Klokke Scan protokoll for bildeanalyse: ImageJ Plugins

Summary

Dette papiret beskriver to nye ImageJ-plugins for 'Clock Scan' bildeanalyse. Disse pluginene utvider funksjonaliteten til det opprinnelige visuelle grunnleggende 6-programmet og, viktigst, gjør programmet tilgjengelig for et stort forskningsmiljø ved å kombinere det med ImageJ gratis bildeanalyseprogramvarepakken.

Abstract

Klokke-skanningsprotokollen for bildeanalyse er et effektivt verktøy for å kvantifisere gjennomsnittspikselintensiteten innenfor, ved grensen og utenfor (bakgrunn) en lukket eller segmentert konveks formet region av interesse, hvilket fører til genereringen av en gjennomsnittlig integrert radial pixel- Intensitetsprofil. Denne protokollen ble opprinnelig utviklet i 2006, som et visuelt grunnleggende 6-skript, men som sådan hadde det begrenset distribusjon. For å løse dette problemet og for å delta i lignende nyliglige anstrengelser fra andre, konverterte vi den opprinnelige klokkeskanningsprotokollkoden til to Java-baserte plugins kompatibelt med NIH-sponsede og fritt tilgjengelige bildeanalyseprogrammer som ImageJ eller Fiji ImageJ. Videre har disse pluginene flere nye funksjoner, som ytterligere utvider kapasiteten til den opprinnelige protokollen, for eksempel analyse av flere interessegrupper og bildestabler. Sistnevnte trekk ved programmet er spesielt nyttig i applikasjoner der det er viktig å bestemme endringer som er relatertTil tid og sted. Dermed kan klokke-skanneanalysen av stabler av biologiske bilder potensielt påføres spredning av Na ⁺ eller Ca ⁺⁺ i en enkelt celle, samt analyse av spredningsaktivitet ( f.eks . Ca ^++- bølger) i synaptisk populasjon -forbindelse eller mellomromskoblede celler. Her beskriver vi disse nye klokke skanne plugins og vise noen eksempler på deres applikasjoner i bildeanalyse.

Introduction

Målet med dette arbeidet er å presentere en Clock Scan-protokoll som er plattformfri og fritt tilgjengelig for enhver forsker som er interessert i denne typen bildeanalyse. Clock Scan-protokollen ble opprinnelig utviklet i 2006 ¹ , med det formål å forbedre eksisterende metoder for pixelintensitetskvantifisering innen konvekse formede interesseområder (ROI), en metode som har bedre integrerende kapasitet og forbedret romlig oppløsning. Under oppkjøpet samler protokollen sekvensielt flere radiale pikselintensitetsprofiler, skannes fra ROI-senteret til grensen, eller til en forhåndsbestemt avstand utenfor avkastningen for å måle "bakgrunns" -pikselintensiteten. Protokollen skalerer disse profilene i henhold til celleradius, målt i retning av skanningen. Dermed er avstanden fra sentrum til ROI-grensen for hver enkelt radial skanning alltid 100% av X-skalaen. Endelig er programmet gjennomsnittlig for denne personenAl profiler i en integrert radial pikselintensitetsprofil. På grunn av skalering er den gjennomsnittlige pixelintensitetsprofilen, produsert av "Clock Scan" -protokollen, avhengig av ROI-størrelsen, heller ikke innenfor rimelige grenser, på avkastningsformen. Denne metoden tillater direkte sammenligning eller, om nødvendig, gjennomsnittlig eller subtraksjon av profiler av forskjellige avkastning. Protokollen tillater også korreksjon av integrerte pikselintensitetsprofiler, av hvilket som helst gjenstand for bakgrunnsstøy, ved en enkel subtraksjon av gjennomsnittsintensiteten til piksler plassert utenfor objektet. Selv om det bare er testet i biologiske prøver, gir protokollen et verdifullt tillegg til andre eksisterende bildeanalyseværktøy som brukes i studier av bilder av fysiske eller kjemiske prosesser som er arrangert rundt et opprinnelsessted (for eksempel diffusjon av stoffer fra en punktkilde ) ¹ .

Imidlertid var hovedbegrensningen av den opprinnelige bildeanalysemetoden at protokollen var devSpredt som en Visual Basic 6 (VB6) (kode, og derfor var den plattformavhengig og vanskelig å distribuere (krever VB6). For å løse dette problemet og for å bli med lignende nylig innsats av andre etterforskere ² , konverterte vi VB6 Clock Scan Programkoden i to Java-baserte plugins, kompatibel med NIH-sponsede og fritt tilgjengelige open-source og plattformuavhengige bildeanalyseprogrammer, ImageJ ³ og Fiji ImageJ ^4. Videre har disse pluginene nå flere nye funksjoner som utvider muligheten Av den opprinnelige protokollen for å behandle flere ROI og bildestabler. Mange bildeanalyseprogrammer er ikke brukervennlige med hensyn til å utføre statistisk analyse av flere objekter, og dermed vises det bare bare representative data. Med Multi Clock Scan ImageJ-pluginet, Det er mulig å lette analysen av flere objekter samtidig. En robust statistisk vurdering av mikroskopi data,Med hensyn til signalintensitetsfordeling i enkeltceller / objekter, er det nå mulig med denne plugin-utvidelsen. Her beskriver vi Clock Scan-pluginene og viser eksempler på deres applikasjoner i bildeanalyse.

Protocol

1. Programvareinstallasjon

1. Installer de nyeste versjonene av kombinert Java og ImageJ eller Fiji ImageJ som anbefalt på de respektive nettstedene (se materialtabell for lenker til de tilhørende nettstedene). I teksten nedenfor blir begge programmene referert til som "ImageJ".
2. Kopier "Clock_Scan-1.0.1. Jar" og "Multi_Clock_Scan-1.0.1.jar" pluginfiler ved hjelp av lenken som er oppgitt i materialetabell og lim dem inn i ImageJ-plugin-katalogen. Alternativt kan du bruke "Plugins | Install plugin" menyalternativet for å installere disse filene etter at de har blitt lagret på datamaskinens harddisk.

2. Klokke Scan-analyse

1. Standard klokke Scan plugin ( Figur 1 ):
   1. Bruk ImageJ "File | Open" menykommandoen for å åpne et bilde av interesse.
   2. Klikk på "polygon" -verktøyet, eller "segmentert linjevalg"Verktøy, og deretter tegne bildet for å skissere hele avkastningen eller et segment av denne regionen. Se figur 1 A for et eksempel på polygonvalg (indre punktert omriss).
      MERK: Andre valgverktøy, som er tilgjengelige i programvaren (rektangulært, ovalt og frittstående linjevalg), kan også brukes.
   3. Velg "Plugins | Clock Scan" fra menyen for å åpne vinduet for standard klokke skanningsprotokoll. Merk at denne kommandoen også åpner ROI Manager-vinduet med oversikten automatisk lagt til den.
   4. Bruk innstillingsvinduet til å gjøre følgende.
      1. Gjennomgå og endre X-og Y-koordinatene til ROI-senteret (automatisk beregnet som koordinater for det fysiske massesenteret) ved å bruke rullestenger eller endre verdiene i de tilsvarende innboksene. Se figur 1 B.
      2. Avhengig av hvor mye av bakgrunnsområdet utenfor objektet er detHvis du vil bli dekket av skanning, må du justere skanningsgrensene ved hjelp av skannelinjen. Se figur 1 A.
         MERK: Skannegrense er brøknummeret som representerer hvor langt skanningen skal gå utover objektets grense i en gitt retning; Standardverdien er 1,20, som indikerer at skanlengden vil være 20% lengre enn objektradiusen i skanneretningen; Se figur 1 A , ytre strekk linje).
      3. Endre utgangen av pluginet ved hjelp av "ekte radius", "subtrahere bakgrunn", "polar transformasjon" og / eller "plott med standardavvik" boksene.
      4. Klikk "OK" for å kjøre plugin. Se figur 1 C-H .
         MERK: Eksempler på protokollets utgang med "plot med standardavvik" og "polar transformasjon" eller "ekte radius" og "polar transfOrm "-alternativene er vist i henholdsvis figur 1 C og 1D og figur 1 E og 1F . Merk at de beregnede standardavviksverdiene (SD) representerer variasjonen mellom individuelle radialpikselintensitetssøk av objektet. Merk også" ROI-valget Lengde "-linjen i plugin-vinduet, som viser informasjonen på avkastningen på avkastningen målt i piksler.
   5. I den genererte "Clock Scan Profile Plot" bruker du "List" -kommandoen til å plotte verdier som vises i to, X og Y-kolonner med data for gråskalabilder og i X- og fire Y-kolonner med data for RGB-bilder, hvorav Y0, Y1, Y2 og Y3 kolonner vil bli fylt med integral og individuelle (rød, grønn og blå) fargekanalpikselintensitetsverdier.
2. Flere ROI Clock Scan plugin - arbeider med flere avkastning ( ):
   1. Åpne et bilde som inneholder flere avkastning.
   2. Åpne avkastningsbehandleren ved å klikke på "Analyser | Verktøy | ROI Manager".
   3. Sequentially disposisjon (se trinn 2.1.2) og legg til hvert avkastning til ROI Manager ved å klikke "Add" i ROI Manager-vinduet; Gjør dette for alle avkastningene i bildet. Bruk kommandoen "Analysér | Mål" hvis ROI-beregninger er av interesse.
      1. Se figur 2 A for et eksempel på flere segmenterte linjevalg og Figur 2 E for et eksempel på flere polygonvalg.
   4. Velg "Multi Clock Scan" i "Plugins" -menyen for å åpne popup-vinduet for protokollvalg.
   5. Bruk protokollalternativvinduet til å gjøre følgende.
      1. Om nødvendig, tilbakestill skannegrensen som i trinn 2.1.4.2; Standardverdien er 1,20.
      2. Hvis nødvendig, velg alternativetIon for å plotte gjennomsnittsklokke skanneprofilen med SD-stenger ved å sjekke "Plot med standardavvik" -boksen. Se figur 2 C og D.
         MERK: De beregnede SD-verdiene representerer variasjon mellom integrerte klokke skanneprofiler av forskjellige objekter. Legg også merke til linjen i plugin-vinduet som viser informasjon om "antall valgte ROIer".
      3. Klikk "OK" for å kjøre protokollen.
   6. I den genererte "Clock Scan Profile Plot" bruker du "List" -kommandoen til å plotte verdiene som vises i vinduet "Plot Values". Se "Multi Clock Scan Profile Plot" -vinduet for kolonnebetegnelse etter fargekanal.
   7. Legg merke til at avkastningene er nummerert, og deres klokke skanneprofiler for en gitt fargekanal er plottet i samme rekkefølge som ROI-ene ble skissert og lagt til "ROI Manager".
3. MulTiple ROI Clock Scan plugin - arbeider med en bildestabel ( figur 3 ):
   1. Åpne en bildestabel av interesse.
   2. Åpne avkastningsbehandleren ved å klikke på "Analyser | Verktøy | ROI Manager".
   3. Sett opp avkastningen på bildene i stakken og legg den til avkastningsbehandler som beskrevet i trinn 2.1.2 og 2.2.3. Bruk kommandoen "Analysér | Mål" hvis avkastningstallene er av interesse.
   4. Velg "Multi Clock Scan" i "Plugins" -menyen for å åpne popup-vinduet for protokollvalg.
   5. Bruk protokollalternativvinduet til å gjøre følgende.
      1. Tilbakestill skannegrensen som beskrevet i trinn 2.1.4.2; Standardverdien er 1,20.
      2. Velg alternativet for å plotte gjennomsnittsklokke skanneprofilen med SD-stenger ved å merke av for "Plot med standardavvik" -boksen.
         MERK: De beregnede SD-verdiene representerer variasjon mellom forskjellige forekomster av objektet som er valgt i bildet stack. Legg også merke til linjen i plugin-vinduet som viser informasjon om "antall bilder i stakken".
      3. Klikk "OK" for å kjøre protokollen.
   6. I vinduet "Klokke Scanprofil" klikker du på "Liste" for å plotte verdiene som vises i vinduet "Plottverdier", der Y-kolonnenummer representerer bildeplasseringen i stakken - 1.

Representative Results

Bildene som brukes her for illustrasjonsformål, hentes fra databaser opprettet under vår tidligere celle- og vevbiologiske studier ^{5 , 6 , 7} og fra Allen Mouse Brain Atlas ⁸ . Begge programtilleggene ble vellykket testet ved hjelp av ImageJ 1.50i / Java 1.8.0_77, ImageJ 2.0.0-rc-44 / 1.50e / Java 1.8.9_66 og Fiji ImageJ 2.0.0-rc54 / 1.51g / Java 1.8.0_66 programmiljø.

Figur 1 viser representative resultater av bildeanalyse med en standard Clock Scan-plugin. For begge plugins er grunnkoden og hovedtrinnene i klokkeskanningsprosedyren i det vesentlige den samme som beskrevet i den opprinnelige protokoll ¹ . Kort fortalt, etter avkastningen eller et segment av avkastningen er skissert på bildet ( figur 1 A , indre gult omriss) og et midtpunkt for omrisset bestemmes (automatisk eller manuelt, ved hjelp av plugin-alternativvinduet, Figur 1 B ) starter den radiale skanningen av pikselintensiteten i en retning fra midten til den første piksel av Celleoversikt og fortsetter med urviseren pixel-for-pixel langs omrisset ( figur 1 A ; henholdsvis rett vektor og buet pil) til alle ROI-radiene er skannet. For å kvantifisere ROI-bakgrunnsintensiteten kan lengden på hver radiell skanning settes til å overstige radiusen av avkastningen i retning av skanningen med et forhåndsinnstilt fraksjonstall (0,2 eller 20% av radius som standard for Clock Scan-pluginens verdi , Ytre gul linje i figur 1 A ). Samlede radiale profiler justeres deretter av skalering til tilsvarende radius og i gjennomsnitt for å produsere integral klokke skanneintensitetsprofil i 256 intensitetsnivåer av gråskalaenheter ( figur 1 C ). For RGB-bilder produserer begge pluginene uavhengige integrerte radialpikselintensitetsprofiler for hver fargekanal (256 intensitetsnivåer av røde, grønne og blå farger) i tillegg til en kombinert fargeprofil.

Som standard representerer x-skalaen for klokke-skannepikselintensitetsprofilen normalisert ROI-radius, med 100% av skalaen som representerer piksler som ligger ved grensen for avkastning ( figur 1C). Profilen vist i figur 1 C ble generert med alternativet "plot med standardavvik" valgt, og derfor viser grafen også SD beregnet for hvert datapunkt langs profilens X-skala. Når alternativet "subtract background" er valgt, korrigeres hele intensitetsprofilen for bakgrunnsnrIse ved punkt-for-punkt-subtraksjon av gjennomsnittlig intensitet av piksler som ligger mellom avkastningsgrensen og grense for grense for skannegrense (ytre gule linje i figur 1A; data ikke vist). Hvis alternativet "Polar transform" er valgt, genererer klokke skanne plugin et ekstra utgangsvindu. Den inneholder en polar transformasjon av bildet av den valgte regionen, inkludert skanningsgrenseområdet, hvor bildet er modifisert i hver radial skanneretning på en slik måte at avstanden fra senteret til grensen til objekterne alltid er normalisert til 100 % Og representert med 100 piksler. Uavhengig av objektets faktiske størrelse er de vertikale og horisontale dimensjonene til dets polare transformasjonsbilde to ganger skannegrensen i piksler (240 piksler x 240 piksler i eksemplet vist på figur 1 D ). Endelig vil valg av "ekte radius" -alternativet resultere i generering av klokke skanne prOfile og et polært transformasjonsbilde, skalert per objektets faktiske middelradius og i enhetene for romlig kalibrering av det opprinnelige bildet ( fig. 1E og F , henholdsvis).

Figur 1G og H illustrerer flere bildeanalysemuligheter ved hjelp av objektstørrelses- og form uavhengig polartransformasjon og de integrerte ImageJ-kommandoene og verktøyene. Eksempler på kommandoer, som kan anses å være nyttige for visse typer bildeanalyse, er kommandoen segmentert linjeverktøy og kommandoen "Analys | Plot Profile" ( Figur 1 G ) og "Analysér | Plattform" -kommandoen ( Figur 1 H ).

Figur 2 og 3 viser representative resultater av bildeanalyse med Multi Clock Scan plugin. Utgangen avMultiklokke-skanneplugin består av to grafer: Den første grafen viser individuelle klokke skanneprofiler av de valgte objektene ( Figur 2C ), og den andre grafen viser gjennomsnittet av disse individuelle klokkeskanningsprofiler (± SD, valgfritt; Figur 2 D ) . For RGB-bilder ( Figur 2E) vises også klokke skanneprofilen beregnet for hver enkelt fargekanal for hver valgt avkastning ( figur 2 F ), og gjennomsnittet beregnes innenfor en gitt kanal for alle valgte objekter ( figur 2 G ) . På samme måte vises de individuelle og gjennomsnittlige klokke skanneprofiler for objekter i bildestakken etter å ha utført klokke skanneanalyse av stabelen ( Figur 3A-3D , den gjennomsnittlige klokke skanneprofilen er ikke vist). Som nevnt før, den numeriskeAl data brukes til å generere disse tomtene ved å utføre plottet "List" -kommandoen.

Figur 4 illustrerer en ekstra applikasjon av alternativet polar transformasjon i Clock Scan-plugin: dets egnethet for bilderegistrering og overleggsoperasjoner. I denne figuren ble ROI-størrelses- og formuavhengige polære transformasjoner brukt til å sammenligne fordelingen av fluorescensmerking av neuroner som uttrykker a3 natrium / kalium-ATPase-pumpe mellom forskjellige musekortikale regioner, med atlasbildet som viser grensene og den anatomiske organisasjonen av Disse områdene ( figur 4A-4B ). Med en klokkeskanningsprotokoll er registreringen av referanse (atlas) og de faktiske bildene som kreves for en slik sammenligning, begrenset til en enkel fremgangsmåte for å justere bildene, skissere strukturen av interesse for begge bilder og deretter generere avkastningsstørrelses- og form- Uavhengige polære transformasjoner.I eksemplet vist i figur 4 demonstrerer en sammenligning av polære transformasjoner tydelig en ikke-jevn fordeling av merkede celler i hjernecortexen i hjernen, idet deres tetthet er spesielt høy i overfladiske områder av lag 2/3 av motorcortex, dorsal del Av den agranulære økulære cortexen, den laterale orbitale cortexen og i dype lag av motorcortexen ( Figur 4C-4D ).

Figur 1 : Representativt eksempel på applikasjon av Clock Scan Plugin for Image Analysis. ( A ) Fluorescerende lysbilde av en del av en rotte dorsalrotganglion immunostained for a3-isoformen av Na + / K + -ATPasen (a3 NKA, se Schneider et al. ³ for detaljer om vevsbehandling og -farging).En av nevronprofilene, med grensen tungt merket for α3 NKA (hvit), er skissert ved hjelp av et polygonlinjeværktøy (indre gul linje). Radialsøk (hvit pil) grenser (ytre gul linje) ble satt til 120% av objektradiusen, fra objektsenteret (hvit prikk) til den første piksel av omrisset, som vist i panel B (skanningsgrense rullefelt). ( B ) Skjermbilde av hovedalternativvinduet i Clock Scan-plugin. ( C ) Plot av integrert pikselintensitetsprofil av cellen vist i panel A (gjennomsnitt av 706 radiale skanneprofiler, se konturlengde i B; vertikale stenger er SD-stenger). ( D ) - Polar transformasjonsbilde av den studerte celleprofilen. ( E ) Klokke-skanneprofil av samme celle som er oppnådd med alternativet "ekte radius" valgt. Merk at i motsetning til profilen vist i C viser x-skalaen til denne profilen reelle romlige kalibreringsenheter (μm). ( F ) Polar transformasjon av samme celle som er oppnådd med Alternativet "ekte radius" er valgt. Merk at omfanget av denne transformasjonen nå er i ekte romlige kalibreringsenheter (μm). ( G ) Grensen for den polære transformasjonen, vist i D, ble skissert ved hjelp av segmentert linjeværktøy (linjetykkelsen ble satt til 10 piksler eller 10% av den radiale skanne lengden) og analysert. Kommandoen "Analyse | Plot Profile" ble utført for å måle endringene i gjennomsnittlig merkingsintensitet langs grensen til objektet (hvert datapunkt i grafen representerer gjennomsnittlig intensitet for alle piksler over utvalgslinjebredden). ( H ) Kommandoen "Analys | Surface Plot" ble påført polartransformeringsbildet vist i panel D for å skape 3-D-representasjon av objektets merkingsintensitet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

E 2 "class =" xfigimg "src =" / filer / ftp_upload / 55819 / 55819fig2.jpg "/>
Figur 2 : Representativt eksempel Anvendelse av bruk av Multi Clock Scan Plugin for bildeanalyse. ( A ) Fire synsfelt ble fanget i delen av rotte-dorsalrotganglion immunostained for α3 NKA (se figur 1 En legning). For å forenkle bruken av multi-klokke skanne plugin, ble disse bildene plassert i en stabel og deretter omgjort til et enkelt bilde ved hjelp av "Bilde | Stacks | Make Montage" -kommandoen. Røde linjer og tall angir en segmentert linjevalg av fem regioner av interesse i dette bildet. ( B ) Et skjermbilde av Multi Clock Scan-vinduet vises når plugin brukes til å analysere et gråskala bilde. ( C ) Individuelle klokke-skanneprofiler med fem ROI-er vist i panel A. ( D ) Gjennomsnittlig klokke-skanneprofil for utvalgte avkastningsposter (panelA) med SD-barer (alternativet "plot med standardavvik" valgt). ( E ) RGB-bilde av dyrkede mus-preBI-lymfocytter, merket med 4,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, nukleær flekk, blå) og med fluorescensmerkede antistoffer for β1-integrin (grønn) og F-aktin ; Se Dobretsov et al. ⁷ for cellekulturteknikken og Yuryev et al. ¹¹ for farging av detaljer). Elleve celler (se nummeretiketter) ble skissert ved hjelp av ImageJ-polygonevalgverktøyet. Paneler til høyre viser grønt og rødt kanalvisning av cellen # 7 (rektangulært valg på venstre panel) etter at menyen "Bilde | Farge | Split kanaler" har blitt utført. ( F ) Individuelle celle-skanneprofiler (sammensatte og røde, grønne og blå fargekanalprofiler vises henholdsvis henholdsvis svart, rød, grønn og blå). ( G ) Mean klokke skanne profiler for alle elleve ROIer valgt i paneletE. Fargebetegnelser som i panel G (ingen plott med standardavviksalternativ ble brukt under Multi Clock Scan-prosedyren). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3 : Multi Clock Scan Plugin og analyse av bildestabler. ( A ) Montasje av utvalgte og "lagrede som stakk" bildebilder. Et bilde av en dorsal rotgang ganglion nevron fanget med differensial interferens kontrast (DIC) mikroskopi er vist i den første rammen. Etterfølgende rammer ble ervervet ved hjelp av epi-belysningsfluorescensmikroskopi for å overvåke intracellulær kalsiumkonsentrasjon ved forskjellige tidsintervaller før og etter elektrisk stimulering av cellen. Tall ved siden av respektivE bilde angi tid i ms ⁶ . Grensen til cellen ble skissert ved hjelp av DIC-bildet av stabelen (øverst til venstre ramme; asterisk indikerer patch-clamp pipetten som brukes til opptak og fylle cellen med kalsiumsensitiv fargestoff Oregon Green BAPTA-1 (OGB-1) ), Og deretter brukes til å kjøre Multi Clock Scan-prosedyren på de gjenværende bildene. ( B ) Skjermbilde av Multi Clock Scan-vinduet, når programmet kjøres på en stabel med bilder. ( C ) Klokke-skanneprofiler av OGB-1 fluorescerende signal på forskjellige avstander fra cellesenteret (% av radius) og på forskjellige tidspunkter før og etter elektrisk stimulering (legenden, i ms). For å forberede disse grafene ble profesjonell grafisk programvare brukt. ( D ) Endringer i intensiteten til OGB-1-signalet med tiden i sub-membran og dypere cytoplasmatiske celleområder (henholdsvis røde og sorte sirkler og linjer). For å oppnå disse dataene ble gjennomsnittet og SD beregnet for hvert datapunktlokatEd mellom 20-40% og 70-90% av x-skalaen for hver klokke-skanneprofil vist i panel C (skyggelagte områder). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4 : Eksempel på bruk av Clock Scan Plugin i bilde registrering og overlegg. ( A og B ) Skjermbilder av plate 29 fra koronalseksjonen (Allen Mouse Brain Atlas) og en 200 μm tykk vibratomseksjon fra den gelatin-innebygde mushjerne kuttet på omtrent samme nivå som atlasbildet. Den transgene musen som ble benyttet i dette eksempelet, uttrykte ZsGreen-fluorescerende protein under promotoren av a3NKA, for å identifisere a3NKA-uttrykkende nevroner ² . For å bestemmeKortikale områder som er spesielt beriket med disse nevronene (lyse prikker på bildet i panel B), ble hele kortikale området skissert (gule punkterte linjer) som startet i begge bildene med samme referansepunkt (midtlinjen mellom cortex og olfactory Pære, piler). ( C ) Paneler representerer (fra venstre til høyre): Clock Scan polar forvandler avkastningen, valgt innenfor atlasbildet (panel A), innenfor bildet av musens hjerneeksjon (panel B) og overlegg av disse to transformasjonsbildene ("Bilde | Overlay | Add Image "kommando med 50% opacity setting). ( D ) Samme bilder som i panel C, men med grensene til de store kortikale områdene (som vist i atlaset) skissert i to andre transformasjonsbilder ved hjelp av ImageJ-polygonet, segmenterte linjevalgverktøy og "Analyser | Verktøy | Synkroniser Windows" kommando. Forkortelser er de samme som i den opprinnelige hjernen atlasbildet: Motor primær og sekundær (MOp, MOs), agranular insular, dorSal del (AId), orbital lateral, ventro-lateral og medial (ORBI, ORBvl, ORBm), prelimbic (PL), anterior cingulate, dorsal del (ACAd) cortex. Tall i MO-området refererer til de viktigste kortikale lagene, som kan skiller seg ut i musemotorens cortex på riktig koronal hjernenivå. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Clock Scan Protocol: Clock Scan-protokollen er et raskt og enkelt verktøy for bildeanalyse. Fordelene ved denne protokollen, sammenlignet med eksisterende vanlige tilnærminger til bildeanalyse (som lineære pikselintensitetsskanninger eller beregning av gjennomsnittlig pikselintensitet av avkastningen), er beskrevet i detaljer i tidligere publikasjoner ^{1 , 9} . Kort fortalt tillater denne protokollen generering av integrerte radiale pikselintensitetsprofiler ved å kvantifisere intensiteten av piksler som befinner seg på forskjellige avstander fra ROI-senteret, for eksempel objektets grense, eller en forhåndsbestemt plassering utenfor objektet (bakgrunn). På grunn av sistnevnte kan klokkeslettskanneprofilene for hvert avkastning alltid korrigeres for sin umiddelbare bakgrunn, hvilket (i biologiske applikasjoner) gjør denne profilen mindre avhengig av lokal, innenfor-prøve eller prøve-til-prøve, ikke-uniformitet I merking / farging, samt ustabilitet iIntensiteten til mikroskopets lyskilde eller lysstrålingstid. Objektets størrelse og form uavhengighet av klokke skanne profiler videre utvide området for anvendelse av denne protokollen ved å muliggjøre sammenligning av forskjellige objekter, samt korrigering ved punkt-for-punkt subtraksjon av profiler av "positiv" og "negativ" kontroll objekter.

Clock Scan Plugins: Hovedbegrensningen for distribusjon og deling av den opprinnelige protokollen var plattformavhengigheten av kode som ble utviklet med Visual Basic 6.0 (VB) ^{1 , 9} . Dette problemet er nylig behandlet av en av forskergruppene ved Leibniz Institute of Molecular Pharmacology, Tyskland, ved å utvikle en lignende Fuji ImageJ Clock Scan plugin ² . Leibniz-instituttets plugin gjengir den opprinnelige klokkeskanningen grunnleggende funksjonalitet i sin evne til å generere ikkeGral radial skanning profiler for vedlagte konvekse form avkastning, og i tillegg kan det behandle segmenter av konturer (buer). Skannegrensen for profilen som genereres av pluginet kan imidlertid kun settes til 100% (objektets grense), hvilket betyr at bakgrunnspikselintensiteten ikke kan kvantifiseres. Videre har den ingen evne til å generere polære transformasjoner, å jobbe med forskjellige fargekanaler i RGB-bilder, eller å jobbe med stabler av bilder og for å behandle flere avkastninger. Til sammenligning gjengir de to nye pluginene, som er beskrevet her, fullstendig muligheten til den opprinnelige VB-koden ( dvs. generering av integrerte klokke skanne pikselintensitetsprofiler med valgfri visning av SD og / eller bakgrunnsuttraksjon, samt behandling av forskjellige fargekanaler av RGB-bilder). I tillegg kan de analysere et segment / bueformet avkastning (funksjonalitet introdusert i Fuji ImageJ-plugin utviklet ved Leibniz Institute of Molecular Pharmacology ² ). Videre, thEse plugins utvider bruken av tidligere programmer ved å generere ROI-størrelse og form-uavhengige polare ROI-bildeformasjoner, som kan brukes i applikasjoner som krever bilderegistrering. Endelig letter multiklokke-plugin-modulen effektivt klokkevisning av flere ROIer som ligger innenfor samme bilde eller i en bildestabel. Den sistnevnte nye funksjonen til programmet er spesielt nyttig i applikasjoner der det er viktig å bestemme endringer relatert til tid og sted.

Begrensninger og feilsøking: Hovedbegrensningen av Clock Scan-metoden er kravet om å velge en konveks formet avkastning. Klokke skanneprofilen ville være meningsløs i situasjoner når noen av radiale skanninger krysser ROI-omrisset mer enn en gang. Dette ville gjøre normaliseringen av lengden av slik radiell skanning med hensyn til avstanden fra sentrum til avkastningen på avkastningen umulig. En annen begrensning er at klokke skanne profil informasjonen er progresSivt redusert i avkastning uten radial symmetri. Imidlertid kan disse to begrensningene i det minste delvis overvinnes ved analyse av utvalgte segmenter (buer) av komplekse og asymmetriske ROI. Bruke segmentskanningen anbefales også i tilfeller der deler av bakgrunnsområdet inneholder merkede funksjoner, noe som kan påvirke bakgrunnsuttrekkingsprosedyren (se figur 2A for et eksempel på utvalg for analyse av de cellesegmentene som ikke står overfor andre merkede celler). Til slutt, hvis analyser av sammensatte bilder som inneholder mer enn 3 fargekanaler, kreves, må fargekanaler av disse bildene deles før de kjører plugin.

Fremtidige retninger: Fremtidige forbedringer i funksjonaliteten til disse pluginene vil inkludere, men er ikke begrenset til å oppdatere koden for å kombinere funksjonaliteten til klokkeskann og multiklokke-plugins i ett plugin. Fargekombinasjonsalgoritmer (som algoritmer basEd på beregninger av Pearson korrelasjon eller Manders split koeffisienter), og utviklingen av plugin for å bli i stand til å arbeide med flere ROIer som er valgt i forskjellige bilder eller i forskjellige skiver i en bildebunke (nåværende versjon av pluginene tillater analyse av flere Avkastningene som er valgt innenfor ett bilde eller en avkastning som er valgt for alle bilder i stakken), vil bli implementert. Forfatterne vil også sette pris på eventuelle forslag fra plugin-brukere og rapporter om problemer som oppstår under bruken av eksisterende pluginprogrammer.

Konklusjon: Klokke skanneanalysen er et lovende verktøy for bildebehandling i mange områder av biologi, fra analyse av statisk cellemerking med ulike markører til studier av spredning av Na ⁺ eller Ca ⁺⁺ , i en enkelt celle, så vel som for Analyse av spredningsaktivitet ( f.eks . Ca ^++- bølger) i populasjoner av synaptisk forbundne celler ¹⁰ , ¹¹ eller gapkoblingskoblede celler ¹² . Andre mulige anvendelsesområder for klokkeskanningsanalysen inkluderer medisinsk bildeanalyse (ultralydbilder av blodkar, CT-skannebilder og bein-tverrsnitt), astronomi (spiral- og radialgalaksimagasinering), kjemi (diffusjon fra en punktkilde), Fysikk (diffraksjonsmønsteranalyse), skogbruk (analyse av trestamme ring for å bestemme alder av treet, samt perioder med tørt vær og dårlig befruktning), engineering (metallrørskorrosjon) og klimatologi (værradaranalyse).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer	Any		compatible with software listed below
ImageJ or Fiji ImageJ	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/ or https://fiji.sc/	bundled with Java 1.8 or higher
Clock-scan plugins	freeware	https://sourceforge.net/projects/clockscan/	Clock_Scan-1.0.1 jar and Multi_Clock_Scan-1.0.1/ jar
Origin 9.0	OriginLab	Northampton, MA, USA	This program was used to generate some graphs of the original Clock Scan data. Any other graphic software can be used to perform this function