Summary
Bu yazı, 'Saat Tarama' görüntü analizi için iki yeni ImageJ eklentisini açıklamaktadır. Bu eklentiler orijinal görsel temel 6 programının işlevselliğini genişletir ve daha da önemlisi, programı büyük bir araştırma topluluğunda ImageJ ücretsiz resim analizi yazılım paketi ile paketleyerek kullanılabilir hale getirir.
Abstract
Görüntü analizi için saat tarama protokolü, sınırdaki ve dışındaki (arka plan) kapalı veya bölmeli dışbükey biçimli bir bölge içindeki ortalama piksel yoğunluğunu ölçmek için etkili bir araçtır ve bu da ortalama bir radyal piksel- Yoğunluk profili. Bu protokol aslen 2006'da görsel bir temel 6 senaryo olarak geliştirildi, ancak öyle olduğu gibi dağılımı sınırlıydı. Bu soruna hitap etmek ve başkaları tarafından benzer yeni çabalara katılmak için orijinal saat tarama protokol kodunu, NIH sponsorluğunda ve ImageJ veya Fiji ImageJ gibi özgürce mevcut görüntü analiz programlarıyla uyumlu olan iki Java tabanlı eklentiye dönüştürdük. Ayrıca, bu eklentilerin, birkaç farklı bölgenin analizi gibi orijinal protokolün yeteneklerini daha da genişleten birkaç yeni işlevi vardır. Programın ikinci özelliği, özellikle ilgili değişiklikleri belirlemenin önemli olduğu uygulamalarda yararlıdır.Zamana ve yere. Bu nedenle, biyolojik görüntü yığınlarının saat tarama analizi, tek bir hücre içerisinde Na + veya Ca ++ ' nin yayılmasının yanı sıra, sinaptik popülasyonlarda yayılma aktivitesinin ( örn. , Ca ++ dalgaları) analizine de uygulanabilir Bağlantılı veya boşluk birleşim bağlantılı hücreler. Burada, bu yeni saat tarama eklentilerini açıklıyor ve görüntü analizindeki uygulamalarının bazı örneklerini gösteriyoruz.
Introduction
Bu çalışmanın amacı, bu tür bir görüntü analiziyle ilgilenen herhangi bir araştırmacıya platformdan bağımsız ve serbestçe erişilebilen bir Saat Tarama protokolü sunmaktır. Saat Tarama protokolü, daha iyi bütünleştirici kapasiteye ve gelişmiş mekansal çözünürlüğe sahip bir yöntem olan, konveks biçimli ilgi alanı (ROI) içindeki mevcut piksel yoğunluğu niceleme yöntemlerini geliştirmeyi amaçlayan, orijinal olarak 2006'da geliştirildi. Satın alma işlemi sırasında, protokol, "arka plan" piksel yoğunluğunu ölçmek amacıyla ROI merkezinden kenara veya taramalı ROI dışındaki önceden belirlenmiş bir mesafeye taranan ardışık radyal piksel yoğunluğu profillerini toplar. Protokol, tarama yönünde ölçülen hücre yarıçapına göre bu profilleri ölçeklendirir. Böylece, merkezden her bir radyal taramanın ROI sınırına olan uzaklığı daima X ölçeğinin% 100'üdür. Son olarak, program bu kişileri ortalama olarakAl profillerini tek bir radyal piksel yoğunluğu profiline dönüştürür. Ölçekleme nedeniyle, "Saat Tarama" protokolü tarafından üretilen ortalama piksel yoğunluğu profili, ne ROI boyutu ne de makul sınırlar içinde ROI şekline bağlı değildir. Bu yöntem, doğrudan ROI'lerin profillerinin doğrudan karşılaştırılmasını veya gerekirse ortalamasını veya çıkarılmasını sağlar. Protokol, nesnenin dışında bulunan piksellerin ortalama yoğunluğunun basit bir çıkarılmasıyla arka plan gürültüsü için herhangi bir nesnenin integral piksel yoğunluğu profillerinin düzeltilmesine de olanak tanır. Sadece biyolojik örneklerde test edilmiş olsa da, protokolümüz orijinal bir noktanın etrafında düzenlenmiş fiziksel veya kimyasal süreç görüntüleri çalışmalarında kullanılan diğer mevcut görüntü analiz araçlarına değerli bir katkı sağlar (maddelerin bir nokta kaynaktan difüzyonu ) 1 .
Bununla birlikte, orijinal görüntü analiz yönteminin en büyük kısıtlılığı protokolün devBir Visual Basic 6 (VB6) (kod ve bu nedenle, platforma bağımlı ve dağıtmak zordu (VB6 gerektiren) idi.) Bu soruna hitap etmek ve diğer araştırmacılar tarafından benzer yeni çabalara katılmak için 2 , VB6 Saat Taramasını Program kodunu NIH destekli ve serbestçe temin edilebilir açık kaynak ve platformdan bağımsız görüntü analiz programlarıyla uyumlu ImageJ 3 ve Fiji ImageJ 4'e sahip iki Java tabanlı eklentiye dönüştürür.Ayrıca bu eklentiler, Birden fazla ROI ve görüntü yığınını işlemek için orijinal protokolün birçoğu.Birçok görüntü analizi uygulaması, birden çok nesnenin istatistiksel analizini gerçekleştirmek açısından kullanıcı dostu değildir ve bu nedenle genellikle sadece temsili veriler gösterilmektedir .. Çok Saatli Tarama ImageJ eklentisi ile, Aynı anda birden çok nesnenin analizini kolaylaştırmak mümkündür Mikroskopi verilerinin sağlam istatistiksel değerlendirmesi,Tekli hücreler / nesnelerdeki sinyal yoğunluğu dağılımı ile ilgili olarak, artık bu eklenti uzantısı ile mümkündür. Burada, Saat Tarama eklentilerini açıklıyor ve görüntü analizindeki uygulamalarının örneklerini gösteriyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Yazılım Kurulumu
- Paketlenmiş Java ve ImageJ veya Fiji ImageJ'in ilgili web sitelerinde önerilen en son sürümlerini yükleyin (ilgili web sitelerine bağlantılar için malzeme tablosuna bakın). Aşağıdaki metinde her iki programa "ImageJ" denir.
- Malzeme tablosunda verilen bağlantıyı kullanarak "Clock_Scan-1.0.1. Jar" ve "Multi_Clock_Scan-1.0.1.jar" eklenti dosyalarını kopyalayıp bunları ImageJ eklenti dizinine yapıştırın. Alternatif olarak, bu dosyalar bilgisayarın sabit disk sürücüsüne kaydedildikten sonra yüklemek için "Eklentiler | Yükleme eklentisi" menü seçeneğini kullanın.
2. Saat Tarama analizi
- Standart Saat Tarama eklentisi ( Şekil 1 ):
- İlgi çekici bir resmi açmak için ImageJ "Dosya | Aç" menü komutunu kullanın.
- 'Çokgen' aracını veya 'bölümlü çizgi seçimi'ni tıklayınAracı seçin ve ardından ROI'nin tamamını veya bu bölgenin bir bölümünü anahatlamak için görüntüyü çizin. Çokgen seçimi örneği (iç kesikli çizgi) için bkz. Şekil 1A.
NOT: Yazılımda bulunan diğer seçim araçları (dikdörtgen, oval ve serbest el çizgisi seçimi) de kullanılabilir. - Standart saat tarama protokolü açılır pencere seçenek penceresini açmak için menüden "Eklentiler | Saat Taraması" nı seçin. Bu komutun ROI Yöneticisi penceresini otomatik olarak eklenen anahatla birlikte açacağını unutmayın.
- Aşağıdakileri yapmak için eklenti seçenek penceresini kullanın.
- Kaydırma çubuklarını kullanarak veya ilgili giriş kutularındaki değerleri değiştirerek ROI merkezinin X ve Y koordinatlarını gözden geçirin ve değiştirin (fiziksel kütle merkezinin koordinatları olarak otomatik olarak hesaplanır). Şekil 1 B'ye bakın.
- Nesne dışındaki arka plan bölgesinin ne kadarına bağlı olarakTarama kapsamına girmek için "tarama limiti" kaydırma çubuğunu kullanarak tarama sınırlarını ayarlayın. Bakınız Şekil 1 A.
NOT: Tarama sınırı, taramanın belirli bir yönde nesne sınırının ötesine ne kadar ilerleyeceğini gösteren kesirli sayıdır; Varsayılan değer 1.20 olup tarama uzunluğu tarama yönünde nesne yarıçapından% 20 daha uzun olacağını belirtir; Bakınız Şekil 1A, dışa kesik çizgi). - "Gerçek yarıçap", "arka plan çıkar", "kutup dönüşümü" ve / veya "standart sapma ile çizim" onay kutularını kullanarak eklentinin çıktısını değiştirin.
- Eklentiyi çalıştırmak için "Tamam" ı tıklayın. Bakınız Şekil 1 C-H .
NOT: "Standart sapma ile çizim" ve "kutupsal dönüşüm" ya da "gerçek yarıçap" ve "kutupsal transfüzyon" protokollerinin çıktı örnekleriOrm "seçenekleri seçildiğinde, sırasıyla Şekil 1C ve 1D ve Şekil 1E ve 1F'de gösterilmiştir Hesaplanan standart sapma (SD) değerleri, nesnenin radyal piksel yoğunluk taramaları arasındaki değişimi göstermektedir Not Ayrıca" ROI seçimi Piksel olarak ölçülen ROI anahat uzunluğu hakkındaki bilgileri görüntüleyen eklenti penceresinde "uzunluk" satırı içerir.
- Oluşturulan "Saat Tarama Profili Çizimi" nde, Gri tonlama görüntüleri için iki, X ve Y veri sütunlarında ve RGB görüntüler için X ve dört Y veri sütununda gösterilen değerleri çizmek için "Liste" komutunu kullanın; bunlardan Y0, Y1, Y2 ve Y3 sütunları, integral ve bireysel (kırmızı, yeşil ve mavi) renk kanalı piksel yoğunluk değerleri ile doldurulacaktır.
- Çoklu ROI Saat Tarama eklentisi - birden fazla ROI ile çalışma (
): - Birden fazla ROI içeren bir resim açın.
- "Çözümle | Araçlar | ROI Yöneticisi" yi tıklayarak ROI Yöneticisi'ni açın.
- Ardışık olarak özetleyin (adım 2.1.2'ye bakın) ve ROI Yöneticisi penceresine "Ekle" düğmesini tıklatarak ROI Yöneticisine her bir ROI'yi ekleyin; Bunu görüntüdeki tüm ROI'ler için yapın. ROI metrikleri ilgileniyorsa, "Analyze | Measure" komutunu kullanın.
- Birden çok parçalı çizgi seçimi örneği için Şekil 2A'ya ve çoklu çokgen seçimlerine örnek olarak Şekil 2E'ye bakınız.
- Protokol seçenekleri açılır penceresini açmak için "Eklentiler" menüsünden "Çoklu Saat Taraması" nı seçin.
- Aşağıdakileri yapmak için protokol seçenek penceresini kullanın.
- Gerekirse, tarama sınırını adım 2.1.4.2'ye göre sıfırlayın; Varsayılan değer 1.20'dir.
- Gerekirse opt'ı seçinStandart sapma ile çiz "kutusunu işaretleyerek SD çubuklarıyla ortalama saat tarama profilini çizmek için kullanın. Bakınız Şekil 2 C ve D.
NOT: Hesaplanan SD değerleri, farklı nesnelerin ayrılmaz saat tarama profilleri arasındaki değişimi temsil edecektir. Ayrıca eklenti penceresindeki "seçilen ROI'lerin sayısı" ile ilgili bilgileri gösteren satırı unutmayın. - Protokolü çalıştırmak için "Tamam" ı tıklayın.
- Oluşturulan "Saat Tarama Profili Plotu" nda, "Plot Values" penceresinde görüntülenen değerleri çizmek için "List" komutunu kullanın. Renk kanalına göre sütun atanması için "Multi Clock Scan Profile Plot" penceresi göstergesine bakın.
- ROI'lerin numaralandırıldığına ve belirli bir renk kanalı için saat tarama profillerinin, ROI'lerin ana hatlarıyla çizildiği ve "ROI Yöneticisi" ne eklendiği sırayla çizildiğine dikkat edin.
- MulTiple ROI Saat Tarama eklentisi - bir görüntü yığınıyla çalışmak ( Şekil 3 ):
- İlgilenilen bir görüntü yığını açın.
- "Çözümle | Araçlar | ROI Yöneticisi" yi tıklayarak ROI Yöneticisi'ni açın.
- 2.1.2 ve 2.2.3 adımlarında açıklandığı gibi, yığın içindeki görüntülerin ROI'sini özetleyip ROI yöneticisine ekleyin. ROI metrikleri ilgileniyorsa, "Analyze | Measure" komutunu kullanın.
- Protokol seçenekleri açılır penceresini açmak için "Eklentiler" menüsünden "Çoklu Saat Taraması" nı seçin.
- Aşağıdakileri yapmak için protokol seçenek penceresini kullanın.
- Tarama sınırını adım 2.1.4.2'de açıklandığı gibi sıfırlayın; Varsayılan değer 1.20'dir.
- 'Ortalama sapma ile çizim' kutusunu işaretleyerek, SD tarama çubuklarıyla ortalama saat tarama profilini çizme seçeneğini seçin.
NOT: Hesaplanmış SD değerleri, görüntü stanasında seçilen nesnenin farklı örnekleri arasındaki değişimi temsil edecektirck. Ayrıca, eklenti penceresindeki "sayıdaki yığın sayısı" ile ilgili bilgileri gösteren satırı unutmayın. - Protokolü çalıştırmak için "Tamam" ı tıklayın.
- "Saat Tarama Profili Çizimi" penceresinde, "Çizim Değerleri" penceresinde görüntülenen değerleri (Y sütun numarasının yığın içindeki görüntü konumunu temsil ettiği - 1) gösteren değerleri görüntülemek için "Liste" yi tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Buraya illüstrasyon amacıyla kullanılan resimler, önceki hücre ve doku biyolojik çalışmalarımızda 5 , 6 , 7 ve Allen Mouse Brain Atlas 8'de oluşturulan veritabanlarından alınmıştır. Her iki eklenti de ImageJ 1.50i / Java 1.8.0_77, ImageJ 2.0.0-rc-44 / 1.50e / Java 1.8.9_66 ve Fiji ImageJ 2.0.0-rc54 / 1.51g / Java 1.8.0_66 program ortamı kullanılarak başarıyla test edildi.
Şekil 1 , standart bir Saat Taraması eklentisi ile görüntü analizinin temsili sonuçlarını göstermektedir. Her iki eklenti için, saat tarama prosedürünün temel kodu ve ana adımları asıl protokol 1'de açıklandığı gibi esasen aynıdır. Kısaca, ROI'dan veya ROI'nın bir bölümünün resim üzerinde açıklandıktan sonra ( Şekil 1 A , iç sarı dış çizgi) ve anahat merkezi belirlenir (eklenti seçenek penceresiyle ( Şekil 1 B ) otomatik veya manuel olarak belirlenir, piksel yoğunluğunun radyal taraması merkezin ilk piksele yönünde başlar Tüm ROI yarıçapları taranana kadar, anahat boyunca ( Şekil 1A; sırasıyla düz vektör ve kavisli ok) piksel-pikselle saat yönünde devam eder. ROI arka plan yoğunluğunu ölçmek için, her radyal taramanın uzunluğu taramanın yönündeki ROI yarıçapını önceden belirlenmiş bir kesirli sayıya (Saat Taraması eklentisinin varsayılan değeri olan yarıçapın% 0.2 veya% 20'si kadar) kadar ayarlayabilir , Şekil 1 A'da dış sarı çizgi). Toplanan radyal profiller daha sonra ilgili yarıçaplara ölçeklendirilerek hizalanır ve 2'de integral saat tarama yoğunluğu profili elde etmek için ortalaması alınır56 gri tonlama birimi şiddeti seviyeleri ( Şekil 1 C ). RGB görüntüleri için her iki eklenti, kombine bir renk profiline ek olarak otomatik olarak her bir renk kanalı için bağımsız integral radyal piksel yoğunluğu profilleri (kırmızı, yeşil ve mavi renklerin 256 yoğunluk seviyesi) üretir.
Varsayılan olarak, saat tarama piksel yoğunluğu profilinin x ölçeği normalleştirilmiş ROI yarıçapını temsil eder ve ölçek% 100'ü ROI sınırında bulunan pikselleri temsil eder ( Şekil 1 C ). Şekil 1 C'de gösterilen profil "standart sapma ile çizim" seçeneği seçilerek oluşturulmuştur ve bu nedenle grafik, profilin X ölçeği boyunca her veri noktası için hesaplanan SD'yi de görüntüler. "Arka planı çıkar" seçeneği seçildiğinde, tüm yoğunluk profili, arka plan no için düzeltilirROI sınırı ile tarama sınırı sınırı ( Şekil 1 A'daki dış sarı çizgi; gösterilmemiş veriler) arasında yer alan ortalama piksel yoğunluğunun noktadan noktaya çıkarılması ile ölçülür. "Kutup dönüşümü" seçeneği seçilirse, saat tarama eklentisi ek bir çıkış penceresi oluşturur. Seçilen bölgenin, tarama sınır bölgesi dahilinde görüntüsünün kutupsal bir dönüşümü vardır; burada, görüntü her radyal tarama yönünde merkezden nesneye sınırla her zaman 100'e normalize olacak şekilde değiştirilir. % Ve 100 piksel ile temsil edilmektedir. Nesnenin gerçek boyutundan bağımsız olarak kutupsal dönüşüm resminin dikey ve yatay boyutları, piksel cinsinden taramanın iki katına (Şekil 1D'de gösterilen örnekte 240 piksel x 240 piksel) sahiptir. Son olarak, "gerçek yarıçap" seçeneğini belirlemek, saat tarama prNesnenin gerçek yarıçapı yarıçapı ve orijinal görüntünün mekansal kalibrasyon birimleri cinsinden ölçeklendirilmiş bir polar dönüşüm görüntüsü (sırasıyla Şekil 1E ve F ).
Şekiller 1G ve H , nesne boyutu ve şekil bağımsız polar dönüştürme ve entegre ImageJ komutları ve araçları kullanarak ek görüntü analiz seçeneklerini göstermektedir. Belirli görüntü analizi türleri için yararlı sayılan komutların örnekleri, bölümlü çizgi aracı ve "Analiz Et Plot Profili" komutu ( Şekil 1 G ) ve "Analiz Et | Yüzey Plotu" komutudur ( Şekil 1 H ).
Şekil 2 ve 3 , Çok Saatli Tarama eklentisi ile görüntü analizinin temsili sonuçlarını göstermektedir. ÇıktısıÇoklu saat taraması eklentisi iki grafikten oluşur: ilk grafik seçilen nesnelerin tek tek saat tarama profillerini gösterir ( Şekil 2C) ve ikinci grafik bu tek tek saat tarama profillerinin ortalamasını gösterir (isteğe bağlı olarak ± SD, isteğe bağlı; Şekil 2D ) . RGB görüntüleri için ( Şekil 2 E ) her bir renk kanalı için hesaplanan saat tarama profili, seçilen her ROI için de görüntülenir ( Şekil 2 F ) ve ortalama, seçilen tüm nesneler için belirli bir kanal içinde hesaplanır ( Şekil 2G ) . Benzer şekilde, görüntü yığındaki nesneler için bireysel ve ortalama saat tarama profilleri, yığının saat taraması analizini yaptıktan sonra görüntülenir ( Şekil 3A-3D , ortalama saat tarama profili gösterilmemektedir). Daha önce belirtildiği gibi, sayısal"List" komutu uygulanarak bu arsaların üretilmesi için al veri kullanılır.
Şekil 4 , Saat Tarama eklentisindeki polar dönüşüm seçeneğinin bir ek uygulamasını göstermektedir: görüntü kaydı ve bindirme işlemleri için uygunluğu. Bu şekilde, farklı fare korteks bölgelerindeki a3 sodyum / potasyum-ATPaz pompa eksprese eden nöronların flüoresan etiketlemesinin dağılımını karşılaştırmak için ROI boyutu ve şekilden bağımsız kutupsal dönüşümler kullanıldı, atlas görüntüsü sınırları ve anatomik organizasyonu gösterdi. Bu bölgeler ( Şekiller 4A-4B ). Bir saat tarama protokolüyle, referans (atlas) kaydı ve bu karşılaştırma için gereken gerçek görüntüler, görüntüleri hizalamak, her iki görüntüye ilgi yapısını gösteren basit bir prosedür ile sınırlıdır ve daha sonra ROI boyutu ve şekli üretir; Bağımsız kutupsal dönüşümler.Şekil 4'te gösterilen örnekte, kutupsal dönüşümlerin karşılaştırılması neticesinde, fare beyin korteksindeki etiketli hücrelerin dağınık olmayan dağılımı açıkça gösterilir; yoğunluğu, motor korteksin 2 / 3'üncü tabakalarının yüzeysel bölgelerinde özellikle yüksektir, dorsal kısım Agranular insular korteksin, lateral orbital korteksin ve motor korteksin derin tabakalarında ( Şekil 4C-4D ).
Şekil 1 : Resim Analizi için Saat Tarama Eklentisinin Uygulanmasına İlişkin Temsilci Örnek. ( A ) Na + / K + - ATPaz'ın α3 izoformu (α3 NKA; doku işleme ve boyama ayrıntıları için bkz. Schneider ve ark.3) için immünostained bir fare dorsal kök gangliyonunun bir bölümünün flüoresan ışığı görüntüsü.Sınırları α3 NKA (beyaz) olarak etiketlenmiş nöronal profillerden biri, çokgen çizgi aracı (iç sarı çizgi) kullanılarak özetlenmiştir. Panel B'de (tarama limiti kaydırma çubuğu) gösterildiği gibi, radyal tarama (beyaz ok) sınırları (dış sarı çizgi) nesne yarıçapının% 120'sine nesne merkezinden (beyaz nokta) ana hattın ilk pikseline ayarlandı. ( B ) Saat Tarama eklentisinin ana seçenek penceresinin ekran görüntüsü. ( C ) Panel A'da gösterilen hücrenin integral piksel yoğunluğu profili (706 radyal tarama profilinin ortalaması, B'deki anahat uzunluğu; dikey çubuklar SD çubuklarıdır). ( D ) - Çalışılan hücre profilinin kutupsal dönüşümü imgesi. ( E ) "Gerçek yarıçap" seçeneği seçilerek elde edilen aynı hücrenin saat tarama profili. C'de gösterilen profilin aksine, bu profilin x ölçeği gerçek mekansal kalibrasyon birimlerini (μm) görüntüler. ( F ) Elde edilen aynı hücrenin kutupsal dönüşümü "Gerçek yarıçap" seçeneği seçildi. Bu dönüşümün ölçeğinin artık gerçek uzaysal kalibrasyon birimlerinde (μm) olduğunu unutmayın. ( G ) D olarak gösterilen polar dönüşümün sınırı, bölümlü çizgi aracı (çizgi kalınlığı 10 piksele veya radyal tarama uzunluğunun% 10'una ayarlandı) kullanılarak özetlendi ve analiz edildi. Nesnenin kenarı boyunca ortalama etiketleme yoğunluğundaki değişiklikleri ölçmek için "Analiz Et Plot Profili" komutu uygulandı (grafiğin her veri noktası, seçim satırı genişliğindeki tüm piksellerin ortalama yoğunluğunu temsil eder). ( H ) Nesnenin etiketleme yoğunluğunun 3-D gösterimini oluşturmak için D panelinde gösterilen kutupsal dönüşüm görüntüsüne "Analize | Surface Plot" komutu uygulandı. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
E 2 "class =" xfigimg "src =" / dosyalar / ftp_upload / 55819 / 55819fig2.jpg "/>
Şekil 2 : Temsilci Örnek Resim Analizi için Çok Saatli Tarama Eklentisi Kullanma uygulaması. ( A ) α3 NKA için immünolojik olarak sıçan dorsal kök gangliyonunun kesitinde dört görüş alanı ele geçirildi (bkz. Şekil 1 A efsaneye bakınız). Çok saatli tarama eklentisinin kullanımını basitleştirmek için bu görüntüler bir yığın içine yerleştirildi ve daha sonra "Görüntü | Yığınlar | Montaj Yap" komutu kullanılarak tek bir görüntüye dönüştürüldü. Kırmızı çizgiler ve sayılar, bu resimdeki beş bölgenin parçalanmış bir satır seçimlerine işaret etmektedir. ( B ) Çok Saatli Tarama penceresinin bir ekran görüntüsü, eklenti bir gri ölçekli görüntüyü analiz etmek için kullanıldığında gösterilir. ( C ) Panelde A'da gösterilen beş ROI'ün bireysel saat tarama profilleri. ( D ) Seçilen ROI'ler için ortalama saat tarama profili (panelA) SD çubuklarla ("standart sapma ile çizelge" seçildi). ( E ) 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI, çekirdek lekesi, mavi) ve floresanla işaretlenmiş antikorlar ile etiketlenmiş kültürlenmiş fare preBI-lenfositlerinin RGB görüntüsü β1-integrin (yeşil) ve F-aktin (kırmızı Hücre kültürü tekniği için Dobretsov ve diğerleri 7'ye ve boyama ayrıntıları için Yuryev ve diğerleri 11'e bakınız). On bir hücre (bkz. Sayı etiketleri) ImageJ çokgen seçme aracı kullanılarak özetlendi. Sağdaki paneller "Resim | Renk | Bölünmüş Kanallar" menü işlevi yürütüldükten sonra hücre # 7'nin yeşil ve kırmızı kanal görünümünü (sol paneldeki dikdörtgen seçki) gösterir. ( F ) Bireysel hücre saat tarama profilleri (kompozit ve kırmızı, yeşil ve mavi renk kanal profilleri sırasıyla siyah, kırmızı, yeşil ve mavi çizgilerle gösterilir). ( G ) Panelde seçilen onbir tüm ROI'ler için ortalama saat tarama profilleriE. Panel G'deki gibi renk tanımlamaları (Çok Saatli Tarama prosedürü sırasında standart sapma seçeneğine sahip herhangi bir grafik kullanılmamıştır). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3 : Çok Saatli Tarama Eklentisi ve Görüntü Yığınlarının Analizi. ( A ) Seçili ve "yığın olarak kaydedilmiş" görüntü çerçevelerinin montajı. İlk karede, diferansiyel interferans kontrastlı (DIC) mikroskopi ile yakalanan bir dorsal kök gangliyon nöronunun bir görüntüsü gösterilmektedir. Sonraki çerçeve, hücrenin elektriksel uyarımı öncesinde ve sonrasında farklı zaman aralıklarında hücre içi kalsiyum konsantrasyonunun izlenmesi için epi-aydınlatma flüoresan mikroskobu kullanılarak elde edildi. Saygının yanındaki numaralarE resim saati ms cinsinden gösterir 6 . Hücrenin kenarlığı, yığının DIC görüntüsü (sol üst çerçeve; yıldız işareti, hücrenin kalsiyuma duyarlı boya Oregon Green BAPTA-1 (OGB-1) ile doldurulması ve doldurulması için kullanılan patch-clamp pipetini belirtir) ) Ve daha sonra kalan görüntülerde Çok Saatli Tarama prosedürünü çalıştırmak için kullanılır. ( B ) Çoklu Saat Tarama penceresinin ekran görüntüsü, program bir yığın görüntü üzerinde çalıştırıldığında. ( C ) OGB-1 flüoresan sinyalinin hücre merkezinden (yarıçapın% 'si) farklı mesafelerde ve elektriksel uyarılmadan önce ve sonra farklı zamanlarda saatlik tarama profilleri (gösterge, ms cinsinden). Bu grafikleri hazırlamak için profesyonel grafik yazılımı kullanıldı. ( D ) Alt membran ve daha derin sitoplazmik hücre bölgelerinde zamanla OGB-1 sinyalinin yoğunluğundaki değişiklikler (sırasıyla kırmızı ve siyah daireler ve çizgiler). Bu verileri elde etmek için, her veri noktası yeri için ortalama ve SD hesaplandıC panelinde (gölgeli alanlar) gösterilen her saat tarama profilinin x ölçeğinin% 20-40'ı ve% 70-90'ı arasındadır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 4 : Resim Kaydı ve Yer Paylaşımı'nda Saat Tarama Eklentisini kullanma örneği. ( A ve B ) Koronal bölümden (Allen Mouse Brain Atlas) alınan plakanın 29 ekran görüntüleri ve atlas görüntüsü ile hemen hemen aynı seviyede kesilmiş jelatin gömülü fare beyininden 200 μm kalınlığında bir vibratome bölümü. Bu örnekte kullanılan transgenik fare α3NKA ifade eden nöronları tanımlamak için α3NKA'nın promotoru altında ZsGreen-flüoresan proteini ifade etmiştir 2 . Belirlemek içinBu nöronlarla zenginleştirilmiş korteks bölgelerinde (panel B'deki görüntü üzerinde parlak noktalar), aynı referans noktasına sahip her iki görüntüden (korteks ve koku arasındaki orta sınırdan başlayarak) tüm kortikal alan çizildi (sarı kesikli çizgiler) Ampul; oklar). ( C ) Paneller (soldan sağa): Saat Tarama polar, fare beyin bölümünün (panel B) görüntüsündeki atlas görüntüsünde (panel A) seçilen ROI'yi ve bu iki dönüşüm imgesinin üst üste bindirilmesini ("Görüntü |% 50 donukluk ayarı ile Yer Paylaşımı | Resim Ekle "komutu). ( D ) Panel C'deki ile aynı görüntüler ancak ImageJ çokgenini, bölümlü çizgi seçim araçlarını ve "Çözümle Araçlar | Windows'u Senkronize Et" i kullanarak diğer iki dönüşüm görüntüsünde ana kortikal bölgelerin sınırları (atlasda gösterildiği gibi) komut. Kısaltmalar, orijinal beyin atlas görüntüsündeki gibidir: Motor primer ve sekonder (MOp, MOs), agranular adular, dorOrbital lateral, ventro-lateral ve medial (ORBI, ORBvl, ORBm), prelimbik (PL), anterior singulat, dorsal kısım (ACAd) korteks. MO alanında bulunan sayılar, uygun koronal beyin seviyesinde fare motor korteksinde ayırt edilebilen ana korteks tabakalarını ifade eder. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Saat Tarama Protokolü: Saat Tarama protokolü hızlı ve basit bir görüntü analizi aracıdır. Bu protokolün avantajları, görüntü analizinin mevcut yaygın yaklaşımları (doğrusal piksel yoğunluğu taramaları veya ROI'nin ortalama piksel yoğunluğunun hesaplanması gibi) ile karşılaştırıldığında önceki yayınlar 1 , 9'da ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Kısaca, bu protokol, nesnenin kenarlığı gibi ROI merkezinden farklı uzaklıklarda bulunan piksellerin yoğunluğunu veya nesnenin dışındaki önceden belirlenmiş bir yeri (arka plan) ölçerek tam radyal piksel yoğunluğu profillerinin oluşturulmasına izin verir. Bu nedenle, her ROI'nin saat tarama profilleri, (biyolojik uygulamalarda) bu profili lokal, örnek içi veya örnek-örnek arasındaki düzensizliklere daha az bağımlı hale getiren hemen arka planı için düzeltilebilir. Etiketleme / boyama yanı sıraMikroskop ışık kaynağının yoğunluğu veya floresan ışığa maruz kalma süreleri. Saat tarama profillerinin nesne boyutu ve şekli bağımsızlığı, bu protokolün uygulama alanını, farklı nesnelerin karşılaştırmalarına olanak tanıyarak ve ayrıca "pozitif" ve "negatif" kontrol profillerinin noktadan noktaya çıkarılması ile düzeltmektedir nesneler.
Saat Tarama Eklentileri: Orijinal protokolü dağıtma ve paylaşma konusundaki en büyük sınırlama, Visual Basic 6.0 (VB) 1 , 9 ile geliştirilen kodun platform bağımlılığıydı. Bu sorun yakın bir tarihte, benzer bir Fuji ImageJ Saat Tarama eklentisi geliştirerek, Almanya, Leibniz Moleküler Farmakoloji Enstitüsündeki araştırma gruplarından biri tarafından ele alınmıştır 2 . Leibniz Enstitüsünün eklentisi orijinal saat taramasını, temel işlevselliği inteKapalı dış bükey şekil ROI için gral radyal tarama profilleri ve ek olarak dış çizgilerin bölümlerini işleyebilir. Bununla birlikte, eklentileri tarafından oluşturulan profilin tarama sınırı yalnızca% 100'e (nesne sınırı) ayarlanabilir; yani, arka plan piksel yoğunluğunun nicelleştirilemediği anlamına gelir. Üstelik kutupsal dönüşümler üretmek, RGB görüntülerindeki farklı renk kanallarıyla çalışmak veya görüntü yığınlarıyla çalışmak ve çoklu ROI'leri işlemek için hiçbir kapasiteye sahip değildir. Karşılaştırıldığında, burada açıklanan iki yeni eklenti, orijinal VB kodunun yeteneğini tamamen üretir ( diğer bir deyişle , isteğe bağlı ekran SD'leri ve / veya arka çıkarma ile integral saat tarama piksel yoğunluğu profillerinin yanı sıra RGB görüntüleri). Ek olarak, bir segment / yay şeklindeki ROI'yi (Leibniz Enstitüsü, Moleküler Farmakoloji 2'de geliştirilen Fuji ImageJ eklentisinde sunulan işlevselliği) analiz edebilirler. AyrıcaEse eklentileri, görüntü kayıt gerektiren uygulamalarda kullanılabilen ROI boyutu ve şekil bağımsız polar ROI görüntü dönüşümleri üreterek önceki programların yararını artırır. Son olarak, çok saatli tarama eklentisi aynı görüntüye veya bir görüntü yığında bulunan çok sayıda ROI'nin saat taramasını etkili bir şekilde kolaylaştırır. Programın yeni özelliği, zaman ve konumla ilgili değişiklikleri belirlemek için önemli olan uygulamalarda özellikle yararlıdır.
Sınırlamalar ve sorun giderme: Saat Tarama yönteminin başlıca kısıtlılığı konveks şeklinde bir ROI seçme gereksinimidir. Saat tarama profili, radyal tarardan herhangi birinin ROI anahattını bir kereden fazla geçtiği durumlarda anlamsız olur. Bu, merkezden ROI sınırına olan mesafeye göre bu radyal taramanın uzunluğunun normalleştirilmesini imkansız hale getirecektir. Bir diğer kısıtlama, saat tarama profili bilgilerinin progres olmasıdırRadyal simetri bulunmayan ROI'de şiddetle azalmıştır. Bununla birlikte, en azından kısmen, bu iki sınırlama, kompleks şekilli ve asimetrik ROI'lerin seçilen bölümlerinin (arklarının) analizi ile üstesinden gelinebilir. Arka plan çıkarma prosedürünü etkileyebilecek arka plan bölümlerinin bölümleri etiketlenmiş özellikler içeriyorsa, segment taramasının kullanılması da önerilir (diğer etiketlenmiş hücrelere bakmayan hücrelerin segmentlerinin analizi için bir örnek için Şekil 2A'ya bakın). Son olarak, eğer 3'den fazla renk kanalı içeren kompozit görüntülerin analizi gerekiyorsa, bu görüntülerin renk kanalları eklentiyi çalıştırmadan önce bölünmelidir.
Gelecekteki yönergeler: Bu eklentilerin işlevselliğinde gelecekteki iyileştirmeler, bunlarla sınırlı olmamak üzere, saat tarama ve çok saatli tarama eklentilerinin işlevselliğini bir eklentiye birleştirmek için kodu güncelleme içerir. Renk ko-yerelleştirme algoritmaları (algoritmalar basPearson korelasyonunun hesaplamaları veya Manders bölünmüş katsayıları) ve bir görüntü yığındaki farklı görüntülerde veya farklı dilimlerde seçilen çoklu ROI'lerle çalışabilecek eklentinin geliştirilmesi (eklentilerin mevcut sürümü, çeşitli Bir görüntüde seçilen ROI'lar veya yığın içindeki tüm görüntüler için seçilen bir ROI) uygulanacaktır. Yazarlar ayrıca, eklenti kullanıcılarından gelen tüm önerileri ve mevcut eklentilerin kullanımı sırasında karşılaşılan sorunların raporlarını takdir edeceklerdir.
Sonuç: Saat tarama analizi, çeşitli işaretleyicilerle statik hücre etiketlemesinin analizinden, Na + veya Ca ++ yayılımı çalışmalarına kadar tek bir hücrede olduğu gibi, biyolojinin birçok alanında görüntüleme çalışmalarında umut vaat eden bir araçtır. Sinaptik olarak bağlı hücrelerin popülasyonlarında yayılma aktivitesinin analizi ( ör . Ca ++ dalgaları) 10 11) veya aralık birleşim birleşimli hücreler ( 12) içerir . Saat tarama analizinin uygulanabilir diğer potansiyel alanları, tıbbi görüntü analizi (kan damarlarının ultrason görüntüleri, CT-tarama görüntüleri ve kemik kesitleri), astronomi (spiral ve radyal galaksi görüntüleme), kimya (nokta kaynağından difüzyon) Fizik (kırınım deseni analizi), ormancılık (ağacın yaşını belirlemek için ağaç kök halkası analizi ve kuru hava ve zayıf gübreleme dönemleri), mühendislik (metal boru korozyonu) ve iklimbilim (hava radarı görüntü analizi).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip mali çıkarları veya başka çıkar çatışması olmadıklarını beyan ettiler.
Acknowledgments
Fuji ImageJ Saat Tarama eklentisinin kendi versiyonunu bizimle paylaştığımız ve programın bu sürümünü geliştirmemiz için bize ilham verdiğiniz için Dr. Tanja Maritzen'e ve Dr. Fabian Feutlinske'ye (Berlin, Almanya, Leibniz Moleküler Farmakoloji Enstitüsü) teşekkür ediyoruz. Ayrıca eklentiyi test etmek ve geliştirmek amacıyla bölümünün veri tabanındaki görüntüleri kullanmak için kendi izninizle Dr. Fritz Melchers'a (Lymphocyte Development Departmanı, Max Planck Enfeksiyon Biyolojisi Enstitüsü) teşekkür ediyoruz. Destek: Translasyonel Sinirbilim Merkezi; NIH hibe: P30-GM110702-03.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer | Any | compatible with software listed below | |
| ImageJ or Fiji ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ or https://fiji.sc/ | bundled with Java 1.8 or higher |
| Clock-scan plugins | freeware | https://sourceforge.net/projects/clockscan/ | Clock_Scan-1.0.1 jar and Multi_Clock_Scan-1.0.1/ jar |
| Origin 9.0 | OriginLab | Northampton, MA, USA | This program was used to generate some graphs of the original Clock Scan data. Any other graphic software can be used to perform this function |
References
- Dobretsov, M., Romanovsky, D. "Clock-scan" protocol for image analysis. Am J Physiol Cell Physiol. 291, 869-879 (2006).
- Feutlinske, F., Browarski, M., Ku, M. C., et al. Stonin1 mediates endocytosis of the proteoglycan NG2 and regulates focal adhesion dynamics and cell motility. Nat Commun. 6, 8535 (2015).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
- Dobretsov, M., Hastings, S. L., Stimers, J. R. Non-uniform expression of alpha subunit isoforms of the Na+/K+ pump in rat dorsal root ganglia neurons. Brain Res. 821, 212-217 (1999).
- Hayar, A., Gu, C., Al-Chaer, E. D. An improved method for patch clamp recording and calcium imaging of neurons in the intact dorsal root ganglion in rats. J Neurosci Methods. 173, 74-82 (2008).
- Dobretsov, M., Pierce, D., Light, K. E., Kockara, N. T., Kozhemyakin, M., Wight, P. A. Transgenic mouse model to selectively identify alpha3 Na,K-ATPase expressing cells in the nervous system. Society for Neuroscience. , Online Program No. 123.01/B54 1 (2015).
- Lein, E. S., Hawrylycz, M. J., Ao, N., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445, 168-176 (2007).
- Romanovsky, D., Mrak, R. E., Dobretsov, M. Age-dependent decline in density of human nerve and spinal ganglia neurons expressing the alpha3 isoform of Na/K-ATPase. Neuroscience. 310, 342-353 (2015).
- Campbell, J., Singh, D., Hollett, G., et al. Spatially selective photoconductive stimulation of live neurons. Front Cell Neurosci. 8, 142 (2014).
- Yuryev, M., Pellegrino, C., Jokinen, V., et al. In vivo Calcium Imaging of Evoked Calcium Waves in the Embryonic Cortex. Front Cell Neurosci. 9, 500 (2015).
- Qiao, M., Sanes, J. R. Genetic Method for Labeling Electrically Coupled Cells: Application to Retina. Front Mol Neurosci. 8, 81 (2015).
