Klocksökningsprotokoll för bildanalys: ImageJ-plugins

Summary

I det här dokumentet beskrivs två nya ImageJ-plugins för bildanalys av klockan. Dessa plugins utökar funktionaliteten hos det ursprungliga visuella grundläggande 6-programmet och, viktigast av allt, gör programmet tillgängligt för en stor forskargrupp genom att kombinera det med ImageJ gratis bildanalysprogramvara.

Abstract

Klocksökningsprotokollet för bildanalys är ett effektivt verktyg för att kvantifiera den genomsnittliga pixelintensiteten inom, vid gränsen och utanför (bakgrund) en sluten eller segmenterad konvexformad region av intresse, vilket leder till genereringen av en medelvärdesintegral radial pixel- Intensitetsprofil. Detta protokoll har ursprungligen utvecklats 2006, som ett visuellt grundläggande 6-skript, men som sådant hade det en begränsad distribution. För att åtgärda detta problem och att ansluta sig till andra liknande ansträngningar från andra konverterade vi den ursprungliga klockskanningsprotokollkoden till två Java-baserade plugins kompatibla med NIH-sponsrade och fritt tillgängliga bildanalysprogram som ImageJ eller Fiji ImageJ. Dessutom har dessa plugins flera nya funktioner, vilket ytterligare utvidgar utbudet av funktioner i det ursprungliga protokollet, såsom analys av flera regioner av intresse och bildstaplar. Det senare inslaget i programmet är särskilt användbart i applikationer där det är viktigt att bestämma förändringar som är relateradeTill tid och plats. Således kan klocksökningsanalysen av staplar av biologiska bilder potentiellt appliceras på spridning av Na ⁺ eller Ca ⁺⁺ inom en enda cell, liksom analysen av spridningsaktivitet ( t.ex. Ca ^++- vågor) i synaptiska populationer -connected eller gap junction-kopplade celler. Här beskriver vi dessa nya klockskanningsprogram och visar några exempel på deras applikationer i bildanalys.

Introduction

Målet med detta arbete är att presentera ett Clock Scan-protokoll som är plattformslöst och fritt tillgängligt för alla forskare som är intresserade av denna typ av bildanalys. Ursökningsprotokollet utvecklades ursprungligen 2006 ¹ , med målet att förbättra befintliga metoder för pixelintensitets kvantifiering inom konvexa formade intressanta regioner (ROI), en metod som har bättre integrerande kapacitet och förbättrad rumslig upplösning. Under förvärvet samlar protokollet flera radiala pixelintensitetsprofiler, skannas från ROI-centret till dess gräns, eller till ett förutbestämt avstånd utanför avkastningen för att mäta pixelintensiteten "bakgrund". Protokollet skala dessa profiler i enlighet med cellradien, mätt i skanningens riktning. Sålunda är avståndet från centrum till ROI-gränsen för varje enskild radiell avsökning alltid 100% av X-skalan. Slutligen genomsyrar programmet dessa personerAl profiler i en integrerad radiell pixelintensitetsprofil. På grund av skalan beror den genomsnittliga pixelintensitetsprofilen, som produceras av "Clock Scan" -protokollet, varken på ROI-storleken eller inom rimliga gränser på ROI-formen. Den här metoden möjliggör direkt jämförelse eller, om det behövs, medelvärde eller subtraktion av profiler med olika avkastningar. Protokollet möjliggör också korrigering av integrerade pixelintensitetsprofiler, av vilket objekt som helst för bakgrundsbrus, genom en enkel subtraktion av den genomsnittliga intensiteten hos pixlar som ligger utanför objektet. Även om det bara har testats i biologiska prover ger vårt protokoll ett värdefullt tillägg till andra befintliga bildanalysverktyg som används vid studier av bilder av fysiska eller kemiska processer som är anordnade runt en ursprungspunkt (såsom diffusion av ämnen från en punktkälla ) ¹ .

Emellertid var huvudbegränsningen för den ursprungliga bildanalysmetoden att protokollet var devUppstod som Visual Basic 6 (VB6) (kod och var därför plattformberoende och svår att distribuera (kräver VB6). För att lösa detta problem och att ansluta sig till liknande senare ansträngningar från andra utredare ² konverterade vi VB6 Clock Scan Programkod i två Java-baserade plugins, kompatibla med NIH-sponsrade och fritt tillgängliga open-source och plattformsoberoende bildanalysprogram, ImageJ ³ och Fiji ImageJ ^4. Dessutom har dessa plugins flera nya funktioner som utökar möjligheten Av det ursprungliga protokollet för att bearbeta flera ROI och bildstaplar. Många applikationer för bildanalys är inte användarvänliga när det gäller att utföra statistisk analys av flera objekt och sålunda visas ofta bara representativa data. Med multi-klocka Scan ImageJ-plugin, Det är möjligt att underlätta analysen av flera objekt samtidigt. En robust statistisk utvärdering av mikroskopi data,Med avseende på signalintensitetsfördelning i enskilda celler / objekt, är det nu möjligt med denna plugin förlängning. Här beskriver vi klockskanningsprogrammen och visar exempel på deras applikationer i bildanalys.

Protocol

1. Installation av programvara

1. Installera de senaste versionerna av buntad Java och antingen ImageJ eller Fiji ImageJ som rekommenderas på respektive webbplatser (se materialtabell för länkar till motsvarande webbplatser). I texten nedan kallas båda programmen som "ImageJ".
2. Kopiera "Clock_Scan-1.0.1. Burk" och "Multi_Clock_Scan-1.0.1.jar" pluginfiler med hjälp av länken i materialtabellen och klistra in dem i ImageJ-pluginkatalogen. Alternativt använd menyalternativet "Plugins | Install plugin" för att installera dessa filer efter att de har sparats på datorns hårddisk.

2. Klockskanning analys

1. Standardklockans skanningsprogram ( Figur 1 ):
   1. Använd menykommandot ImageJ "File | Open" för att öppna en intressant bild.
   2. Klicka på "polygon" -verktyget, eller "segmenterat linjeval"Verktyget, och dra sedan bilden för att beskriva hela avkastningen eller ett segment i den här regionen. Se Figur 1 A för ett exempel på polygonval (inre streckad kontur).
      OBS! Andra valverktyg som finns tillgängliga i programvaran (rektangulärt, ovalt och fritt val av linjer) kan också användas.
   3. Välj "Plugins | Clock Scan" från menyn för att öppna fönstret för standardklockskanningsprotokoll. Observera att det här kommandot också öppnar fönstret ROI Manager med konturen som automatiskt läggs till den.
   4. Använd fönstret för pluginalternativ för att göra följande.
      1. Granska och ändra X-och Y-koordinater för ROI-centret (automatiskt beräknat som det fysiska masscenterets koordinater) genom att använda rullningsfält eller ändra värdena i motsvarande ingångslådor. Se figur 1 B.
      2. Beroende på hur mycket av bakgrundsregionen utanför objektet shoOm du vill täcka av skanning, justera skanningsgränserna med hjälp av skannerns granskningsfält. Se figur 1 A.
         OBS: Skanningsgräns är det fraktionsnummer som representerar hur långt skanningen ska gå bortom objektets gräns i vilken riktning som helst; Standardvärdet är 1,20, vilket indikerar att skanlängden kommer att vara 20% längre än objektradiusen i avsökningsriktningen; Se figur 1 A , yttre streckad linje).
      3. Ändra pluginens utdata med hjälp av "realradie", "subtrahera bakgrund", "polär transformation" och / eller "rutan med standardavvikelse" kryssrutor.
      4. Klicka på "OK" för att köra plugin. Se figur 1 C-H .
         ANMÄRKNING: Exempel på protokollets utgång med "plot med standardavvikelse" och "polär transformation" eller "verklig radie" och "polärtransfiguration"Orm "-alternativen visas i Figur 1 C respektive 1D respektive Figur 1 E respektive 1F . Observera att de beräknade standardavvikelserna (SD) representerar variationen mellan objektets individuella radiella pixelintensitetsskanningar. Observera också" ROI-valet Längd "i pluginfönstret, som visar informationen på ROI-konturlängden mätt i pixlar.
   5. I den genererade "Klockskannaprofilplot" använd kommandot "List" för att plotta värden som visas i två, X och Y-kolumner med data för gråskaliga bilder och i X- och fyra Y-kolumner för data för RGB-bilder, varav Y0, Y1, Y2 och Y3 kolumner fylls med integrerade och individuella (röda, gröna och blå) färgkanal pixelintensitetsvärden.
2. Flera ROI Clock Scan plugin - arbetar med flera avkastningar ):
   1. Öppna en bild som innehåller flera avkastningar.
   2. Öppna ROI Manager genom att klicka på "Analysera | Verktyg | ROI Manager".
   3. Sequentially skissera (se steg 2.1.2) och lägg till varje avkastning till ROI Manager genom att klicka på "Add" i ROI Manager-fönstret; Gör detta för alla avkastningar inom bilden. Använd kommandot "Analysera | Mät" om ROI-statistik är av intresse.
      1. Se Figur 2 A för ett exempel på flera segmenterade linjeväljningar och Figur 2 E för ett exempel på flera polygonval.
   4. Välj "Multi Clock Scan" i "Plugins" -menyn för att öppna popup-fönstret för protokollalternativ.
   5. Använd fönstret för protokollalternativ för att göra följande.
      1. Om det behövs, återställ skanningsgränsen enligt steg 2.1.4.2; Standardvärdet är 1,20.
      2. Om det behövs väljer du optJon för att plotta den genomsnittliga klockskanningsprofilen med SD-fält genom att markera rutan "Plot with standard deviation". Se figur 2 C och D.
         OBS! De beräknade SD-värdena representerar variation mellan integrerade klocksökprofiler för olika objekt. Observera också linjen i pluginfönstret som visar information om "antal markerade avkastningar".
      3. Klicka på "OK" för att köra protokollet.
   6. I den genererade "Klockskannaprofilplot" använd kommandot "List" för att plotta de värden som visas i fönstret "Plot Values". Se "Multi Clock Scan Profile Plot" -fönstret för kolonnbeteckning via färgkanal.
   7. Observera att ROI-numren är numrerade och deras klockskanningsprofiler för en viss färgkanal ritas i samma ordning som ROI-värdena skisserades och läggs till i "ROI Manager".
3. MulTiple ROI Clock Scan plugin - arbetar med en bildstapel ( Figur 3 ):
   1. Öppna en bildstapel av intresse.
   2. Öppna ROI Manager genom att klicka på "Analysera | Verktyg | ROI Manager".
   3. Beskriv avkastningen på bilderna i stapeln och lägg till den i ROI-hanteraren enligt beskrivningen i steg 2.1.2 och 2.2.3. Använd kommandot "Analysera | Åtgärd" om avkastningen är av intresse.
   4. Välj "Multi Clock Scan" i "Plugins" -menyn för att öppna popup-fönstret för protokollalternativ.
   5. Använd fönstret för protokollalternativ för att göra följande.
      1. Återställ skanningsgränsen som beskrivs i steg 2.1.4.2; Standardvärdet är 1,20.
      2. Välj alternativet för att plotta medelklockskanningsprofilen med SD-fält genom att markera rutan "Plot med standardavvikelse".
         OBS! De beräknade SD-värdena representerar variation mellan olika instanser av objektet som valts i bilden stack. Notera också raden i pluginfönstret som visar information om "antal bilder i stapeln".
      3. Klicka på "OK" för att köra protokollet.
   6. I fönstret "Klocksökningsprofil" klickar du på "Lista" för att plotta de värden som visas i fönstret "Plot Values", där Y-kolumnnumret representerar bildpositionen i stapeln - 1.

Representative Results

Bilderna som används här för illustration ändamål tas från databaser som skapats under våra tidigare cell- och vävnadsbiologiska studier ^{5 , 6 , 7} och från Allen Mouse Brain Atlas ⁸ . Båda pluginsna testades med hjälp av ImageJ 1.50i / Java 1.8.0_77, ImageJ 2.0.0-rc-44 / 1.50e / Java 1.8.9_66 och Fiji ImageJ 2.0.0-rc54 / 1.51g / Java 1.8.0_66 programmiljö.

Figur 1 visar representativa resultat av bildanalys med en standard Clock Scan plugin. För båda plugins är baskoden och huvudstegen i klockskanningsförfarandet väsentligen desamma som beskrivs i det ursprungliga protokollet ¹ . Kort sagt, efter avkastningen eller ett segment av avkastningen skisseras på bilden ( Figur 1 A , inre gula konturerna) och ett centrum för konturerna bestäms (automatiskt eller manuellt, med hjälp av pluginalternativsfönstret, Figur 1 B ) börjar den radiella avsökningen av pixelintensiteten i en riktning från mitten till den första pixeln i Cellplanering och fortsätter medurs pixel-vid-pixel längs konturen ( figur 1 A , respektive rak vektor respektive krökt pil) tills alla ROI-radierna är skannade. För att kvantifiera ROI-bakgrundsintensiteten kan längden för varje radialsökning ställas in så att den överstiger ROI-radie i skanningsriktningen med ett förinställt fraktionsnummer (0,2 eller 20% av radien som standard för Clock Scan-pluginvärdet , Yttre gula linjen i figur 1 A ). Insamlade radiella profiler justeras sedan genom skalning till motsvarande radier och i medeltal för att producera integral klockavståndsintensitetsprofil i 256 intensitetsnivåer av gråskalaenheter ( Figur 1 C ). För RGB-bilder producerar båda pluginsna automatiskt oberoende integrerade radiella pixelintensitetsprofiler för varje färgkanal (256 intensitetsnivåer av röda, gröna och blå färger) förutom en kombinerad färgprofil.

Som standard representerar x-skalaen för klockans skanningspixelintensitetsprofil normaliserad ROI-radie, med 100% av skalan som representerar pixlar som ligger vid gränsen för ROI ( Figur 1 C ). Profilen som visas i Figur 1 C genererades med alternativet "Plot med standardavvikelse" vald, och därför visar grafen även SD-värdet beräknat för varje datapunkt längs profilens X-skala. När alternativet "subtrahera bakgrund" är vald, korrigeras hela intensitetsprofilen för bakgrundsnummerIse genom punkt-för-punkt subtraktion av medelintensiteten hos pixlar som ligger mellan ROI-gränsen och gränsen för scangränsen (yttre gula linjen i figur 1 A ; data ej visad). Om alternativet "polär transform" väljs, genererar klockans genomsökningsprogram ett extra utmatningsfönster. Den innehåller en polär transformation av bilden av den valda regionen inklusive skanningsgränsytan, där bilden är modifierad i varje radiell avsökningsriktning på ett sådant sätt att avståndet från mitten till gränsen för föremålen alltid normaliseras till 100 % Och representeras av 100 pixlar. Oavsett objektets faktiska storlek är de vertikala och horisontella dimensionerna för sin polära transformationsbild två gånger avsökningsgränsen i pixlar (240 pixlar x 240 pixlar i det exempel som visas i Figur 1 D ). Slutligen kommer valet av "realradie" -alternativet att generera klockskanning perOfile och en polär transformationsbild, skalad enligt objektets faktiska medelradius och i enheterna för rumlig kalibrering av originalbilden (figurerna 1E respektive F ).

Figurerna 1G och H illustrerar ytterligare bildanalysalternativ med hjälp av objektstorleks- och formoberoende polärtransformation och de integrerade ImageJ-kommandon och verktyg. Exempel på kommandon, som kan anses vara användbara för vissa typer av bildanalys, är kommandot "Segmenterad linje" och "Analysera | Plottprofil" ( Figur 1 G ) och kommandot "Analysera | Plattform" ( Figur 1 H ).

Figurerna 2 och 3 visar representativa resultat av bildanalys med Multi Clock Scan-plugin. Utsignalen frånMultiklockavsökningsprogrammet består av två diagram: det första diagrammet visar individuella klockansökningsprofiler för de valda objekten ( Figur 2 C ) och det andra diagrammet visar medelvärdet för dessa individuella klockskanningsprofiler (± SD, valfritt, Figur 2 D ) . För RGB-bilder ( Figur 2 E ) visas klockans skanningsprofil som beräknats för varje enskild färgkanal för varje vald ROI ( Figur 2 F ) och medelvärdet beräknas inom en given kanal för alla valda objekt ( Figur 2 G ) . På samma sätt visas de enskilda och genomsnittliga klockskanningsprofilerna för objekt i bildstapeln efter att ha utfört klockans skanningsanalys av stapeln (figurerna 3A-3D , den genomsnittliga klockans skanningsprofil visas inte). Som sagt tidigare, den numeriskaAl data används för att generera dessa diagram genom att utföra kommandot "List"

Figur 4 illustrerar en ytterligare tillämpning av alternativet polar transformation i urskanningsplugin: dess lämplighet för bildregistrering och överläggningsoperationer. I denna figur användes ROI-storlek och formoberoende polära transformationer för att jämföra fördelningen av fluorescensmärkning av neuroner som uttrycker a3 natrium / kalium-ATPaspump mellan olika muskortikala regioner, med atlasbilden som visar gränserna och den anatomiska organisationen av Dessa regioner ( figurerna 4A-4B ). Med ett klockskanningsprotokoll är referensregistreringen (atlasen) och de faktiska bilder som krävs för en sådan jämförelse begränsad till ett enkelt förfarande för att anpassa bilderna, skissera strukturen av intresse för båda bilderna och generera sedan ROI-storlek och form- Oberoende polära transformationer.I exemplet som visas i figur 4 visar en jämförelse av polära transformationer tydligt en ojämn fördelning av märkta celler i hjärncortexen i musen, varvid deras densitet är specifikt hög i ytliga områden av skikt 2/3 av motorcortexen, dorsaldelen Av den agranulära insulära cortexen, den laterala orbitala cortexen och i djupa lager av motorcortexen (figurerna 4C-4D ).

Figur 1 : Representativt exempel på tillämpning av klockskanningsprogrammet för bildanalys. ( A ) Fluorescerande ljusbild av en sektion av en råttor-dorsalrotganglion immunförstärkt för a3-isoformen av Na + / K + -ATPasen ( a3NKA, se Schneider et al. ³ för detaljerna för vävnadsbehandling och färgning).En av neuronprofilerna, med sin gräns tungt märkt för α3 NKA (vit), skisseras med hjälp av ett polygonlinjeverktyg (inre gula linjen). Radiell skanning (vit pil) gränser (yttre gula linjen) sattes till 120% av objektradiusen, från objektets centrum (vit punkt) till den första pixeln i konturen, som visas i panel B (skanningsgränsrulle). ( B ) Skärmdump av huvudalternativsfönstret i klockskanningsprogrammet. ( C ) Plot av integrerad pixelintensitetsprofil för cellen som visas i panel A (medelvärde av 706 radiella scanprofiler, se konturlängden i B; vertikala staplar är SD-staplar). ( D ) - Polar transformationsbild av den studerade cellprofilen. ( E ) Klockskanningsprofil för samma cell som erhållits med alternativet "verklig radie" vald. Observera att i motsats till profilen som visas i C visar x-skalaen i den här profilen riktiga rumsliga kalibreringsenheter (μm). ( F ) Polär transformation av samma cell erhållen med Alternativet "riktigt radie" valts. Observera att omfattningen av denna transformation nu finns i reala rumsliga kalibreringsenheter (μm). ( G ) Gränsen för den polära transformationen, som visas i D, skisserades med hjälp av segmenteringslinjeverktyget (linjetyckden sattes till 10 pixlar eller 10% radial avsökningslängd) och analyserades. "Analyze | Plot Profile" -kommandot utfördes för att mäta förändringarna i medelvärdesintensiteten längs objektets gräns (varje datapunkt i grafen representerar medelintensiteten för alla pixlar över bredden på valgränsen). ( H ) Kommandot "Analys | Surface Plot" applicerades på den polära transformationsbilden som visas i panel D för att skapa 3-D-representation av objektets märkintensitet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

E 2 "class =" xfigimg "src =" / filer / ftp_upload / 55819 / 55819fig2.jpg "/>
Figur 2 : Representativt exempel Användning av att använda Multi Clock Scan Plugin för bildanalys. ( A ) Fyra synfält fångades inuti sektionen av råttor-dorsalrotganglion immunostained för a3 NKA (se Figur 1 En legend). För att förenkla användningen av multiklockans sökplugin placerades dessa bilder i en stapel och konverterades sedan till en enda bild med kommandot "Bild | Stacks | Make Montage". Röda linjer och siffror anger en segmenterad linjeval av fem intressanta regioner i den här bilden. ( B ) En skärmdump av Multi Clock Scan-fönstret visas när plugin används för att analysera en gråskalig bild. ( C ) Individuella klockskanningsprofiler med fem ROI: er som visas i panel A. ( D ) Genomsnittlig klockskanningsprofil för valda ROI (panelen)A) med SD-staplar (alternativet "plot med standardavvikelse" vald). ( E ) RGB-bild av odlade mus-prebi-lymfocyter märkta med 4,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, nukleär fläck, blå) och med fluorescensmärkta antikroppar för β1-integrin (grön) och F-aktin ; Se Dobretsov et al. ⁷ för cellodlingstekniken och Yuryev et al. ¹¹ för färgningsdetaljer). Elva celler (se nummeretiketter) skissades med hjälp av ImageJ-polygonens urvalsverktyg. Paneler till höger visar grön och röd kanalvy av cellen # 7 (rektangulärt urval på vänster panel) efter att menyn "Bild | Färg | Split kanaler" har utförts. ( F ) Individuella cellklockskanningsprofiler (komposit- och röda, gröna och blåa färgkanalprofiler visas med respektive svart, rött, grönt och blått). ( G ) Genomsnitta klockskanningsprofiler för alla elva avkastningar som valts i panelenE. Färgbeteckningar som i panel G (ingen plot med standardavvikelse alternativ användes under Multi Clock Scan-proceduren). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3 : Multi Clock Scan Plugin och analys av bildstaplar. ( A ) Montage av valda och "sparade som stack" bildramar. En bild av en dorsalrotganglionneuron fångad med differential-interferenskontrast (DIC) -mikroskopi visas i den första ramen. Efterföljande ramar erhölls med användning av epi-belysningsfluorescensmikroskopi för att övervaka intracellulär kalciumkoncentration vid olika tidsintervaller före och efter elektrisk stimulering av cellen. Nummer bredvid respE bild anger tid i ms ⁶ . Gränsen på cellen skisserades med hjälp av DIC-bilden av stapeln (vänstra bildramen; asterisk indikerar patch-clamp-pipetten som används för att spela in och fylla cellen med den kalciumkänsliga färgen Oregon Green BAPTA-1 (OGB-1) ) Och brukade sedan köra Multi Clock Scan-proceduren på de återstående bilderna. ( B ) Skärmdump av Multi Clock Scan-fönstret, när programmet körs på en stapel bilder. ( C ) Klockskanningsprofiler av OGB-1-fluorescenssignalen vid olika avstånd från cellcentralen (% av radie) och vid olika tidpunkter före och efter elektrisk stimulering (legend, i ms). För att förbereda dessa grafer användes professionell grafisk programvara. ( D ) Förändringar i intensiteten hos OGB-1-signalen med tiden i submembran och djupare cytoplasmiska cellregioner (röda och svarta cirklar respektive linjer). För att erhålla dessa data beräknades medelvärdet och SD för varje datapunktslägeEd mellan 20-40% och 70-90% av x-skalaen för varje klockskanningsprofil som visas i panel C (skuggade områden). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4 : Exempel på att använda klockansökningsplugin i bildregistrering och överläggning. ( A och B ) Skärmbilder av tallrik 29 från koronaldelen (Allen Mouse Brain Atlas) och en 200 μm tjock vibratomsektion från den gelatininkopplade mushjärnan skär vid ungefär samma nivå som atlasbilden. Den transgena musen som användes i detta exempel uttryckte ZsGreen-fluorescerande protein under promotorn av a3NKA för att identifiera a3NKA-uttryckande neuroner ² . För att bestämmaKortikala områden som specifikt berikas med dessa neuroner (ljusa punkter på bilden i panel B), hela kortikala området skisserades (gula streckade linjer) som startade i båda bilderna med samma referenspunkt (mellan gränsen mellan cortex och olfactory Glödlampa, pilar). ( C ) Paneler representerar (från vänster till höger): Klocka Skanpolar omvandlar ROI, vald inom Atlasbilden (panelen A), inom bilden av mushjärnansektion (panel B) och överlagring av dessa två transformationsbilder | Överlay | Add Image "kommando med 50% opacitet inställning). ( D ) Samma bilder som i panel C men med gränserna för de stora kortikala regionerna (som visas i atlasen) skisserade i två andra transformationsbilder med hjälp av ImageJ-polygonen, segmenterade linjevalsverktyg och "Analysera | Verktyg | Synkronisera Windows" kommando. Förkortningar är desamma som i den ursprungliga hjärnatlasbilden: Motorens primära och sekundära (MOp, MOs), agranularisular, dorSal-del (AId), orbital lateral, ventro-lateral och medial (ORBI, ORBvl, ORBm), prelimbic (PL), främre cingulat, dorsal del (ACAd) cortex. Antal i MO-området hänvisar till de huvudsakliga kortikala skikten, som kan särskiljas i musmotorcortexen vid lämplig koronal hjärnnivå. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Discussion

Klocksökningsprotokoll: Klocksökningsprotokollet är ett snabbt och enkelt verktyg för bildanalys. Fördelarna med detta protokoll jämfört med befintliga gemensamma metoder för bildanalys (såsom linjära pixelintensitetsskanningar eller beräkning av avkastningens genomsnittliga pixelintensitet) har beskrivits i detaljer i tidigare publikationer ^{1 , 9} . Kortfattat tillåter detta protokoll generering av integrerade radiella pixelintensitetsprofiler genom att kvantifiera intensiteten hos pixlar som ligger på olika avstånd från ROI-centret, såsom objektets gräns, eller en förutbestämd plats utanför objektet (bakgrunden). På grund av det senare kan klockans skanningsprofiler för varje ROI alltid korrigeras för sin omedelbara bakgrund, vilket (i biologiska tillämpningar) gör den här profilen mindre beroende av lokal, in-the-sample eller sample-to-sample, ojämnheter I märkning / färgning, såväl som instabilitet iIntensiteten hos mikroskopets ljuskälla eller fluorescerande ljus exponeringstider. Objektets storlek och formoberoende av klockskanningsprofilerna utökar vidare tillämpningsområdet för detta protokoll genom att möjliggöra jämförelser av olika objekt, såväl som korrigering genom punkt-för-punkt-subtraktion av profiler av "positiv" och "negativ" kontroll föremål.

Klockansökningsinställningar : Huvudbegränsningen för distribution och delning av det ursprungliga protokollet var plattformsberoende av sin kod som utvecklades med Visual Basic 6.0 (VB) ^{1 , 9} . Detta problem har nyligen tagits upp av en av forskargrupperna vid Leibniz Institute of Molecular Pharmacology, Tyskland, genom att utveckla en liknande Fuji ImageJ Clock Scan plugin ² . Leibniz-institutets plugin återger den ursprungliga klockans grundläggande funktionalitet i sin förmåga att generera inteGral radiala scanprofiler för den bifogade konvexa formen av ROI, och dessutom kan den bearbeta segment av konturer (bågar). Skanningsgränsen för profilen som genereras av deras plugin kan dock endast sättas till 100% (objektets gräns), vilket innebär att bakgrundspixelintensiteten inte kan kvantifieras. Dessutom har den ingen kapacitet att generera polära transformationer, att arbeta med olika färgkanaler i RGB-bilder, eller för att arbeta med staplar av bilder och att bearbeta flera ROI. Som jämförelse reproducerar de två nya pluginsna, som beskrivs här, fullständigt förmågan hos den ursprungliga VB-koden ( dvs. generering av integrerade klockavsöknings-pixelintensitetsprofiler med valfri visning av SD-skivor och / eller bakgrundsintertraktion, samt bearbetning av olika färgkanaler av RGB-bilder). Dessutom kan de analysera ett segment / bågformat ROI (funktionalitet introducerad i Fuji ImageJ-plugin utvecklat vid Leibniz Institute of Molecular Pharmacology ² ). Dessutom, thEse plugins utökar användningen av tidigare program genom att generera ROI-storlek och formoberoende polära ROI-bildtransformationer, som kan användas i program som kräver bildregistrering. Slutligen underlättar plug-in för flera klockor effektivt klockskanning av flera avkastningar som ligger inom samma bild eller i en bildstapel. Den senare nya funktionen av programmet är speciellt användbar i applikationer där det är viktigt att bestämma förändringar relaterade till tid och plats.

Begränsningar och felsökning: Huvudbegränsningen av klockskanningsmetoden är kravet på att välja en konvexformad avkastning. Klockans skanningsprofil skulle vara meningslös i situationer när någon av de radiella scanningarna överstiger ROI-konturen mer än en gång. Detta skulle göra normaliseringen av längden på en sådan radiell avsökning med hänsyn till avståndet från mitten till omkastningen av avkastningen på avkastningen. En annan begränsning är att klockan skannar profilinformationen är progressivSively minskat i ROI saknar radiell symmetri. Men åtminstone delvis kan dessa två begränsningar övervinnas genom analys av utvalda segment (bågar) av komplexa och asymmetriska ROI. Användning av segmentsökning rekommenderas också i fall där delar av bakgrundsområdet innehåller märkta funktioner, vilket kan påverka bakgrundsintertraktionsförfarandet (se Figur 2A för ett exempel på val för analys av de cellsegment som inte står inför andra märkta celler). Slutligen, om analys av kompositbilder som innehåller mer än 3 färgkanaler krävs, bör färgkanalerna för dessa bilder delas innan de körs i plugin.

Framtida riktningar: Framtida förbättringar av funktionaliteten för dessa plugins kommer att inkludera, men är inte begränsade till, uppdatering av koden för att kombinera funktionaliteten för klock-scan och multi-klock-scan plugins i ett plugin. Färgsamlokaliseringsalgoritmer (såsom algoritmer basEd på beräkningar av Pearson korrelation eller Manders split-koefficienter) och utvecklingen av plugin för att kunna arbeta med flera avkastningar som väljs i olika bilder eller i olika skivor i en bildstapel (aktuell version av plugin-programmen möjliggör analys av flera ROI-värden som valts inom en bild eller en ROI vald för alla bilder i stapeln) kommer att implementeras. Författarna kommer också att uppskatta några förslag från plugin-användarna och rapporter om eventuella problem som uppstått vid användning av befintliga plugins.

Slutsats: Klockskanningsanalysen är ett lovande verktyg för avbildningsstudier inom många områden av biologi, från analys av statisk cellmärkning med olika markörer till studier av spridning av Na ⁺ eller Ca ⁺⁺ , inom en enda cell såväl som för Analys av spridningsaktivitet ( t.ex. Ca ^++- vågor) i populationer av synaptiskt anslutna celler ¹⁰ , ¹¹ eller gapskopplingskopplade celler ¹² . Andra potentiella tillämpningsområden för klockanalysanalysen inkluderar medicinsk bildanalys (ultraljudsbilder av blodkärl, CT-skanna bilder och ben tvärsnitt), astronomi (spiral och radiell galaxbildning), kemi (diffusion från en punktkälla), Fysik (diffraktionsmönsteranalys), skogsbruk (trädstamringanalys för bestämning av ålder av trädet samt perioder med torrt väder och dålig befruktning), teknik (metallrörskorrosion) och klimatologi (väderradarbildanalys).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer	Any		compatible with software listed below
ImageJ or Fiji ImageJ	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/ or https://fiji.sc/	bundled with Java 1.8 or higher
Clock-scan plugins	freeware	https://sourceforge.net/projects/clockscan/	Clock_Scan-1.0.1 jar and Multi_Clock_Scan-1.0.1/ jar
Origin 9.0	OriginLab	Northampton, MA, USA	This program was used to generate some graphs of the original Clock Scan data. Any other graphic software can be used to perform this function