Summary
このプロトコルの全体的な目標はポータブル、コスト効果の高い、機能的なナノセンサーを合成する、特にターゲットに磁気緩和と蛍光発光モダリティの組み合わせにより病原性細菌の迅速検出。
Abstract
腸管出血性大腸菌o157: h7 は、水性の両方にリンクされている媒介する病気と食料と水上映方法にも関わらず脅威は現在使用されるまま。従来の細菌検出方法、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)、酵素抗体法 (ELISA) 特に病原性の汚染物質を検出できるよう彼らが豊富なサンプル準備と待機時間が長く必要です。さらに、これらのプラクティスは洗練された実験室の器械と設定、要求し、訓練を受けた専門家によって実行される必要があります。ここで、ナノ粒子ベースのプラットフォームの磁気および蛍光パラメーターの一意の組み合わせを備えて簡単診断技術のためのプロトコルを提案します。提案多重磁気蛍光ナノセンサー (MFnS) は、大腸菌o157: h7 汚染としてはほとんど 1 コロニー形成単位未満 1 時間以内のソリューションに存在を検出できます。牛乳など複雑なメディアで高機能を維持する MFnS の能力をさらに、湖の水を確認します。その他特異性アッセイも同じような細菌種の存在下でも、特定のターゲット細菌のみを検出する MFnS の能力を発揮する使用されました。検出の両方の初期と後期段階の汚染検出でその高性能を出展、濃度の広い範囲の病原体汚染の定量化により、磁気や蛍光灯のモダリティのペアリングします。有効性、手頃な価格、および、MFnS の移植性から作ることがポイント ・ オブ ・ ケア スクリーニング細菌汚染のための理想的な候補の設定の広い範囲で市販加工食品に水生の貯水池。
Introduction
両方の細菌汚染度の永続的な発生市販食品と水の源はますます急速なと特定の診断プラットフォームの必要性を作成しました。1,2より一般的な細菌汚染食料と水の汚染のための責任の一部はサルモネラ、黄色ブドウ球菌、リステリア菌、腸炎ビブリオ、赤痢菌、細菌、大腸菌属です。3,4多くの場合これらの病原体が細菌汚染の結果熱、コレラ、胃腸炎、下痢などの症状。4しばしば水源の汚染が十分にろ過された水へのアクセスなしでコミュニティに抜本的な不利な影響と食品汚染が病気や製品のリコールの努力の偉大な数につながっています。5,6
細菌汚染に起因する病気の発生を減らすために、水と食品を効率的にスキャン販売または消費する前に方法を開発する努力の数がずっとあります。1,7,8,9,10 12ループ lamp 法 (11,, elisa 法、PCR などの3手法ランプ)13,14 15、16,17,18,19,20,21、 22,23,24は、最近様々 な病原体の検出に使用されています。伝統的な細菌の培養方法と比較して、これらの技術、特異性と時間に関してはるかに多く効率的です。しかし、これらの技術はまだ偽陽性とネガ、複雑な手順、コストと戦います。1,3,25細菌検出のための代替方法として多重磁気蛍光ナノセンサー (MFnS) を提案する、まさにこの理由のためです。
これらナノセンサーでの磁気緩和と迅速かつ適確なデュアル検出プラットフォームを可能にする蛍光のモダリティのペアリング方法一緒に一意に。E. 大腸菌o157: h7 を使用すると、サンプルの汚染物質として、分以内として少し 1 CFU を検出する MFnS の能力を発揮します。病原体特異抗体は特異性を上げるため、磁気や蛍光灯のモダリティの組み合わせにより、検出の両方の低と高の汚染範囲の細菌汚染の定量化。16細菌汚染の場合、ナノセンサー、細菌病原体特異的抗体のターゲットの能力のため周辺群発地震します。磁気ナノセンサーと細菌の間のバインドは、磁気鉄のコアと周辺の水のプロトン間の相互作用を制限します。これは磁気 relaxometer で記録された T2 緩和時間の増加を引き起こします。ソリューションにおける細菌の濃度が上昇すると、T2 値が小さい結果、細菌数の増加など、ナノセンサーを分散します。逆に、病原体を直接バインド ナノセンサーの数が増えたため、細菌の濃度に比例した蛍光性の放出が増えます。サンプルの遠心分離と分離細菌のペレットのみ任意の浮遊ナノセンサーを取り外して直接関連付けの数と蛍光性の放出、細菌に直接接続されているナノ粒子を節約します。ソリューションに存在する細菌。このメカニズムの概略は、図 1で表されます。
この MFnS プラットフォームは、ポイント ・ オブ ・ ケア スクリーニング低コスト ・ ポータブルの特性で、心で設計されています。MFnS は常温で安定しているし、細菌汚染の正確な検出のための非常に低濃度で必要なだけです。さらに、合成後に、、MFnS の使用は簡単、分野で訓練を受けた専門家の使用を必要としません。最後に、この診断プラットフォームにより高度なカスタマイズをターゲットに、さまざまな設定のすべての種類の病原体を検出する 1 つのプラットフォームを使用可能性があります、この手段を提供します。
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Protocol
1. 合成と多パラメトリック磁気蛍光ナノセンサー (MFnS) の機能化
。- 超常磁性酸化鉄の合成ナノ粒子 (IONPs)
- IONP 合成に備えて準備次の 3 ソリューション: ソリューション 1: した FeCl 3 (0.70 g) とした FeCl 2 H 2 O (2 mL)、ソリューション 2: NH 4 ああ (2.0 mL、13.4 M) H 2 O (15 mL)、ソリューション 3: ポリアクリル酸 (0.855 g) H 2 O (5 mL).
- は、ソリューション 1 に 2 M 塩酸 (HCl) の 90 μ l 添加しすぐに 875 rpm でボルテックスしながらソリューション 2 を混ぜます。解決策 3 を追加します。60 分のボルテックスを続ける
- 1,620 x g に 20 分間遠心遠心 2,880 x g に 20 分間清
- は、透析による最終的な上澄みを浄化します。透析バッグに上澄みを追加 (MWCO 6 − 8 K)、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) が含まれているビーカーに配置 (pH = 7.4) とスピン バー。それはすべて 2-3 h. 新鮮なバッファーに置き換えて、12 時間浸してみましょう
- IONPs の表面にターゲット固有の抗体の共役
- 次の 4 つのソリューションを準備: ソリューション a: 5 mg 1-エチル - 3-(3-dimethylaminopropyl) 250 μ L MES のカルボジイミド塩酸塩 (EDC) [2-(N-morpholino) ethanesulfonic 酸] バッファー (0.1 M、pH = 6.8)、ソリューション b: 3 mg N-(NHS) の MES バッファーの 250 μ L (0.1 M、pH = 6.8)、IgG1、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (pH 7.4) の 225 μ L で、大腸菌 mAb のソリューション c: 5 μ g、IONP ソリューション d: 4 ml (5.0 m モル) を 1 mL の PBS (pH 7.4)。
- 追加 2 (N Morpholino) ethanesulfonic 酸 (MES) バッファー溶液をすぐに追加溶液ソリューション d 15 内の小さな単位で s、混合の各付加の後でソリューションを反転します 。
- はすぐに 3 分間にわたって少しずつソリューション d ソリューション B を追加する開始します。各付加の後でソリューションを反転してミックスします 。
- 混合の各付加の後でソリューションを反転ソリューション C を 5 μ L の単位でソリューションに追加します 。
- 反応室温で 3 時間して一晩 4 ° C で孵化を続行するを許可します 。
- PBS を使用する磁気の列を介して結果 Ab 共役 IONPs を浄化する (pH 7.4、決勝 [Fe] を = = 3.5 mmol) 任意の非抗体を削除します。
- PBS (1 mL) で洗浄磁気の列。磁気プレートに列を添付し、IONP ソリューションを追加します 。
- は、PBS (1 mL) の磁気コラムを再度洗浄します。磁気プレートから磁気の列を削除します。PBS を列に追加し、ソリューションを収集します。4 ° C でストア
- カプセル化蛍光 1, 1 の ' - Dioctadecyl - 3,3,3 ' 3、'-Tetramethylindocarbocyanine 過塩素酸塩 (DiI) 色素標識抗体 IONPs を使用してのポリアクリル酸 (PAA) のコーティングに、溶媒拡散法。
- 、IONPs の 4 mL に追加滴 2.0 μ L で 1100 rpm 連続混合 DMSO の 100 μ L の DiI 色素 (2 mmol) の 。
- [Fe] の最終的な鉄濃度を最終的な MFnS ソリューションの作成、PBS に対して得られた溶液 (12 h MWCO 6-8 KDa) を dialyze = 2 モル 。
- MFnS 特性
- 吸光光度分析用プレート リーダー 595 で蛍光性の放出でカプセル化された DiI 染料を検出する nM 。
- 動的光散乱法による
- が平均サイズとは MFnS の表面電荷を決定する zetasizer に MFnS ソリューションのサンプルを配置します
。 注: ここでは、平均サイズと機能 MFnS の表面電荷ことがわかった 77.09 nm と-22.3 mV、それぞれします 。
- が平均サイズとは MFnS の表面電荷を決定する zetasizer に MFnS ソリューションのサンプルを配置します
2。細菌の培養とストックに調製した溶液
- 細菌培養
- 水和物の凍結乾燥ペレット (E. 大腸菌 o157: h7) 栄養流体培養基の 1 mL にし、スープの追加 5 mL を追加します 。
- 寒天培地と連勝するには、このソリューションの適用 100 μ L を使用して滅菌接種ループ、37 ° C 24 時間で孵化が続く
- 後 24 h、寒天板から隔離されたコロニーを選択し、15 mL の培養液を追加します。光学濃度値を監視しながら 4-6 時間、37 ° C で孵化させなさい (吸光度 600 nm).
- 0.1 の光学密度値を取得した後、培養を停止し、シリアル希薄を実行します 。
- シリアル希薄
- 8 つの滅菌遠心チューブに栄養流体培養基の追加 900 μ L.
- 初の管 (希釈 10 -1) に細菌懸濁液の追加 100 μ L.
- 最初から取る 100 μ L チューブ 10 -2 の希釈を取得する、2 番目に追加.残りのチューブ、最終希釈 10 -8 で終わるこのパターンを続ける 。
- 寒天培地プレートを分離し、37 で 24 時間インキュベート各チューブから転送 100 μ L ° C
- 次の日は、各プレート上 (CFUs) の単位を形作っているコロニーをカウントします。〜 100 CFUs のプレートを選択します。さらに実験のための対応する希釈を使用 (100 μ L = 100 ~ CFUs).
注: ここにそれは 〜 100 CFUs の結果 10 -6 希釈します 。
3。迅速な検出の E. 大腸菌 o157: h7 MFnS を使用して
- スパイク 1 ~ 100 CFU 範囲の結果 10 -6 細菌の在庫の増加額で様々 な PBS ソリューション (1 X、pH 7.4 では、300 μ L)。MFnS の一貫した量を追加 (100 μ L) これらのソリューションにします 。
- PBS (1 X、pH 7.4 では、300 μ L) のみが含まれている 1 つのベースライン ソリューションを作成し、MFnS (100 μ L).
- 37 ° C で 30 分のためのソリューションをインキュベートし、部屋の温度を冷ますします 。
- 磁気 relaxometer (0.47 テスラ) と各ソリューションの CFUs 基準緩和時間 (T2) の変更を記録する個々 のソリューションを転送します。
- T2 値の変化を記録、PBS と MFnS のみを含むベースライン ソリューションの T2 値を測定することによって開始します。
- 磁気でソリューションの場所 relaxometer。それぞれのソフトウェアを開き、選択、" T2 緩和 " 設定を押し " 測定 "
- 様々 なスパイクが追加のソリューションの T2 値を測定基準 T2、のコレクションを次。細菌の濃度.
注意: T2 に変更、ベースライン スパイク T2 から減算 T2 に相当します 。
- T2 値の変化を記録、PBS と MFnS のみを含むベースライン ソリューションの T2 値を測定することによって開始します。
- 磁気 relaxometer からのサンプルを削除し 2880 x g で 10 分間のチューブを遠心分離
- 上清を捨て、100 μ L の PBS (1 X、pH 7.4) の細菌のペレットを再懸濁します 。
- 96 ウェル プレートと 595 でのレコードの蛍光強度をそれぞれの巻き上がりを追加 80 μ L nM
。 注: テスト繰り返すことができる結果のセクションで説明するように、湖の水、ミルクなど、異なる溶媒を用いた
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Representative Results
MFnS の作用機序は、図 1で表されます。細菌汚染物質の表面周囲の MFnS のクラスタ リングは、MFnS の magnetic cores と周囲の水素原子核の相互作用を妨げます。このクラスタ リング、磁気緩和の結果として値が増加します。細菌汚染の濃度が増えると、クラスタ リングが縮小し、T2 値の変動が減少します。したがって、蛍光のモダリティの追加が重要です。細菌の濃度が増えると、MFnS によって生成される蛍光信号の強度が増加し、両方の低と高濃度範囲内の細菌汚染の高感度の検出を可能にします。
次のプロトコルは、16 MFnS を合成し、まず PBS (1 X、pH 7.4) のソリューションでテストします。検出、磁気緩和のため初期のモダリティは、T2 値の変化を記録する使用されました。プロトコルに従ってサンプル遠心し、ペレットが再停止され、蛍光のデータが収集されました。対応する ΔT2 と蛍光発光値は、図 2に掲載されています。示すように、ΔT2 値は、細菌汚染の低濃度で最大だったし、約 20 CFUs で飽和状態に達しています。蛍光性の放出、その一方より正確になった > 20 CFUs、これらの 2 つのモダリティを組み合わせることの重要性を表示します。次のこれらの主要な試複雑なメディア、湖の水や牛乳などで同様のテストを行った。これは、ナノセンサーがより複雑なメディアでまだ有効であることを確保するために行われました。これらの試金から収集されたデータは、図 3のとおりで、PBS で行われた試金に非常に類似しています。これは、複雑なメディアでこれらナノセンサーが効力を確認します。
MFnS が単純および複雑なメディアの細菌汚染の存在を検出できることを確認し、テストの数、行った、ナノセンサーによって維持の特異性のレベルを決定します。このため、MFnS ターゲット細菌熱殺されたターゲット、非標的細菌 (病原性大腸菌やサルモネラ) ・混合物を含む溶液で培養。これは特異性アッセイのみ、磁気緩和データのみのコレクションは十分だった、図 4に対応するデータを表示しました。エシェリヒア属大腸菌o157: h7 をライブにのみバインドされている、MFnS 見ることができると他の熱殺されたまたは非標的細菌。このレベルの特異性は、共役ターゲット抗体に起因してさらに MFnS ときの存在下でも非病原性の細菌種の特定病原体汚染の検出に有効であることを確認します。
図 1: 磁気蛍光検出メカニズムです。MFnS 合成とデュアル モーダル細菌検出機構の模式図。短い潜伏期間 (30 分)、MFnS、磁気共鳴と蛍光性の放出の組み合わせを介してターゲット細菌を敏感に検出することができます。磁気 relaxometer によって検出不可能である磁気緩和値の変化を引き起こす細菌汚染物質の表面周囲の MFnS のクラスタ リングします。さらに、細菌汚染に直接バインドされている MFnS から蛍光信号を収集ことがあります。これは、両方の低と高濃度範囲内細菌汚染を検出できるデュアル モーダル検出プラットフォームを提供します。16この図はからの許可を変更されています。16
図 2:.の概念の証明A) 磁気緩和データ (ΔT2) はエシェリヒア属大腸菌o157: h7 (1 100 CFU) PBS 溶剤での希釈液を採取した最初 (1 X、pH 7.4 を =)。氏細菌の検出された高感度低い CFU の数 (はめ込み式: 1 20 CFU に至る)。ただし、ΔT2 測定値になったより高い細菌濃度で飽和状態 (> 20 CFU)、氏が検出と早期の細菌汚染の定量化のために貴重であることを示します。B) 蛍光発光データから同じスパイク PBS ソリューション (inset: 直線性プロット)。それは低 CFU サンプルの感受性に欠けている間、蛍光検出法が高い CFU の数より敏感であることがわかった。一緒に、これらのデータは、検出し、細菌汚染の細菌汚染の初期と後期-段を定量化する磁気や蛍光灯のモダリティの能力を発揮します。16 3 つの測定の平均値が描かれた ± 標準誤差です。この図はからの許可を変更されています。16
図 3: 複雑なメディアで細菌を検出します。磁気緩和 ΔT2 データ収集 A) 湖などのより複雑なメディアから水と牛乳 B)。以前の PBS 溶液から収集されたデータと同様に、細菌汚染の検出された 1 20 CFU (インセット) の範囲でより敏感が認められた.対応する蛍光発光データ収集された C) 湖の水と D) ミルクのサンプル (インセット: 直線性プロット)、CFU の数を増やすとより高い感受性を示した。もう一度、これらのデータは、各モダリティを補完する他の有効性を実証し、複雑なメディアの機能を維持する能力を検証します。16 3 つの測定の平均値が描かれた ± 標準誤差です。この図はからの許可を変更されています。16
図 4: MFnS 特異性。MFnS の特異性は、A) 細菌の交差汚染物質との混合物と B) 熱不活化の数を含む栄養流体培養基溶液中における氏の分析を使用してテストされたエシェリヒア属大腸菌o157: h7 です。示すように、それは、ナノセンサーが少しにバインディングのない非対象の細菌とがまだ他の汚染物質の存在下でターゲット細菌を検出できる経由でこの形式のスクリーニングのことを確保することが明らかble 非病原性細菌の種数を含む複雑なメディアで使用するため。アイソタイプの抗体と MFnS を合成した C) さらに特異性試験を行った (赤い円: 抗大腸菌O111)、o157: h7 抗体共役 MFnS (黒い正方形) と比較してバインドする少しにつながった。これらのデータは、MFnS に対して、実行可能なターゲット細菌と反応するだけ、さらにポイント ・ オブ ・ ケア診断プラットフォームとしてその有効性を検証することを示します。16 3 つの測定の平均値が描かれた ± 標準誤差です。この図はからの許可を変更されています。16
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Discussion
このプロトコルは、単に完全に機能の MFnS を生成する設計されている可能な限り。ただし、プロトコルの変更、ユーザーの目的に応じて、役に立つかもしれない多くの重要なポイントがあります。たとえば、異なった抗体の使用は他の多くの病原体の対象になります。さらに、このプロトコルは抗体分子をターゲットとしての使用に限定ではありません。ホスト細胞受容体などのターゲットの病原体の特定の結合親和性のある分子は、分子をターゲットとして使用する場合があります。ターゲット分子第一次アミンまたはアルコール グループ、または 1 つが機能することができます、限りは、プロトコルに記載されている EDC/NHS 共役化学によると酸化鉄ナノ粒子の表面に共役があります。第二に、各検出ソリューションで使用される MFnS の量は変わるかもしれない。(溶剤と対象病原体なしナノセンサーのみ含む) ベースライン ソリューションの T2 値は 100-250 ミリ秒の範囲で基準値が 100、以下の場合、T2 値の変化は敏感になりますので、十分を使用することが重要です。、ナノセンサーの過剰による。ベースライン T2 値を高めるためには、ソリューションでナノセンサーの量を減らします。ただし、ベースラインが 250 超えると場合、それが過度に敏感になるし、偽陽性になる可能性が高い。これらの理由は、ベースライン ソリューション 100 250 ms 間 T2 値を目指すことをお勧めします。
ポイント ・ オブ ・ ケア診断としての利用を検討する際、このプロトコルの現在の制限は、現在のベンチトップ磁場 relaxometer への依存です。効果的な安定した、この磁気緩和プラットフォームをサイズ可搬性を高めるために減らすことができます。これは、このプラットフォームされる可能性があります異なる環境でなど、水源や効果的な敷地内細菌のスクリーニングのための食料品市場で使いやすさを増加させます。これはまたポイント ・ オブ ・ ケア病原体検出のより可能となった、このマシンのコストを減らすことができます。
低リソースの設定で、病気の診断と病原体の検出に関するこのプラットフォーム現在病原体診断技術、今日使用される PCR や ELISA などよりもより効果的になる可能性があります。伝統技法は主として効率的に証明されている、非常に複雑、高価で遅いが。そのため、ポイント ・ オブ ・ ケア検出病原体や病気の診断のための低リソースの設定で使用するために開発される可能性が正確な診断プラットフォームの必要性があります。このプラットフォームは、比較的使いやすく、コスト効果的かつ迅速です。別に必要となるマシン (relaxometer とプレート リーダー) の初期スタートアップのコスト、実際の MFnS は比較的安価と非常に安定しました。また、T2 値のコレクションは簡単、プロの研究室の技術者を必要としません。
将来は、MFnS を用いた細菌汚染の磁気および蛍光検出に使用できるより多くのポータブル、ハンドヘルド デバイスを設計する生物・化学のエンジニアとのコラボレーションを推進します。小さい装置の開発は、さらにこの検出プラットフォームに関連付けられているコストを削減し、フィールドでその有効性を高めるのに役立つでしょう。さらに、このプラットフォームを使用して殺菌剤を開発の効果を分析する可能性があります。我々 のデータに示すように、私たちの MFnS ライブ対象菌と結合することができた、小さなに信号がない熱殺された細菌の培養を生産します。これに基づき、殺生物剤候補者の有効性をテストするよう当社のプラットフォームを使用でき、さらに将来的にこれを検討する予定します。
このプロトコルの重要なステップには、MFnS の初期の合成と T2 のデータのコレクションが含まれます。正しく浮遊抗体が T2 データ コレクションと干渉しないように MFnS を浄化することが重要です。さらに、MFnS 濃度の変化は偽陽性/陰性を危険にさらす T2 値が変更されますと、各テストのサンプルは、MFnS の量が一貫性のある、なければなりません。
結論としては、MFnS が細菌汚染との戦いで新しい一歩と追加病原体の目標が達成されるとさらに発展して、設計よりポータブル機器を追求。低コストと低複雑さの MFnS の使用に関連付けられているそれら細菌汚染の現場検知に使用する実行可能な候補になります。これらナノセンサーの合成には、入念な準備が必要ですが、実際の使用は比較的簡単ですと食中毒および水上に浮かんだ病気を減らすために可能性を与えます。さらなる発展をこれらナノセンサーの実装は、貯水池の審査で見られるかもしれない、市販食品包装のサイト、販売、および多分均一な家のポイント。
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Disclosures
このナノテクノロジーの実証済みのアプリケーションは、まだ FDA によって承認されていません。
Acknowledgments
この作品は、K INBRE P20GM103418、カンザス大豆委員会 (KSC/PSU 1663 年)、ACS PRF 56629 UNI7 と SS にすべて電源ユニット高分子化学スタートアップ資金によってサポートされます。ビデオと彼の顕著な仕事のため大学のビデオグラファー、ジェイコブ アンセルミ氏に感謝いたします。我々 もありがとう氏のロジャー ・ Heckert と夫人カタ Heckert 研究のための彼らの寛大なサポート。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ferrous Chloride Tetrahydrate | Fisher Scientific | I90-500 | |
| Ferric Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | I88-500 | |
| Ammonium Hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Polyacryllic Acid | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
| EDC | Thermofisher Scientific | 22980 | |
| NHS | Fisher Scientific | AC157270250 | |
| Anti-E. coli O111 antibody | sera care | 5310-0352 | |
| Anti-E. coli O157:H7 antibody [P3C6] | Abcam | ab75244 | |
| DiI Stain | Fisher Scientific | D282 | |
| Nutrient Broth | Difco | 233000 | |
| Freeze-dried E. coli O157:H7 pellet | ATCC | 700728 | |
| Magnetic Relaxomteter | Bruker | mq20 | |
| Zetasizer | Malvern | NANO-ZS90 | |
| Plate Reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Magnetic Column | QuadroMACS | 130-090-976 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 Series | |
| Centrifuge (accuSpin Micro 17) | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
| Floor Model Shaking Incubator | SHEL LAB | SSI5 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | ME104E | |
| Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Open-Air Rocking Shaker | Fisher Scientific | 02-217-765 |
References
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