このプロトコルの全体的な目標はポータブル、コスト効果の高い、機能的なナノセンサーを合成する、特にターゲットに磁気緩和と蛍光発光モダリティの組み合わせにより病原性細菌の迅速検出。
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この記事について
サマリー
要約
腸管出血性大腸菌o157: h7 は、水性の両方にリンクされている媒介する病気と食料と水上映方法にも関わらず脅威は現在使用されるまま。従来の細菌検出方法、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)、酵素抗体法 (ELISA) 特に病原性の汚染物質を検出できるよう彼らが豊富なサンプル準備と待機時間が長く必要です。さらに、これらのプラクティスは洗練された実験室の器械と設定、要求し、訓練を受けた専門家によって実行される必要があります。ここで、ナノ粒子ベースのプラットフォームの磁気および蛍光パラメーターの一意の組み合わせを備えて簡単診断技術のためのプロトコルを提案します。提案多重磁気蛍光ナノセンサー (MFnS) は、大腸菌o157: h7 汚染としてはほとんど 1 コロニー形成単位未満 1 時間以内のソリューションに存在を検出できます。牛乳など複雑なメディアで高機能を維持する MFnS の能力をさらに、湖の水を確認します。その他特異性アッセイも同じような細菌種の存在下でも、特定のターゲット細菌のみを検出する MFnS の能力を発揮する使用されました。検出の両方の初期と後期段階の汚染検出でその高性能を出展、濃度の広い範囲の病原体汚染の定量化により、磁気や蛍光灯のモダリティのペアリングします。有効性、手頃な価格、および、MFnS の移植性から作ることがポイント ・ オブ ・ ケア スクリーニング細菌汚染のための理想的な候補の設定の広い範囲で市販加工食品に水生の貯水池。
概要
両方の細菌汚染度の永続的な発生市販食品と水の源はますます急速なと特定の診断プラットフォームの必要性を作成しました。1,2より一般的な細菌汚染食料と水の汚染のための責任の一部はサルモネラ、黄色ブドウ球菌、リステリア菌、腸炎ビブリオ、赤痢菌、細菌、大腸菌属です。3,4多くの場合これらの病原体が細菌汚染の結果熱、コレラ、胃腸炎、下痢などの症状。4しばしば水源の汚染が十分にろ過された水へのアクセスなしでコミュニティに抜本的な不利な影響と食品汚染が病気や製品のリコールの努力の偉大な数につながっています。5,6
細菌汚染に起因する病気の発生を減らすために、水と食品を効率的にスキャン販売または消費する前に方法を開発する努力の数がずっとあります。1,7,8,
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プロトコル
1. 合成と多パラメトリック磁気蛍光ナノセンサー (MFnS) の機能化
。- 超常磁性酸化鉄の合成ナノ粒子 (IONPs)
- IONP 合成に備えて準備次の 3 ソリューション: ソリューション 1: した FeCl 3 (0.70 g) とした FeCl 2 H 2 O (2 mL)、ソリューション 2: NH 4 ああ (2.0 mL、13.4 M) H 2 O (15 mL)、ソリューション 3: ポリアクリル酸 (0.855 g) H 2 O (5 mL).
- は、ソリューション 1 に 2 M 塩酸 (HCl) の 90 μ l 添加しすぐに 875 rpm でボルテックスしながらソリューション 2 を混ぜます。解決策 3 を追加します。60 分のボルテックスを続ける
- 1,620 x g に 20 分間遠心遠心 2,880 x g に 20 分間清
- は、透析による最終的な上澄みを浄化します。透析バッグに上澄みを追加 (MWCO 6 − 8 K)、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) が含まれているビーカーに配置 (pH = 7.4) とスピン バー。それはすべて 2-3 h. 新鮮なバッファーに置き換えて、12 時間浸してみましょう
- IONPs ....
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結果
MFnS の作用機序は、図 1で表されます。細菌汚染物質の表面周囲の MFnS のクラスタ リングは、MFnS の magnetic cores と周囲の水素原子核の相互作用を妨げます。このクラスタ リング、磁気緩和の結果として値が増加します。細菌汚染の濃度が増えると、クラスタ リングが縮小し、T2 値の変動が減少します。したがって、蛍光のモダリティの追加が重要です。細菌の濃度が増えると、MFnS によって生成される蛍光信号の強度が増加し、両方の低と高濃度範囲内の細菌汚染の高感度の検出を可能にします。
次のプロトコルは、16 MFnS を合成し、まず PBS (1 X、pH 7.4) のソリューションでテストします。検出、磁気緩和のため初期のモダリティは、T2 値の変化を記録する使用されました。プロトコルに従ってサンプル遠心し、ペレットが再停止され、蛍光のデータが収集されました。対応する ΔT2 と蛍光発光値は、図 2
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ディスカッション
このプロトコルは、単に完全に機能の MFnS を生成する設計されている可能な限り。ただし、プロトコルの変更、ユーザーの目的に応じて、役に立つかもしれない多くの重要なポイントがあります。たとえば、異なった抗体の使用は他の多くの病原体の対象になります。さらに、このプロトコルは抗体分子をターゲットとしての使用に限定ではありません。ホスト細胞受容体などのターゲットの病原体の特定の結合親和性のある分子は、分子をターゲットとして使用する場合があります。ターゲット分子第一次アミンまたはアルコール グループ、または 1 つが機能することができます、限りは、プロトコルに記載されている EDC/NHS 共役化学によると酸化鉄ナノ粒子の表面に共役があります。第二に、各検出ソリューションで使用される MFnS の量は変わるかもしれない。(溶剤と対象病原体なしナノセンサーのみ含む) ベースライン ソリューションの T2 値は 100-250 ミリ秒の範囲で基準値が 100、以下の場合、T2 値の変化は敏感になりますので、十分を使用することが重要です。、ナノセンサーの過剰による。ベースライン T2 .......
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開示事項
このナノテクノロジーの実証済みのアプリケーションは、まだ FDA によって承認されていません。
謝辞
この作品は、K INBRE P20GM103418、カンザス大豆委員会 (KSC/PSU 1663 年)、ACS PRF 56629 UNI7 と SS にすべて電源ユニット高分子化学スタートアップ資金によってサポートされます。ビデオと彼の顕著な仕事のため大学のビデオグラファー、ジェイコブ アンセルミ氏に感謝いたします。我々 もありがとう氏のロジャー ・ Heckert と夫人カタ Heckert 研究のための彼らの寛大なサポート。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 塩化第一鉄四水和物 | ッシャーサイエンティフィ | I90-500 | |
| 第二鉄六水和物 | ッシャーサイエンティフィック | I88-500 | |
| 酸化アンモニウム | フィッシャーサイエンティフィ | A669S-500 | |
| 酸 | ッシャーサイエンティフィ | A144S-500 | |
| ポリアクリル酸 | シグマアルドリッチ | 323667-100G | |
| EDC | Thermofisher Scientific | 22980 | |
| NHS | Fisher Scientific | AC157270250 | |
| Anti-E. coli O111 抗体 | sera care | 5310-0352 | |
| 抗大腸菌 O157:H7 抗体 [P3C6] | Abcam | ab75244 | |
| DiI Stain | Fisher Scientific | D282 | |
| Nutrient Broth | Difco | 233000 | |
| 凍結乾燥大腸菌 O157:H7 ペレット | ATCC | 700728 | |
| Magnetic Relaxomteter | ブルカー | mq20 | |
| ゼータサイザー | マルバーン | NANO-ZS90 | |
| プレートリーダー | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| マグネティックカラム | QuadroMACS | 130-090-976 | |
| 遠心分離機 | Eppendorf | 5804 シリーズ | |
| 遠心分離機 (accuSpin Micro 17) | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
| フロアモデル 振とうインキュベーター | SHEL LAB | SSI5 | |
| 分析天びん | Metler Toledo | ME104E | |
| デジタルボルテックスミキサー | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| オープンエアロッキングシェーカー | フィッシャーサイエンティフィ | 02-217-765 |
参考文献
- Law, J. W., Ab Mutalib, N. S., Chan, K. G., Lee, L. H. Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens: principles, applications, advantages and limitations. Front Microbiol. 5, 770(2014).
- Pandey, P. K., Kass, P. H., Soupir, M. L., Biswas, S., Singh, V. P.
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再版と許可
