目標とするCaを用いたER / SRカルシウム放出のモニタリング Published: May 19, 2017 doi: 10.3791/55822

DOI

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Florence N. Reddish¹, Cassandra L. Miller¹, Rakshya Gorkhali¹, Jenny J. Yang¹

¹Department of Chemistry, Center of Diagnostics and Therapeutics (CDT), Georgia State University

Summary

我々は、リアルタイム蛍光顕微鏡法を用いて、HEK293および骨格筋C2C12細胞の小胞/筋小胞体（ER / SR）における急速なカルシウム過渡状態をモニタリングするための、標的遺伝子操作されたカルシウムインジケータ（GECI）CatchER ⁺ in situ K _d測定および較正のためのプロトコルについても議論する。

Abstract

細胞外刺激によって誘発される細胞内カルシウム（Ca ²⁺ ）過渡応答は、生体内で多数の生物学的プロセスを開始する。細胞内カルシウム放出の中心には、主要な細胞内カルシウム貯蔵オルガネラ、小胞体（ER）および筋細胞におけるより特化した筋小胞体（SR）がある。これらのオルガネラからのカルシウムの動的放出は、サルコ/小胞体カルシウムATPase（SERCA）ポンプを介して再充填するリアノジン受容体（RyR）およびイノシトール1,4,5-三リン酸受容体（IP ₃ R）によって媒介される。 ER / SRからの急速なカルシウム放出をモニターするために、CatchERと呼ばれる遺伝的にコード化されたカルシウムセンサー（GECI）を作成した。ここで、HEK293およびC2C12細胞における改善されたER / SR標的GECI CatchER ^+のトランスフェクションおよび発現の詳細なプロトコールおよびIP ₃ R、RyRおよびSERCAポンプ媒介性カルシウム一過性のモニタリングにおけるその適用sの蛍光顕微鏡を用いたHEK293細胞の概要を概説する。選択されたレセプターアゴニストまたは阻害剤は、チャンバー溶液中に分散され、強度変化がリアルタイムで記録される。この方法では、4-クロロ-m-クレゾール（4-cmc）によるRyR活性化、アデノシン三リン酸（ATP）によるIP ₃ Rの間接活性化、およびシクロピアゾン酸によるSERCAポンプの阻害によりERカルシウムの減少が見られる酸（CPA）。また、 in situ K _dを決定し、C2C12細胞の基底[Ca ²⁺ ]を定量するためのプロトコールについても議論する。要約すると、CatchER ⁺と組み合わせて使用​​されるこれらのプロトコールは、ER / SRカルシウム関連病理の研究における将来の適用と共に、ERからの受容体媒介性カルシウム放出を誘発することができる。

Introduction

細胞内カルシウム（Ca ²⁺ ）過渡応答の時空間的な特性は、様々な生物学的機能を活性化する¹ 。これらのCa ²⁺シグナル伝達事象は、異なる刺激によって細胞外に誘発され、主要なCa ²⁺貯蔵オルガネラおよび多数のCa ²⁺ポンプ、チャネル、およびCa ²⁺結合タンパク質によって細胞内で制御される。 Ca ^2+の過渡状態は、シグナルモジュレーションの欠陥の結果として大幅に変更され、異なる疾患²につながる可能性があります。中心にあるエンド - （ER）および筋小胞体（SR）を有するCa ²⁺シグナル伝達系の速度および複雑さのために、高速カイネティクスで哺乳動物発現のために最適化された遺伝子暗号化Ca ²⁺プローブが必要である異なる細胞における全球および局所Ca ²⁺変化を観察する³ 。

ERとSR、筋肉細胞中のその対応物は、主要な細胞内Ca ²⁺貯蔵オルガネラであり、Ca ²⁺シグナルを増幅するのに役立つCa ²⁺シンクとして作用する⁴ 。 ER / SRは、Ca ²⁺シグナリングの不可欠な部分であり、シグナルの送信と受信の2つの役割を担っています⁵ 。リアノジン受容体（RyR）およびイノシトール1,4,5-三リン酸受容体（IP ₃ R）は、Ca ^{2+ 6}によって調節されるER / SRの膜上に位置するCa ²⁺放出受容体である。他の薬剤は、これらの受容体の機能を直接的または間接的に刺激する。 4-クロロ-m-クレゾール（4-cmc）はRyRの強力なアゴニストであり、両方ともRyR媒介性Ca ²⁺放出を研究するために定期的に使用されるSR Ca ²⁺放出を誘導するためにカフェインより10倍高い感度を有する健康な細胞と病気の細胞⁷ 。 ATPはIP ₃媒介性のCa ^2+を増加させるIP ₃ R ^8をリースします。 ATPは、IP ₃ Rに結合してER ^9,10からCa ²⁺を放出するIP _3の産生を誘発する、プリン作動性受容体P2YR、Gタンパク質共役受容体（GPCR）に結合する。サルコ小胞体カルシウムATPアーゼ（SERCA）ポンプは、細胞質Ca ²⁺を減少させER / SR内腔にイオンを能動的にポンピングすることによりER / SRを補充するER / SR膜上にも位置するP型ATPaseポンプである¹¹ 。 SERCAポンプの特異的阻害剤には、 アスペルギルス（Aspergillus ）およびペニシリウム（Penicillium）由来のタプシガルギン（thapsigargin ）、 タプシアガルガニカ （ Thapsia garganica）由来のタプシガルギン 、およびシクロピアゾン酸（CPA）が含まれる。 CPAはポンプに対する親和性が低く、Ca ²⁺アクセスポイント^12を可逆的にブロックする。一方、タプシガルギンは、M3らせん中の残基F256のCa ²⁺遊離ポンプに不可逆的に結合するアフィニティー¹¹ 。 Ca ²⁺刺激事象に関与する変化を分析し、定量化することは、依然として課題であり、依然として課題である。 ER / SRは、Ca ²⁺シグナルの伝播における中心的機能を有する主要な細胞内Ca ²⁺含有区画であるので、多くの研究がER / SR Ca ²⁺シグナル伝達^5の理解に集中している。

合成Ca ²⁺色素の生成は、Ca ²⁺イメージングの分野および実践を進歩させるのに役立った。 Mag-Fura-2のような色素は、異なる細胞（13,14,15）の区画化されたCa ²⁺を測定するために広く使用されているが^、それらは不均一色素負荷、光退色、および特定の細胞小器官。緑色蛍光タンパク質（GFP）の発見および蛍光タンパク質 - タンパク質複合体の進歩は、Ca ²⁺プローブはCa ²⁺イメージングの分野を推進している¹⁶ 。いくつかの既存のGECIは、黄色蛍光タンパク質（YFP）、シアン蛍光タンパク質（CFP）、カルモジュリンおよびM13結合ペプチド^17,18を含むフォルスター共鳴エネルギー移動（FRET）対である。トロポニンCに基づくGECIはまた、CFPおよびシトリンのFRET対として、および単一フルオロフォアプローブとして19,20,21として利用可能である。 GCaMP2およびR-GECOのような他のものは、カルモジュリンを含む単一のフルオロフォアセンサー^{である（ 22,23）} 。それらのCa ²⁺結合ドメイン^24に見られる複数のCa ²⁺結合部位に関連するK _dおよび協同的結合の狭いチューニングの限界を克服するために、新規クラスのカルシウムセン細胞は、増強された緑色蛍光タンパク質（EGFP） ^25,26の発色団に感受性の高い位置で、βバレルの表面上にCa ²⁺結合部位を設計することによって作製された。 CatchERと呼ばれるこの高度に宣伝されたセンサーは、〜0.18mMのK _d 、拡散限界近くのak、および700s ^-1の ak _オフを有する。 CatchERは、HeLa、HEK293、およびC2C12 ^25のような異なる哺乳動物細胞株における受容体媒介ER / SRカルシウム放出をモニターするために使用されている。その速い動態のために、FDBにおいて2秒の脱分極の後に、より多くのCa ²⁺がSRに残ることを明らかにするために、若いおよび古いフレンドウイルスB NIHジャクソン（FVB）マウスのflexor digitorum brevis（FDB）筋繊維においてCatchERを使用した老齢マウスの繊維は若いマウスの繊維と比較して²⁷ 。 37℃でのその低い蛍光を克服するために、哺乳動物のカルシウムイメージングにおけるその応用を妨げているCatchER ⁺と呼ばれるCatchERの改良版を開発しました。 CatchER ⁺は、哺乳動物細胞でのより良い適用のために、37℃で蛍光を増強する。追加の突然変異をCatchERに組み込み、CatchER +を作製するために37℃で熱安定性および蛍光性を改善した。 CatchER ⁺は、CatchER ^30よりも信号対雑音比（SNR）が6倍に向上しています。

ここでは、CatchER ⁺を用いたHEK293およびC2C12細胞の培養およびトランスフェクションのためのプロトコールおよびER / SRレセプター媒介カルシウム過渡状態をモニターするためのその適用が提示される。代表的な結果は、4-cmc、CPAおよびATPで処理したHEK293細胞で発現したCatchER ⁺について示されている。本発明者らは、C2C12筋芽細胞およびQuaにおけるCatchER ^+の in situ K _dを決定するためのプロトコールも提供する基底[Ca ²⁺ ]の存在化。

Protocol

1.スライドの準備

1. 22cm×40mmのガラス顕微鏡スライドを6cmの細胞培養皿に置き、1皿あたり1枚のスライドを置く。
2. 滅菌フード内で滅菌するために、各スライドの各側面ならびに6cm皿を15〜20分間紫外線（UV）光に暴露する。
3. パラフィルムでスライドを内側にしてカバーし、使用するまで4℃で保存します。

媒体、緩衝液、溶液および試薬の調製

1. 脱イオン水中のハンクス平衡塩類溶液（HBSS）1Lを調製し、10mM HEPES、5mM NaHCO ₃ 、および1mM EGTAを加える。 NaOHでpH7.2~7.3に調整する。フィルターを0.22μmフィルターでオートクレーブしたボトルに入れる。
2. 脱イオン水中の高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）900mLを調製する。 44mM NaHCO ₃を添加し、HClでpHを7.2-7.3に調整する。オートクレーブされたボトルに0.22μmフィルターでろ過します。 100 mLの胎仔牛を加える。（FBS）を培地に添加して、FBS濃度を10％にした。 4℃で保存する。
3. 脱イオン水中の1Lの細胞内緩衝液（125mM KCl、25mM NaCl、10mM HEPES、0.2mM CaCl 2、0.5mM EGTA、0.2mM MgCl ₂ ）を調製し、pHを7.25に調整する。最終の[Ca ²⁺ ]は約100nMになるであろう。使用前に、0.5 mM ATPを添加する。室温で保管してください。
4. 脱イオン水中にリンゲル緩衝液（121mM NaCl、2.4mM K ₂ HPO 4、0.4mM KH ₂ PO 4、10mM HEPESおよび1.2mM MgCl ₂ ）1Lを調製し、pHを7.2に調整する。室温で保管してください。使用するために、50mLチューブに50mLを分注し、1.8mM Ca ²⁺および10mMグルコースを加える。
5. 脱イオン水中のKClすすぎ溶液（125mM KCl、25mM NaCl、10mM HEPES、0.2mM MgCl ₂ ）1Lを調製し、pHを7.25に調整する。
6. イオノマイシン5mgを1mLのジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解する。マイクロチューブに30μLを等分し、-20℃で保存する。6; C。
7. CPAをDMSOに溶解してシクロピアゾン酸（CPA）ストックを調製する。アポトーシスを防ぐために、細胞に加えたCPAのDMSOの最終パーセントが1％以下であることを確認してください。ろ過したH ₂ Oに溶解し、37℃で振とうさせて一晩溶解させることにより、20 mM 4-クロロ-m-クレゾール（4-cmc）を調製する。濾過したH ₂ Oを100mMに溶解してATPストックを調製する。
8. インサイチュ K _dを決定するために、100μlを用いて、KCl緩衝液中の1mM EGTA、0.2mM、0.6mM、2mM、5mM、10mM、20mM、50mMおよび100mMのCa ^2+の各15mLを調製するmM EGTAストックおよび1M CaCl ₂ストックを脱イオン水に溶解した。

3.細胞培養

1. 培養C2C12筋芽細胞およびHEK293細胞を、無菌UVフード中の10cm細胞培養皿を用いて、ATCCプロトコールに従って培養した。
   注：C2C12細胞は、筋芽細胞の分化が始まるため、〜70％以上のコンフルエンスまで増殖させてはならないteを筋管に挿入する。 HEK293細胞およびC2C12細胞はいずれも容易に増殖し、細胞の完全性を維持するために100％コンフルエンシーを超えて増殖することは許されない。さらに、細胞の健康を保つために実験に使用する前に、細胞を10倍以上継代するべきではありません。

4. HEK293細胞のトランスフェクション

1. 滅菌した22mm×40mmのガラス顕微鏡スライド上にHEK293細胞を6cm皿でスライドさせ、トランスフェクションの日〜70％コンフルエントになるようにします。
2. 翌日、2μgのCatchER ⁺ cDNAおよび1：3（重量/体積）DNA：トランスフェクション試薬比を還元血清培地（ 例えば、 Opti-MEM）中で用いて、トランスフェクション試薬の製造業者のプロトコールに従って細胞をトランスフェクトする。
3. ディッシュからDMEM培地を空にし、3mLの還元血清培地を加える。 DNA：トランスフェクション試薬混合物をディッシュに加え、37℃で4〜6時間インキュベートする。
4. インキュベーション後、5〜6mLのHBSSで細胞を洗浄する。 HBSS fを破棄する3 mLの新鮮なDMEMで置き換え、37℃で48時間インキュベートして、GECIの発現を可能にする。
5. C2C12筋芽細胞のトランスフェクション
   1. C2C12筋芽細胞の場合、ディッシュの底を覆うのに十分なトリプシン（1-2 mL）を加えて細胞をトリプシン処理します。トリプシンが皿の底から細胞を緩めることができるように2-6分37℃のインキュベーターに皿を置きます。
   2. インキュベーションが完了したら、トリプシンを除去し、8mLのDMEM中で細胞を吸引する。細胞をDMEMで徹底的にピペットして、均一に分散させ、te細胞を再懸濁し、3mlのDMEMを含む6cmの細胞培養皿に無菌カバーグラス上に播種し、最終コンフルエントが60％になるようにする。
   3. ステップ4.2-4.3で概説したのと同じ日に細胞をトランスフェクションする。 37℃で24時間インキュベートする。
   4. ステップ4.4を繰り返します。

5.スライド・蛍光顕微鏡の作製

1. mをオンにするicroscopeと光源を開き、Simple PCIプログラムを開きます。顕微鏡を15-20分間またはCCDカメラが-65℃に冷えるまでウォーミングアップします。チャンバーを準備し、細胞を待ってスライドさせます。
2. 綿棒を使用して薄型のシーラント層で薄型オープンダイヤモンド浴イメージングチャンバの底を覆う。
3. インキュベーターからトランスフェクションされた細胞を含むスライドを取り出し、37℃に予熱した10mMグルコースおよび1.8mM Ca ^2+を含むリンガー緩衝液1mLで3回穏やかにすすぐ。
4. 細胞が乾燥しないように、ディッシュに1 mLのリンゲル緩衝液を残し、スライドを皿から取り出すために鉗子を使用します。余分な溶液を実験室の組織に吸着させるには、スライドの端に触れて実験室の組織に触れさせます。次にグリースが入ったチャンバーの側面に、細胞がグリースに向かって上になるように置き、ドライバーを使用してチャンバーをステージマウントに固定します。
5. 1を加えるmLのリンガー緩衝液をチャンバーに添加して、チャンバーをステージ上に載せながら細胞が乾燥するのを防ぎ、残りの顕微鏡セットアップを完了させた。真空吸引ホースがチャンバに取り付けられると、チャンバが保持する最終容積は約450μLです。
6. 顕微鏡の対物レンズを40倍の油浸対物レンズに切り替えます。
7. 対物レンズを洗浄して乾燥させるには、レンズペーパーとレンズ洗浄液を使用してください。目的をこすらないでください。表面がきれいになるまで静かに拭きます。
8. 1滴の液浸油を目的に加えます。
9. マウントを顕微鏡ステージに置き、チャンバーに真空チップを追加します。真空吸引ホースがチャンバに取り付けられ、オンになると、チャンバが保持する最終容積は約450μLになります。この最終的な体積は、チャンバの側面と同じ高さである。実験中にチャンバー溶液が水平になって、オーバーフィルによる溶液の目的地への流出を防ぐことが不可欠です。
10. 明視野モードを使用して、ゲインを175に調整し、露光時間を0.03秒に設定してセルをフォーカスします。
11. 細胞が集束したら、488nm励起を用いて蛍光モードに切り替える。露光時間を0.07秒に変更してください。画像に適切な蛍光を発し、十分な細胞が健康である視野を探します。
12. 視野が選択されたら、蛍光と明視野モードで撮影します。
13. 細胞内の関心領域（ROI）を囲むか、選択した領域から強度を記録するために細胞全体を丸く囲みます。

画像化薬物誘発Ca ²⁺トランジェントおよびインサイチュ K _d較正

1. フレームレートを5秒ごとに1に設定して輝度測定を開始します。
2. ベースライン強度を20〜30フレーム（100〜150秒）安定させる。必要に応じて、frを小さくするこのステップ中に、光退色を防止するために、1秒間に1回、
3. 200μMの最終濃度にするために〜450μLの最終チャンバー容量に基づいて20mMストックから必要とされる4-cmcの量を計算する。必要に応じて株式を希釈する。
4. 慎重に、60μLのリンガー緩衝液をチャンバーから取り出し、マイクロ遠心チューブに入れます。この溶液で計算した4-cmcの量を希釈し、チャンバーに戻して、画像化されている細胞からの意図された応答を誘発する。
5. 計算された4-cmcの量をマイクロ遠心チューブに加え、ピペットで混合します。
6. 視野の上に穏やかにソリューションを追加すると同時に、強度測定でイベントマーカーを追加します。
7. 薬物が受容体に結合してシグナルが減少するまで時間をおいてから、1.8mM Ca ²⁺および10mMグルコースを含むリンゲル緩衝液3〜6mLで同時に洗浄しながら同時にイベントマーカーを加えます。チャンバ容積は450＆＃181; Lであり、真空に接続され、3〜6mLの緩衝液を添加することにより、薬物を含有する元の溶液が洗い流され、新たに添加された溶液と交換されることを確実にする。
8. 各アッセイにトランスフェクトされた細胞の新しいスライドを使用して、100μMATPおよび15μMCPAについて6.1-6.7を繰り返す。
9. 測定が完了したら、Simple PCIプログラムの強度測定ウィンドウでデータ収集を終了します。
10. 細胞の蛍光と明視野の写真を撮る。
11. 実験用のデータファイルを開きます。ここで、必要に応じて、強度値を再計算するために、細胞または関心領域を再円で囲む。
12. C2C12筋芽細胞のin situ K _dを決定するには 、セクション4.2およびセクション5に概説されたプロトコールに従い、0mM Ca ²⁺リンゲル緩衝液1mLをチャンバーに入れる。
    1. 15〜30秒間、細胞内緩衝液中0.002〜0.005％サポニンで細胞を浸透させて、いずれかの細胞を空にする。CatchER ⁺は細胞質ゾルに存在する可能性があります。 10μMイオノマイシンを含むKCl緩衝液中の1 mL EGTA 3〜6 mLで細胞を洗浄する。プラトーに達するまで強度を下げてください。
    2. 10μMのイオノマイシンを含む3〜6mLのKCl緩衝液ですすぎ、強度を安定させ、次いで、工程2.7で詳述した各Ca ²⁺溶液を加える。各添加の間に強度がプラトーに達するようにする。
13. 基底[Ca ²⁺ ]定量のためにセンサーを較正するには、ステップ6.12に従ってください。ステップ2.7のEGTAおよび100 mM Ca ²⁺バッファーを使用して、最小および最大蛍光強度を取得します。

7.データ処理

1. 強度測定データのスプレッドシートファイルをダウンロードします。
2. 各セルのデータをベースライン強度（F / F ₀ ）に正規化する。任意のグラフ作成プログラムで時間に対する正規化データをプロットします。
3. ％変化を計算するには、正規化されたピーク値1からueに100を掛けます。複数の細胞が画像化された場合の平均および標準偏差を計算します。
4. SNRを計算するには、実験で保存した画像ファイルをImageJなどの画像処理ソフトウェアで開き、信号、トランスフェクトされた細胞、ノイズ、バックグラウンドを測定します。方程式SNR =信号/ノイズを使用してSNRを計算します。
5. 収集された蛍光イメージングデータからその場 K _dを計算するために、各Ca ²⁺濃度およびEGTA（0mM Ca ²⁺ ）の添加後にプラトーを含む強度データを平均化する。 θ=（F - F _min ）/（F _max - F _min ）を用いて分数飽和度（相対強度）を計算する。ここでθは相対強度であり、Fは任意の点での蛍光であり、F _minは最小蛍光強度であり、 F _maxは最大蛍光強度であり、tの強度の変化を見る彼は最小強度と比較してCa ^2+の添加でプローブする。どのグラフ作成および曲線適合プログラムにおいても[Ca ²⁺ ]に対する相対強度データをプロットする。任意のグラフ化および曲線当てはめプログラムのために変換された1：1結合式θ= [M _T ] /（K _d + [M _T ]）を使用してK _{dを計算する} 。 M _Tは全金属濃度である。
6. 6.13に概説した較正からの基礎カルシウムを定量するために、1mM EGTA（F _min ）および100mM Ca ²⁺ （F _max ）の添加後のプラトーを含む強度データを平均する。基礎カルシウムを計算するには、較正式[Ca ²⁺ ] = K _d （[F - F _min ）/（F _max - F）]を使用します。

Representative Results

このセクションは、異なるレセプター媒介経路を介してER / SR Ca ^2+の変化をモニターするために、最適化されたER / SR標的GECI CatchER ⁺を用いて以前に記載された方法を用いて達成された結果を説明する。

図1は、200μMの4-cmcで刺激されたRyRを介したER排出を示す。 4-cmcはRyRのアゴニストである。薬物の添加は、CatchER ⁺蛍光強度の減少によって測定されるように、ERカルシウムの減少を誘導する。マークされているように、ここに概説されたプロトコルは、ER Ca ^2+の変化に関する情報を提供するCatchER ⁺を使用して、受容体媒介Ca ²⁺過渡応答の可視化および測定を可能にする。

図2に示すように、1SERCAポンプを可逆的に遮断するために、5μMのCPAは、プラトーを形成する蛍光強度の大きな減少を生じる。 SERCAポンプの機能が阻害されるにつれて、ER Ca ²⁺放出チャネルは依然としてCa ²⁺を活性化してサイトゾルに放出し、蛍光強度を低下させる。 1.8mMのCa ²⁺および10mMのグルコースを含むリンガー緩衝液でCPAを洗浄した後、細胞を回収する。これらの結果は、CatchER ⁺がSERCAポンプに特異的なCa ²⁺過渡応答をモニターする能力を確認する。

図3は、CatchER ^+でトランスフェクトしたHEK293細胞における200μMのATPを用いたIP ₃ Rの間接的活性化に関する代表的なデータを示す。 ATPは、IP ₃ Rを介してCa ²⁺放出を活性化するIP ₃を生成するGタンパク質共役受容体であるP2Y受容体に結合する。しかし、200μMのATPの添加は、シグナル強度の目に見える減少を生じる。 1.8mMのCa ²⁺および10mMのグルコースを含むリンガー緩衝液で細胞を洗浄することにより、ERが補充され、シグナルがベースラインに戻ることが可能になる。これらの結果は、CatchER ⁺が間接刺激によるIP ₃ R媒介カルシウム放出をモニターする能力を強調している。

図4において、CatchER ⁺をC2C12筋芽細胞にトランスフェクションしてin situ K _{dを決定した} 。データはプロトコルに概説されるように収集した。 C2C12筋芽細胞を0.005％サポニンで15〜30秒間透過処理し、次いで10μMイオノマイシンを含むKCl緩衝液中の1mM EGTAで洗浄した。様々なCa ^{2+濃度を、} 10μMイオノマイシンを含有するKCl緩衝液中で調製し、段階的に添加した。データを正規化し、1：1バインドを使用して適合させた等式。平均K _dは7細胞で3.1±1.4mMであった。 CatchER ^+の弱い親和性は、それがERまたはSRのような高Ca ²⁺オルガネラにおいてCa ²⁺を感知することを可能にする。 SR中の基底[Ca ²⁺ ]を決定するために、C2C12細胞を0.005％サポニンで15〜30秒間浸透させ、KCl緩衝液で洗浄し、10μMイオノマイシンを含有するKCl緩衝液中の1mM EGTAで洗浄してF _min 。 EGTAをKCl緩衝液で洗浄した後、10mMイオノマイシンを含む100mM Ca ^2+の最大値F _maxを加えた。基礎Ca ²⁺は0.4±0.2mMと計算された。

図1：HEK293細胞における4cmcを用いたRyRの刺激。 （ A ）4-cmcでのRyRの活性化の描写。 （ B ）HEK293細胞の強度記録CatchER ⁺をトランスフェクトし、ERに局在させ、200μMの4-cmcで処理した。 4-cmcでのRyRの刺激は、[Ca ²⁺ ] _ERの減少と直接的に相関する正規化された蛍光強度の減少を引き起こす。 nは、画像化された細胞の数を示す。平均シグナル減少は12.0±2.2％であった。リンガー緩衝液中の1.8mM Ca ^2+の存在は、強度回復に反映されたERの再充填をベースラインまで促進した。挿入画像は、4cmcでの処置の前後の細胞を示す。 SNRは4.3±0.8と計算された。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図2：可逆的SERCA pを用いた[Ca ²⁺ ] _ERの減少HEK293細胞中のインヒビターCPAを阻害する。 （ A ）CPAによるSERCAポンプの阻害。 （ B ）15μMのCPAで処理したERに局在するCatchER ⁺でトランスフェクトしたHEK293細胞のライブイメージング。 Ca ²⁺は依然としてIP ₃ RおよびRyRを通って流れることができるので、SERAポンプをCPAでブロックすると、[Ca ²⁺ ] _ERの減少と直接相関する正規化された蛍光強度が減少する。 nは、画像化された細胞の数を示す。挿入画像は、治療前および治療後にCatchER ^+でトランスフェクトしたHEK293細胞である。平均シグナル減少は21.0±0.3％であった。リンガー緩衝液中の1.8mM Ca ^2+の存在は、強度回復に反映されたERの再充填をベースラインまで促進した。 SNRは5.5±0.8と計算された。 より大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてくださいこの数字。

図3：ATPは、HEK293細胞中の[Ca ²⁺ ] _ERを減少させる。 （ A ）プリン作動性受容体P2YRを介したATPによるIP ₃ Rの間接的活性化の概略_図 。 P2YRは、ATP結合時にIP _3を生成するGPCRである。 IP ₃はIP ₃ Rを活性化し、ERからのカルシウム放出を刺激する。 （ B ）200μMのATPで処理したERに局在する、CatchER ⁺でトランスフェクトしたHEK293細胞のリアルタイムイメージング。 ATPを用いたP2Y受容体を介したIP ₃ Rの間接的刺激は、[Ca ²⁺ ] _ERの減少と直接相関する正規化蛍光強度の減少を引き起こす。 nは、画像化された細胞の数を示す。平均シグナル減少は6.0±3.0％であった。 SNRはc6.7±2.7と計算された。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図4：C2C12筋芽細胞におけるCatchER ^+の in situ K _d 。 CatchER +でトランスフェクトした透過化C2C12筋芽細胞から集めた正規化強度の代表的なトレース。細胞を細胞内緩衝液中0.005％サポニンで15〜30秒間透過処理した。 EGTAおよびCa ²⁺溶液をKCl緩衝液中で調製し、nは画像化した細胞の数を示す。 （ A ）インセット蛍光画像は、処置前後の細胞の代表である。 0.3μM、0.6μM、2μM、5μM、10μM、20μM、50μMおよび100mMのCa ²⁺を10μMの存在下で透過性のC2C12筋芽細胞に添加したイオノマイシンを添加して3.1±1.4mMのK _dを得た。 （ B ）インセット蛍光画像は、それぞれ10μMイオノマイシンを含む1mM EGTAおよび100mM Ca ^2+の添加後の最小値および最大値の細胞を表す。基礎Ca ²⁺は0.4±0.2mMと計算された。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

Discussion

CatchER ^+のような蛍光プローブのライブシングルセルイメージングは​​、レセプターアゴニストまたはアンタゴニストに応答する各細胞の複雑なER / SR Ca ²⁺シグナル伝達プロセスを分析するのに有効な技術である。この技術は、Fura-2に必要なように複数の波長を同時に使用してイメージングを行う場合や、ERおよびサイトゾルカルシウムの両方の変化をそれぞれ監視するためにCatchER ⁺とRhod-2を一緒にイメージングする場合にも役立ちます。このプロトコルにはいくつかの重要なステップがあります。細胞トランスフェクションはイメージングの実行可能性に大きな影響を及ぼす可能性があります。トランスフェクション率が低いと、カルシウム応答をモニターするためのGECIの発現が不十分になることがあります。他方、CatchER ^+の過剰発現は、合成カルシウム色素に関連するER / ER Ca ²⁺に対する緩衝効果を有さない。 Ca ²⁺プローブの緩衝効果は、細胞小器官の[Ca ²⁺ ]、pのK _d測定に必要なプローブの濃度に依存します。サイトゾル[Ca ²⁺ ]は、典型的には、低いナノモル範囲にあるが、必要とされるプローブ濃度は、匹敵する範囲にある。この場合、色素濃度の量およびサイトゾルカルシウムを緩衝するその能力は、細胞イメージングの主な関心事であり、そしてそれである。対照的に、ER / SR [Ca ²⁺ ]は、異なる哺乳動物細胞系について決定したように、マイクロモルからミリモルの範囲の100にある。 CatchER ^+の 0.1-1μM発現がERカルシウムの検出を可能にするのに十分であるため、CatchERの緩衝効果は無視できる程度である。このように、CatchER ⁺は管腔ER / SR Ca ^{2+ 32に}緩衝効果を持たずに高Ca ^{2+環境下で} Ca ²⁺フラックスをモニターすることができます。

いくつかの因子が、GECIのトランスフェクション効率、例えばインキュベーション時間、theトランスフェクション試薬、インキュベーション温度、および細胞コンフルエントを含む。細胞コンフルエントは、スライド上に細胞を播種するとき、イメージング品質に著しく影響を及ぼし得る。コンフルエントが低いと細胞の数が少なく（n）、統計的精度は低くなるが、コンフルエントが高いほど細胞の重なり合った層が画像に大きな変数を生じる。トランスフェクションの時間と温度は、細胞の種類に基づいて最適化する必要があります。さらに、血清培地を減らしたDMEMを添加すると、より長いトランスフェクション時間でアポトーシスを防ぐのに最適です。哺乳動物細胞におけるオリジナルのGECI CatchER蛍光は、培養およびトランスフェクトされた場合、わずか30℃であった。 CatchERの蛍光は、37℃での発現のために首尾よく最適化され、改良され、その結果、新しい改良型CatchER ^{+が得られました} 。 EGFPに対する抗体を用いたウエスタンブロットを行って、Ca ²⁺プローブの発現を確認することができる。

また、私試薬供給の一貫性が重要である。試薬は、灌流、少量の拡散、または機械的ポンプによってチャンバーに添加することができ、これらはすべて異なる応答を誘発することができる。スライド上に置かれるチャンバーの底にシーラントグリースの層を塗布することによって、溶液チャンバーが適切にシールされることが不可欠です。正しい波長をプローブに選択する必要があります。 CatchER ^+の励起波長と発光波長は、それぞれ395 / 488nmと510nmです。細胞イメージングのために、488nmのみが励起に使用され、細胞に対するUV光の有害な影響を回避する。従って、488nmで励起し、510nmで発光を収集する任意の光学フィルターを使用することは、CatchER ^+で画像化するのに許容される。光漂白を防止するために、フレーム/ ³³などの光の強さおよび露光を最適化する努力が集中している。

このプロトコルは、エフェクトを分析するのに理想的ですがCatchER ₊ Ca ²⁺ ER / SR蛍光プローブを使用したER / SR変化の例では、いずれの実験においても予想通りの制限がある。単一細胞ライブイメージングは​​細胞の小さなフレームのみを分析するので、細胞の数（n）は平均して1〜100個の細胞で変動する可能性があるが、より大きな細胞系では低くなる可能性がある。これにより、複数の試験を行うことなく、細胞数が減少し、統計的に異なる結果がもたらされる。統計的精度にはn> 6が必要です。より大きなnを得るためには、多くの皿を画像化しなければならず、または他の技法を同時に使用しなければならない。さらに、CatchER ⁺は単一波長のER / SR Ca ²⁺プローブであり、細胞の破壊とは対照的にシグナルが真であるかどうかを知ることができず、シグナルを定量化できない他の単一波長プローブおよび色素の問題を引き起こすアーチファクト、及びレシオメトリックシステム³⁴と比較してより大きなノイズを有する。

この研究は、これらの最適化されたCa ²⁺プローブが、レセプター媒介性のER / SR Ca ²⁺放出をモニターするために異なる細胞型または組織型に適用され得る。 CatchER ⁺は単一波長のER / SR Ca ²⁺プローブです。したがって、実験パラメータと設定値が定量測定に一貫していることが重要です。細胞株におけるカルシウム濃度およびカルシウムセンサーのK _dの詳細な較正は、定量分析のための追加の重要な測定値である。

これらの開発されたカルシウムセンサーは、様々な生物学的および病理学的状態における全体的なCa ²⁺変化と比較して存在する広範に異なるCa ²⁺過渡状態をモニターするために、ER / SR内の特定の位置を標的とすることもできる。これらの発見は、Ca ²⁺関連疾患の診断のための将来のツールを提供するために、今後もCa ²⁺イメージングおよびプローブデザインの分野を推進していきます。報告されたプロトコールおよび開発されたセンサーはまた、薬物dカルシウムシグナリングに関連する疾患に対する保護剤。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-Chloro-3-methylphenol (4-CmC)	Sigma-Aldrich	C55402
515DCXR dichroic mirror	Chroma Technology Corp.	NC338059
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A26209
Calcium chloride dihydrate	EMD Millipore	102382
Corning tissue-culture treated culture dishes (100 mm)	Sigma-Aldrich	CLS430167
Corning tissue-culture treated culture dishes (60 mm)	Sigma-Aldrich	CLS430166
Cyclopiazonic Acid (CPA)	EMD Millipore	239805
D(+)-Glucose	ACROS Organics	41095-0010
Dow Corning 111 Valve Lubricant & Sealant	Warner Instruments	64-0275
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D7777
Ethylenebis(oxyethylenenitrilo) tetraacetic Acid (EGTA)	ACROS Organics	409911000
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher	26140087
Fisherbrand Cover Glasses 22x40 mm	Fisher Scientific	12-544B
Hanks’ Balanced Salts (HBSS)	Sigma-Aldrich	H4891
HEPES, Free Acid, Molecular Biology Grade	EMD Millipore	391340
Immersion Oil without autofluorescence	Leica	11513859
Ionomycin, Free Acid	Fisher Scientific	50-230-5804
Leica DM6100B inverted microscope with a cooled EM-CCD camera	Hamamatsu	C9100-13
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	ThermoFisher	11668019
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	ThermoFisher	L3000015
Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber	Warner Instruments	RC-26GLP
Magnesium Chloride Hexahydrate	Fisher Scientific	M33-500
Opti-MEM	ThermoFisher	51985034
Potassium Chloride	EMD Millipore	PX1405
Potassium Phosphate, Dibasic	EMD Millipore	PX1570
Potassium Phosphate, Monobasic	EMD Millipore	PX1565
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
SimplePCI Image Analysis Software	Hamamatsu	N/A
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific	S233-3
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271-500
Sterivex-GV 0.22 µm filter	EMD Millipore	SVGVB1010
Till Polychrome V Xenon lamp	Till Photonics	N/A
Trypsin (2.5%), no phenol red (10x)	ThermoFisher	15090046