Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para isolar os endossimbionetas da mosca branca Bemisia tabaci através da dissecção e filtração. Após a amplificação, as amostras de DNA são adequadas para posterior seqüenciamento e estudo do mutualismo entre endosimbiontes e mosca branca.
Abstract
Os simbiontes bacterianos formam um relacionamento íntimo com seus hospedeiros e conferem vantagens aos hospedeiros na maioria dos casos. A informação genômica é fundamental para estudar as funções e a evolução dos simbiontes bacterianos em seu hospedeiro. Como a maioria dos simbiontes não pode ser cultivada in vitro , os métodos para isolar uma quantidade adequada de bactérias para o sequenciamento do genoma são muito importantes. Na mosca branca Bemisia tabaci , vários endossimbionos foram identificados e se prevê que sejam importantes no desenvolvimento e reprodução das pragas através de abordagens múltiplas. No entanto, o mecanismo subjacente às associações permanece em grande parte desconhecido. O obstáculo vem parcialmente do fato de que os endossimbicetos na mosca branca, principalmente retidos em bacteriócitos, são difíceis de separar das células hospedeiras. Aqui relatamos um protocolo passo-a-passo para a identificação, extração e purificação de endosimbiontes da mosca branca B. tabaci principalmente por dissectiSobre e filtração. As amostras de endossimbiontes preparadas por este método, apesar de ainda ser uma mistura de diferentes espécies de endosimbiontes, são adequadas para sequenciação subseqüente do genoma e análise das possíveis funções dos endossimbiontes em B. tabaci . Este método também pode ser usado para isolar endosimbionetas de outros insetos.
Introduction
As bactérias que formam uma relação simbiótica íntima com hospedeiros relativos são generalizadas nos artrópodes 1 . Os endossimbiontes demonstraram afetar aspectos de hospedeiros, como o metabolismo nutricional, a reprodução, as respostas aos estresses ambientais 2 , 3 , 4 , etc. , em quase todos os estádios de desenvolvimento 5 . No entanto, o mecanismo subjacente às associações ainda é bastante desconhecido. A genômica é de prioridade e importância ao estudar as potenciais funções e papéis das bactérias. Algumas informações fundamentais, ou seja , o status taxonômico, genes funcionais, caminhos do metabolismo, sistemas de secreção, podem ser inferidos a partir de seqüências do genoma, que lança luzes sobre os potenciais papéis dos simbiontes em simbiose. Com o desenvolvimento de seqüenciamento de alto rendimento, um grande número de genomas bacterianos foram sequenciados wCom diversas funções reveladas 6 .
Endosymbionts são de importância vital em hemipterans, como pulgões 7 , percevejos 8 , psyllids 9 , brownhoas 10 e cigarras 11 . Por exemplo, Buchnera nos pulgões, como o simbionte obrigatório, demonstrou estar envolvido na biossíntese de aminoácidos essenciais, juntamente com os genes do genoma do pulgão 12 . Além disso, a regulação transcricional da Buchnera também é revelada 13 . Em psílidos , Carsonella é sequenciada e classificada como o menor genoma bacteriano já encontrado 14 . Todas essas características dos endossimbiontes são baseadas e inferidas a partir das sequências do genoma. Como esses endosimbiontes não podem ser cultivados in vitro , várias abordagens foram aplicadas para isolar bactérias adequadas para seqUencing. Nos pulmões, os endossimbiontes são extraídos através de centrifugação e filtração e submetidos a análises genômicas e transcriptômicas adicionais 5 . Em planthoppers marrons, os endossimbionetas são sequenciados juntamente com todo o genoma do inseto 10 .
Whitefly B. tabaci é um complexo de espécies contendo mais de 35 espécies morfologicamente indistinguíveis (espécies crípticas), entre as quais duas espécies invasivas invadiram todo o mundo e causaram enormes danos à produção agrícola 15 . De notar, os endossimbictos dentro das espécies de B. tabaci mostraram importância no desenvolvimento das pragas 16 . Até à data, oito endossimbiontes foram identificados na mosca branca, incluindo o simbionte obrigatório, Candidatus Portiera aleyrodidarum e sete simbiontes secundários Hamiltonella , Rickettsia , Arsenophonus , Cardinium , <Em> Wolbachia, Fritschea e Hemipteriphilus definiram 17 , 18 .
Ao contrário dos hemipteranos descritos anteriormente, a mosca branca B. tabaci é um inseto extremamente pequeno com apenas 1 mm de comprimento. A maioria dos endossimbiontes é confinada aos bacteriócitos 19 (células especializadas que contêm simbiontes, que ainda formam bacteriomo em B. tabaci ). Além disso, estes endosimbiontes não podem ser cultivados in vitro . A única maneira de obter endosimbiontes de B. tabaci é dissecar a bactéria. No entanto, há dificuldade na dissecação. Primeiro, a bactéria frágil sempre se liga a outros tecidos da mosca branca, o que é difícil de separar. Em segundo lugar, o pequeno tamanho da mosca branca limita o isolamento de bacteriomo suficiente. Em terceiro lugar, os endossimbiontes se agrupam na bactéria, tornando extremamente complicado adquirir uma única espécie de bactéria.
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Protocol
1. Criação de mosca branca e identificação de espécies criptípicas
- Manter as espécies de moscas brancas em algodão Gossypium hirsutum (Malvaceae) (cv. Zhe-Mian 1973) em gaiolas sob condições padrão de 27 ± 1 ° C, 70 ± 10% de umidade e 14 h de luz: 10 h de regime escuro.
- Recolher uma mosca branca branca individual e homogeneizar em 30 μL de tampão de lise (Tris 10 mM, pH 8,4, KCl 50 mM, 0,45% [wt / vol] Tween-20, 0,2% [wt / vol] de gelatina, 0,45% [vol / Vol] Nonidet P 40, 60 g / mL Proteinase K).
- Incubar o homogeneizado a 65 ° C durante 1 h e depois 100 ° C durante 10 min.
NOTA: O tempo de incubação a 65 ° C pode ser aumentado, se necessário. O tempo de incubação a 100 ° C deve ser controlado criticamente para inativar suficientemente a Proteinase K e evitar danos no DNA. - Realize a reação em cadeia da polimerase (PCR) usando DNA de mosca branca (adquirido na seção 1.3) com base nos iniciadores mitocondriais de citocromo oxidase I.
COI-F: 5'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3 '
COI-R: 5'-TAATATGGCAGATTAGTGCATTGGA-3 '- Realize as reações de PCR em um volume final de 25 μL contendo 1 U de polimerase de ADN Taq , 2,5 μL de tampão 10x, dNTP 0,2 mM, 0,2 mM de cada iniciador e 2 μL de DNA de mosca branca.
- Utilize as seguintes condições de procedimento de PCR: desnaturação inicial 95 ° C durante 3 minutos seguido de 35 ciclos de 95 ° C durante 45 s (desnaturação), 50 ° C durante 45 s (recozimento) e 72 ° C durante 1 min (extensão) e Outros 10 min a 72 ° C para maior extensão.
- Limpe o produto amplificado por PCR usando um kit de extração de gel de DNA com o protocolo recomendado.
- Seqüência de amostras de DNA purificado com um sistema de seqüenciamento de amostras de DNA seguindo as instruções do fabricante.
- Analise as seqüências usando a Ferramenta de Pesquisa de Alinhamento Local Básico (BLAST) para identificar as espécies crípticas da mosca branca e evitar a contaminação de outras espéciesEs.
2. Endosymbiont Identificação e localização
- Execute PCR no DNA da mosca branca (adquirida no Passo 1.3) para amplificar os genes específicos de cada endosimbionto dentro da mosca branca (a receita de PCR é descrita na seção 1.4, e os procedimentos de PCR e primers estão listados na Tabela 1 ).
- Sujeita a amostra amplificada em eletroforese em gel de agarose de acordo com o protocolo 20 previamente publicado (1% de gel de agarose, Tris-acetato-EDTA como tampão de corrida, tensão 5 V / cm) para identificar o gene específico de cada bactéria.
- Recupere e sequencie cada banda para determinar as espécies bacterianas dentro da mosca branca (ver seções 1.5-1.7).
- Execute hibridizações in situ de fluorescência (FISH) em moscas brancas para identificar a localização dos endossimbionetas de acordo com o protocolo 19 previamente publicado.
NOTA: Aumente a concentração das sondas fluorescentes se necessário. 3. Microscopia eletrônica de transmissão (TEM) - Mergulhe e corrija as moscas brancas em tampão fosfato (0,1 M, pH 7,0) contendo 2,5% [vol / vol] glutaraldeído durante 4 h.
- Lavar as amostras em tampão de fosfato (0,1 M, pH 7,0) três vezes, 15 min cada vez.
- Mergulhe e repare novamente as amostras em tampão fosfato (0,1 M, pH 7,0) contendo 1% [wt / vol] OsO 4 durante 2 h.
- Desidratar as amostras por uma série de etanol graduada (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% e 100%), 15 min a cada vez.
- Transfira e mergulhe as amostras em 100% de acetona por 20 min.
- Coloque as amostras em mistura de 100% de acetona e 100% de resina Spurr (1: 1) durante 1 h à temperatura ambiente.
- Transfira as amostras para a mistura de 100% de acetona e 100% de resina Spurr (1: 3) durante 3 h à temperatura ambiente.
- Transfira e mergulhe as amostras em 100% de resina Spurr (incubada a 70 ° C) por mais de 9 h.
- Corte as amostras de moscas brancas usando um micropara mim.
- Mancha os filmes ultra finos (adquiridos na seção 3.9) por imersão em acetato de uranilo absoluto durante 5-10 min, seguido de imersão em citrato de chumbo alcalino a 50% por mais 5-10 min.
NOTA: Os volumes de reagentes utilizados na seção 3.1-3.10 dependem das amostras. Verifique se as amostras estão imersas nos reagentes. - Observe amostras sob microscopia eletrônica de transmissão (15,000 X) para determinar a localização, a forma e o tamanho das bactérias para uso posterior (ver seção 4.6).
- Adicione 100 μL de 1x solução de PBS em uma lâmina de microscópio. Escolha algumas ninfas do 3º ou 4º instar das folhas de algodão e mergulhe na solução de PBS.
- Use agulhas entomológicas finas sob um estereomicroscópio e puxe as bacteriomas para fora do corpo da mosca branca.
- Corte suavemente um buraco de um lado da ninfa e pressione levemente o outroLado para deixar as bacteriomas sair.
- Monte um microcarregador de 20 μL (com o corte de extremidade dianteiro para atingir o tamanho da bactéria) em uma pipeta de 0,5-10 μL. Extraia o bacteriomo individual da solução PBS para o microcarregador.
- Lave o bacteriomo para eliminar a contaminação de outros tecidos de mosca branca por pipetagem da bacterioma na solução de PBS e extração do bacteriomo. Repita três vezes.
- Em seguida, pipetar a bacterioma lavada em um tubo de centrífuga contendo 60 μL de 1x solução de PBS.
- Filtro de seringa da bacterioma montada através de uma membrana filtrante de 5 μm (determinada por tamanhos de bactérias e núcleo de bacteriócitos na mosca branca). Repita várias vezes para mover o líquido misto através da membrana do filtro completamente.
NOTA: Para obter um melhor resultado de amplificação e seqüenciamento, montar mais de 100 bacteriomas. Molhe a membrana do filtro primeiro usando 1x solução de PBS para diminuir a perda de bactériasLigação à membrana. - Amplifique o filtrado (contendo principalmente endosimbiontes da mosca branca) usando um kit de amplificação de DNA pelo protocolo recomendado com alguma modificação.
- Escolha o protocolo recomendado de amplificação de DNA genômico de sangue ou células e prepare o tampão D2 para experiência subseqüente.
- Adicione diretamente 1,5 μL de filtrado (ver seção 4.6) ao tubo de centrífuga, seguido de 1,5 μL do tampão D2 e misture bem.
- Incubar em gelo durante 10 min e adicionar 1,5 μL da solução de parada.
- Adicione 15 μL do tampão de reação e 1 μL da DNA polimerase e misture suavemente.
- Incubar a mistura a 30 ° C durante 16 h, seguido de 3 min a 65 ° C.
- Execute o PCR diretamente no filtrado amplificado (diluir as amostras amplificadas, se necessário) usando iniciadores específicos projetados para bacPara confirmar as espécies de bactérias (ver seção 2.1).
- Conduza a PCR para confirmar se há contaminação do genoma do hospedeiro usando o beta-Actin e os primers EF1 do vírus da mosca branca de acordo com o método 21 previamente publicado (a receita de PCR é descrita na seção 1.4).
- Sujeite o filtrado amplificado para um espectrofotômetro e um fluorômetro (de acordo com as instruções do fabricante) antes do seqüenciamento para testar a qualidade das amostras e se as amostras atendem aos critérios de seqüenciamento.
- Assine o amplificador para um seqüenciador de genoma de acordo com as instruções do fabricante.
4. Dissecção e Purificação de Bacterioma da Baleia Branca
5. Amplificação de Genomas de Endosimbionto
6. Seqüenciamento de Metagenome de Endosymbiont
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Representative Results
As espécies do Médio Oriente Ásia Menor 1 (MEAM1) do complexo B. tabaci foram tomadas como exemplo aqui para descrição. O algodão para a criação de moscas brancas e vários estádios de desenvolvimento de moscas brancas são mostrados na Figura 1, incluindo uma planta de algodão, mosca branca adulta e as ninfas 1ª, 2ª e 4ª instar da mosca branca (a ninfa do 3º instar parece similar à ninfa do 4º instar ). Era óbvio que a ninfa do 4º instar é maior que as ninfas do 1º e 2º instar ( Figura 1 ). A análise FISH de Portiera e Hamiltonella dentro do MEAM1 é mostrada na Figura 2 . Esses dois endossimbiontes são confinados aos bacteriócitos da mosca branca, e a sobreposição das duas bactérias também é observada. A Figura 3 mostra o eletro de transmissão Imagens de tron microscopia do endosimbio de Portiera da mosca branca, o que indica que a Portiera pode perder a parede celular.
Para o seqüenciamento, foram construídas duas bibliotecas, com tamanhos de inserção de 200 pb e 2.000 pb, respectivamente. Após a seqüenciamento, as duas bibliotecas geraram 1.626 Mb e 1.302 Mb de dados brutos, respectivamente. Após a limpeza dos dados de contaminação para adaptadores e duplicações, foram adquiridos 1.484 Mb e 1.219 Mb de dados limpos. A montagem resultou em uma sequência de genoma completa para o simbionte obrigatório, Portiera . Além disso, um genoma de rascunho de Hamiltonella também foi obtido. A montagem baseada em bibliotecas de 200 pb e 2.000 pb resultou em 138 contigs. De acordo com os relacionamentos emparelhados, os 138 contigs foram novamente montados em 89 andaimes ( Tabela 2 ).
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Figura 1: Visão geral do sistema de insetos vegetais utilizado neste documento. ( A ) As moscas brancas são criadas em plantas de algodão ( Gossypium hirsutum cv. Zhe-Mian 1793). ( B ) Vista de uma mosca branca adulta. ( C ) Vários estádios de desenvolvimento da ninfa do instar no ciclo de vida da mosca branca. A seta vermelha refere-se ao ovo da mosca branca; A flecha preta refere-se à ninfa da mosca branca do 1º estádio; A flecha branca se refere à 2 ª ninfa da mosca branca; A seta azul refere-se à ninfa da mosca branca do 4º instar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Análise FISH de Portiera , PresuntoIltonella na 4ª Instinca da Ninfa de MEAM1. Foi utilizada uma sonda especifica de Portiera (vermelha) conjugada com Cy3, uma sonda específica de Hamiltonella (verde) marcada com Cy5. Barras de escala = 100 μm. ( A ) Os sinais de hibridação vermelha representam a Portiera em campo escuro. ( B ) Os sinais de hibridação verde representam o Hamiltonella em um campo escuro. ( C ) Portiera e Hamiltonella fundiram sinais em campo escuro. ( D ) Portiera e Hamiltonella fundiram sinais sob campo brilhante . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Transmissão Electron MicroScopy Imagem de Portiera em Whitefly. A seta indica a localização da Portiera. Barra de escala = 1 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Símbolo alvo | Gene alvo | Primeiras sequências (5'-3 ') | Procedimentos de PCR | Referências | ||
| Portiera | ARNr 16S | Por-F: TGCAAGTCGAGCGGCATCAT | 95 ° C 1 min, 60 ° C 1 min, 72 ° C 1 min, 5 ciclos; | 27 | ||
| Por R: AAAGTTCCCGCCTTATGCGT | 9576; C 1 min, 58 ° C 1 min, 72 ° C 1 min, 30 ciclos; | |||||
| 72 ° C 20 min | ||||||
| Hamiltonella | ARNr 16S | Ham-F: TGAGTAAAGTCTGGGAATCTGG | 95 ° C 1 min, 60 ° C 1 min, 72 ° C 1 min, 5 ciclos; | 27 | ||
| Ham-R: CCCGGGAACGTATTCACCGTAG | 95 ° C 1 min, 58 ° C 1 min, 72 ° C 1 min, 30 ciclos; | |||||
| 72 ° C 20 min | ||||||
| Rickettsia | ARNr 16S | Ric-F: GCTCAGAACGAACGCTATC | 95 ° C 2 min; | 24 | ||
| Ric-R: GAAGGAAAGCATCTCTGC | 92 ° C 1 min, 58 °C 1 min, 72 ° C 90 s, 30 ciclos; | |||||
| 72 ° C 5 min | ||||||
| Arsenofono | ARNr 23S | Ars-F: CGTTTGATGAATTCATAGTCAAA | 95 ° C 5 min; | 28 | ||
| Ars-R: GGTCCTCCAGTTAGTGTTACCCAAC | 95 ° C 30 s, 60,5 ° C 30 s, 72 ° C 45 s, 30 ciclos; | |||||
| 72 ° C 10 min | ||||||
| Cardinium | ARNr 16S | Car-F: TACTGTAAGAATAAGCACCGGC | 95 ° C 2 min | 29 | ||
| Car-R: GTGGATCACTTAACGCTTTCG | 92 ° C 1 min, 57 ° C 1 min, 72 ° C 90 s, 30 ciclos; | |||||
| 72 ° C 5 min | ||||||
| Wolbachia | ARNr 16S | Wol-F: TTGTAGCCTGCTATGGTATAACT | 94 ° C 5 min; | 30, 31 | ||
| Wol-R: GAATAGGTATGATTTTCATGT | 94 ° C 1 min, 55 ° C 1 min, 72 ° C 1 min, 35 ciclos | |||||
| Fritschea | ARNr 23S | Fri-F: GATGCCTTGGCATTGATAGGCGATGAAGGA | 95 ° C 5 min; | 32 | ||
| Fri-R: TGGCTCATCATGCAAAAGGCA | 94 ° C 1 min, 64 ° C 1 min, 72 ° C 90 s, 35 ciclos; | |||||
| 72 ° C 5 min | ||||||
| Hemipteriphilus | GroEL | OR- groEL -F: CACCWAAAATTACTAAAGATGG | 94 ° C 3 min; | 18 | ||
| OR- groEL -R: TAGAARTCCATWCCKCCCATWC | 94 ° C 30 s, 52 ° C 30 s, 72 ° C 2 min, 34 ciclos; | |||||
| 72 ° C 10 min | ||||||
Tabela 1: Imprimações e Procedimentos de PCR de endosimbiltes em Whitefly.
| Portiera | Hamiltonella | |
| Número Contig | 1 | 138 |
| Número do andaime a | 1 | 89 |
| Comprimento total, pb | 358.232 | 1.711.449 |
| N50, pb | / | 118.802 |
| N90, pb | / | 16.753 |
| Comprimento máximo, bp | / | 390,511 |
| Comprimento mínimo, bp | / | 503 |
| Conteúdo GC,% | 26.18 | 39,89 |
| A Informação apresentada abaixo é baseada em andaimes. | ||
Tabela 2: Características gerais de Portiera e Hamiltonella Draft Genome.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
O apoio financeiro para este estudo foi fornecido pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Chave (2016YFC1200601) e a Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (31390421).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq DNA polymerase | Takara | R001A | including rTaq, 10×Buffer and dNTP |
| Gel DNA extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| DNA sample sequencing system | ABI | ABI-3730XL | |
| Microtome | Leica | EM UC7 | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7650 TEM | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| 20 μL microloader | Eppendorf | F2771951 | |
| Filter holder | Millipore | SX0001300 | |
| Filter membrane filter | Millipore | SMWP001300 | 5.0 μm SMWP |
| REPLI-g UltraFast Mini Kit | Qiagen | 150033 | DNA amlification kit |
| NanoDrop | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Genome Sequencer | Illumina | Hiseq 2000 |
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