Summary
Ce travail démontre une approche novatrice pour évaluer la prolifération, la différenciation et le potentiel de formation des vaisseaux des cellules souches endothéliales vasculaires (VESC) par une transplantation de graisse mammaire, suivie d'une préparation tissulaire complète pour l'observation microscopique. Une stratégie de traçage de lignage pour étudier le comportement des VESC in vivo est également présentée.
Abstract
Les cellules endothéliales (CE) sont les éléments fondamentaux de l'architecture vasculaire et mesurent la croissance vasculaire et le remodelage pour assurer un développement adéquat des vaisseaux et une homéostasie. Cependant, les études sur la hiérarchie des lignées endothéliales restent difficiles à respecter en raison de l'absence d'outils pour accéder à leurs connaissances et d'évaluer directement leur comportement in vivo . Pour remédier à cette lacune, un nouveau modèle de tissu pour étudier l'angiogenèse à l'aide du tampon gras mammaire a été développé. La glande mammaire se développe principalement dans les étapes postnatales, y compris la puberté et la grossesse, au cours desquelles une prolifération robuste de l'épithélium s'accompagne d'un remodelage vasculaire étendu. Les tampons à graisse mammaire fournissent des stimuli spatiaux, matriciels et riches en angiogénie de l'épithélium mammaire en croissance. En outre, les tampons à graisse mammaire sont situés à l'extérieur de la cavité péritonéale, ce qui en fait un site de greffage facilement accessible pour évaluer le potentiel angiogénique des cellules exogènes. Ce travail décrit également une efficacitéNt approche de traçage en utilisant des souris rapporteurs fluorescentes pour étiqueter spécifiquement la population ciblée de cellules souches endothéliales vasculaires (VESC) in vivo . Cette méthode de traçage de lignage, associée à un microscopie de tissu entier, permet la visualisation directe des cellules ciblées et de leurs descendants, grâce auxquelles la capacité de prolifération peut être quantifiée et l'engagement de différenciation peut être cartographié. En utilisant ces méthodes, une population de récepteurs de protéine Bipotent (Procr) exprimant des VESC a récemment été identifiée dans de multiples systèmes vasculaires. Procr + VESC, donnant naissance à la fois de nouvelles EC et des pericytes, contribuent activement à l'angiogenèse au cours du développement, de l'homéostasie et de la réparation des blessures. Dans l'ensemble, ce manuscrit décrit une nouvelle transplantation de graisse mammaire et des techniques de traçage de lignage in vivo qui peuvent être utilisées pour évaluer les propriétés des cellules souches des VESC.
Introduction
Au cours du développement et de l'homéostasie, la croissance vasculaire et le remodelage se déroulent fidèlement en fonction de la croissance et de la réparation des organes. L'angiogenèse décrit la génération de nouveaux vaisseaux à partir de vaisseaux sanguins préexistants et est considérée comme une force majeure en médiation de ces changements vasculaires dynamiques. Chaque vaisseau sanguin est doublé à l'intérieur d'une couche de cellules endothéliales (EC), et ils semblent être le fondement de l'architecture des navires. Pendant longtemps, le mécanisme par lequel le pool de la CE est reconstitué pendant l'homéostasie est resté incertain et des arguments ont été soulevés sur le fait que le renouvellement vasculaire est le résultat d'une prolifération mature de la CE ou est la contribution des activités vasculaires des cellules souches / progénitrices. En raison de l'absence de données physiologiques directes, l'existence et l'identité cellulaire des cellules souches endothéliales vasculaires (VESC) sont également restés controversés.
L'une des approches les plus communes utilisées pour vérifier le comportement des cellules souches est à travers le transplanTation de cellules souches putatives dans des souris destinataires. Cette méthode mesure le potentiel de la tige des cellules souches candidates in vivo. La transplantation a d'abord été appliquée à l'étude des cellules souches de la moelle osseuse 1 , ce qui a contribué à l'établissement des caractéristiques hiérarchiques du système hématopoïétique 2 . Dans le champ endothélial, un bouchon de matrice de membrane basique ( p. Ex ., Matrigel) inséré sous la peau sous le flanc a été un test standard d' angiogenèse in vivo utilisé pour traiter les capacités de formation des vaisseaux des CE transplantés. Plusieurs méthodes expérimentales, y compris la formation de colonies dans les systèmes de culture 3D et la transplantation, ont suggéré des populations potentielles de progéniteurs / VESC de la CE 3 , 4 , 5 , 6 . Cependant, comme les EC incorporés dans la matrice de la membrane du sous-sol sont relativement séparés deLe tissu environnant, cela ne fournit pas l'environnement de niche optimal requis pour explorer pleinement le potentiel angiogénique des cellules transplantées. En conséquence, les vaisseaux formés à l'intérieur du bouchon de matrice sont principalement de type capillaire et sont fonctionnellement non mesurables.
La glande mammaire se développe par voie postnatale, la croissance la plus forte se produisant pendant la puberté et la grossesse. Au stade pubertaire, l'épithélium mammaire subit une expansion rapide, pour occuper l'ensemble des graisses mammaires, accompagné d'un remodelage efficace des structures vasculaires environnantes. Ainsi, la glande mammaire offre un excellent modèle pour l'étude de l'angiogenèse. Il fournit de l'espace, de la matrice et des stimuli angiogéniques riches à partir de l'épithélium mammaire grandissant et constitue donc un site de greffage idéal pour évaluer le potentiel angiogénique des cellules exogènes. En outre, le tampon gras mammaire permet aux vaisseaux exogènes formés de s'intégrer au système de circulation de l'hôte, ce qui permet d'ajouter fÉvaluation décentralisée et représentant un avantage sur la transplantation sous-cutanée.
Bien que les essais de culture et de transplantation in vitro soient un moyen efficace d'étudier les propriétés de régénération d'une population cellulaire, on sait que de tels tests peuvent stimuler la plasticité lorsque les cellules sont retirées de leurs habitats indigènes et que des changements peuvent être induits lorsque les cellules sont déconnectées de Leur environnement physiologique 7 . Par conséquent, l'obtention de preuves directes in vivo du devenir cellulaire est l'approche clé pour faire avancer la compréhension actuelle du comportement des populations endothéliales.
La cartographie du devenir génétique ( c.-à-d., Le traçage des lignées in vivo ) est impératif pour l'identification des VESC et pour l'étude de leurs propriétés dans le système du corps, car il peut révéler le comportement des cellules souches in vivo dans son contexte physiologique et la tige réelle peut être Évalué. Traits de lignageNg fournit une preuve directe de la persistance à long terme ( c. -à- d. L' auto-renouvellement) des VESC candidats et leur capacité à produire des types de cellules pour le tissu d'origine ( c'est-à-dire la puissance de différenciation).
Ce protocole décrit une nouvelle technique de transplantation de graisse mammaire et une méthode de traçage de lignée pour observer la capacité de génération de vaisseau des VESC. Ces techniques suppriment les faiblesses des tests actuellement disponibles et fournissent une nouvelle façon d'évaluer de manière optimale les propriétés des cellules souches des VESC. Ces approches sont des outils efficaces qui peuvent être utilisés pour évaluer le comportement et les propriétés de formation des vaisseaux des populations endothéliales, ainsi que pour déterminer l'altération de la puissance des cellules vasculaires dans un environnement pathologique.
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Protocol
Les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité de soins et d'utilisation des animaux de l'Institut de biochimie et de biologie cellulaire de Shanghai, l'Académie chinoise des sciences, selon le protocole approuvé SIBCB-NAF-15-002-S335-003.
1. Isolation des VESC de la glandes mammaires de la souris
- Récolte de mammifères mammaires et digestion des tissus.
- Utilisez 8 souris moines vierges matures d' Actin-GFP d' une semaine, avec des poids compris entre 20 et 25 g, en tant que donneurs de tissus.
Remarque: Les cellules provenant du donneur peuvent être facilement suivies par l'expression GFP. - Préparer un milieu de base de digestion des tissus constitué de 5% de sérum bovin fœtal (FBS), 1% de stylo / streptococèses et 25 mM d'HEPES dans RPMI1640. Filtrer le mélange à travers un filtre de 0,22 μm pour stériliser et préchauffer à 37 ° C dans un bain d'eau.
- Sacrifiez les souris dans une chambre à CO 2 . Dissectionnez la quatrième paire de glandes mammaires inguinales en faisant d'abord une peau verticale iNcision à la ligne médiane inférieure de l'abdomen à l'aide d'un scalpel (ou ciseaux chirurgicaux). Épluchez doucement la peau d'un côté pour exposer la glande mammaire inguinale à l'aide d'une pince. Obtenir les quatre glandes mammaires inguinales des deux côtés et les couper en morceaux fins dans une boîte de Petri de 6 cm à l'aide de ciseaux.
- Mesurer le poids total du tissu émincé et le placer dans un tube de 50 mL.
Remarque: Assurez-vous que le morceau de tissu résultant est inférieur à 1 mm 3 de taille pour chaque pièce. Un rendement typique est d'environ 5 000 VESC par animal.
- Mesurer le poids total du tissu émincé et le placer dans un tube de 50 mL.
- Préparer le milieu de base de la digestion dans un tube de centrifugation coiffée de 50 ml au volume de 10 mL par 1 g de moelleux de tissu. Ajouter la collagénase de type 3 à la concentration de 300 unités par 10 ml de milieu de base de digestion pour constituer le tampon de digestion. Mélanger uniformément et l'ajouter au mouchoir.
- Placer horizontalement le tube de centrifugation de 50 ml sur une plate-forme basculante et régler la vitesse à 100 tr / min et la température à 37 ° C. AgiterLe tissu mammaire pendant 2 h. Vérifiez et secouez manuellement le tube toutes les 20 minutes pour assurer une bonne digestion.
Note: Le but de la digestion des tissus avant FACS est de préparer une solution monocellulaire à partir de tissus solides. Par conséquent, à la fin de la digestion, le contenu doit être une solution épaisse sans morceaux de tissus visibles.
- Utilisez 8 souris moines vierges matures d' Actin-GFP d' une semaine, avec des poids compris entre 20 et 25 g, en tant que donneurs de tissus.
- Préparation de solution monocellulaire.
- Après la digestion, compléter le tube de centrifugation de 50 ml avec du PBS pré-réchauffé et stérile et inverser le tube pour le mélanger uniformément. Centrifuger le tube à 200 xg pendant 5 minutes pour obtenir une pastille cellulaire.
- Retirer le surnageant et faire basculer le fond du tube pour desserrer la pastille cellulaire. Ajouter 3 ml de tampon de lyses de globules rouges (voir la Table des matières) et incuber dans un capuchon de culture tissulaire à température ambiante (RT) pendant 5 minutes pour éliminer les globules rouges.
- Ajouter 10 ml de PBS stérile et inverser le tube pour le mélanger uniformément. Centrifuger le contenu tissulaire à 200 xg pendant 5 min et le disqueLe surnageant. Ajouter 3 ml de trypsine préchauffée à 0,05% et stocker le tube à 37 ° C pendant 5 min pour digérer davantage le tissu restant.
- Ajouter 3 mL de IMDM préchauffé puis ajouter 100 μL de solution de DNase I (0,25 mg de DNase I diluée dans 1 ml de PBS). Rangez le tube à 37 ° C pour séparer les filaments d'ADN. Passer le mélange de tissus à travers une crépine cellulaire de 70 μm pour obtenir la solution cellulaire. Rincer le filtre deux fois avec 2 ml de PBS + 5% de FBS pour neutraliser la digestion enzymatique.
- Centrifuger le mélange cellulaire à 200 xg pendant 5 minutes pour granuler les cellules. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de PBS + 5% de FBS pour colorer les anticorps.
- Isolation Procr + VESC basée sur FACS.
- Soumettre le mélange cellulaire obtenu à partir du tissu mammaire donneur à la coloration d'anticorps suivant les protocoles de routine publiés 8 .
Note: Les anticorps suivants ont été utilisés: anti-sourisLignée de sang-FITC, CD31 anti-souris (PECAM1) -PECY7, anti-souris CD105-APC (tous utilisés à une concentration de 1 μg / mL), anti-souris CD201 (Procr) -biotine (utilisée à une concentration de 2,5 Μg / mL) et la streptavidine-v450 (utilisée à une concentration de 0,5 μg / mL).- Après la coloration des anticorps, compléter les cellules avec PBS + 5% de FBS, puis centrifuger à 200 g pendant 5 min. Jeter le surnageant et resuspendre les cellules avec 1 ml de PBS + 5% de FBS. Filtrer par une passoire de cellule de 40 μm. Placez-le sur glace jusqu'à ce que le tri FACS.
- Procédez pour effectuer un triage basé sur FACS pour isoler Procr + VESCs.
- Analyser l'échantillon non coloré et chaque contrôle de couleur unique pour déterminer la tension pour chaque couleur. Calculez les paramètres de compensation pour éviter l'auto-fluorescence ou la coloration d'arrière-plan. Configurez le modèle pour le gating et le tri approprié pour les populations de cellules souhaitées.
- Pour établir la hiérarchie du triage FACS, d'abord éliminer les débris deTous les événements, puis jeter les doublets ou les cloches de cellules adhésives en déclenchant avec une largeur. Déposer des cellules de lignée de sang, puis utiliser CD31 + et CD105 + pour définir les populations endothéliales.
Note: Les cellules Procr + ont été isolées de CD31 + CD105 + EC par rapport à un contrôle FMO. Un graphique représentatif de l'analyse FACS est représenté à la figure 1 . Une population VESC isolée FACS devrait être suspendue dans IMDM + 50% FBS et stockée sur de la glace jusqu'à un traitement ultérieur.
- Soumettre le mélange cellulaire obtenu à partir du tissu mammaire donneur à la coloration d'anticorps suivant les protocoles de routine publiés 8 .
2. In Vivo VESC Ensemble de formation de navire en utilisant le tampon de graisse mammaire
- Préparer les EC primaires pour la transplantation.
- Remplir les cellules triées FACS avec 10 mL de PBS + 5% de FBS, puis centrifuger à 200 xg pendant 5 minutes pour régler les cellules vers le bas.
- Aspirer soigneusement le liquide, compter le numéro de cellule à l'aide d'un hémocytomètre et ré-endiguer le culot cellulaire avec un mélange de matrice de membrane basique (consiUne piqûre de 50% de matrice de membrane de sous-sol et de PBS avec 20% de FBS, complétée avec 100 ng / mL de rmVEGF et 60 U / mL d'héparine) pour atteindre une concentration de 15 000 cellules / 15 μL.
Remarque: Le mélange matriciel de la membrane basale doit toujours être conservé sur de la glace. - Diluer en série les cellules triées et comptées pour atteindre les concentrations d'entrée requises dans un microtube de 1,5 mL, en veillant à ce que les volumes d'injection finaux ne dépassent pas 15 μL au total. Ajoutez 0,1% de bleu trypan à chaque tube pour une meilleure visualisation du contenu pendant la transplantation. Pipeter soigneusement pour mélanger. Rangez les tubes sur glace jusqu'à leur utilisation.
Note: Une génération réussie des navires pourrait être réalisée avec un minimum de 100 VESC.
- Transplanter les EC primaires sur la graisse mammaire.
- Désinfectez les instruments chirurgicaux et la tablette. Si vous utilisez les mêmes instruments sur plusieurs animaux, un stérilisateur à perles peut être utilisé pour la désinfection.
- Anesthésier 3-week-old BALB / c nude microE en utilisant le protocole anesthésique recommandé par le vétérinaire de votre établissement et l'IACUC. Placez chaque souris en position couchée, avec son dos sur la table d'opération. Immobiliser ses membres en utilisant du ruban adhésif.
- Trempez un coton-tige en solution antiseptique à base d'iode. Essuyez complètement toute la zone de l'abdomen de la souris pour stériliser la surface de la peau avant la chirurgie.
- Tenez et soulevez la peau de l'abdomen de la souris avec une pince. Utilisez un scalpel chirurgical pour faire une petite incision verticale de 1 cm. Faites deux coupes d'environ 0,5 à 1 cm de longueur, chacune vers la patte arrière, pour obtenir une incision à l'envers et en forme de Y.
- Utilisez une pince et un coton-tige pour séparer doucement la peau de l'abdomen et épinglez la peau de coté pour exposer les glandes mammaires inguinales. Placez la souris sous un stéréoscope et réglez le grossissement sur 2.0X. Assurez-vous d'ajuster la mise au point de sorte que le tampon gras mammaire puisse être clairement vu et utilisé.
- Placez un besoin de 27G 1/2 "E sur la glace pour pré-refroidir. Préparez une seringue de 1 mL avec un mélange de matrice de membrane basique à l'avance pour éliminer les éventuelles bulles d'air piégées dans la région de fixation de l'aiguille. Pipetter 15 μL de solution mélangée sur le capuchon du tube à microcentrifugeuse, puis aspirer le volume entier dans la seringue amorcée.
- Tenez le coussinet gras mammaire devant le ganglion inguinal, utilisez une pince fine et soulevez-le légèrement pour une injection facile. Insérer délicatement environ 1/4 de l'aiguille de la seringue dans le tampon gras.
- Relâchez la pince à épiler de la façade pour la serrer et stabilisez l'aiguille de la seringue. Injecter la solution lentement pour éviter une fuite de liquide. Tenez pendant quelques secondes pour vous assurer que le mélange cellulaire est solidifié pour minimiser les fuites lors de l'extraction de l'aiguille.
- Fermez le volet de la peau avec des sutures absorbables. Suture le volet de la peau en utilisant une suture de monofilament non réactive de taille 5-0 et fermez les plaies avec des noeuds de style chirurgien, chaque noeud approximatifÀ 0,3 cm d'intervalle. Sinon, fermez la peau avec des agrafes enroulées.
- Placez les souris activées dans une cage séparée pour récupérer. Placez une lampe de chauffage sur la cage pour éviter que les souris anesthésiées ne souffrent d'hypothermie. Placez du papier doux et du coton au fond de la cage pour garder les souris chaudes après la chirurgie.
- Respectez attentivement les souris jusqu'à ce que tous les récipients soient complètement éveillés. Pour les prochains jours, appliquer des analgésiques post-chirurgicaux de manière préventive à tous les animaux ou selon les directives du vétérinaire de l'établissement. Appliquer des antibiotiques selon le protocole animal approuvé si une infection de la plaie survient. Si la plaie chirurgicale a été fermée avec des agrafes enroulées, retirer les attaches de la plaie 10 jours après la chirurgie, lorsque la plaie a complètement fermé.
3. Préparation des tissus à montage intégral pour l'observation microscopique
- Récolte de tissus
- Après 2 à 4 semaines après l'implantation, anesthésier le récepteur BALB / cDes souris nues avec une injection intrapéritonéale d'agent anesthésiant de 2,5% à une dose de 0,12 ml par 20 g de poids corporel, comme à l'étape 2.2.2.
Note: La croissance positive des vaisseaux peut être détectée 2 à 4 semaines après la transplantation cellulaire. - Étiquetez la circulation systémique du destinataire avec une injection de la queue-veine du colorant isolectin-647 à une dose de 50 μg / 25 g de poids corporel, remis en suspension dans 50 μL de PBS stérile. Permettre une période de repos de 5 à 10 min. Sacrifiez les souris en utilisant du CO 2 .
- Dissectionner la zone du tissu mammaire où les cellules ont été injectées initialement après l'étape 2.2.4; Utiliser des ciseaux chirurgicaux. À l'aide d'une lame chirurgicale, coupez le tissu dans environ 3 à 3 mm 3 cubes dans une boîte de Petri de 6 cm.
- Après 2 à 4 semaines après l'implantation, anesthésier le récepteur BALB / cDes souris nues avec une injection intrapéritonéale d'agent anesthésiant de 2,5% à une dose de 0,12 ml par 20 g de poids corporel, comme à l'étape 2.2.2.
- La digestion des tissus et la préparation pour la coloration des anticorps.
- Découper les morceaux de tissu dans un tube de centrifugation de 15 ml rempli de 10 ml de milieu de base de digestion préalablement réchauffé (étape 1.1.2) complété par une collagénase III(300 U par 10 ml).
- Placer le tube de centrifugation de 15 mL horizontalement sur une plate-forme basculante avec une vitesse réglée à 100 tr / min et la température réglée à 37 ° C pendant environ 1 heure pour desserrer la structure tissulaire et éliminer les tissus adipocytaires excessifs.
Note: Les adipocytes ont tendance à produire une auto fluorescence qui pourrait entraîner un fond fluorescent bruyant. À la fin de la digestion, les morceaux de tissu doivent avoir une apparence douce et trouble. La période de digestion optimale dépend de la taille des morceaux de morceaux hachés et devrait donc être ajustée en conséquence pour obtenir les meilleurs résultats. Étant donné que la vascularisation du tissu a déjà été marquée avec de l'isolectine marquée par fluorescence, toutes les procédures suivantes doivent être effectuées contre la lumière. - Laver les morceaux de tissu avec du PBS à la température ambiante pendant 10 minutes. Fixez le tissu total en plaçant soigneusement les pièces dans une boîte de Petri de 6 cm à moitié remplie avec 4% de PFA (pH 7,2 à 7,4) pour préserver la fluorescence. Placer la boîte de PetriSur une plate-forme basculante et agiter doucement le tissu pendant 30 min à la température ambiante.
Note: Le PFA est cancérogène et doit être manipulé avec précaution. - Retirez le PFA restant et lavez le tissu fixe trois fois avec un tampon de lavage complet (0,1% d'interpolation dans PBS), avec un intervalle de 10 minutes entre chaque lavage.
- Coloration intégrée des anticorps tissulaires.
- Diluer l'anticorps primaire dans un tampon de coloration d'anticorps dans un tube de centrifugation de 2 mL. Incuber le tissu avec un anticorps primaire pendant une nuit à 4 ° C.
Note: On utilise comme anticorps primaires le rat anti-CD31 (concentration: 10 μg / mL) ou la protéine anti-VE-Cadherine (CD144 / Cdh5: 2,5 μg / mL). Les CD31 et les VE-Cadherin sont des marqueurs de surface cellulaire utilisés pour reconnaître l'endothélium. Un tampon de coloration 5x anticorps est préparé avec de l'acide maléique 500 mM, pH 7,5; NaCl 750 mM; Et 0,5% (v / v) d'interpolation dissous dans PBS. Ajouter uniquement un volume sérique approprié (5%) lors de la préparation d'une nouvelle solution de travail 1x9 . - Retirez le tampon de coloration d'anticorps et lavez le tissu de montage complet trois fois avec un tampon de lavage, avec un intervalle de 10 minutes. Incuber le tissu avec un anticorps secondaire (voir la Table des matières ) plus DAPI à la RT pendant 4 h sur une plate-forme basculante ou pendant une nuit à 4 ° C.
Note: utiliser DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phénylindole) à une concentration finale de 5 μg / mL pour visualiser les noyaux. - Laver le tissu total avec un tampon de lavage 3 fois pendant 10 minutes chacun. Incuber les morceaux de tissu dans 80% de glycerol ou 80% de saccharose pendant une nuit pour déshydrater le tissu pour une meilleure conservation.
- Placez les morceaux de tissu individuels sur une glissière en verre et retirez le tampon de déshydratation excessif. Couvrir le tissu avec un support de support, poser une lamelle et serrer doucement le tissu pour le régler.
- Effectuer une acquisition d'image microscopique confocal. Pour les glandes mammaires intégrales, acquérir des images à l'aide d'un objectif 40X avec NA = 1.3 oil objectiVe. Acquérir les balayages des tuiles Z à une résolution de section optique de 1 024 x 1 024 et une séparation des couches de 1,0 à 1,2 μm.
Remarque: Pour capturer le signal lumineux de fluorescence correct, le diviseur de faisceau de filtre doit être réglé sur triple dichroïque (TD) 488/553/638, avec le réglage de gain au PMT Gain 600-800. Les sources d'excitation / émission suivantes doivent être utilisées: mGFP, avec maxima d'excitation / émission de 488/509 nm; MTomato avec maxima d'excitation / émission de 532/588 nm; Alexa-647, avec maxima d'excitation / émission de 594/665; Et DAPI, avec maxima d'excitation / émission de 350/470.
- Diluer l'anticorps primaire dans un tampon de coloration d'anticorps dans un tube de centrifugation de 2 mL. Incuber le tissu avec un anticorps primaire pendant une nuit à 4 ° C.
4. Traçage linéaire à l'aide d'un modèle de souris génétiquement modifié
- Détectez Procr + VESC à l'aide du modèle de la souris.
- Utilisez la souche de traction Traver Procr CreERT2-IRES-tdTomato / + (appelée Procr CreERT2 ).
Remarque: Dans ce modèle de souris, une cassette Creert2-IRES-tdTomato Procr 11 .- Les souris Cross Procr CreERT2 avec la souche rapportrice Rosa26 mTtomatomGFP (appelée R26 mTmG ) pour repérer le sort des Procr + EC in endogènes in vivo 11 . Identifiez toutes les Procr + EC endogènes étiquetées et leurs descendants en utilisant une expression GFP.
- Administrer la solution de tamoxifène 11 (10 mg de tamoxifène dissous dans 1 mL d'huile d'arachide + 10% d'éthanol pour constituer une solution mère de 10 mg / mL) par voie intrapéritonéale à une dose de 4 mg / 25 g de poids corporel pendant le stade pubertaire (5 semaines Ancien) pour suivre le sort du développement de Procr + ECs.
- Analyser l'efficacité de formation de clones des cellules marquées par l'immunocoloration totale après les étapes de préparation décrite à l'étape 3. Obtenir des tampons gras de mammifères à partir de souris traitées à la fois à court terme (2 jours) et des délais prolongés (jusqu'à 10 mois). Voir la figure 3 .
- Utilisez la souche de traction Traver Procr CreERT2-IRES-tdTomato / + (appelée Procr CreERT2 ).
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Representative Results
Isolation mammaire VESCs:
Pour isoler la population endothéliale pour le dosage de transplantation consécutif, des glandes mammaires vierges de souris (8 semaines) ont été récoltées en tant que matériau donneur. Les cellules endothéliales ont été isolées en utilisant une technique de tri cellulaire à base d'anticorps. Des graphiques représentatifs de l'analyse FACS de la population VESC dans les EC de glande mammaire C57BL / 6 de 8 semaines sont présentés à la figure 1 (figure adaptée de Yu et al., 8 , avec autorisation).
Transplantation de graisse mammaire:
Le tampon gras mammaire constitue un site idéal pour l'étude de l'angiogenèse. Après l'isolement basé sur FACS, les Procr + EC ont été mélangés avec 0,5% de matrice de membrane de base et 0,1% d'indicateur de bleu de trypan et ont ensuite été transplanésAu tampon gras des destinataires SCID de 3 semaines. Pendant la puberté, le tampon gras mammaire crée un environnement angiogénique, favorisant le remodelage de la vascularisation en alignement avec l'expansion de l'épithélium mammaire. En conséquence, Procr + ECs transplantés (GFP + ) incorporés dans les grands vaisseaux de l'hôte ( Figure 2B , flèches) et également formé des branches de vaisseaux GFP + secondaires et tertiaires ( Figure 2B , pointes de flèche). Bien que les Procr + EC transplantés puissent également générer des vaisseaux dans un test de matrice (inséré sous la peau du flanc), les vaisseaux formés apparaissent uniquement comme capillaires ( Figure 2A , figure adaptée de Yu et al., 8 , avec autorisation).
Fonctionnalité des navires formé par Procr + VESCs:
Pour déterminer si GFP + vLes essels dans les plaques de graisse mammaire font partie du système vasculaire fonctionnel circulatoire, l'isolectine a été administrée par injection intraveineuse avant la récolte. Les navires GFP + étaient isolectin +, ce qui indique que les vaisseaux formés sont lumineux et connectés à la vasculature de l'hôte ( Figure 2B , figure adaptée de Yu et al., 8 , avec autorisation).
Traitement des lignées VESC mammaire en utilisant Procr CreERT2 ; Rosa26 mTmG Mouse Modèle:
Procr CreERT2 ; Les souris Rosa26 mTmG ont été utilisées pour le traçage des Procra + VESC in vivo ( Figure 3A ). Pour étudier comment Procr + VESC contribuent à l'angiogenèse robuste et au remodelage vasculaire pendant le développement pubertaire de la glande mammaire, Procr CreERT2 ; Rosa26 mTmG était administréD avec du tamoxifène pour induire une expression de GFP dans la population endothéliale Procr +. Les comprimés de graisse mammaire du Procr CreERT2 traité au médicament ; Les souris Rosa26 mTmG ont été récoltées à court terme (2 jours après injection, Figure 3B ) et à long terme (jusqu'à 10 mois après l'injection, figure 3C- F, figure adaptée de Yu et al., 8 , avec autorisation). La préparation complète a été réalisée pour visualiser les résultats du traçage. L'identité de l'endothélium vasculaire peut être validée par coloration avec le marqueur de surface endothélial VE-Cadherine (Cdh5; Figure 3B , image de droite).
Figure 1: Analyse des VESC dans les glandes mammaires de la souris. Analyse FACS de l'expression de Procr dans les EC de glande mammaire C57BL / 6 de 8 semaines. 8 semaines vLes souris femelles C67BL / 6 vierges ont été utilisées pour la collecte des glandes mammaires. Une fois les échantillons cellulaires préparés, des échantillons non colorés et chaque contrôle à une seule couleur ont été analysés pour déterminer la tension pour chaque couleur. Les paramètres de compensation ont été calculés pour éviter l'auto-fluorescence ou la coloration d'arrière-plan. Un gabarit a été établi pour un passage correct et pour trier les populations de cellules souhaitées. Pour établir la hiérarchie du triage FACS, les débris de tous les événements ont été éliminés et les doublets ou les groupes de cellules adhésives ont été éliminés. Les cellules de lignage ont été exclues, et CD31 et CD105 ont été utilisés pour définir les populations endothéliales. Les cellules Procr + ont été isolées de CD31 + CD105 + EC par rapport au contrôle FMO. Ce chiffre a été modifié de Yu et al. 8 , avec permission. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: essai de transplantation de graisse mammaire mammaire VESC. ( A ) Un vaisseau formé à partir de Procr + EC dans une matrice de membrane de sous-sol insérée par voie sous-cutanée sous la peau du flanc. ( B ) Image confocale d'un tampon gras gras mammaire récepteur, ce qui indique l'intégration et la contribution des Procr + ECs transplantés (GFP +) pour administrer la vascularisation mammaire. Les EC ont été contrastées avec CD31. ( C ) L'injection intraveineuse chez des souris réciproques avec isolectine a montré que les excroissances formaient des vaisseaux lumineux. Barre à l'échelle, 50 μm. Les images ont été acquises en utilisant un objectif huile 40X NA 1.3. Les balayages de tuiles Z ont été acquis à une résolution de section optique de 1 024 x 1 024 et chaque couche était de 1,0 à 1,2 μm. Pour capturer le signal lumineux de fluorescence correct, le diviseur de faisceau de filtre a été réglé sur TD 488/553/638, avec le gAin au PMT Gain 600 - 800. Les sources d'excitation / émission suivantes ont été utilisées: mGFP, avec maxima d'excitation / émission de 488/509 nm; MTomato, avec maxima d'excitation / émission de 532/588 nm; Alexa-647, avec maxima d'excitation / émission de 594/665; Et DAPI, avec maxima d'excitation / émission de 350/470. Ce chiffre a été modifié de Yu et al. 8 , avec permission. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Traçage linéaire de Procr + ECs démontre leur contribution à l'expansion clonale de l'EC pendant le développement. ( A ) Illustration de la stratégie de traçage de lignée utilisant Procr CreERT2 ; Rosa26 mTmG line (panneau de gauche). ExpérimentalConfiguration utilisée à court terme (2 jours) et à long terme (7 jours à 10 mois), comme indiqué (panneau de droite). ( BF ) Imagerie confocale intégrale de la vascularisation mammaire après différentes longueurs de périodes de traçage, indiquant l'emplacement initial des Procr + EC marquées et leur contribution à la vascularisation mammaire à différents stades de traçage. Barre d'échelle = 50 μm. Ce chiffre a été modifié de Yu et al. 8 , avec permission. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Les analyses d'angiogenèse représentent une bonne approche expérimentale pour étudier la dynamique vasculaire. La vascularisation de la rétine de la souris, qui se développe par voie postnatale, s'est avérée être un modèle attrayant pour étudier l'angiogenèse 12 . Bien qu'il soit relativement accessible, la manipulation réelle dans le lit vasculaire de la rétine est plutôt difficile. Jusqu'à présent, la transplantation in vivo la mieux décrite a été le test du bouchon, qui renferme des cellules à l'intérieur d'une masse de matrice de membrane basique et implante / injecte chirurgicalement par voie sous-cutanée dans la région de flanc d'une souris destinataire. Ce test d'angiogenèse est efficace pour tester le potentiel de régénération et la capacité de formation de vasque des cellules incorporées. Cependant, étant donné que la localisation de la fiche matricielle implantée crée un environnement comparativement isolé pour les cellules internes, elle ne fournit pas une niche physiologique optimale. Récemment, un nouveau modèle d'angiogenèse pulmonaire a également été développé en appliquant un patch de fibrine sur la surfaCe site du poumon de souris 13 . Cependant, les manipulations représentent un autre risque, car cette technique fonctionne de manière invasive à l'intérieur de la cavité thoracique de la souris, ce qui rend difficile l'utilisation dans un réglage de dosage plus généralisé.
Dans le dosage de l'angiogenèse décrit ici, un petit volume de mélange cellulaire est transplanté à l'intérieur du tampon gras de la glande mammaire, ce qui fournit des stimuli spatiaux, matriciels et riches en angiogénie pendant la puberté. Cela permet aux vaisseaux générés de se conformer et de s'intégrer dans le remodelage de la vascularisation de l'hôte, permettant une évaluation fonctionnelle supplémentaire, tout en représentant un avantage sur l'analyse par bouchon sous-cutané. En outre, le tampon gras mammaire est situé en périphérie de la cavité péritonéale, ce qui en fait un site très accessible. L'opération sur le tampon de graisse mammaire introduit une détresse limitée pour l'animal récepteur, en évitant les interventions chirurgicales invasives impliquées dans les analyses rétiniennes et pulmonaires.
Sagesse du système sanguinUn organe s'intègre souvent entre les composants tissulaires pour maximiser la couverture vasculaire de sorte que la fourniture d'oxygène sanguin et de transfert de matière peut être optimisée. Pour cette raison, la coupe conventionnelle du tissu intercepte fréquemment la structure tubulaire de ses récipients. L'analyse des propriétés vasculaires se fait le mieux lorsque les vaisseaux peuvent être conservés et restent intacts. La préparation complète d'un tissu peut préserver en grande partie l'intégralité de l'architecture vasculaire à l'intérieur. Cette méthode permet non seulement l'observation de la répartition spatiale authentique du vaisseau sanguin au sein d'un organe, mais aussi la relation avec d'autres composants tissulaires.
L'homéostasie d'un tissu contenant des cellules souches est soutenue en équilibrant la génération et la perte de masse cellulaire. Les cellules souches dans l'organe habitant spécifique sont souvent protégées et en contact étroit avec l'environnement tissulaire environnant, appelé niche de cellules souches. Par conséquent, stuDécoulent d'analyser les tissus de cellules souches adultes devrait de préférence être effectuée dans un contexte physiologique intact. Les tests de transplantation pourraient fournir un moyen d'évaluer le potentiel cellulaire, tandis que la technique de traçage des lignées permet d'explorer le véritable sort des cellules dans l'habitat naturel. Au cours des dernières années, le traçage de lignage in vivo est devenu une technique puissante pour l'évaluation expérimentale des propriétés de la tige. Cette stratégie a été utilisée pour identifier les cellules souches des résidus tissulaires et leur progéniture dans de multiples tissus, y compris l'intestin 10 , 14 , les follicules pileux 15 , l'estomac 16 et le pancréas 17 . La méthode de traçage des lignées dépend en grande partie du marquage génétique des cellules souches et est initiée dans des populations définies. Par conséquent, il est difficile d'exclure la possibilité que la tige réelle soit trouvée dans une sous-population encore plus petite dans les cellules étiquetées. Il est donc impératif de cartographier la cellule de l'origine des clones tracés avec précision et de mesurer quantitativement l'efficacité du traçage dans le temps. De cette façon, la capacité d'auto-renouvellement de la population marquée peut être appréhendée.
Le dosage d'angiogenèse décrit peut être modifié à des fins d'étude spécifiques: il peut être utilisé non seulement pour tester la capacité de génération de vasque des populations endothéliales d'intérêt, mais aussi pour évaluer l'effet des facteurs angiogéniques sur le remodelage localisé des vaisseaux. Cependant, étant donné que la glande mammaire subit des changements morphologiques dynamiques au cours de différents stades de développement ( par exemple, la puberté, les cycles d'oestrus et la grossesse), il faut tenir compte de l'effet des changements systémiques, tels que la fluctuation du niveau hormonal, lors de l'interprétation des résultats. Les étapes critiques de ce dosage comprennent l'isolement primaire des cellules endothéliales. Pour obtenir de manière optimale des cellules viables pour la transplantation, les procédures d'isolement FACS devraient être bE a effectué doucement. Il faut prendre en charge pour éviter une manipulation sévère lors des préparations cellulaires, telles que le relâchement et la suspension des pastilles cellulaires. Une autre étape critique est l'injection de mélange de cellules dans la capsule de graisse. Au cours de l'injection de tampon gras, il est important de s'assurer que le mélange cellulaire est déposé précisément à l'intérieur du tampon gras. Cela peut être délicat si l'insertion de l'aiguille est trop profonde ou peu profonde ou si le volume global dépasse la dose recommandée.
Ce protocole fournit une série de méthodes expérimentales qui ont aidé à identifier une population de cellules souches endothéliales. Grâce à ces techniques, il était possible d'évaluer les propriétés des cellules souches par transplantation, ainsi que de suivre et d'observer leur comportement sous des processus physiologiques in vivo . Ces approches sont des outils efficaces qui peuvent être appliqués à de multiples disciplines, y compris des études sur les populations endothéliales dans des environnements de tumeurs et des altérations de leur pouvoir cellulaire. jeEn particulier, la greffe de graisse et la préparation complète sont des méthodes reproductibles et puissantes qui peuvent aider dans les efforts futurs pour étudier différents aspects de la biologie vasculaire.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (31530045 et 31371500 à YAZ, 31401245 à QCY), le Ministère de la Science et de la Technologie de Chine (2014CB964800), l'Académie chinoise des sciences (XDB19000000 à YAZ) et les Chinois Société de biologie cellulaire (Early Career Fellowship to QCY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-Ethylene Diamine Tetraacetic Acid(EDTA) (1x) | Gibco (Life Technologies) | 25300-062 | 0.05% Trypsin |
| 0.22 µm Filter Unit | Merck Millipore Ltd. | SLGP033RB | 0.22 µm Filter |
| 2-Methylbutanol-2, ReagentPlus | Sigma-Aldrich | 24, 048-6 | Tert Amyl Alcohol |
| 222, Tribromethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25g | 222, Tribromethanol |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) | Invitrogen | D1306 | DAPI |
| 70 µm Cell Strainer | BD FAL | 352350 | 70 µm Cell Strainer |
| Adhesion Microscope Slides | CITOGLAS | 188105 | Glass slides |
| Anti-mouse CD105 APC | eBioscience | 17-1051-82, clone MJ7/18 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| Anti-mouse CD201 Biotin | eBioscience | 13-2012-82 | for FACS analusis use at 2.5 µg/mL |
| Anti-mouse CD31 PE-Cyanine 7 | eBioscience | 25-0311-82, clone 390 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| BD FACSJazz Cell Sorter | BD Biosciences | 655489 | FACS |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 100190332 | BSA |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Centrifuge |
| Collagenase type 3 | Worthington-Biochem | #LS004183 | Collagenase III |
| Confocal microscopy | Leica | sp8 | Confocal |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D2463-5VL | Dnase I |
| Donkey anti-Rat Cy3 | Jackson ImmunResearch | 712-165-150 | Secondary antibody, use at 0.5 µg/mL |
| Dumont Forceps | WPI | 500342 | Froceps |
| Dumont Forceps - Micro-Blunted Tips | FST | 11253-20 | Forceps |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | FBS |
| FITC Ms CD3/Gr1/CD11b/CD45R(B220)/Ter-119 | BioLegend | 78022 | Blood lineage cocktail for FACS analysis, use at 25 µL per test |
| Glycerol | Sigma | G6279 | Glycerol |
| Iscov's Modified Dulbecco's Medium | Gibco (Life Technologies) | 12440-053 | IMDM |
| Isolectin GS-IB4 from Griffonia Simplicifolia, Alexa Fluora 647 | Invitrogen | Z32450 | Isolectin-647 |
| Matrigel Matrix (growth factor reduced) | BD | 356231 | Matrigel |
| Mouse strain (Actin-GFP) | Jax Laboratories | 3773 | Actin-GFP |
| Mouse strain (C57BL/6) | SLAC | C57BL/6 | C57BL/6 |
| Mouse strain (BALB/c nude) | SLAC | BALB/c nude | Nude mice |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | PFA |
| Penicilin Streptomycin | Gibco (Life Technologies) | 5140-122 | Pen/Strep |
| Phosphate Buffered Saline (pH7.2) 1x | Gibco (Life Technologies) | c20012500BT | PBS |
| PRIM1640 | Gibco (Life Technologies) | c11875500CP | PRIM1640 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | Mounting Medium |
| Rat anti CD144 | BD Biosciences | 550548 | for whole-mount analysis, anti-VE-Cadherin / Cdh5 antibdy for endothelial tight junction, use at 2.5 µg/mL |
| Rat anti CD31-biotin | BD Biosciences | 553371 | for whole-mount analusis, anti-CD31/PECAM1 antibody for endothelial surface adhesion molecule, use at 10 µg/mL |
| Red Cell Lysis Buffer | Sigma | R7767-100ML | Red blood cell lysing buffer |
| Straight/Sharp-Blunt/10cm | FST | 14028-10 | Fine Scissors |
| Streptavidin eFluor 450 | eBioscience | 48-4317-82 | for FACS analysis use at 0.5 µg/mL |
| Tamoxifen | Sigma | 101551374 | TAM |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | TritonX |
| Wax Coated Braided Silk (Size 5-0 USP (1 Metric), 18 inches (45 cm) BLACK on C-1 Needle) | COVIDIEN | S1173 | Suture |
| Sterile Disposable Scaplels | Swann Morton | #10 | Scalpel |
| Betadine | Yifeng Medical | 20160101 | Antiseptic solution |
References
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