Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד endosymbionts מ tabaci בימייה פרפר באמצעות נתיחה וסינון. לאחר הגברה, דגימות DNA מתאימים לרצף הבאים ולימוד של הדדיות בין endosymbionts ו whitefly.
Abstract
חיידקים בקטריאליים יוצרים קשר אינטימי עם המארחים שלהם ומעניקים יתרונות למארח ברוב המקרים. מידע גנומי הוא קריטי ללמוד את הפונקציות ואת האבולוציה של חיידקים חיידקים המארח שלהם. כמו רוב symbionts לא יכול להיות מתורבת במבחנה , שיטות לבודד כמות נאותה של חיידקים עבור רצף הגנום חשובים מאוד. ב bemisia bamisia tabaci , מספר endosymbionts זוהו ו צפויים להיות בעל חשיבות בפיתוח ורבייה של מזיקים דרך גישות רבות. עם זאת, המנגנון המסייע לאסוציאציות נותר בלתי מוכר במידה רבה. המכשול נובע באופן חלקי מהעובדה כי endosymbionts ב whitefly, בעיקר מאופק בבקטריוציטים, קשה להפריד בין התאים המארח. כאן אנו מדווחים על פרוטוקול צעד אחר צעד לזיהוי, מיצוי וטיהור של endosymbionts מ whitefly B. tabaci בעיקר על ידי dissectiב ו סינון. דגימות Endosymbiont שהוכנו על ידי שיטה זו, אם כי עדיין תערובת של מינים שונים endosymbiont, מתאימים רצף הגנום הבאים וניתוח של תפקידים אפשריים של endosymbionts ב Tabaci. שיטה זו עשויה לשמש גם לבידוד endosymbionts מ חרקים אחרים.
Introduction
חיידקים המרכיבים מערכת יחסים סימביוטית אינטימית עם המארחים היחסיים נפוצים אצל פרוקי רגליים. את endosymbionts הוכחו כדי להשפיע על היבטים של המארחים, כגון מטבוליזם תזונה, רבייה, תגובות ללחץ סביבתי 2 , 3 , 4 וכו ' , כמעט בכל שלב התפתחותי 5 . עם זאת, המנגנון העומד בבסיס הארגונים עדיין אינו ידוע. גנומיקה היא בעלת חשיבות עליונה כאשר לומדים את הפונקציות הפוטנציאליות ואת תפקידים של חיידקים. חלק מהמידע הבסיסי, כלומר המעמד הטקסונומי, הגנים הפונקציונליים, מסלולי חילוף החומרים, מערכות ההפרשה, ניתן להסיק מרצפי הגנום, אשר שופכים אורות על התפקידים הפוטנציאליים של סימביונטות בסימביוזה. עם התפתחות של רצף תפוקה גבוהה, מספר עצום של גנומים חיידקים כבר רצף wIth פונקציות מגוונות גילה 6 .
Endosymbionts הם בעלי חשיבות חיונית ב hemipterans, כגון כנימות 7 , פשפשים 8 , פסיילים 9 , Planthoppers חום 10 ו cicadas 11 . לדוגמה, בוכנרה ב כנימות, כמו סימביונט חובה, הוכח להיות מעורב חומצות אמינו חיוניות biosynthesis, יחד עם הגנים של הגנום aphid 12 . יתר על כן, תקנה תעתיק של Buchnera נחשף גם 13 . בפסילים, קרסונלה הוא רצף מדורגת הגנום החיידקי הקטן ביותר שנמצא אי פעם 14 . כל אלה סימני ההיכר של endosymbionts מבוססים ו להסיק את רצפי הגנום. בגלל אלה endosymbionts לא יכול להיות מתורבת במבחנה , מספר גישות הוחלו לבודד חיידקים נאותים עבור seqהעלאה. ב כנימות, endosymbionts מופקים באמצעות צנטריפוגה וסינון, ונתונה ניתוח גנומי נוסף transcriptomic 5 . ב planthoppers חום, endosymbionts הם רצף יחד עם גנום חרק כולו 10 .
Whitefly B. Tabaci הוא קומפלקס מינים המכיל יותר מ -35 מינים שאינם ניתנים לזיהוי מבחינה מורפולוגית (מינים סתומים), בהם שני מינים פולשניים פלשו לכל רחבי העולם וגרמו לפגיעה עצומה בייצור החקלאי. של הערה, endosymbionts בתוך מינים tabaci B. הראו חשיבות בפיתוח מזיקים 16 . עד כה, שמונה endosymbionts זוהו ב whitefly, כולל symbiont חובה, Candidatus Portiera alerodididum, ושבע סימביונטות משניות המילטונלה , Rickettsia , ארסנופונוס , קרדיניום , < Em> וולבכיה, פריטשה והמיפטריפילוס הגדירו 17 , 18 .
שלא כמו ההמיפטרנים שתוארו קודם לכן, הטפטף הלבן הוא חרק זעיר באורך של 1 מ"מ בלבד. רוב endosymbionts מוגבלים bacteriocytes 19 (תאים מיוחדים המכילים symbionts, אשר טופס נוסף bacteriome ב B. tabaci ). בנוסף, אלה endosymbionts לא יכול להיות מתורבת במבחנה . הדרך היחידה להשיג endosymbionts מ B. tabaci היא לנתח את bacteriome החוצה. עם זאת, יש קושי של דיסקציה. ראשית, החיידק השברירי תמיד מקשר עם רקמות אחרות של הפרפר, שקשה להפריד ביניהם. שנית, הגודל הזעיר של הפרפר מגביל את הבידוד של בקטריום מספיק. שלישית, endosymbionts מקבץ בבקטריום, מה שהופך אותו מסובך מאוד לרכוש מינים בודדים של חיידק.
התחת = "jove_content"> כאן, אנו מדווחים פרוטוקול פשוט וזול לבודד endosymbionts whitefly עבור רצף metagenome הבאים. באמצעות דיסקציה, טיהור והגברה, ניתן להשיג DNA מתאים ל- endosymbiont וניתן לאשר את מינים של חיידקים. פרוטוקול המתואר ניתן להשתמש באופן דומה אחרים פרוקי רגליים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Whitefly Rearing ומין מינים זיהוי
- שמירה על מינים לבן על כותנה Gossypium hirsutum (Malvaceae) (cv. Zian-mian 1973) בכלובים בתנאים סטנדרטיים של 27 ± 1 ° C, לחות 70 ± 10% ו 14 שעות אור: 10 שעות משטר כהה.
- איסוף לבן יחיד מבוגר ו homogenize ב 30 μL של חיץ תמוגה (10 מ"מ טריס, pH 8.4, 50 מ"מ KCl, 0.45% [wt / vol] Tween-20, 0.2% [wt / vol] ג 'לטין, 0.45% [vol / Vol] Nonidet P 40, 60 גרם / מ"ל Proteinase K).
- דגירה homogenate ב 65 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות ולאחר מכן 100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
הערה: זמן דגירה על 65 מעלות צלזיוס ניתן להגדיל אם יש צורך. זמן דגירה על 100 מעלות צלזיוס צריך להיות מבוקר בביקורתית מספיק להשבית Proteinase K ולהימנע נזק DNA. - בצע את התגובה שרשרת פולימראז (PCR) באמצעות DNA לבן (שנרכש בסעיף 1.3) על בסיס אוקטידאז ציטוכרום המיטוכונדריה אני primers.
COI-F: 5'-TTGATTTTTGGTCATCCAGAAGT-3 '
COI-R: 5'-TAATATGGAGATTAGTGCATTGGA-3 '- בצע את התגובות PCR בנפח סופי של 25 μL המכיל 1 U של פולימרז DNA Taq , 2.5 מאגר μL 10x, 0.2 מ"מ dNTP, 0.2 מ"מ של כל תחל ו 2 μL של DNA לבן.
- השתמש בתנאים הבאים הליך PCR: denaturation הראשונית 95 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ואחריו 35 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס במשך 45 שניות (denaturation), 50 מעלות צלזיוס במשך 45 שניות (חישול) ו 72 מעלות צלזיוס למשך 1 דקות (הרחבה) ו עוד 10 דקות ב 72 מעלות צלזיוס להארכה נוספת.
- נקה את המוצר מוגבר PCR באמצעות ערכת ג 'ל DNA החילוץ עם פרוטוקול מומלץ.
- רצף דגימות DNA מטוהרים עם דגימה דנ"א רצף המערכת בעקבות ההוראה של היצרן.
- לנתח את sequences באמצעות כלי בסיסי מקומי יישור כלי (BLAST) כדי לזהות את מינים סתומים של זבוב לבן ולמנוע זיהום של speci אחריםEs.
2. זיהוי Endosymbiont לוקליזציה
- לבצע PCR על DNA לבן (שנרכש בשלב 1.3) כדי להגביר את הגנים הספציפיים של endosymbiont כל בתוך whitefly (מתכון ה- PCR מתואר בסעיף 1.4, ו PCR נהלים פריימרים המפורטים בטבלה 1 ).
- נושא המדגם מוגבר על ג'ל אלקטרופורזה agarose על פי פרוטוקול שפורסם בעבר 20 (1% agarose ג'ל, Tris-אצטט-EDTA כמו חיץ פועל, מתח 5 V / cm) כדי לזהות את הגן הספציפי של כל חיידק.
- לשחזר ורצף כל הלהקה כדי לקבוע את מינים חיידקי בתוך whitefly (ראה סעיפים 1.5-1.7).
- בצע הקרינה באתר הכלאות (FISH) על whiteflies לזהות את המיקום של endosymbionts על פי פרוטוקול שפורסם בעבר 19 .
הערה: יש להגדיל את הריכוז של בדיקות פלורסנט במידת הצורך. 3. הילוכים אלקטרונים מיקרוסקופית (TEM) - לטבול לתקן whiteflies במאגר פוספט (0.1 M, pH 7.0) המכיל 2.5% [vol / vol] glutaraldehyde עבור 4 שעות.
- שטפו את דגימות במאגר פוספט (0.1 M, pH 7.0) שלוש פעמים, 15 דקות בכל פעם.
- לטבול ולתקן את דגימות שוב במאגר פוספט (0.1 M, pH 7.0) המכיל 1% [wt / vol] OsO 4 עבור 2 שעות.
- מייבשים את הדגימות על ידי סדרה מדורגת של אתנול (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% ו 100%), 15 דקות בכל פעם.
- העברה לטבול את דגימות לתוך אצטון 100% במשך 20 דקות.
- מניחים את הדגימות בתערובת של אצטון 100% ו 100% שרף spurr (1: 1) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר.
- מעבירים את הדגימות לתערובת של אצטון 100% ו 100% שרף Spurr (1: 3) במשך 3 שעות בטמפרטורת החדר.
- העברה לטבול את דגימות 100% שרף spurr (מודגרות על 70 מעלות צלזיוס) במשך יותר מ 9 שעות.
- סעיף דגימות פרפר באמצעות מיקרולי.
- כתם את הסרטים דק במיוחד (שנרכש בסעיף 3.9) על ידי טבילה ב אצטט uranyl מוחלטת עבור 5-10 דקות, ואחריו טבילה ב 50% אלקטרלי ציטראט להוביל עוד 5-10 דקות.
הערה: כרכים של ריאגנטים מנוצל בסעיף 3.1-3.10 תלויים הדגימות. ודא דגימות שקועים ריאגנטים. - שימו לב לדגימות במיקרוסקופ אלקטרונים בתדר (15,000X) כדי לקבוע את לוקליזציה, צורה וגודל של חיידקים לשימוש נוסף (ראה סעיף 4.6).
- הוסף 100 μL של פתרון 1x PBS על שקופית מיקרוסקופ. בחר כמה 3 rd או 4 th נימפות מן העלים כותנה לטבול אותם לתוך הפתרון PBS.
- השתמש מחטים אנטומולוגיים בסדר תחת stereomicroscope ולמשוך את הבקטריומים מתוך הגוף פרפר.
- לחתוך בעדינות חור בצד אחד של נימפה, ולחץ מעט על השניבצד לתת את הבקטריומים החוצה.
- הר microloader 20 μL (עם לחתוך את קצה מוביל כדי לענות על גודל bacteriome) על פיפטה 0.5-10 μL. לחלץ את החיידק הפרט מתוך הפתרון PBS לתוך microloader.
- לשטוף את bacteriome לחסל את הזיהום של רקמות רקמות אחרות על ידי pipetting את הבקטריום לתוך הפתרון PBS ולחלץ את הבקטריום. חזור שלוש פעמים.
- מיד פיפטה הבקטריום שטף לתוך צינור צנטריפוגה המכיל 60 μL של פתרון PBS 1x.
- מזרק לסנן את bacteriome התאספו באמצעות 5 קרום מסנן מיקרומטר (נקבע על ידי גדלים של חיידקים וגרעין של bacteriocyte ב whitefly). חזור על מספר פעמים כדי להעביר את הנוזל המעורב דרך קרום המסנן ביסודיות.
הערה: כדי להשיג תוצאה טובה יותר של הגברה ורצף, להרכיב מעל 100 bacteriomes. רטוב קרום המסנן הראשון באמצעות פתרון 1x PBS כדי להפחית את אובדן החיידקיםמחייב את הממברנה. - להגביר את תסנין (בעיקר המכיל endosymbionts של פרפר) באמצעות ערכת הגברה DNA על ידי פרוטוקול מומלץ עם שינוי כלשהו.
- בחר את הפרוטוקול המומלץ של הגברה של DNA גנומי מן הדם או תאים ולהכין D2 חיץ לניסוי הבא.
- להוסיף ישירות 1.5 μL של תסנין (ראה סעיף 4.6) לצינור צנטריפוגה, ואחריו μL 1.5 של D2 הצפת ומערבבים היטב.
- לדגור על הקרח במשך 10 דקות ולהוסיף 1.5 μL של פתרון להפסיק.
- הוסף 15 μL של חיץ התגובה 1 μL של פולימראז DNA לערבב בעדינות.
- לדגור את התערובת על 30 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות, ואחריו 3 דקות ב 65 מעלות צלזיוס.
- בצע PCR ישירות על סינון מוגבר (לדלל את הדגימות מוגבר במידת הצורך) באמצעות פריימרים ספציפיים המיועדים bacטריה כדי לאשר את מינים חיידקים (ראה סעיף 2.1).
- התנהגות PCR כדי לאשר אם יש זיהום של הגנום המארח באמצעות גרגר לבן בטן אקטין ו EF1 primers על פי השיטה שפורסמה בעבר 21 (מתכון ה- PCR מתואר בסעיף 1.4).
- נושא סינון מוגבר ספקטרופוטומטר ו fluorometer (על פי הוראות היצרן) לפני רצף לבדוק את איכות דגימות ואם הדגימות לעמוד בקריטריונים של רצף.
- נושא המוגבר לרצף הגנום בהתאם להוראות היצרן.
4. Whitefly Bacteriome Dissection וטיהור
5. הגברה של הגנום Endosymbiont
6. Endosymbiont Metagenome רצף
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
המזרח התיכון אסיה 1 מינור 1 (MEAM1) מינים של B. Tabaci מורכבים נלקח כדוגמה כאן לתיאור. כותנה לגידול whiteflies וכמה שלבים התפתחותיים של whiteflies מוצגים באיור 1 כולל צמח כותנה, זבוב לבן ו 1 st, 2 nd ו 4 n נימפות ניר של whitefly (3 rd instar נימפה נראה דומה נימפה 4 אינסטאר ). זה היה ברור כי 4 נימפה instar גדול יותר 1 ו 2 נימפות אינסטאר השני ( איור 1 ). ניתוח דגים של Portiera ו המילטונלה בתוך MEAM1 מוצג באיור 2 . אלה שני endosymbionts מוגבלים על bacteriocytes של פרפר, וכן חופפים של שני חיידקים הוא ציין גם. איור 3 מציג את השידור elec תמונות מיקרוסקופיות טרון של endosymbiont Portiera של פרפר, המציין כי Portiera עלול לאבד את קיר התא שלו.
עבור רצף, שתי ספריות נבנו, עם הגדלת גדלים של 200 bp ו 2000 bp, בהתאמה. לאחר הרצף, שתי הספריות יצרו 1,626 Mb ו- 1,302 Mb של נתונים גולמיים, בהתאמה. לאחר ניקוי נתוני הזיהום עבור מתאמים ושכפולים, נרכשו 1,484 Mb ו - 1,219 Mb של נתונים נקיים. ההרכבה הניבה בהצלחה רצף גנום מלא עבור סימביונט המחייב, פורטייה . בנוסף, טיוטה הגנום של המילטונלה הושג גם. הרכבה המבוססת על 200 bp ו -2,000 ספריות bp גרמה ל -138 תדרים. על פי יחסי זיווג-קצה, 138 המתקנים הורכבו עוד יותר ל -89 פיגומים ( טבלה 2 ).
Figimg "src =" / files / ftp_upload / 55809 / 55809fig1.jpg "/>
איור 1: סקירה כללית של מערכת החרקים המשמשת בנייר זה. ( א ) Whiteflies הם גידלו על צמחים כותנה ( Gossypium hirsutum cv. ז 'מיאן 1793). ( ב ) מבט של זבוב לבן מבוגר. ( ג ) כמה שלבים התפתחותיים של נימפה instar במחזור החיים של פרפר. החץ האדום מתייחס לביצה של פרפר; חץ שחור מתייחס נימפה 1 st instar של פרפר; חץ לבן מתייחס לנימפה השנייה של פרפר; החץ הכחול מתייחס נימפה 4 אינר של נייטף. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: ניתוח דגים של Portiera , HamIltonella ב 4 אינסטאר נימפה של MEAM1. בדיקה ספציפית Portiera (אדום) מצומדות ל Cy3, בדיקה Hamiltonella- Specific (ירוק) מסומן עם Cy5 שימשו. סולם ברים = 100 מיקרומטר. ( א ) אותות ההכלאה האדומים מייצגים את הפורטיירה תחת שדה אפל. ( ב ) אותות היברידיזציה הירוק מייצג את המילטונלה תחת השדה החשוך. ( ג ) Portiera ו המילטונלה התמזגה תחת השדה החשוך. ( ד ) Portiera ו- Hamiltonella התמזגו מתחת לשדות בהירים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: העברת אלקטרונים מיקרותמונה של Portiera ב Whitefly . חץ מציין את המיקום של Portiera . סולם בר = 1 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
| יעד סימביונט | גן היעד | רצפי פריימר (5'-3 ') | הליכי PCR | הפניות | ||
| פורטירה | 16R rRNA | Por-F: TGCAAGTCGAGCGGCATCAT | 95 ° C 1 דקות, 60 ° C 1 דקות, 72 ° C 1 דקות, 5 מחזורים; | 27 | ||
| Por-R: AAAGTTCCCGCCTTATGCGT | 9576, C 1 דקות, 58 מעלות צלזיוס 1 דקות, 72 מעלות צלזיוס 1 דקות, 30 מחזורים; | |||||
| 72 ° C 20 דקות | ||||||
| המילטונלה | 16R rRNA | Ham-F: TGAGTAAAGTCTGGGAATCTGG | 95 ° C 1 דקות, 60 ° C 1 דקות, 72 ° C 1 דקות, 5 מחזורים; | 27 | ||
| Ham-R: CCCGGGAACGTATTCACCGTAG | 95 ° C 1 דקות, 58 ° C 1 דקות, 72 ° C 1 דקות, 30 מחזורים; | |||||
| 72 ° C 20 דקות | ||||||
| ריקטציה | 16R rRNA | Ric-F: GCTCAGAACGAACGCTATC | 95 מעלות צלזיוס 2 דקות; | 24 | ||
| Ric-R: GAAGGAAAGCATCTCTGC | 92 ° C 1 דקות, 58 °C 1 דקות, 72 ° C 90 s, 30 מחזורים; | |||||
| 72 ° C 5 דקות | ||||||
| ארסנופונוס | 23S rRNA | Ars-F: CGTTTGATGAATTCATAGTCAAA | 95 ° C 5 דקות; | 28 | ||
| Ars-R: GGTCCTCCAGTTAGTGTTACCCAAC | 95 ° C 30 s, 60.5 ° C 30, 72 ° C 45 s, 30 מחזורים; | |||||
| 72 ° C 10 דקות | ||||||
| קרדיניום | 16R rRNA | Car-F: TACTGTAAGAATAAGCACCGGCC | 95 ° C 2 דקות | 29 | ||
| Car-R: GTGGATCACTTAACGCTTTCG | 92 ° C 1 דקות, 57 ° C 1 דקות, 72 ° C 90 s, 30 מחזורים; | |||||
| 72 ° C 5 דקות | ||||||
| וולבכיה | 16R rRNA | Wol-F: TTGTAGCCTGCTATGGTATAACT | 94 ° C 5 דקות; | 30, 31 | ||
| Wol-R: GAATAGGTATGATTTATATGT | 94 ° C 1 דקות, 55 ° C 1 דקות, 72 ° C 1 דקות, 35 מחזורים | |||||
| Fritschea | 23S rRNA | Fri-F: GATGCCTTGGCATTGATAGGGGATGAAGGA | 95 ° C 5 דקות; | 32 | ||
| Fri-R: TGGCTCATCATGCAAAAGGA | 94 ° C 1 דקות, 64 ° C 1 דקות, 72 ° C 90 s, 35 מחזורים; | |||||
| 72 ° C 5 דקות | ||||||
| המיפטריפילהוס | גרגר | אורקל : F: CACCWAAAATTACTAAAGATGG | 94 מעלות צלזיוס 3 דקות; | 18 | ||
| ORGROEL - R: TAGAARTCCATWCCKCCCATWC | 94 ° C 30 s, 52 ° C 30 s, 72 ° C 2 דקות, 34 מחזורים; | |||||
| 72 ° C 10 דקות | ||||||
טבלה 1: PCR primers ונהלים של endosymbionts ב.
| פורטירה | המילטונלה | |
| מספר קונטג | 1 | 138 |
| מספר פיגומים א | 1 | 89 |
| סה"כ אורך, bp | 358,232 | 1,711,449 |
| N50, bp | / | 118,802 |
| N90, bp | / | 16,753 |
| אורך מרבי, bp | / | 390,511 |
| אורך מינימלי, bp | / | 503 |
| תוכן GC,% | °.18 | 39.89 |
| המידע המוצג להלן מבוסס על פיגומים. | ||
טבלה 2: תכונות כלליות של פורטייה ו המילטונלה טיוטת הגנום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
תמיכה כספית במחקר זה ניתנה על ידי לאומי מפתח מחקר ופיתוח התוכנית (2016YFC1200601) ואת הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31390421).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq DNA polymerase | Takara | R001A | including rTaq, 10×Buffer and dNTP |
| Gel DNA extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| DNA sample sequencing system | ABI | ABI-3730XL | |
| Microtome | Leica | EM UC7 | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7650 TEM | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| 20 μL microloader | Eppendorf | F2771951 | |
| Filter holder | Millipore | SX0001300 | |
| Filter membrane filter | Millipore | SMWP001300 | 5.0 μm SMWP |
| REPLI-g UltraFast Mini Kit | Qiagen | 150033 | DNA amlification kit |
| NanoDrop | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Genome Sequencer | Illumina | Hiseq 2000 |
References
- Buchner, P. Endosymbiosis of animals with plant microorganisms. J. Basic Microbiol. 7 (2), Interscience. New York. (1967).
- Sloan, D. B., Moran, N. A. Endosymbiotic bacteria as a source of carotenoids in whiteflies. Biol. Letters. 8 (6), 986-989 (2012).
- Stouthamer, R., Breeuwer, J. A., Hurst, G. D. Wolbachia pipientis: microbial manipulator of arthropod reproduction. Annu. Rev. Microbiol. 53, 71-102 (1999).
- Brumin, M., Kontsedalov, S., Ghanim, M. Rickettsia influences thermotolerance in the whitefly Bemisia tabaci B biotype. Insect Sci. 18 (1), 57-66 (2011).
- Hansen, A. K., Degnan, P. H. Widespread expression of conserved small RNAs in small symbiont genomes. ISME J. 8, 2490-2502 (2014).
- Moran, N. A., McCutcheon, J. P., Nakabachi, A. Genomics and evolution of heritable bacterial symbionts. Annu. Rev. Genet. 42, 165-190 (2008).
- Shigenobu, S., Watanabe, H., Hattori, M., Sakaki, Y., Ishikawa, H. Genome sequence of the endocellular bacterial symbiont of aphids Buchnera sp. APS. Nature. 407, 81-86 (2000).
- Nikoh, N., et al.
- Sloan, D. B., et al. Parallel histories of horizontal gene transfer facilitated extreme reduction of endosymbiont genomes in sap-feeding insects. Mol. Biol. Evol. 31 (4), 857-871 (2014).
- Xue, J., et al. Genomes of the rice pest brown planthopper and its endosymbionts reveal complex complementary contributions for host adaptation. Genome Biol. 15 (12), 521 (2014).
- Campbell, M. A., et al. Genome expansion via lineage splitting and genomereduction in the cicada endosymbiont Hodgkinia. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (33), 10192-10199 (2015).
- Wilson, A. C., et al. Genomic insight into the amino acid relations of the pea aphid, Acyrthosiphon pisum, with its symbiotic bacterium Buchnera aphidicola. Insect Mol. Biol. 19, 249-258 (2010).
- Degnan, P. H., Ochman, H., Moran, N. A. Sequence conservation and functional constraint on intergenic spacers in reduced genomes of the obligate symbiont Buchnera. PLoS Genet. 7 (9), e1002252 (2011).
- Nakabachi, A., et al. The 160-kilobase genome of the bacterial endosymbiont Carsonella. Science. 314 (5797), 267 (2006).
- De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annu. Rev. Entomol. 56, 1-19 (2011).
- Himler, A. G., et al. Rapid spread of a bacterial symbiont in an invasive whitefly is driven by fitness benefits and female bias. Science. 332 (6026), 254-256 (2011).
- Bing, X. L., Ruan, Y. M., Rao, Q., Wang, X. W., Liu, S. S. Diversity of secondary endosymbionts among different putative species of the whitefly Bemisia tabaci. Insect Sci. 20 (2), 194-206 (2013).
- Bing, X. L., Yang, J., Zchori-Fein, E., Wang, X. W., Liu, S. S. Characterization of a newly discovered symbiont of the whitefly Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae). Appl. Environ. Microbiol. 79 (2), 569-575 (2013).
- Kliot, A., et al. Fluorescence in situ hybridizations (FISH) for the localization of viruses and endosymbiotic bacteria in plant and insect tissues. J. Vis. Exp. (84), e51030 (2014).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923 (2012).
- Rao, Q., et al. Genome reduction and potential metabolic complementation of the dual endosymbionts in the whitefly Bemisia tabaci. BMC Genomics. 16 (1), 226 (2015).
- Thao, L. L., Baumann, P. Evolutionary relationships of primary prokaryotic endosymbionts of whiteflies and their hosts. Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3401-3406 (2004).
- Zhu, D. T., et al. Sequencing and comparison of the Rickettsia genomes from the whitefly Bemisia tabaci Middle East Asia Minor I. Insect Sci. 23 (4), 531-542 (2016).
- Gottlieb, Y., et al. Identification and localization of a Rickettsia sp. in Bemisia tabaci (HomopteraAleyrodidae). Appl. Environ. Microbiol. 72 (5), 3646-3652 (2006).
- Zhang, C. R., et al. Differential temporal changes of primary and secondary bacterial symbionts and whitefly host fitness following antibiotic treatments. Sci. Rep. 5, 15898 (2015).
- Shan, H. W., et al. Temporal changes of symbiont density and host fitness after rifampicin treatment in a whitefly of the Bemisia tabaci species complex. Insect Sci. 23 (2), 200-214 (2016).
- Zchori-Fein, E., Brown, J. K. Diversity of prokaryotes asscociated with Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 95 (6), 711-718 (2002).
- Thao, M. L., Baumann, P. Evolutionary relationships of primary prokaryotic endosymbionts of whiteflies and their hosts. Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3401-3406 (2004).
- Zchori-Fein, E., Perlman, S. J. Distribution of the bacterial symbiont Cardinium in arthropods. Mol. Ecol. 13 (7), 2009-2016 (2004).
- O'Neill, S. L., Giordano, R., Colbert, A. M., Karr, T. L., Robertson, H. M. 116S rRNA phylogenetic analysis of the bacterial endosymbionts associated with cytoplasmic incompatibility in insects. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 (7), 2699-2702 (1992).
- Nirgianaki, A. Wolbachia infections of the whitefly Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 47 (2), 93-101 (2003).
- Everett, K. D., Thao, M. L., Horn, M., Dyszynski, G. E., Baumann, P. Novel chlamydiae in whiteflies and scale insects: endosymbionts 'Candidatus Fritschea bemisiae' strain Falk and 'Candidatus Fritschea eriococci' strain Elm. Int. J. Syst. Evol. Micr. 55, 1581-1587 (2005).
