Summary
Hier presenteren wij een protocol om endosymbionten van de whitefly Bemisia tabaci te isoleren door dissectie en filtratie. Na amplificatie zijn de DNA monsters geschikt voor latere sequencing en studie van de mutualiteit tussen endosymbionten en whitefly.
Abstract
Bacteriële symbionten vormen een intieme relatie met hun gastheren en geven in de meeste gevallen voordelen aan de gastheren. Genomische informatie is cruciaal om de functies en evolutie van bacteriële symbionten in hun gastheer te bestuderen. Aangezien de meeste symbionten niet in vitro kunnen worden gekweekt, zijn methoden om een adequate hoeveelheid bacteriën te isoleren voor genoom sequencing zeer belangrijk. In de Whitefly Bemisia tabaci zijn een aantal endosymbionten geïdentificeerd en wordt voorspeld dat ze belangrijk zijn bij de ontwikkeling en voortplanting van de plaag door meerdere benaderingen. Het mechanisme van de verenigingen blijft echter grotendeels onbekend. Het obstakel komt ten dele uit het feit dat de endosymbionten in wittevlieg, die meestal in bacteriocyten worden vastgehouden, moeilijk zijn om van de gastheercellen te scheiden. Hier rapporteren we een stap-voor-stap protocol voor de identificatie, extractie en zuivering van endosymbionten uit de witte vlinder B. tabaci voornamelijk door dissectiAan en filtratie. Endosymbiont-monsters bereid volgens deze werkwijze, hoewel nog steeds een mengsel van verschillende endosymbiont-soorten, zijn geschikt voor latere genoomsequencing en analyse van de mogelijke rollen van endosymbionten in B. tabaci . Deze methode kan ook gebruikt worden om endosymbionten van andere insecten te isoleren.
Introduction
Bacteriën die een intieme symbiotische relatie met relatieve gastheren vormen zijn wijdverspreid bij geleedpotigen 1 . De endosymbionten zijn aangetoond dat ze aspecten van gastheren beïnvloeden, zoals voedingsmetabolisme, reproductie, reacties op milieu-stress 2 , 3 , 4 enz. , In bijna elke ontwikkelingsfase 5 . Het mechanisme dat de verenigingen ondersteunt, blijft echter grotendeels onbekend. Genomics heeft voorrang en belang bij het bestuderen van de potentiële functies en rollen van bacteriën. Enkele fundamentele informatie, dat wil zeggen de taxonomische status, functionele genen, metabolisme pathways, secretiesystemen, kan worden afgeleid uit genoomsequenties, die lichten op de potentiële rollen van symbionten in symbiose. Met de ontwikkeling van high-throughput sequencing is een groot aantal bacteriële genen sequenced wVerschillende functies onthulden 6 .
Endosymbionten zijn van vitaal belang in hemipteranen, zoals bladluizen 7 , bedbugs 8 , psyllids 9 , bruine planthoppers 10 en cicaden 11 . Bijvoorbeeld , Buchnera in bladluizen , als de verplichte symbiont, is aangetoond dat zij betrokken zijn bij essentiële aminozuren biosynthese, samen met de genen van aphid-genoom 12 . Verder wordt ook transcriptie-regulering van Buchnera geopenbaard 13 . In psylliden wordt Carsonella sequenced en wordt het kleinste bacteriegenoom ooit gevonden 14 . Al deze kenmerken van endosymbionten zijn gebaseerd en afgeleid van de genoomsequenties. Omdat deze endosymbionen niet in vitro kunnen worden gekweekt, zijn verschillende benaderingen toegepast om adequate bacteriën te isoleren voor zeefuencing. In bladluizen worden endosymbionten geëxtraheerd door middel van centrifugeren en filtratie, en onderworpen aan verdere genomische en transcriptomische analyse 5 . In bruine planthoppers worden endosymbionten samen met het hele insectengenoom 10 getraceerd.
Whitefly B. tabaci is een soort complex met meer dan 35 morfologisch onderscheiden soorten (cryptische soorten), waaronder twee invasieve soorten over de hele wereld binnengevallen en de landbouwproductie enorme schade hebben veroorzaakt 15 . Van de nota hebben endosymbionten binnen de B. tabaci- soorten belang in de ontwikkeling van de plagen 16 . Tot op heden zijn acht endosymbionten geïdentificeerd in de whitefly, waaronder de verplichte symbiont, Candidatus Portiera aleyrodidarum, en zeven secundaire symbionten Hamiltonella , Rickettsia , Arsenophonus , Cardinium , <Em> Wolbachia, Fritschea en Hemipteriphilus gedefinieerd 17 , 18 .
In tegenstelling tot de eerder beschreven hemipteranen, is de whitefly B. tabaci een extreem klein insect dat slechts 1 mm lang is. De meeste endosymbionten zijn beperkt tot bacteriocyten 19 (gespecialiseerde cellen die symbionten bevatten, die bovendien bacteriën vormen in B. tabaci ). Bovendien kunnen deze endosymbionen niet in vitro worden gekweekt. De enige manier om endosymbionten van B. tabaci te verkrijgen is om de bacteriome te ontleden. Er is echter moeilijkheid in de dissectie. Ten eerste, de breekbare bacteriome verbindt altijd met andere weefsels van de whitefly, die moeilijk te scheiden is. Ten tweede beperkt de kleine grootte van de whitefly de isolatie van genoeg bacteriomen. Ten derde, endosymbionts cluster in de bacteriome, waardoor het extreem ingewikkeld om een enkele soort bacterie te verwerven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Witte vliegende en cryptische soorten identificatie
- Onderhoud van de wittevliegsoorten op katoen Gossypium hirsutum (Malvaceae) (cv. Zhe-Mian 1973) in kooien onder standaard omstandigheden van 27 ± 1 ° C, 70 ± 10% vochtigheid en 14 uur licht: 10 uur donker regime.
- Verzamel een individuele witte witte vlinder en homogeniseer in 30 μl lysisbuffer (10 mM Tris, pH 8,4, 50 mM KCl, 0,45% [wt / vol] Tween-20, 0,2% [gew./vol.] Gelatine, 0,45% [vol / Vol] Nonidet P 40, 60 g / ml Proteïnase K).
- Incubeer het homogenaat bij 65 ° C gedurende 1 uur en dan 100 ° C gedurende 10 minuten.
OPMERKING: De incubatietijd bij 65 ° C kan eventueel worden verhoogd. De incubatietijd bij 100 ° C moet kritisch gecontroleerd worden om Proteïnase K voldoende te inactiveren en DNA-schade te vermijden. - Voer polymerase kettingreactie (PCR) uit met behulp van whitefly DNA (verkregen in sectie 1.3) gebaseerd op mitochondriale cytochroom oxidase I primers.
COI-F: 5'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3 '
COI-R: 5'-TAATATGGCAGATTAGTGCATTGGA-3 '- Voer de PCR reacties uit in een eindvolume van 25 μl die 1 U Taq DNA polymerase, 2,5 μL 10x buffer, 0,2 mM dNTP, 0,2 mM van elke primer en 2 μL whitefly DNA bevat.
- Gebruik de volgende PCR-procedure: initiële denaturatie 95 ° C gedurende 3 minuten gevolgd door 35 cycli van 95 ° C gedurende 45 s (denaturatie), 50 ° C gedurende 45 s (gloeien) en 72 ° C gedurende 1 min (verlenging) en Nog eens 10 minuten bij 72 ° C voor verdere verlenging.
- Reinig het PCR-geamplificeerd product met behulp van een DNA-extractie kit met het aanbevolen protocol.
- Volg de gesuiverde DNA-monsters met een DNA-monster sequencing systeem volgens de instructies van de fabrikant.
- Analyseer de sequenties met behulp van het Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) om de cryptische soorten whitefly te identificeren en voorkomt besmetting van andere species.
2. Endosymbiont-identificatie en lokalisatie
- Voer PCR uit op het whitefly-DNA (verworven in stap 1.3) om de specifieke genen van elke endosymbiont binnen de witte vlinder te amplificeren (het PCR-recept wordt beschreven in sectie 1.4 en PCR-procedures en primers staan vermeld in tabel 1 ).
- Onderwerp het geamplificeerde monster om agarose gelelektroforese volgens agarose gel-elektroforese volgens het eerder gepubliceerde protocol 20 (1% agarosegel, Tris-acetaat-EDTA als lopende buffer, spanning 5 V / cm) te identificeren om het specifieke gen van elke bacterie te identificeren.
- Herstel en sequentieer elke band om de bacteriële species binnen witvlieg te bepalen (zie secties 1.5-1.7).
- Voer fluorescentie in situ hybridisaties (FISH) op whiteflies uit om de locatie van endosymbionten te identificeren volgens het eerder gepubliceerde protocol 19 .
OPMERKING: Verhoog de concentratie van de fluorescerende probes indien nodig. 3. Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) - Dompel en fix whiteflies in fosfaatbuffer (0,1 M, pH 7,0) die 2,5% [vol / vol] glutaraldehyde bevat gedurende 4 uur.
- Was de monsters drie keer, 15 minuten per keer in fosfaatbuffer (0,1 M, pH 7,0).
- Dompel en monteer de monsters opnieuw in fosfaatbuffer (0,1 M, pH 7,0), die 1% [wt / vol] OsO 4 gedurende 2 uur bevatten.
- De monsters worden gedehydrateerd door een gegradeerde reeks ethanol (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% en 100%), 15 minuten per keer.
- Vervolgens de monsters gedurende 20 minuten in 100% aceton dompelen.
- Plaats de monsters in een mengsel van 100% aceton en 100% Spurrhars (1: 1) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Breng de monsters in een mengsel van 100% aceton en 100% Spurrhars (1: 3) gedurende 3 uur bij kamertemperatuur.
- Vervoer en dompel de monsters in 100% Spurrhars (geïncubeerd bij 70 ° C) gedurende meer dan 9 uur.
- Sectie de whitefly monsters door een micro te gebruikennaar mij.
- Vlek de ultra dunne films (verworven in sectie 3.9) door onderdompeling in absolute uranylacetaat gedurende 5-10 minuten, gevolgd door onderdompeling in 50% alkalisch lood citraat gedurende nog eens 5-10 minuten.
OPMERKING: De hoeveelheden reagentia gebruikt in sectie 3.1-3.10 zijn afhankelijk van de monsters. Zorg ervoor dat de monsters in de reagentia worden gedompeld. - Let op de monsters onder transmissie-elektronmicroscopie (15.000X) om de lokalisatie, vorm en grootte van bacteriën te bepalen voor verder gebruik (zie rubriek 4.6).
- Voeg 100 μl 1x PBS oplossing op een microscoopschuif. Kies 3 of 4 instar nimfen uit katoenbladeren en dompel ze in de PBS-oplossing.
- Gebruik fijne entomologische naalden onder een stereomicroscoop en trek de bacteriomen uit het witvlieglichaam.
- Zet een gat voorzichtig aan de ene kant van de nimf en druk de ander iets opKant om de bacteriomen uit te laten.
- Monteer een 20 μL microloader (met de voorste eindvergroting om de grootte van bacteriome te ontmoeten) op een 0,5-10 μL pipet. Extract de individuele bacteriome uit de PBS oplossing in de microloader.
- Was de bacteriome om de vervuiling van andere wittevliesweefsels te elimineren door de bacteriome in de PBS-oplossing te pipetteren en de bacteriome te extraheren. Herhaal drie keer.
- Pipet de gewassen bacteriome onmiddellijk in een centrifugebuis die 60 μl 1x PBS-oplossing bevat.
- Spuit de geassembleerde bacteriomen door een 5 μm filtermembraan (bepaald door bacteriën en nucleus van bacteriocyten in whitefly). Herhaal meerdere keren om de gemengde vloeistof door het filtermembraan grondig te bewegen.
OPMERKING: Om een beter resultaat van amplificatie en sequencing te bereiken, assembleer meer dan 100 bacteriomen. Vet het filtermembraan eerst door gebruik te maken van 1x PBS-oplossing om het verlies van bacteriën te verminderenBindend aan het membraan. - Versterk het filtraat (voornamelijk met endosymbionten van de whitefly) met behulp van een DNA-amplificatie kit door het aanbevolen protocol met enige wijziging.
- Kies het aanbevolen protocol van amplificatie van genomisch DNA uit bloed of cellen en berei buffer D2 op voor het volgende experiment.
- Voeg 1,5 μl filtraat direct toe (zie rubriek 4.6) aan de centrifugebuis, gevolgd door 1,5 μl van de buffer D2 en meng goed.
- Incubeer op ijs gedurende 10 minuten en voeg 1,5 μL van de stopoplossing toe.
- Voeg 15 μl van de reactiebuffer en 1 μl van het DNA-polymerase toe en meng zachtjes.
- Incubeer het mengsel gedurende 16 uur bij 30 ° C, gevolgd door 3 minuten bij 65 ° C.
- Voer PCR direct uit op het geamplificeerde filtraat (verdun de geamplificeerde monsters indien nodig) door gebruik te maken van specifieke primers ontworpen voor bacTeria om de bacterie soorten te bevestigen (zie paragraaf 2.1).
- Voer PCR uit om te bevestigen of er sprake is van besmetting van gastheergenoom door gebruik te maken van whitefly gen beta-Actin en EF1 primers volgens de eerder gepubliceerde methode 21 (het PCR recept is beschreven in sectie 1.4).
- Onderwerp het geamplificeerde filtraat op een spectrofotometer en een fluorometer (volgens de instructies van de fabrikant) alvorens de kwaliteit van de monsters te bepalen en of de monsters voldoen aan de criteria voor sequencing.
- Onderwerp de versterkte naar een genoom sequencer volgens de instructies van de fabrikant.
4. Whitefly Bacteriome Dissection and Purification
5. Versterking van Endosymbiont Genomes
6. Endosymbiont Metagenome Sequencing
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De soort van het B. tabaci- complex van het Midden-Oosten-Azië Minor 1 (MEAM1) werd hier als voorbeeld genomen voor de beschrijving. Katoen voor het opgroeien van witvliegen en verschillende ontwikkelingsfasen van witvliegjes worden getoond in Figuur 1, waaronder een katoenplant, witte wittevlinder en de 1e, 2e en 4e instarnimf van witvlieg (de 3e instarnimf ziet er op als de 4e instarnimf ). Het was duidelijk dat de 4e instar nimf groter is dan de 1e en 2e instar nimf ( Figuur 1 ). FISH analyse van Portiera en Hamiltonella binnen MEAM1 is weergegeven in Figuur 2 . Deze twee endosymbionten zijn beperkt tot de bacteriocyten van de whitefly, en ook overlapping van de twee bacteriën wordt waargenomen. Figuur 3 toont transmissie elec Tron microscopie beelden van de Portiera endosymbiont van de whitefly, wat aangeeft dat Portiera de celwand kan verliezen.
Voor sequencing werden twee bibliotheken gebouwd met respectievelijk inzetgroottes van 200 bp en 2.000 bp. Na sequentie hebben de twee bibliotheken respectievelijk 1.626 Mb en 1.302 Mb ruwe data gegenereerd. Na het opruimen van de vervuilingsgegevens voor adapters en duplicaties werden 1,484 Mb en 1,219 Mb schone data verworven. De assemblage leidde succesvol tot een volledige genoomsequentie voor de verplichte symbiont, Portiera . Daarnaast werd ook een ontwerpgenoom van Hamiltonella verkregen . Het congres gebaseerd op zowel 200 bp als 2000 bp bibliotheken resulteerde in 138 contigs. Volgens de verhoudingen met koppelingen werden de 138 contigs verder gemonteerd in 89 steigers ( tabel 2 ).
Figimg "src =" / files / ftp_upload / 55809 / 55809fig1.jpg "/>
Figuur 1: Overzicht van het plantensectiesysteem dat in dit document wordt gebruikt. ( A ) Witvliegen worden op katoenplanten ( Gossypium hirsutum cv. Zhe-Mian 1793) opgetrokken . ( B ) Weergave van een volwassen witte vlinder. ( C ) Verschillende ontwikkelingsstadia van instarnemph in de whitefly levenscyclus. Rode pijl verwijst naar het ei van whitefly; Zwarte pijl verwijst naar de 1e instar nimf van whitefly; Witte pijl verwijst naar de 2e nimf van whitefly; Blauwe pijl verwijst naar de 4e instar nimf van whitefly. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Visanalyse van Portiera , HamIltonella in de 4e Instar Nymph van MEAM1. Portiera -specifieke sonde (rood) geconjugeerd met Cy3, Hamiltonella -specifieke sonde (groen) gemarkeerd met Cy5 werden gebruikt. Schaalstaven = 100 μm. ( A ) De rode hybridisatie signalen vertegenwoordigen de Portiera onder het donkere veld. ( B ) De groene hybridisatiesignalen vertegenwoordigen de Hamiltonella onder het donkere veld. ( C ) Portiera en Hamiltonella samengevoegd signalen onder donker veld. ( D ) Portiera en Hamiltonella samengevoegd signalen onder helder veld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Transmissie Electron MicroScopy Afbeelding van Portiera in Whitefly. Pijl geeft de locatie van Portiera aan . Schaalbalk = 1 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Doel symbiont | Doelgen | Primer sequenties (5'-3 ') | PCR procedures | Referenties | ||
| Portiera | 16S rRNA | Por-F: TGCAAGTCGAGCGGCATCAT | 95 ° C 1 min, 60 ° C 1 min, 72 ° C 1 min, 5 cycli; | 27 | ||
| Por-R: AAAGTTCCCGCCTTATGCGT | 9576; C 1 min, 58 ° C 1 min, 72 ° C 1 min, 30 cycli; | |||||
| 72 ° C 20 min | ||||||
| Hamiltonella | 16S rRNA | Ham-F: TGAGTAAAGTCTGGGAATCTGG | 95 ° C 1 min, 60 ° C 1 min, 72 ° C 1 min, 5 cycli; | 27 | ||
| Ham-R: CCCGGGAACGTATTCACCGTAG | 95 ° C 1 min, 58 ° C 1 min, 72 ° C 1 min, 30 cycli; | |||||
| 72 ° C 20 min | ||||||
| Rickettsia | 16S rRNA | Ric-F: GCTCAGAACGAACGCTATC | 95 ° C 2 min; | 24 | ||
| Ric-R: GAAGGAAAGCATCTCTGC | 92 ° C 1 min, 58 °C 1 min, 72 ° C 90 s, 30 cycli; | |||||
| 72 ° C 5 min | ||||||
| Arsenophonus | 23S rRNA | Ars-F: CGTTTGATGAATTCATAGTCAAA | 95 ° C 5 min; | 28 | ||
| Ars-R: GGTCCTCCAGTTAGTGTTACCCAAC | 95 ° C 30s, 60,5 ° C 30s, 72 ° C 45s, 30 cycli; | |||||
| 72 ° C 10 min | ||||||
| Cardinium | 16S rRNA | Auto-F: TACTGTAAGAATAAGCACCGGC | 95 ° C 2 min | 29 | ||
| Car-R: GTGGATCACTTAACGCTTTCG | 92 ° C 1 min, 57 ° C 1 min, 72 ° C 90 s, 30 cycli; | |||||
| 72 ° C 5 min | ||||||
| Wolbachia | 16S rRNA | Wol-F: TTGTAGCCTGCTATGGTATAACT | 94 ° C 5 min; | 30, 31 | ||
| Wol-R: GAATAGGTATGATTTTCATGT | 94 ° C 1 min, 55 ° C 1 min, 72 ° C 1 min, 35 cycli | |||||
| Fritschea | 23S rRNA | Vr-F: GATGCCTTGGCATTGATAGGCGATGAAGGA | 95 ° C 5 min; | 32 | ||
| Vrij-R: TGGCTCATCATGCAAAAGGCA | 94 ° C 1 min, 64 ° C 1 min, 72 ° C 90 s, 35 cycli; | |||||
| 72 ° C 5 min | ||||||
| Hemipteriphilus | groEL | OR- groel -F: CACCWAAAATTACTAAAGATGG | 94 ° C 3 min; | 18 | ||
| OR- groel -R: TAGAARTCCATWCCKCCCATWC | 94 ° C 30 s, 52 ° C 30 s, 72 ° C 2 min, 34 cycli; | |||||
| 72 ° C 10 min | ||||||
Tabel 1: PCR Primers en Procedures van Endosymbionts in Whitefly.
| Portiera | Hamiltonella | |
| Contig nummer | 1 | 138 |
| Steiger nummer a | 1 | 89 |
| Totale lengte, bp | 358.232 | 1.711.449 |
| N50, bp | / | 118.802 |
| N90, bp | / | 16.753 |
| Max lengte, bp | / | 390.511 |
| Min lengte, bp | / | 503 |
| GC inhoud,% | 26.18 | 39.89 |
| Een hieronder gegeven informatie zijn allemaal gebaseerd op steigers. | ||
Tabel 2: Algemene kenmerken van Portiera en Hamiltonella Draft Genome.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Financiële steun voor deze studie is verstrekt door het Nationale Key Research and Development Program (2016YFC1200601) en de National Natural Science Foundation of China (31390421).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq DNA polymerase | Takara | R001A | including rTaq, 10×Buffer and dNTP |
| Gel DNA extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| DNA sample sequencing system | ABI | ABI-3730XL | |
| Microtome | Leica | EM UC7 | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7650 TEM | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| 20 μL microloader | Eppendorf | F2771951 | |
| Filter holder | Millipore | SX0001300 | |
| Filter membrane filter | Millipore | SMWP001300 | 5.0 μm SMWP |
| REPLI-g UltraFast Mini Kit | Qiagen | 150033 | DNA amlification kit |
| NanoDrop | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Genome Sequencer | Illumina | Hiseq 2000 |
References
- Buchner, P. Endosymbiosis of animals with plant microorganisms. J. Basic Microbiol. 7 (2), Interscience. New York. (1967).
- Sloan, D. B., Moran, N. A. Endosymbiotic bacteria as a source of carotenoids in whiteflies. Biol. Letters. 8 (6), 986-989 (2012).
- Stouthamer, R., Breeuwer, J. A., Hurst, G. D. Wolbachia pipientis: microbial manipulator of arthropod reproduction. Annu. Rev. Microbiol. 53, 71-102 (1999).
- Brumin, M., Kontsedalov, S., Ghanim, M. Rickettsia influences thermotolerance in the whitefly Bemisia tabaci B biotype. Insect Sci. 18 (1), 57-66 (2011).
- Hansen, A. K., Degnan, P. H. Widespread expression of conserved small RNAs in small symbiont genomes. ISME J. 8, 2490-2502 (2014).
- Moran, N. A., McCutcheon, J. P., Nakabachi, A. Genomics and evolution of heritable bacterial symbionts. Annu. Rev. Genet. 42, 165-190 (2008).
- Shigenobu, S., Watanabe, H., Hattori, M., Sakaki, Y., Ishikawa, H. Genome sequence of the endocellular bacterial symbiont of aphids Buchnera sp. APS. Nature. 407, 81-86 (2000).
- Nikoh, N., et al.
- Sloan, D. B., et al. Parallel histories of horizontal gene transfer facilitated extreme reduction of endosymbiont genomes in sap-feeding insects. Mol. Biol. Evol. 31 (4), 857-871 (2014).
- Xue, J., et al. Genomes of the rice pest brown planthopper and its endosymbionts reveal complex complementary contributions for host adaptation. Genome Biol. 15 (12), 521 (2014).
- Campbell, M. A., et al. Genome expansion via lineage splitting and genomereduction in the cicada endosymbiont Hodgkinia. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (33), 10192-10199 (2015).
- Wilson, A. C., et al. Genomic insight into the amino acid relations of the pea aphid, Acyrthosiphon pisum, with its symbiotic bacterium Buchnera aphidicola. Insect Mol. Biol. 19, 249-258 (2010).
- Degnan, P. H., Ochman, H., Moran, N. A. Sequence conservation and functional constraint on intergenic spacers in reduced genomes of the obligate symbiont Buchnera. PLoS Genet. 7 (9), e1002252 (2011).
- Nakabachi, A., et al. The 160-kilobase genome of the bacterial endosymbiont Carsonella. Science. 314 (5797), 267 (2006).
- De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annu. Rev. Entomol. 56, 1-19 (2011).
- Himler, A. G., et al. Rapid spread of a bacterial symbiont in an invasive whitefly is driven by fitness benefits and female bias. Science. 332 (6026), 254-256 (2011).
- Bing, X. L., Ruan, Y. M., Rao, Q., Wang, X. W., Liu, S. S. Diversity of secondary endosymbionts among different putative species of the whitefly Bemisia tabaci. Insect Sci. 20 (2), 194-206 (2013).
- Bing, X. L., Yang, J., Zchori-Fein, E., Wang, X. W., Liu, S. S. Characterization of a newly discovered symbiont of the whitefly Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae). Appl. Environ. Microbiol. 79 (2), 569-575 (2013).
- Kliot, A., et al. Fluorescence in situ hybridizations (FISH) for the localization of viruses and endosymbiotic bacteria in plant and insect tissues. J. Vis. Exp. (84), e51030 (2014).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923 (2012).
- Rao, Q., et al. Genome reduction and potential metabolic complementation of the dual endosymbionts in the whitefly Bemisia tabaci. BMC Genomics. 16 (1), 226 (2015).
- Thao, L. L., Baumann, P. Evolutionary relationships of primary prokaryotic endosymbionts of whiteflies and their hosts. Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3401-3406 (2004).
- Zhu, D. T., et al. Sequencing and comparison of the Rickettsia genomes from the whitefly Bemisia tabaci Middle East Asia Minor I. Insect Sci. 23 (4), 531-542 (2016).
- Gottlieb, Y., et al. Identification and localization of a Rickettsia sp. in Bemisia tabaci (HomopteraAleyrodidae). Appl. Environ. Microbiol. 72 (5), 3646-3652 (2006).
- Zhang, C. R., et al. Differential temporal changes of primary and secondary bacterial symbionts and whitefly host fitness following antibiotic treatments. Sci. Rep. 5, 15898 (2015).
- Shan, H. W., et al. Temporal changes of symbiont density and host fitness after rifampicin treatment in a whitefly of the Bemisia tabaci species complex. Insect Sci. 23 (2), 200-214 (2016).
- Zchori-Fein, E., Brown, J. K. Diversity of prokaryotes asscociated with Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 95 (6), 711-718 (2002).
- Thao, M. L., Baumann, P. Evolutionary relationships of primary prokaryotic endosymbionts of whiteflies and their hosts. Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3401-3406 (2004).
- Zchori-Fein, E., Perlman, S. J. Distribution of the bacterial symbiont Cardinium in arthropods. Mol. Ecol. 13 (7), 2009-2016 (2004).
- O'Neill, S. L., Giordano, R., Colbert, A. M., Karr, T. L., Robertson, H. M. 116S rRNA phylogenetic analysis of the bacterial endosymbionts associated with cytoplasmic incompatibility in insects. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 (7), 2699-2702 (1992).
- Nirgianaki, A. Wolbachia infections of the whitefly Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 47 (2), 93-101 (2003).
- Everett, K. D., Thao, M. L., Horn, M., Dyszynski, G. E., Baumann, P. Novel chlamydiae in whiteflies and scale insects: endosymbionts 'Candidatus Fritschea bemisiae' strain Falk and 'Candidatus Fritschea eriococci' strain Elm. Int. J. Syst. Evol. Micr. 55, 1581-1587 (2005).
