Summary
Questo lavoro dimostra un nuovo approccio per valutare la proliferazione, la differenziazione e il potenziale di formazione delle vascelle di cellule staminali endoteliali (VESCs) attraverso il trapianto di grassi mammarie, seguito da una preparazione del tessuto a tutto sesto per l'osservazione microscopica. Viene inoltre presentata una strategia di tracciamento delle linee per indagare il comportamento dei VESC in vivo .
Abstract
Le cellule endoteliali (ECs) costituiscono i fondamenti fondamentali dell'architettura vascolare e mediano la crescita vascolare e il rimodellamento per garantire lo sviluppo adeguato dei vasi e l'omeostasi. Tuttavia, gli studi sulla gerarchia delle linee endoteliali rimangono inafferrabili a causa della mancanza di strumenti per accedere e di valutare direttamente il loro comportamento in vivo . Per risolvere questo problema, è stato sviluppato un nuovo modello di tessuto per studiare l'angiogenesi usando il tampone di grasso mammario. La ghiandola mammaria si sviluppa soprattutto nelle fasi postnatali, tra cui la pubertà e la gravidanza, durante la quale la robusta proliferazione epiteliale è accompagnata da un'ampia rimodellamento vascolare. I rilievi di grasso mammario forniscono spazio, matrice e ricchi stimoli angiogenici dal crescente epitelio mammario. Inoltre, i tamponi di grasso mammario sono situati al di fuori della cavità peritoneale, rendendoli un luogo di innesto facilmente accessibile per valutare il potenziale angiogenico delle cellule esogene. Questo lavoro descrive anche un efficeNt tracciando l'approccio utilizzando topi reporter fluorescenti per specificare in modo specifico la popolazione mirata di cellule staminali endoteliali vascolari (VESCs) in vivo . Questo metodo di tracciamento delle linee, accoppiato con la successiva microscopia integrale a tessuto, consente la visualizzazione diretta di cellule mirate e dei loro discendenti, attraverso i quali la capacità di proliferazione può essere quantificata e l'impegno di differenziazione può essere suddiviso. Utilizzando questi metodi, una popolazione di recettori Bipotenti di proteine C (Procr) che esprimono VESCs è stata recentemente identificata in più sistemi vascolari. Procr + VESCs, che danno origine a nuove EC e periciti, contribuiscono attivamente all'angiogenesi durante lo sviluppo, l'omeostasi e la riparazione degli infortuni. Nel complesso, questo manoscritto descrive un nuovo trapianto di tessuto grasso mammario e tecniche di tracciamento in linea vivo che possono essere utilizzate per valutare le proprietà delle cellule staminali dei VESCs.
Introduction
Durante lo sviluppo e l'omeostasi, la crescita vascolare e il rimodellamento si svolgono fedelmente in conformità con la crescita e la riparazione dell'organo. L'angiogenesi descrive la generazione di nuove vasi da vasi sanguigni preesistenti ed è considerata una forza importante che medierà questi cambiamenti vascolari dinamici. Ogni vaso sanguigno è interiore rivestito con uno strato di cellule endoteliali (ECs), e sembrano essere il fondamento dell'architettura dei vasi. Per lungo tempo, il meccanismo attraverso il quale è stato rifornito il pool comunitario durante l'omeostasi è rimasto chiaro e sono stati sollevati argomenti su se il fatturato vascolare sia il risultato di una proliferazione maturata della CE o il contributo delle attività delle cellule staminali vascolari / progenitori. A causa della mancanza di prove fisiologiche dirette, l'esistenza e l'identità cellulare delle cellule staminali endoteliali vascolari (VESC) restano comunque controverse.
Uno degli approcci più comuni utilizzati per verificare il comportamento delle cellule staminali è attraverso il trapiantoDelle cellule staminali presenti nei topi riceventi. Questo metodo misura il potenziale di stemma delle cellule staminali candidate in vivo. Il trapianto è stato applicato per lo studio delle cellule staminali del midollo osseo 1 , che hanno contribuito alla definizione delle caratteristiche gerarchiche del sistema ematopoietico 2 . Nel campo endoteliale, una matrice di membrana basale ( ad es., Matrigel) inserita sottocutanea sotto la pelle del fianco è stata un test standard di angiogenesi in vivo utilizzato per affrontare le capacità di formazione delle vasche di EC trapiantate. Metodi sperimentali multipli, compresa la formazione di colonie nei sistemi di coltura 3D e trapianto, hanno suggerito le potenziali popolazioni EC progenitor / VESC 3 , 4 , 5 , 6 . Tuttavia, poiché le EC incorporate nella matrice della membrana basale sono relativamente separateIl tessuto circostante, questo non fornisce l'ambiente di nicchia ottimale richiesto per esplorare pienamente il potenziale angiogenico delle cellule trapiantate. Di conseguenza, le navi formate all'interno della spina a matrice sono prevalentemente capillari e sono funzionalmente inconfondibili.
La ghiandola mammaria si sviluppa postnatale, con la crescita più robusta durante la pubertà e la gravidanza. Alla fase pubertale, l'epitelio mammario subisce un'espansione rapida, per occupare l'intero grasso di grasso mammario, accompagnato dall'efficace rimodellamento delle strutture vascolari circostanti. Pertanto, la ghiandola mammaria offre un eccellente modello per lo studio dell'angiogenesi. Fornisce spazio, matrice e ricchi stimoli angiogenici dal crescente epitelio mammario e quindi è un luogo di innesto ideale per valutare il potenziale angiogenico delle cellule esogene. Inoltre, il tampone di grasso mammario consente ai vasi esogeni formati di integrarsi con il sistema di circolazione dell'ospite, consentendo ulteriori fValutazione non unica e che rappresenta un vantaggio rispetto al trapianto sottocutaneo.
Sebbene i test di coltura in vitro e di trapianto siano un modo efficace per indagare le proprietà di rigenerazione di una popolazione cellulare, è noto che tali saggi possono stimolare la plasticità poiché le cellule vengono tolte dai loro habitat naturali e le modifiche potrebbero essere indotte quando le cellule sono scollegate da Il loro ambiente fisiologico 7 . Pertanto, ottenere l'evidenza diretta in vivo del destino cellulare è l'approccio chiave per favorire la comprensione attuale del comportamento delle popolazioni endoteliali.
La mappatura del destino genetico ( cioè il tracciamento di linee in vivo ) è indispensabile per l'identificazione dei VESC e per l'indagine delle loro proprietà nel sistema corporeo in quanto può rivelare il comportamento delle cellule staminali in vivo nel suo contesto fisiologico e l'effettivo gambo può essere valutato. Lineage traciNg fornisce una dimostrazione diretta della persistenza a lungo termine ( cioè, autoreplicazione) dei VESC candidati e della loro capacità di produrre tipi cellulari per il tessuto di origine ( cioè potenza di differenziazione).
Questo protocollo descrive una nuova tecnica di trapianto di grassi del grasso mammario e un metodo di tracciamento delle linee per osservare la capacità di generazione dei vasi di VESCs. Queste tecniche superano le carenze dei dosaggi attualmente disponibili e forniscono un nuovo modo per valutare in modo ottimale le proprietà delle cellule staminali dei VESCs. Questi approcci sono strumenti efficaci che possono essere utilizzati per valutare le proprietà di comportamento e di formazione delle navi delle popolazioni endoteliali, nonché per determinare la alterazione della potenza delle cellule vascolari all'interno di un ambiente patologico.
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Protocol
Le procedure sperimentali sono state approvate dal comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Istituto di biologia e biologia delle cellule di Shanghai, Accademia cinese delle scienze, con il protocollo approvato SIBCB-NAF-15-002-S335-003.
1. Isolamento di VESC dalla ghiandola mammaria
- Raccolta delle ghiandole mammarie e digestione dei tessuti.
- Usa 8 settimane di età Actin-GFP mature vergini reporter topo, con pesi da 20 a 25 g, come donatori di tessuti.
Nota: le celle originate dal donatore possono essere facilmente tracciate con l'espressione GFP. - Preparare il mezzo di base della digestione tissutale costituito da 5% di siero fetale fetale (FBS), 1% pen / strep e 25 mM HEPES in RPMI1640. Filtrare la miscela attraverso un filtro da 0,22 μm per sterilizzare e pre-riscaldarlo a 37 ° C in un bagno d'acqua.
- Sacrificare i topi in una camera di CO 2 . Disseccare la quarta coppia di ghiandole mammarie inguinali facendo prima una pelle verticale iNcision al midline addominale inferiore utilizzando un bisturi (o forbici chirurgiche). Sbucciate delicatamente la pelle da un lato per esporre la ghiandola mammaria inguinale con pinze. Ottenere le quattro ghiandole mammarie inguinali da entrambi i lati e tagliarli in pezzi fini in un piatto di Petri da 6 cm con forbici.
- Misurare il peso totale del tessuto macinato e collocarlo in un tubo da 50 ml.
Nota: Assicurarsi che il frammento di tessuto risultante sia inferiore a 1 mm 3 per ogni pezzo. Una resa tipica è di circa 5.000 VESC per animale.
- Misurare il peso totale del tessuto macinato e collocarlo in un tubo da 50 ml.
- Preparare il substrato di base della digestione in un tubo di centrifuga a capsule da 50 ml al volume di 10 mL per 1 g di tronco di tessuto. Aggiungere la collagenasi tipo 3 alla concentrazione di 300 unità per 10 ml di mezzo di base della digestione per costituire il tampone di digestione. Mescolare in modo uniforme e aggiungerlo al mosto di tessuto.
- Posizionare orizzontalmente il tubo centrifuga da 50 ml su una piattaforma a dondolo e impostare la velocità a 100 giri / min e la temperatura a 37 ° C. AgitareIl tessuto mammario per 2 ore. Controllare e scuotere manualmente il tubo ogni 20 minuti per garantire una corretta digestione.
Nota: Lo scopo della digestione tissutale prima del FACS è quello di preparare una sola cellula soluzione dal tessuto solido. Pertanto, alla fine della digestione, il contenuto dovrebbe essere una soluzione spessa senza pezzi di tessuto visibile.
- Usa 8 settimane di età Actin-GFP mature vergini reporter topo, con pesi da 20 a 25 g, come donatori di tessuti.
- Preparazione di una sola cellula.
- Dopo la digestione, riempire il tubo centrifuga da 50 ml con PBS sterile pre-riscaldato e invertire il tubo per uniformarsi uniformemente. Centrifugare il tubo a 200 xg per 5 min per ottenere un pellet di cellule.
- Rimuovere il surnatante e far scorrere il fondo del tubo per allentare il pellet cellulare. Aggiungere 3 ml di tampone di lisi di globuli rossi (vedere tabella dei materiali) e incubare in un cappuccio per la cultura tissutale a temperatura ambiente (RT) per 5 minuti per eliminare le cellule del sangue rosso.
- Aggiungere 10 ml di PBS sterile e invertire il tubo per uniformarsi uniformemente. Centrifugare il contenuto di tessuto a 200 xg per 5 minuti e il discoArd il supernatante. Aggiungere in 3 mL di trypsina pre-riscaldato di 0,05% e conservare il tubo a 37 ° C per 5 minuti per digerire ulteriormente il tessuto rimanente.
- Aggiungere in 3 ml di IMDM pre-riscaldato e quindi aggiungere 100 μL di soluzione DNasi I (0,25 mg di DNasi I diluiti in 1 ml di PBS). Conservare il tubo a 37 ° C per rompere i filamenti del DNA. Passare la miscela tissutale attraverso un filtro da 70 μm per ottenere la soluzione cellulare. Sciacquare due volte il filtro con 2 ml di PBS + 5% FBS per neutralizzare la digestione enzimatica.
- Centrifugare la miscela cellulare a 200 xg per 5 minuti per far pelliccare le cellule. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 ml di PBS + 5% FBS per la colorazione degli anticorpi.
- FACS-based isolamento Procr + VESC.
- Soggetta la miscela cellulare ottenuta da tessuto mammario donatore alla colorazione anticorpale seguendo protocolli di routine pubblicati 8 .
Nota: Sono stati utilizzati gli anticorpi seguenti: anti-mouseAnti-egizio CD31 (PECAM1) -PECY7, anti-mouse CD105-APC (tutti utilizzati a una concentrazione di 1 μg / mL), anti-mouse CD201 (Procr) -biotina (utilizzata ad una concentrazione di 2,5 Μg / mL) e streptavidina-v450 (utilizzata ad una concentrazione di 0,5 μg / mL).- Dopo la colorazione degli anticorpi, superare le cellule con PBS + 5% FBS e poi centrifugare a 200 g per 5 min. Scartare il surnatante e risospendere le cellule con 1 ml di PBS + 5% di FBS. Filtra attraverso un filtro da 40 μm. Posizionare su ghiaccio fino alla classificazione FACS.
- Procedere per eseguire l'ordinamento basato su FACS per isolare Procr + VESCs.
- Analizzare il campione non colorato e ogni singolo controllo colore per determinare la tensione per ogni colore. Calcolare i parametri di compensazione per evitare la fluorescenza automatica o la colorazione di fondo. Impostare il modello per la corretta gating e l'ordinamento per le popolazioni di celle desiderate.
- Per stabilire la gerarchia di ordinamento FACS, prima eliminare i detriti daTutti gli eventi e poi scartare doppiette o cluster di cellule adesive attivando con larghezza. Estrarre le cellule di sangue del sangue e quindi utilizzare CD31 + e CD105 + per definire le popolazioni endoteliali.
Nota: le cellule Procr + sono state isolate da CD31 + CD105 + ECs rispetto a un controllo FMO. Un diagramma di analisi FACS rappresentativo è mostrato in Figura 1 . Una popolazione VESC isolata da FACS dovrebbe essere sospesa in IMDM + 50% FBS e conservata sul ghiaccio fino all'ulteriore elaborazione.
- Soggetta la miscela cellulare ottenuta da tessuto mammario donatore alla colorazione anticorpale seguendo protocolli di routine pubblicati 8 .
2. In Vivo VESC Vessel Formation Assay Utilizzando il Mammary Fat Pad
- Preparare EC primarie per il trapianto.
- Raggiungere le cellule ordinate FACS con 10 ml di PBS + 5% FBS e centrifugare a 200 xg per 5 min per sistemare le cellule fino al fondo.
- Aspirare con cura il liquido, contare il numero di cellule usando un emocitometro e risospendere il pellet cellulare con la miscela di matrice a membrana basale (consi50% di matrice di membrana basale e PBS con il 20% di FBS, integrato con 100 ng / mL rmVEGF e 60 E / mL di eparina) per raggiungere una concentrazione di lavoro di 15.000 cellule / 15 μL.
Nota: la miscela di matrice di membrana basale deve essere sempre conservata sul ghiaccio. - Diluire serialmente le cellule ordinate e contate per raggiungere le concentrazioni di input richieste in un microprocessore da 1,5 ml, assicurandosi che i volumi di iniezione finali non superino di almeno 15 μL. Aggiungere 0,1% Trypan blu ad ogni tubo per una migliore visualizzazione del contenuto durante il trapianto. Pipette accuratamente per mescolare. Conservare i tubi sul ghiaccio fino all'uso.
Nota: La generazione di navi di successo potrebbe essere raggiunta con un minimo di 100 VESC.
- Trascinare EC primari al tampone grasso mammario.
- Disinfettare gli strumenti chirurgici e il benchtop. Se si utilizzano gli stessi strumenti su più animali, è possibile utilizzare una sterilizzatrice per la disinfezione.
- Anestetizza il 3 settimane BALB / c nude micUtilizzando il protocollo anestetico raccomandato dal veterinario dell'istituzione e dalla IACUC. Posizionare ogni mouse in posizione supina, con la schiena sulla tabella di funzionamento. Immobilizzare le membra utilizzando un nastro adesivo.
- Immergere un tampone di cotone in soluzione antisettica a base di iodio. Pulire completamente l'intera zona addominale del mouse per sterilizzare la superficie della pelle prima dell'intervento.
- Tenere e sollevare la pelle dell'addome del topo con le pinze. Utilizzare un bisturi chirurgico per eseguire una piccola incisione verticale da 1 cm. Fate due tagli di circa 0,5-1 cm di lunghezza, ciascuno verso la gamba posteriore, per ottenere un'incisione a forma di Y a testa in giù.
- Usare la pinza e un tampone di cotone per separare delicatamente la pelle dall'addome e fissare la pelle lateralmente per esporre le ghiandole mammarie inguinali. Posizionare il mouse sotto un stereoscopio e impostare l'ingrandimento su 2.0X. Assicurarsi di regolare la messa a fuoco in modo che il tampone grasso mammario possa essere chiaramente visto e operato.
- Posizionare un ago da 27G 1/2 "E sul ghiaccio per pre-chill. Prima di iniziare una siringa da 1 ml con la matrice della membrana basale per rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate nella regione di attacco dell'ago. Pipettare 15 μL di soluzione mista sul tappo del tubo di microcentrifuga e aspirare l'intero volume nella siringa primerizzata.
- Tenere il tampone di grasso mammario davanti al linfonodo inguinale, utilizzando delle pinzette, e sollevare leggermente per una facile iniezione. Inserire delicatamente circa 1/4 dell'ago della siringa nel tampone grasso.
- Rilasciare le pinzette dal fodero per impugnare e stabilizzare l'ago a siringa. Iniettare lentamente la soluzione per evitare perdite di liquido. Tenere premuto per alcuni secondi per assicurarsi che la miscela cellulare sia solidificata per ridurre al minimo la perdita durante l'estrazione dell'ago.
- Chiudere il flap della pelle con suture assorbibili. Sutura il flap della pelle usando la sutura monofilamento non reattiva di dimensioni 5-0 e chiudi le ferite con nodi di chirurgo, ogni nodo approssimativoA distanza di 0,3 cm. In alternativa, chiudere la pelle con graffette ferite.
- I topi gestiti in luogo in una gabbia separata per il recupero. Mettere una lampada di riscaldamento sopra la gabbia per impedire che i topi anestetizzati soffrono di ipotermia. Mettere la carta morbida e il cotone alla base della gabbia per mantenere i topi caldo post-intervento chirurgico.
- Osserva attentamente i topi fino a quando tutti i destinatari sono completamente svegli. Per i prossimi giorni, applicare analgesici post-chirurgici in modo preventivo a tutti gli animali o come diretto dal veterinario dell'impianto. Applicare gli antibiotici secondo il protocollo animale approvato se si verifica un'infezione da ferita. Se la ferita chirurgica è stata chiusa con graffette ferite, rimuovere le clip della ferita 10 giorni dopo la chirurgia, quando la ferita è completamente chiusa.
3. Preparazione sintetica del tessuto per osservazione microscopica
- Raccolta dei tessuti
- A 2 - 4 settimane dopo l'impianto, anestetizza il destinatario BALB / cTopi nude con una iniezione intraperitoneale di agente anestetizzante del 2,5% ad un dosaggio di 0,12 ml per 20 g di peso corporeo, come al punto 2.2.2.
Nota: La crescita positiva delle vasi può essere rilevata 2 - 4 settimane dopo il trapianto di cellule. - Etichettare la circolazione sistemica del destinatario con una iniezione coda di erbe di colorante isolectin-647 ad un dosaggio di 50 μg / 25 g di peso corporeo, risospeso in 50 μL di PBS sterile. Consentire un periodo di riposo di 5 - 10 min. Sacrificare i topi usando CO 2 .
- Disseccare l'area del tessuto mammario in cui le cellule sono state inizialmente iniettate seguendo la fase 2.2.4; Utilizzare forbici chirurgiche. Utilizzando una lama chirurgica, tagliate il tessuto in circa 3 - 4 mm 3 cubi in un piatto di Petri da 6 cm.
- A 2 - 4 settimane dopo l'impianto, anestetizza il destinatario BALB / cTopi nude con una iniezione intraperitoneale di agente anestetizzante del 2,5% ad un dosaggio di 0,12 ml per 20 g di peso corporeo, come al punto 2.2.2.
- La digestione tissutale e la preparazione per la colorazione degli anticorpi.
- Digestare i pezzi di tessuto in un tubo di centrifuga da 15 ml riempito con 10 ml di mezzo di base di digestione pre-riscaldato (fase 1.1.2) integrato con collagenasi III(300 U per 10 mL).
- Posizionare orizzontalmente il tubo centrifuga da 15 ml su una piattaforma a dondolo con la velocità impostata a 100 giri / min e la temperatura impostata a 37 ° C per circa 1 h per allentare la struttura del tessuto e per eliminare i tessuti adipociti eccessivi.
Nota: gli adipociti tendono a produrre auto-fluorescenza che potrebbe causare un rumoroso sfondo fluorescente. Alla fine della digestione, i pezzi di tessuto dovrebbero avere un aspetto morbido e nuvoloso. Il periodo di digestione ottimale dipende dalla dimensione dei pezzi di tessuto tritato e pertanto dovrebbe essere adeguato di conseguenza per ottenere i migliori risultati. Poiché la vascolarizzazione del tessuto è già stata etichettata con Isolectin a fluorescenza, tutte le procedure seguenti devono essere eseguite protette dalla luce. - Lavare i pezzi di tessuto con PBS a RT per 10 min. Fissare il tessuto a tutto tondo, posizionando con cura i pezzi in un piatto di Petri da 6 cm in pieno con 4% PFA (pH 7,2 - 7,4) per preservare la fluorescenza. Posizionare il piatto di PetriSu una piattaforma a dondolo e agitare delicatamente il tessuto per 30 minuti a RT.
Nota: il PFA è cancerogeno e deve essere manipolato con cautela. - Rimuovere il restante PFA e lavare il tessuto fisso tre volte con un tampone di lavaggio interamente montato (0,1% in PBS), con un intervallo di 10 minuti tra ogni lavaggio.
- Colorazione anticorpale tissutale integrale.
- Diluire l'anticorpo primario nel tampone di colorazione degli anticorpi in un tubo da centrifuga da 2 ml. Incubare il tessuto con anticorpo primario per una notte a 4 ° C.
Nota: gli anticorpi primari sono stati utilizzati come anticorpi anti-CD31 (concentrazione: 10 μg / mL) o anti-VE-cadherina (CD144 / Cdh5; concentrazione: 2,5 μg / mL). Sia CD31 che VE-Cadherin sono marcatori di superficie cellulare utilizzati per riconoscere l'endotelio. Viene preparato un tampone di colorazione anticorpale da 5x con 500 mM acido maleico, pH 7,5; 750 mM NaCl; E 0,5% (v / v) si dissolvono in PBS. Aggiungete solo un volume appropriato di siero (5%) durante la preparazione di una soluzione di lavoro fresca 1x9 . - Rimuovere il tampone di colorazione degli anticorpi e lavare il tessuto di montaggio per tre volte con il tampone di lavaggio, con un intervallo di 10 minuti. Incubare il tessuto con anticorpo secondario (vedere la tabella dei materiali ) più DAPI a RT per 4 ore su una piattaforma a dondolo o per una notte a 4 ° C.
Nota: Utilizzare DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo) ad una concentrazione finale di 5 μg / mL per visualizzare i nuclei. - Lavare il tessuto interamente montato con il tampone di lavaggio 3 volte per 10 minuti ciascuno. Incubare i tessuti in 80% di glicerolo o 80% di saccarosio durante la notte per disidratare il tessuto per una migliore conservazione.
- Posizionare i singoli pezzi di tessuto su uno scivolo in vetro e rimuovere l'eccessivo tampone di disidratazione. Coprire il tessuto con il supporto di montaggio, mettere un coperchio e spremere delicatamente il tessuto per impostarlo.
- Effettuare l'acquisizione di immagini microscopiche confocali. Per le ghiandole mammarie intere, acquisite immagini usando un 40X con NAI = 1.3 oggetti oliove. Acquisisci le scansioni di piastrelle di Z-stack a una risoluzione di sezione ottica di 1.024 x 1.024 e una separazione di strato da 1.0 a 1.2 μm.
Nota: per catturare il segnale luminoso della luce di fluorescenza, lo splitter del filtro deve essere impostato su triplo dicroico (TD) 488/553/638, con l'impostazione di guadagno a PMT Gain 600-800. Devono essere utilizzate le seguenti fonti di eccitazione / emissione: mGFP, con massimi di eccitazione / emissione di 488/509 nm; MTomato con massimi di eccitazione / emissione di 532/588 nm; Alexa-647, con massima di eccitazione / emissione di 594/665; E DAPI, con maxi di eccitazione / emissione di 350/470.
- Diluire l'anticorpo primario nel tampone di colorazione degli anticorpi in un tubo da centrifuga da 2 ml. Incubare il tessuto con anticorpo primario per una notte a 4 ° C.
4. Tracciatura di lineage utilizzando un modello di mouse modificato geneticamente
- Rileva Procr + VESC usando il modello del mouse.
- Utilizzare il ceppo del mouse Knock-in di Procr CreERT2-IRES-tdTomato / + (indicato come Procr CreERT2 ).
Nota: In questo modello del mouse, una cassetta CreERT2-IRES-tdTomato Procr 11 .- Cross Procr CreERT2 topi con il Rosa26 mTtomatomGFP (indicato come R26 mTmG ) ceppo di reporter per tracciare il destino di Procr + ECs endogeno in vivo 11 . Identificare tutti gli endogeni Procr + ECs etichettati e il loro discendente utilizzando l'espressione GFP.
- Somministrare soluzione tamoxifene 11 (10 mg di tamoxifene disciolto in 1 ml di olio di arachidi + 10% di etanolo per costituire una soluzione di scorta di 10 mg / ml) intraperitonealmente ad una dose di 4 mg / 25 g di peso corporeo durante la fase pubertalica (5 settimane Vecchio) per seguire il destino dello sviluppo di Procr + ECs.
- Analizzare l'efficienza di clonazione delle cellule etichettate mediante l'immunostaining mantenuta a monte secondo le fasi di preparazione descritte al punto 3. Ottenere i rilievi di grasso mammario da topi trattati sia dopo brevi periodi (2 giorni) e periodi prolungati (fino a 10 mesi). Vedere la Figura 3 .
- Utilizzare il ceppo del mouse Knock-in di Procr CreERT2-IRES-tdTomato / + (indicato come Procr CreERT2 ).
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Representative Results
Isolamento VESC mammarie:
Per isolare la popolazione endoteliale per il successivo saggio di trapianto, le ghiandole mammarie del mouse vergine mature (8 settimane) sono state raccolte come materiale donatore. Le cellule endoteliali sono state isolate usando una tecnica di selezione delle cellule a base di anticorpi. I diagrammi rappresentativi dell'analisi FACS della popolazione VESC in ECs di ghiandola mammaria C57BL / 6 di 8 settimane sono mostrati in Figura 1 (Figura adattata da Yu et al. , 8 , con permesso).
Trapianto di grassi del grasso mammario:
Il rilievo grasso mammario rappresenta un luogo ideale per lo studio dell'angiogenesi. Dopo l'isolamento basato su FACS, Procr + ECs sono state mescolate con la matrice di membrana del basamento del 0,5% e l'indicatore di Trypan blu dello 0,1% e sono stati poi trasplanatiAlla griglia di grasso vuota dei destinatari SCID di 3 settimane. Durante la pubertà, il tampone grasso mammario crea un ambiente angiogenico, promuovendo il rimodellamento della vasculatura in allineamento con l'espansione epitelio mammaria. Di conseguenza, i Procr + ECs trapiantati (GFP + ) sono stati incorporati nei vasi grandi dell'host ( figura 2B , frecce) e hanno anche costituito i rami secondari e terziari GFP + ( Figura 2B , frecce). Sebbene trapiantato Procr + EC può anche generare navi in un saggio spina matrice (inserito sotto la pelle del fianco), i vasi formate appaiono solo capillare-simile (Figura 2A; figura adattato da Yu et al 8, con permesso.).
Funzionalità delle navi formate da Procr + VESCs:
Per verificare se il GFP + vGli essei in pastiglie grasse mammarie fanno parte della vasculatura circolatoria funzionale, l'isolectina è stata somministrata per via iniettiva per via endovenosa prima del raccolto. Le navi GFP + erano isolectin +, indicando che le vasi formate sono luminose e collegate alla vasculatura dell'ospite ( figura 2B , figura adattata da Yu et al. , 8 , con autorizzazione).
Tracciamento delle linee del Vasculo mammario utilizzando il ProcR CreERT2 ; Rosa26 mTmG Mouse Modello:
Procr CreERT2 ; I topi Rosa26 mTmG sono stati utilizzati per il tracciamento del destino di Procr + VESCs in vivo ( Figura 3A ). Per studiare come Procr + VESC contribuisca alla robusta angiogenesi e rimodellamento vascolare durante lo sviluppo pubertalico delle ghiandole mammarie, Procr CreERT2 ; Sono stati somministrati Rosa26 mTmGD con tamoxifene per indurre l'espressione di GFP nella popolazione endoteliale Procr +. I rilievi grassi mammari di Procr CreERT2 trattati con farmaci ; Topi Rosa26 mTmG state raccolte sia a breve termine (2 giorni post-iniezione; la figura 3B) ea lungo termine (fino a 10 mesi dopo l'iniezione; Figura 3C -F; figura adattato da Yu et al 8, con permesso.). La preparazione a tutto montaggio è stata effettuata per visualizzare il risultato di tracciamento. L'identità endoteliale vascolare può essere convalidata mediante colorazione con marcatore superficiale endoteliale VE-Cadherin (Cdh5; Figura 3B , immagine destra).
Figura 1: Analisi di VESC in ghiandola mammaria del mouse. Analisi FACS dell'espressione di Procr nelle ECs di mammaria C57BL / 6 di 8 settimane. 8 settimane vI topi femminili irgin C67BL / 6 sono stati utilizzati per la raccolta delle ghiandole mammarie. Dopo aver preparato campioni di cellule, sono stati analizzati campioni non colorati e ogni singolo controllo di colore per determinare la tensione per ciascun colore. I parametri di compensazione sono stati calcolati per evitare l'auto-fluorescenza o la colorazione di fondo. È stato stabilito un template per la corretta gating e per ordinare per le popolazioni di cellule desiderate. Per stabilire la gerarchia di ordinamento FACS, i detriti di tutti gli eventi sono stati eliminati e poi i doppi oi cluster di cellule adesivi sono stati scartati. Le cellule di derivazione sono state escluse, e CD31 e CD105 sono state utilizzate per definire le popolazioni endoteliali. Le cellule di Procr + sono state isolate da CD31 + CD105 + ECs rispetto al controllo FMO. Questa cifra è stata modificata da Yu et al. 8 , con permesso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Saggio di trapianto di grasso del mammario VESC. ( A ) Una nave formata da Procr + ECs all'interno di una spina di matrice a membrana basale inserita sotto la pelle del fianco. ( B ) Immagine confocale di un rilievo grasso mammario destinatario, che indica l'integrazione e il contributo di Procr + ECs (GFP +) trapiantati per ospitare la vascolarizzazione mammaria. Le ECs sono state contrastate con CD31. ( C ) L'iniezione intravenosa nei topi riceventi con isolectina ha mostrato che le colture formano vasi luminose. Barra di scala, 50 μm. Le immagini sono state acquisite utilizzando un obiettivo 40X NA 1.3 olio. Le scansioni di piastrelle di Z-stack sono state acquisite con una risoluzione di sezione ottica di 1.024 x 1.024 e ciascun strato è separato da 1.0 a 1.2 μm. Per catturare il segnale luminoso della luce di fluorescenza, lo splitter del filtro del fascio è stato impostato su TD 488/553/638, con il gMin su PMT Gain 600 - 800. Sono state utilizzate le seguenti sorgenti di eccitazione / emissione: mGFP, con i massimi di eccitazione / emissione di 488/509 nm; MTomato, con massimi di eccitazione / emissione di 532/588 nm; Alexa-647, con massima di eccitazione / emissione di 594/665; E DAPI, con maxi di eccitazione / emissione di 350/470. Questa cifra è stata modificata da Yu et al. 8 , con permesso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Tracciatura di linee di Procr + ECs Dimostra il loro contributo all'estensione clonale EC durante lo sviluppo. ( A ) Illustrazione della strategia di tracciamento di linee utilizzando Procr CreERT2 ; Linea Rosa26 mTmG (pannello sinistro). SperimentaleImpostazione utilizzata a breve (2 giorni) e a lungo termine (7 giorni a 10 mesi), come indicato (pannello destro). ( BF ) Imaging confocale di vasculatura mammaria dopo diverse lunghezze di periodi di tracciamento, che indica la posizione iniziale di Procr + ECs etichettati e il loro contributo alla vasculatura mammaria in varie fasi di tracciamento. Barra di scala = 50 μm. Questa cifra è stata modificata da Yu et al. 8 , con permesso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I dosaggi di angiogenesi rappresentano un buon approccio sperimentale per studiare la dinamica vascolare. La vasculatura retinica del mouse, che si sviluppa dopo la nascita, si è dimostrata un modello attraente per studiare l'angiogenesi 12 . Nonostante sia relativamente accessibile, la manipolazione effettiva all'interno del letto vascolare della retina è piuttosto difficile. Finora, il trapianto in vivo meglio descritto è stato il test di spina, che racchiude celle all'interno di una massa di matrice della membrana basale e impianti chirurgicamente implanta / inietta sottocutanea alla regione del fianco di un topo ricevente. Questo test di angiogenesi è efficace nel test del potenziale rigenerativo e della capacità di formazione delle vasche di cellule incorporate. Tuttavia, poiché l'ubicazione della spina matrice impiantata crea un ambiente relativamente isolato per le celle dentro, non fornisce una nicchia fisiologica ottimale. Recentemente, è stato anche sviluppato un nuovo modello di angiogenesi polmonare applicando una patch di fibrina sul surfaSito del polmone del mouse 13 . Tuttavia, le manipolazioni rappresentano un altro rischio, perché questa tecnica opera invasivamente all'interno della cavità toracica del mouse, rendendo quindi difficile l'uso in un ambiente di analisi più generale.
Nel test di angiogenesi descritto qui, un piccolo volume di miscela cellulare viene trapiantato all'interno del tampone grasso della ghiandola mammaria, che fornisce spazio, matrice e ricchi stimoli angiogenici durante la pubertà. Ciò consente alle navi generate di conformarsi e di integrarsi nella rimodellamento della vasculatura dell'ospite, consentendo una ulteriore valutazione funzionale, oltre a rappresentare un vantaggio rispetto al saggio sottocutaneo della spina. Inoltre, il tampone grasso mammario è situato fuori dalla cavità peritoneale, rendendolo un sito molto accessibile. L'operazione sul tampone di grasso mammario presenta una limitata distrazione all'animale destinatario, evitando le procedure chirurgiche invasive coinvolte nei rilievi della retina e del polmone.
Vascolarizzazione del sangueHin un organo spesso si intreccia tra i componenti del tessuto per massimizzare la copertura vascolare in modo che possa essere ottimizzata la fornitura di ossigeno e trasferimento di materiale sangue. Per questo motivo, la sezione tradizionale del tessuto intercetta frequentemente la struttura tubolare dei suoi vasi. L'analisi sulle proprietà vascolari è meglio eseguita quando le navi possono essere conservate e rimangono intatte. La preparazione su tutto il supporto di un tessuto può in gran parte preservare l'intera struttura dell'architettura vascolare. Questo metodo consente non solo l'osservazione della distribuzione spaziale autentica del vaso sanguigno all'interno di un organo, ma anche la relazione con altri componenti tissutali.
L'omeostasi di un tessuto contenente cellule staminali è sostenuta bilanciando la generazione e la perdita di massa cellulare. Le cellule staminali all'interno dell'organo specifico abitativo sono spesso protette e in stretto contatto con l'ambiente circostante circostante, chiamato nicchia di cellule staminali. Di conseguenza, stuI mutamenti che analizzano il tessuto adulto di cellule staminali dovrebbero essere preferibilmente eseguiti in un contesto fisiologico intatto. I dosaggi di trapianto potrebbero fornire un mezzo per valutare il potenziale cellulare, mentre la tecnica di tracciamento delle linee consente l'esplorazione del vero destino cellulare all'interno dell'habitat nativo. Negli ultimi anni, il tracciamento di lineage in vivo è diventato una tecnica potente per la valutazione sperimentale delle proprietà di stemma. Questa strategia è stata utilizzata per identificare le cellule staminali del tessuto residuo e la loro prole in tessuti multipli, tra cui l'intestino 10 , 14 , i follicoli piliferi 15 , lo stomaco 16 e il pancreas 17 . Il metodo di tracciamento delle linee dipende in larga misura dalla marcatura genetica delle cellule staminali e viene avviato in popolazioni definite. Pertanto, è difficile escludere la possibilità che lo stemma reale si trovi in una sottopopolazione ancora minore all'interno delle celle etichettate. È quindi indispensabile mappare con precisione l'origine cellulare dei cloni tracciati e misurare quantitativamente le efficienze di tracciamento nel tempo. In questo modo, la capacità di auto-rinnovo della popolazione etichettata può essere bloccata.
Il test di angiogenesi descritto può essere modificato per scopi specifici di studio: può essere utilizzato non solo per testare la capacità di generazione delle nazioni di popolazioni endoteliali di interesse, ma anche per valutare l'effetto dei fattori angiogenici sul rimodellamento localizzato delle nave. Tuttavia, dal momento che la ghiandola mammaria subisce cambiamenti morfologici dinamici durante le diverse fasi di sviluppo ( ad es., Pubertà, cicli di estrusione e gravidanza) si deve tener conto dell'effetto dei cambiamenti sistemici, come la fluttuazione del livello ormonale, durante l'interpretazione dei risultati. I passi critici in questo dosaggio comprendono l'isolamento primario delle cellule endoteliali. Per ottimizzare le cellule vitali per il trapianto, le procedure per l'isolamento FACS dovrebbero bE eseguito delicatamente. Occorre prestare attenzione per evitare una manipolazione dura durante le preparazioni cellulari, come l'allentamento e la sospensione del pellet. Un altro passo critico è l'iniezione della miscela cellulare nella patata grassa. Durante l'iniezione del grasso, è importante assicurarsi che la miscela cellulare sia esattamente depositata all'interno del grasso. Questo può essere difficile se l'inserimento dell'ago è troppo profondo / superficiale o se il volume complessivo supera il dosaggio consigliato.
Questo protocollo fornisce una serie di metodi sperimentali che hanno aiutato nell'identificazione di una popolazione endemica cellulare. Attraverso queste tecniche è stato possibile valutare le proprietà delle cellule staminali attraverso il trapianto, nonché per monitorare e osservare il loro comportamento in processi fisiologici in vivo . Questi approcci sono strumenti efficaci che possono essere applicati a più discipline, tra cui studi sulle popolazioni endoteliali in ambienti tumorali e sulle alterazioni della loro potenza cellulare. ioIn particolare, il trapianto di grasso e la preparazione a monte sono metodi riproducibili e potenti che possono aiutare nei futuri sforzi per indagare aspetti diversi della biologia vascolare.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation della Cina (31530045 e 31371500 a YAZ, 31401245 a QCY), dal Ministero della Scienza e della Tecnologia della Cina (2014CB964800), dall'Accademia Cinese delle Scienze (XDB19000000 a YAZ) e dai cinesi Società di Biologia cellulare (Early Career Fellowship to QCY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-Ethylene Diamine Tetraacetic Acid(EDTA) (1x) | Gibco (Life Technologies) | 25300-062 | 0.05% Trypsin |
| 0.22 µm Filter Unit | Merck Millipore Ltd. | SLGP033RB | 0.22 µm Filter |
| 2-Methylbutanol-2, ReagentPlus | Sigma-Aldrich | 24, 048-6 | Tert Amyl Alcohol |
| 222, Tribromethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25g | 222, Tribromethanol |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) | Invitrogen | D1306 | DAPI |
| 70 µm Cell Strainer | BD FAL | 352350 | 70 µm Cell Strainer |
| Adhesion Microscope Slides | CITOGLAS | 188105 | Glass slides |
| Anti-mouse CD105 APC | eBioscience | 17-1051-82, clone MJ7/18 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| Anti-mouse CD201 Biotin | eBioscience | 13-2012-82 | for FACS analusis use at 2.5 µg/mL |
| Anti-mouse CD31 PE-Cyanine 7 | eBioscience | 25-0311-82, clone 390 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| BD FACSJazz Cell Sorter | BD Biosciences | 655489 | FACS |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 100190332 | BSA |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Centrifuge |
| Collagenase type 3 | Worthington-Biochem | #LS004183 | Collagenase III |
| Confocal microscopy | Leica | sp8 | Confocal |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D2463-5VL | Dnase I |
| Donkey anti-Rat Cy3 | Jackson ImmunResearch | 712-165-150 | Secondary antibody, use at 0.5 µg/mL |
| Dumont Forceps | WPI | 500342 | Froceps |
| Dumont Forceps - Micro-Blunted Tips | FST | 11253-20 | Forceps |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | FBS |
| FITC Ms CD3/Gr1/CD11b/CD45R(B220)/Ter-119 | BioLegend | 78022 | Blood lineage cocktail for FACS analysis, use at 25 µL per test |
| Glycerol | Sigma | G6279 | Glycerol |
| Iscov's Modified Dulbecco's Medium | Gibco (Life Technologies) | 12440-053 | IMDM |
| Isolectin GS-IB4 from Griffonia Simplicifolia, Alexa Fluora 647 | Invitrogen | Z32450 | Isolectin-647 |
| Matrigel Matrix (growth factor reduced) | BD | 356231 | Matrigel |
| Mouse strain (Actin-GFP) | Jax Laboratories | 3773 | Actin-GFP |
| Mouse strain (C57BL/6) | SLAC | C57BL/6 | C57BL/6 |
| Mouse strain (BALB/c nude) | SLAC | BALB/c nude | Nude mice |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | PFA |
| Penicilin Streptomycin | Gibco (Life Technologies) | 5140-122 | Pen/Strep |
| Phosphate Buffered Saline (pH7.2) 1x | Gibco (Life Technologies) | c20012500BT | PBS |
| PRIM1640 | Gibco (Life Technologies) | c11875500CP | PRIM1640 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | Mounting Medium |
| Rat anti CD144 | BD Biosciences | 550548 | for whole-mount analysis, anti-VE-Cadherin / Cdh5 antibdy for endothelial tight junction, use at 2.5 µg/mL |
| Rat anti CD31-biotin | BD Biosciences | 553371 | for whole-mount analusis, anti-CD31/PECAM1 antibody for endothelial surface adhesion molecule, use at 10 µg/mL |
| Red Cell Lysis Buffer | Sigma | R7767-100ML | Red blood cell lysing buffer |
| Straight/Sharp-Blunt/10cm | FST | 14028-10 | Fine Scissors |
| Streptavidin eFluor 450 | eBioscience | 48-4317-82 | for FACS analysis use at 0.5 µg/mL |
| Tamoxifen | Sigma | 101551374 | TAM |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | TritonX |
| Wax Coated Braided Silk (Size 5-0 USP (1 Metric), 18 inches (45 cm) BLACK on C-1 Needle) | COVIDIEN | S1173 | Suture |
| Sterile Disposable Scaplels | Swann Morton | #10 | Scalpel |
| Betadine | Yifeng Medical | 20160101 | Antiseptic solution |
References
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