7, CD105-APC anti-mouse (todos utilizados a uma concentração de 1 μg / mL), anti-CD201 (Procr) -biotina (utilizada a uma concentração de 2,5 Μg / mL) e estreptavidina-v450 (utilizado a uma concentração de 0,5 μg / mL).- Após a coloração do anticorpo, complete as células com PBS + FBS a 5% e depois centrifugue a 200 g durante 5 min. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células com 1 mL de PBS + FBS a 5%. Filtra através de um filtro de células de 40 μm. Coloque em gelo até a classificação FACS.
- Proceda para executar a classificação baseada em FACS para isolar Procr + VESCs.
- Analise a amostra não manuseada e cada controle de uma única cor para determinar a tensão para cada cor. Calcule os parâmetros de compensação para evitar a fluorescência automática ou coloração de fundo. Configure o modelo para fechar e classificar adequadamente para as populações de células desejadas.
- Para estabelecer a hierarquia da classificação FACS, primeiro elimine os restos deTodos os eventos e, em seguida, descarte os dupletos ou grupos de células adesivas, disparando com largura. Coloque células de linhagem sanguínea e use CD31 + e CD105 + para definir as populações endoteliais.
Nota: As células Procr + foram isoladas de CD31 + CD105 + ECs em comparação com um controle de FMO. Um gráfico de análise FACS representativo é mostrado na Figura 1 . Uma população VESC isolada por FACS deve ser suspensa em IMDM + 50% de FBS e armazenada em gelo até processamento posterior.
- Sujeite a mistura celular obtida do tecido mamário doador com a coloração de anticorpos após os protocolos de rotina publicados 8 .
2. In Vivo VESC Ensaio de Formação de Navios Usando a Pasta de Gordura Mamária
- Prepare EC primárias para o transplante.
- Completar as células ordenadas por FACS com 10 mL de PBS + 5% de FBS e, em seguida, centrifugar a 200 xg durante 5 min para depositar as células no fundo.
- Aspirar cuidadosamente o líquido, contar o número da célula usando um hemocitômetro e ressuspender o sedimento celular com a mistura da matriz da membrana basal (consiPicada de 50% de matriz de membrana basal e PBS com 20% de FBS, suplementada com 100 ng / mL de rmVEGF e 60 U / mL de heparina) para atingir uma concentração de trabalho de 15 000 células / 15 μL.
Nota: A mistura da matriz da membrana basal deve sempre ser armazenada no gelo. - Diluir em série as células classificadas e contadas para atingir as concentrações de entrada necessárias em um microtube de 1,5 mL, assegurando que os volumes de injeção final não excedam 15 μL no total. Adicione 0,1% de azul de tripa a cada tubo para uma melhor visualização do conteúdo durante o transplante. Pipetar bem para misturar. Armazene os tubos no gelo até o uso.
Nota: uma geração de vasos bem sucedida pode ser alcançada com um mínimo de 100 VESCs.
- Transplante ECs primárias para a almofada de gordura mamária.
- Desinfecte os instrumentos cirúrgicos e a bancada. Se estiver usando os mesmos instrumentos em vários animais, um esterilizador de talão pode ser usado para desinfecção.
- Anestesiar microfone nu BALB / c de 3 semanas de idadeE usando o protocolo anestésico recomendado pelo veterinário da sua instituição e pela IACUC. Coloque cada mouse na posição supina, com as costas na mesa de operação. Imobilize seus membros usando fita adesiva.
- Dip um cotonete de algodão em solução anti-séptica à base de iodo. Limpe toda a área abdominal do mouse cuidadosamente para esterilizar a superfície da pele antes da cirurgia.
- Segure e levante a pele do abdômen do mouse com fórceps. Use um bisturi cirúrgico para fazer uma pequena incisão vertical de 1 cm. Faça dois cortes de cerca de 0,5 a 1 cm de comprimento, cada um para a perna traseira, para obter uma incisão invertida em forma de Y.
- Use fórceps e um cotonete de algodão para separar suavemente a pele do abdômen e pino a pele lateralmente para expor as glândulas mamárias inguinais. Coloque o mouse sob um estereoscópio e ajuste a ampliação para 2.0X. Certifique-se de ajustar o foco para que a almofada de gordura mamária possa ser claramente vista e operada.
- Coloque uma necessidade de 27G 1/2 "E no gelo para pré-frio. Coloque uma seringa de 1 mL com mistura de matriz de membrana basal com antecedência para remover possíveis bolhas de ar presas na região de fixação da agulha. Pipetar 15 μL de solução mista na tampa do tubo de microcentrífuga e depois aspirar todo o volume para dentro da seringa pré-preparada.
- Segure a almofada de gordura mamária na frente do nódulo linfático inguinal, usando uma pinça fina e levante ligeiramente para fácil injeção. Insira suavemente cerca de 1/4 da agulha da seringa na almofada de gordura.
- Solte as pinças da almofada de moda para apertar e estabilize a agulha da seringa. Injete lentamente a solução para evitar vazamento de líquido. Segure por alguns segundos para se certificar de que a mistura celular é solidificada para minimizar o vazamento ao retirar a agulha.
- Feche a aba da pele com suturas absorvíveis. Suture a aba da pele usando sutura de monofilamento não reativa de tamanho 5-0 e feche as feridas com nó de cirurgião, cada nó aproxima0,3 cm de distância. Alternativamente, feche a pele com grampos feridos.
- Coloque ratos operados em uma gaiola separada para recuperação. Coloque uma lâmpada de aquecimento sobre a gaiola para evitar que os ratos anestesiados sofram de hipotermia. Coloque papel macio e algodão no fundo da gaiola para manter os camundongos quentes após a cirurgia.
- Observe cuidadosamente os camundongos até que todos os receptores estejam totalmente acordados. Para os próximos dias, aplique analgésicos pós-cirúrgicos de forma preventiva para todos os animais ou de acordo com as instruções do veterinário da instalação. Aplique antibióticos de acordo com o protocolo animal aprovado se ocorrer infecção na ferida. Se a ferida cirúrgica foi fechada com grampos feridos, remova os grampos da ferida 10 dias após a cirurgia, quando a ferida estiver completamente fechada.
3. Preparação do tecido de montagem total para observação microscópica
- Colheita de tecidos
- De 2 a 4 semanas após a implantação, anestesiar o receptor BALB / cCamundongos nus com injeção intraperitoneal de 2,5% de agente anestesiante a uma dosagem de 0,12 mL por 20 g de peso corporal, como no passo 2.2.2.
Nota: O crescimento positivo do vaso pode ser detectado 2 a 4 semanas após o transplante celular. - Rotular a circulação sistêmica do receptor com uma injeção da veia da cauda de corante isolectina-647 com uma dosagem de 50 μg / 25 g de peso corporal, ressuspensa em 50 μL de PBS estéril. Permitir um período de repouso de 5 a 10 min. Sacrifique os ratos usando CO 2 .
- Dissecar a área do tecido mamário onde as células foram inicialmente injetadas após o passo 2.2.4; Use tesoura cirúrgica. Usando uma lâmina cirúrgica, corte o tecido em aproximadamente 3 a 4 mm 3 cubos em uma placa de Petri de 6 cm.
- De 2 a 4 semanas após a implantação, anestesiar o receptor BALB / cCamundongos nus com injeção intraperitoneal de 2,5% de agente anestesiante a uma dosagem de 0,12 mL por 20 g de peso corporal, como no passo 2.2.2.
- Digestão de tecidos e preparação para coloração de anticorpos.
- Digerir os pedaços de tecido em um tubo de centrífuga de 15 mL preenchido com 10 mL de meio de base de digestão pré-aquecido (passo 1.1.2) suplementado com colagenase III(300 U por 10 mL).
- Coloque o tubo de centrífuga de 15 mL horizontalmente em uma plataforma de balanço com a velocidade ajustada para 100 rpm e a temperatura ajustada para 37 ° C durante aproximadamente 1 h para soltar a estrutura do tecido e para remover o tecido adipócito excessivo.
Nota: Os adipócitos tendem a produzir auto-fluorescência que podem resultar em um fundo fluorescente ruidoso. Ao final da digestão, os pedaços de tecido devem ter uma aparência suave e turva. O período ideal de digestão depende do tamanho das peças de tecido cortadas e, portanto, deve ser ajustado de acordo para obter os melhores resultados. Uma vez que a vasculatura do tecido já foi marcada com isolectina marcada com fluorescência, todos os procedimentos a seguir devem ser realizados protegidos da luz. - Lave as peças de tecido com PBS à TA durante 10 min. Corrigir todo o tecido de montagem colocando cuidadosamente as peças em uma placa de Petri de 6 cm meio cheia com 4% de PFA (pH 7,2-7,4) para preservar a fluorescência. Coloque a placa de PetriEm uma plataforma de balanço e agite suavemente o tecido durante 30 min à TA.
Nota: A PFA é cancerígena e deve ser manuseada com cautela. - Remova o PFA restante e lave o tecido fixo três vezes com um tampão de lavagem de montagem total (0,1% de interpolação em PBS), com um intervalo de 10 minutos entre cada lavagem.
- Coloração de anticorpos de tecido de montagem total.
- Diluir o anticorpo primário em tampão de coloração de anticorpos em um tubo de centrífuga de 2 mL. Incubar o tecido com anticorpo primário durante a noite a 4 ° C.
Nota: Foram utilizados anticorpos anti-CD31 (concentração: 10 μg / mL) ou ratazana anti-VE-caderina (CD144 / Cdh5: 2,5 μg / mL) como anticorpos primários. Tanto CD31 quanto VE-Cadherin são marcadores de superfície celular usados para reconhecer o endotélio. O tampão de coloração de anticorpo 5x é preparado com ácido maleico 500 mM, pH 7,5; NaCl 750 mM; E 0,5% (v / v) de dissolução em PBS. Adicione apenas um volume sérico apropriado (5%) ao preparar uma solução de trabalho fresca de 1x9 . - Remova o tampão de coloração de anticorpos e lave todo o tecido de montagem três vezes com tampão de lavagem, com um intervalo de 10 minutos. Incubar o tecido com anticorpo secundário (ver Tabela de Materiais ) mais DAPI à TA durante 4 h em uma plataforma de balanço ou durante a noite a 4 ° C.
Nota: Use DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) a uma concentração final de 5 μg / mL para visualizar os núcleos. - Lave todo o tecido com tampão de lavagem 3 vezes por 10 min cada. Incubar os pedaços de tecido em 80% de glicerol ou 80% de sacarose durante a noite para desidratar o tecido para uma melhor preservação.
- Coloque os pedaços de tecido individuais em um slide de vidro e remova o buffer de desidratação excessivo. Cubra o tecido com o meio de montagem, coloque uma lamínula e aperte suavemente o tecido para ajustá-lo.
- Execute a aquisição de imagem microscópica confocal. Para glândulas mamárias de montagem total, adquira imagens usando um 40X com NA = 1,3, objetiva de óleoVe. Adquirir varreduras de azulejos de pilhas Z em uma resolução de seção óptica de 1.024 x 1.024 e uma separação de camada de 1,0 a 1,2 μm.
Nota: Para capturar o sinal de luz de fluorescência correto, o divisor do feixe de filtro deve ser configurado para triplicar o dicroico (TD) 488/553/638, com a configuração de ganho no PMT Gain 600-800. Devem ser utilizadas as seguintes fontes de excitação / emissão: mGFP, com máximos de excitação / emissão de 488/509 nm; MTomato com máximos de excitação / emissão de 532/588 nm; Alexa-647, com maxima de excitação / emissão de 594/665; E DAPI, com máximos de excitação / emissão de 350/470.
- Diluir o anticorpo primário em tampão de coloração de anticorpos em um tubo de centrífuga de 2 mL. Incubar o tecido com anticorpo primário durante a noite a 4 ° C.
4. Rastreamento de linhagem usando um modelo de mouse geneticamente modificado
- Detectar Procr + VESCs usando o modelo do mouse.
- Use a tentativa de tração do mouse Procr CreERT2-IRES-tdTomato / + (referido como Procr Creert2 ).
Nota: neste modelo de mouse, uma cassete Creert2-IRES-tdTomato Procr 11 .- Cross Procr Creert2 ratos com a Rosa26 mTtomatomGFP (referido como R26 mTmG ) repórter cepa para rastrear o destino de endógena Procr + ECs in vivo 11 . Identifique todas as Procr + ECs endógenas rotuladas e seus descendentes usando a expressão GFP.
- Administrar a solução de tamoxifeno 11 (10 mg de tamoxifeno dissolvido em 1 mL de óleo de amendoim + 10% de etanol para formar uma solução de reserva de 10 mg / mL) por via intraperitoneal em uma dose de 4 mg / 25 g de peso corporal durante a fase puberal (5 semanas Antigo) para rastrear o destino do desenvolvimento de Procr + ECs.
- Analisar a eficiência de formação de clones de células marcadas por imunomarcação de montagem completa seguindo as etapas de preparação delineadas no passo 3. Obter almofadas de gordura mamária de ratos tratados, ambos após curto prazo (2 dias) e períodos de tempo prolongados (até 10 meses). Veja a Figura 3 .
- Use a tentativa de tração do mouse Procr CreERT2-IRES-tdTomato / + (referido como Procr Creert2 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isolamento mamário VESCs:
Para isolar a população endotelial para o subsequente teste de transplante, as glândulas mamárias de camundongo virgem (8 semanas de idade) foram colhidas como material doador. As células endoteliais foram isoladas utilizando uma técnica de classificação de células baseada em anticorpos. Lotes representativos da análise FACS da população VESC em ratinhos C57BL / 6 glândula mamaria de 8 semanas de idade ECs são mostrados na Figura 1 (Figura adaptada de Yu et al. 8, com permissão).
Transplante de almofada gorda mamária:
A almofada de gordura mamária fornece um local ideal para o estudo da angiogênese. Após o isolamento baseado em FACS, Procr + ECs foram misturados com 0,5% de matriz de membrana basal e 0,1% de indicador de azul de Trypan e foram então transplanEnvolvido na almofada gorda vazia de receptores SCID de 3 semanas de idade. Durante a puberdade, a almofada de gordura mamária cria um ambiente angiogênico, promovendo a remodelação da vasculatura em alinhamento com a expansão do epitélio mamário. Como resultado, as Procr + ECs transplantadas (GFP + ) incorporadas nos grandes vasos do hospedeiro ( Figura 2B , setas) e também formaram ramos de vasos GFP + secundários e terciários ( Figura 2B , pontas de seta). Embora transplantado Procr + ECs também pode gerar vasos em um ensaio tampão matriz (inserido sob a pele do flanco), os vasos formados só aparecem capilar semelhante (Figura 2A; figura adaptado de Yu et al 8, com permissão.).
Funcionalidade dos navios formados por Procr + VESCs:
Para investigar se o GFP + vEssels em almofadas de gordura mamária são parte da vasculatura circulatória funcional, a isolectina foi administrada por injeção intravenosa antes da colheita. A GFP + vasos foram isolectina +, o que indica que os vasos formados são luminized e conectado com a vasculatura do hospedeiro (Figura 2B; figura adaptado de Yu et al 8, com permissão.).
Rastreamento de linhagem mamária VESC Usando o Procr Creert2 ; Rosa26 mTmG Mouse Modelo:
Procr Creert2 ; Os ratos Rosa26 mTmG foram utilizados para o rastreamento do destino de Procr + VESCs in vivo ( Figura 3A ). Para investigar como Procr + VESCs contribuem para a angiogênese robusta e remodelação vascular durante o desenvolvimento da puberdade da glândula mamária, Procr Creert2 ; Rosa26 mTmG foram administradosD com tamoxifeno para induzir expressão GFP na população endotelial Procr +. As almofadas de gordura mamária do Procr Creert2 tratado com fármaco ; Os ratos Rosa26 mTmG foram colhidos tanto a curto prazo (2 dias após a injeção, Figura 3B ) quanto a longo prazo (até 10 meses após a injeção, Figura 3C- F, figura adaptada de Yu et al. , 8 , com permissão). A preparação completa foi realizada para visualizar o resultado do rastreamento. A identidade do endotélio vascular pode ser validada por coloração com marcador de superfície endotelial VE-Cadherin (Cdh5; Figura 3B , imagem direita).
Figura 1: Análise de VESCs na glândula mamária do mouse. Análise FACS da expressão de Procr em EC de glândula mamária C57BL / 6 de 8 semanas de idade. 8 semanas de idade vForam utilizados ratinhos fêmeas C67BL / 6 irginosos para a coleta de glândulas mamárias. Após a preparação das amostras de células, foram analisadas amostras não amostradas e cada controle de uma única cor para determinar a tensão para cada cor. Os parâmetros de compensação foram calculados para evitar a fluorescência automática ou a coloração de fundo. Foi estabelecido um modelo para o fechamento adequado e para ordenar as populações de células desejadas. Para estabelecer a hierarquia da classificação FACS, os restos de todos os eventos foram eliminados e os dupletos ou grupos de células adesivas foram descartados. As células de linhagem foram fechadas e CD31 e CD105 foram usadas para definir as populações endoteliais. As células Procr + foram isoladas a partir de CD31 + CD105 + ECs em comparação com o controle de FMO. Esta figura foi modificada de Yu et al. 8 , com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Ensaio de transplante de massa gorda VESC Mammary. ( A ) Um vaso formado a partir de Procr + ECs dentro de um tampão de matriz de membrana basal inserido subcutaneamente sob a pele do flanco. ( B ) Imagem confocal de uma almofada de gordura mamária destinatária, indicando a integração e contribuição das Procr + ECs transplantadas (GFP +) para hospedar vasculatura mamária. As ECs foram contrastadas com CD31. ( C ) Injeção intravenosa em camundongos receptores com isolectina mostrou que as conseqüências formaram vasos luminosos. Barra de escala, 50 μm. As imagens foram adquiridas usando um objetivo de óleo 40X NA 1.3. As varreduras de telhas de pilhas Z foram adquiridas em uma resolução de seção óptica de 1.024 x 1.024, e cada camada foi de 1,0 a 1,2 μm. Para capturar o sinal de luz de fluorescência correto, o divisor de feixe de filtro foi ajustado para TD 488/553/638, com o gConfiguração em PMT Gain 600 - 800. Foram utilizadas as seguintes fontes de excitação / emissão: mGFP, com máximos de excitação / emissão de 488/509 nm; MTomato, com maxima de excitação / emissão de 532/588 nm; Alexa-647, com maxima de excitação / emissão de 594/665; E DAPI, com máximos de excitação / emissão de 350/470. Esta figura foi modificada de Yu et al. 8 , com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: O rastreamento de linhagem de Procr + ECs demonstra sua contribuição para a Expansão Clonal da CE durante o Desenvolvimento. ( A ) Ilustração da estratégia de rastreamento de linhagem usando Procr Creert2 ; Rosa26 linha mTmG (painel esquerdo). ExperimentalConfiguração usada no curto prazo (2 dias) e no longo prazo (7 dias a 10 meses), conforme indicado (painel direito). ( BF ) Criação total confocal de vasculatura mamária após diferentes comprimentos de períodos de rastreamento, indicando a localização inicial de Procr + ECs e sua contribuição para a vasculatura mamária em vários estágios de rastreamento. Barra de escala = 50 μm. Esta figura foi modificada de Yu et al. 8 , com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Os ensaios de angiogênese representam uma boa abordagem experimental para estudar a dinâmica vascular. A vasculatura da retina do mouse, que se desenvolve pós-natal, provou ser um modelo atraente para estudar angiogênese 12 . Apesar de ser relativamente acessível, a manipulação real dentro do retículo vascular é bastante difícil. Até agora, o transplante in vivo melhor descrito foi o ensaio de plugue, que encerra células dentro de uma massa de matriz de membrana basal e implantamentos cirúrgicos / injeta subcutaneamente na região do flanco de um mouse receptor. Este ensaio de angiogénese é eficaz para testar o potencial regenerativo e a capacidade de formação de vasos de células incorporadas. No entanto, uma vez que a localização do plugue da matriz implantada cria um ambiente comparativamente isolado para as células internas, não fornece um nicho fisiológico ótimo. Recentemente, um novo modelo de angiogênese pulmonar também foi desenvolvido aplicando um adesivo de fibrina na superfícieCe site do pulmão do rato 13 . No entanto, os manipulamentos representam mais um risco, porque esta técnica opera de forma invasiva dentro da cavidade torácica do mouse, tornando assim difícil a sua utilização em uma configuração de ensaio mais generalizada.
No ensaio de angiogênese aqui descrito, um pequeno volume de mistura de células é transplantado dentro da almofada de gordura da glândula mamária, que fornece estímulos angiogênicos espaciais, matriciais e ricos durante a puberdade. Isso permite que os vasos gerados cumpram e se integrem na remodelação da vasculatura do hospedeiro, permitindo uma avaliação funcional adicional, bem como representando uma vantagem sobre o ensaio de plug subcutâneo. Além disso, a almofada de gordura mamária está localizada a partir da cavidade peritoneal, tornando-se um site muito acessível. A operação na almofada de gordura mamária introduz dificuldade limitada para o animal receptor, evitando os procedimentos cirúrgicos invasivos envolvidos em ensaios retinianos e baseados em pulmão.
Sagacidade sanguínea sagacidadeUm órgão geralmente se entrelaça entre os componentes do tecido para maximizar a cobertura vascular, de modo que o fornecimento de oxigênio no sangue e transferência de material pode ser otimizado. Por essa razão, o corte convencional do tecido freqüentemente intercepta a estrutura tubular de seus vasos. A análise das propriedades vasculares é melhor realizada quando os vasos podem ser preservados e permanecerem intactos. A preparação total de um tecido pode preservar em grande parte a totalidade da arquitetura vascular dentro. Este método permite não apenas a observação da autêntica distribuição espacial do vaso sanguíneo dentro de um órgão, mas também a relação com outros componentes teciduais.
A homeostase de um tecido contendo células-tronco é sustentada pelo equilíbrio da geração e perda de massa celular. As células-tronco dentro do órgão habitante específico são muitas vezes abrigadas e em contato próximo com o ambiente de tecido circundante, referido como o nicho de células-tronco. Portanto, stuA análise do tecido das células estaminais adultas deve ser realizada de preferência em um contexto fisiológico intacto. Os ensaios de transplante podem fornecer um meio de avaliar o potencial celular, enquanto a técnica de rastreamento de linhagem permite a exploração do destino das células verdadeiras no habitat natural. Nos últimos anos, o rastreamento de linhagem in vivo tornou-se uma técnica poderosa para a avaliação experimental das propriedades da haste. Esta estratégia tem sido usada para identificar as células-tronco de resíduos de tecidos e sua prole em múltiplos tecidos, incluindo o intestino 10 , 14 , folículos pilosos 15 , estômago 16 e pâncreas 17 . O método de rastreamento da linhagem depende em grande parte da marcação genética das células-tronco e é iniciado em populações definidas. Portanto, é difícil excluir a possibilidade de que a haste real seja encontrada em uma subpopulação ainda menor dentro das células rotuladas. Portanto, é imperativo mapear a célula de origem dos clones rastreados com precisão e medir quantitativamente as eficiências de rastreamento ao longo do tempo. Dessa forma, a capacidade de auto-renovação da população rotulada pode ser apreendida.
O ensaio de angiogénese descrito pode ser modificado para fins de estudo específicos: pode ser usado não só para testar a capacidade de geração de vasos de populações endoteliais de interesse, mas também para avaliar o efeito de fatores angiogênicos na remodelação de vasos localizados. No entanto, uma vez que a glândula mamária sofre alterações morfológicas dinâmicas durante diferentes estádios de desenvolvimento ( por exemplo, puberdade, ciclos de estro e gravidez), deve-se levar em consideração o efeito de mudanças sistêmicas, como a flutuação do nível hormonal, durante a interpretação dos resultados. Os passos críticos neste ensaio incluem o isolamento primário das células endoteliais. Para otimizar a obtenção de células viáveis para o transplante, os procedimentos para o isolamento FACS devem serE executado gentilmente. Deve-se ter cuidado para evitar manuseio severo durante as preparações celulares, como afrouxamento e suspensão das pelozes celulares. Outro passo crítico é a injeção da mistura de células no tapado de gordura. Durante a injeção da almofada gorda, é importante garantir que a mistura celular seja depositada com precisão dentro da almofada de gordura. Isso pode ser complicado se a inserção da agulha for muito profunda ou rasa ou se o volume total exceder a dosagem recomendada.
Este protocolo fornece uma série de métodos experimentais que auxiliaram na identificação de uma população de células estaminais endoteliais. Através destas técnicas, foi possível avaliar as propriedades das células estaminais através do transplante, bem como acompanhar e observar seu comportamento sob processos fisiológicos in vivo . Essas abordagens são ferramentas eficientes que podem ser aplicadas em múltiplas disciplinas, incluindo estudos de populações endoteliais em ambientes tumorais e de alterações na potência celular. EuEm particular, o transplante de almofadas de gordura e a preparação de montagem total são métodos reprodutíveis e poderosos que podem auxiliar nos esforços futuros para investigar diferentes aspectos da biologia vascular.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (31530045 e 31371500 a YAZ, 31401245 a QCY), o Ministério da Ciência e Tecnologia da China (2014CB964800), a Academia Chinesa de Ciências (XDB19000000 a YAZ) e os chineses Sociedade de Biologia Celular (Early Career Fellowship to QCY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-Ethylene Diamine Tetraacetic Acid(EDTA) (1x) | Gibco (Life Technologies) | 25300-062 | 0.05% Trypsin |
| 0.22 µm Filter Unit | Merck Millipore Ltd. | SLGP033RB | 0.22 µm Filter |
| 2-Methylbutanol-2, ReagentPlus | Sigma-Aldrich | 24, 048-6 | Tert Amyl Alcohol |
| 222, Tribromethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25g | 222, Tribromethanol |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) | Invitrogen | D1306 | DAPI |
| 70 µm Cell Strainer | BD FAL | 352350 | 70 µm Cell Strainer |
| Adhesion Microscope Slides | CITOGLAS | 188105 | Glass slides |
| Anti-mouse CD105 APC | eBioscience | 17-1051-82, clone MJ7/18 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| Anti-mouse CD201 Biotin | eBioscience | 13-2012-82 | for FACS analusis use at 2.5 µg/mL |
| Anti-mouse CD31 PE-Cyanine 7 | eBioscience | 25-0311-82, clone 390 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| BD FACSJazz Cell Sorter | BD Biosciences | 655489 | FACS |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 100190332 | BSA |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Centrifuge |
| Collagenase type 3 | Worthington-Biochem | #LS004183 | Collagenase III |
| Confocal microscopy | Leica | sp8 | Confocal |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D2463-5VL | Dnase I |
| Donkey anti-Rat Cy3 | Jackson ImmunResearch | 712-165-150 | Secondary antibody, use at 0.5 µg/mL |
| Dumont Forceps | WPI | 500342 | Froceps |
| Dumont Forceps - Micro-Blunted Tips | FST | 11253-20 | Forceps |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | FBS |
| FITC Ms CD3/Gr1/CD11b/CD45R(B220)/Ter-119 | BioLegend | 78022 | Blood lineage cocktail for FACS analysis, use at 25 µL per test |
| Glycerol | Sigma | G6279 | Glycerol |
| Iscov's Modified Dulbecco's Medium | Gibco (Life Technologies) | 12440-053 | IMDM |
| Isolectin GS-IB4 from Griffonia Simplicifolia, Alexa Fluora 647 | Invitrogen | Z32450 | Isolectin-647 |
| Matrigel Matrix (growth factor reduced) | BD | 356231 | Matrigel |
| Mouse strain (Actin-GFP) | Jax Laboratories | 3773 | Actin-GFP |
| Mouse strain (C57BL/6) | SLAC | C57BL/6 | C57BL/6 |
| Mouse strain (BALB/c nude) | SLAC | BALB/c nude | Nude mice |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | PFA |
| Penicilin Streptomycin | Gibco (Life Technologies) | 5140-122 | Pen/Strep |
| Phosphate Buffered Saline (pH7.2) 1x | Gibco (Life Technologies) | c20012500BT | PBS |
| PRIM1640 | Gibco (Life Technologies) | c11875500CP | PRIM1640 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | Mounting Medium |
| Rat anti CD144 | BD Biosciences | 550548 | for whole-mount analysis, anti-VE-Cadherin / Cdh5 antibdy for endothelial tight junction, use at 2.5 µg/mL |
| Rat anti CD31-biotin | BD Biosciences | 553371 | for whole-mount analusis, anti-CD31/PECAM1 antibody for endothelial surface adhesion molecule, use at 10 µg/mL |
| Red Cell Lysis Buffer | Sigma | R7767-100ML | Red blood cell lysing buffer |
| Straight/Sharp-Blunt/10cm | FST | 14028-10 | Fine Scissors |
| Streptavidin eFluor 450 | eBioscience | 48-4317-82 | for FACS analysis use at 0.5 µg/mL |
| Tamoxifen | Sigma | 101551374 | TAM |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | TritonX |
| Wax Coated Braided Silk (Size 5-0 USP (1 Metric), 18 inches (45 cm) BLACK on C-1 Needle) | COVIDIEN | S1173 | Suture |
| Sterile Disposable Scaplels | Swann Morton | #10 | Scalpel |
| Betadine | Yifeng Medical | 20160101 | Antiseptic solution |
References
- Thomas, E. D., Lochte, H. L., Lu, W. C., Ferrebee, J. W. Intravenous infusion of bone marrow in patients receiving radiation and chemotherapy. N Engl J Med. 257 (11), 491-496 (1957).
- Chao, M. P., Seita, J., Weissman, I. L. Establishment of a normal hematopoietic and leukemia stem cell hierarchy. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 439-449 (2008).
- Bompais, H., et al. Human endothelial cells derived from circulating progenitors display specific functional properties compared with mature vessel wall endothelial cells. Blood. 103 (7), 2577-2584 (2004).
- Fang, S., Wei, J., Pentinmikko, N., Leinonen, H., Salven, P. Generation of functional blood vessels from a single c-kit+ adult vascular endothelial stem cell. PLoS Biol. 10 (10), e1001407 (2012).
- Naito, H., Kidoya, H., Sakimoto, S., Wakabayashi, T., Takakura, N. Identification and characterization of a resident vascular stem/progenitor cell population in preexisting blood vessels. EMBO J. 31 (4), 842-855 (2012).
- Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
- Snippert, H. J., Clevers, H.
- Yu, Q. C., Song, W., Wang, D., Zeng, Y. A. Identification of blood vascular endothelial stem cells by the expression of protein C receptor. Cell Res. 26 (10), 1079-1098 (2016).
- Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506, 322-327 (2014).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449, 1003-1007 (2007).
- Wang, D. S., et al. Identification of multipotent mammary stemcells by protein C receptor expression. Nature. 517, 81-U201 (2015).
- Stahl, A., et al. The Mouse Retina as an Angiogenesis Model. Invest Ophth Vis Sci. 51 (6), 2813-2826 (2010).
- Mammoto, T., Mammoto, A. Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis. J. Vis. Exp. (94), e52012 (2014).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21 (1), 70-71 (1999).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Solar, M., et al. Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth. Dev Cell. 17 (6), 849-860 (2009).
