표적화 된 Ca를 이용한 ER / SR 칼슘 방출 모니터링 Published: May 19, 2017 doi: 10.3791/55822

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Florence N. Reddish¹, Cassandra L. Miller¹, Rakshya Gorkhali¹, Jenny J. Yang¹

¹Department of Chemistry, Center of Diagnostics and Therapeutics (CDT), Georgia State University

Summary

우리는 실시간 형광 현미경을 사용하여 HEK293 및 골격근 C2C12 세포의 소포체 / sarcoplasmic reticulum (ER / SR)에서 빠른 칼슘 과도 현상을 모니터링하기위한 우리의 표적 유전자 코딩 칼슘 지시약 (GECI) CatchER ^{+의 적용} 을위한 프로토콜을 제시합니다. 현장 K _d 측정 및 교정을위한 프로토콜도 논의됩니다.

Abstract

세포 외 자극에 의해 유발 된 세포 내 칼슘 (Ca ²⁺ ) 과도 현상은 살아있는 유기체에서 수많은 생물학적 과정을 일으킨다. 세포 내 칼슘 방출의 중심에는 주요 세포 내 칼슘 저장 소기관, 소포체 (endoplasmic reticulum, ER) 및 근육 세포에서보다 특이적인 소구엽 (sarcoplasmic reticulum, SR)이있다. 이러한 세포 소기관에서 칼슘의 동적 방출은 raranodine 수용체 (RyR)와 이노시톨 1,4,5- 트리 포스페이트 수용체 (IP ₃ R)에 의해 매개되며, sarco / endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) 펌프를 통해 재충전이 일어납니다. ER / SR에서 급속한 칼슘 방출을 모니터링하기 위해 유 전적으로 코딩 된 칼슘 센서 (GECI) 인 CatchER를 만들었습니다. 여기에서 HEK293 및 C2C12 세포에서 개선 된 ER / SR 표적 GECI CatchER ⁺ 의 형질 감염 및 발현에 대한 상세한 프로토콜 및 IP ₃ R, RyR 및 SERCA 펌프 매개 형 과도 단백질의 모니터링에 대한 적용s가 형광 현미경을 사용하여 HEK293 세포에서 설명됩니다. 수용체 작용제 또는 선택 억제제를 챔버 용액에 분산시키고 강도 변화를 실시간으로 기록한다. 이 방법으로 ER 칼슘의 감소는 4- 클로로 -m- 크레졸 (4-cmc)에 의한 RyR 활성화, 아데노신 트리 포스페이트 (ATP)에 의한 IP ₃ R의 간접적 활성화, 사이클로 피아 조 닉성을 지닌 SERCA 펌프의 억제 산 (CPA). 우리는 또한 in situ K _d 를 결정하고 C2C12 세포에서 기저 [Ca ²⁺ ]를 정량화하기위한 프로토콜을 논의한다. 요약하면, CatchER ⁺ 와 함께 사용되는이 프로토콜은 ER / SR 칼슘 관련 병리학을 연구 할 때 ER에서 수용체 매개 칼슘 방출을 유도 할 수 있습니다.

Introduction

세포 내 칼슘 (Ca ²⁺ ) 과도의 시공간적 특성은 다양한 생물학적 기능을 활성화시킨다 ¹ . 이러한 Ca ²⁺ 신호 전달 사건은 다른 자극을 통해 세포 외적으로 유발되어 주요 Ca ²⁺ 저장 기관과 수많은 Ca ²⁺ 펌프, 채널 및 Ca ²⁺ 결합 단백질에 의해 세포 내로 조절됩니다. Ca ²⁺ 과도 현상은 신호 변조로 인한 결함으로 인해 크게 달라질 수있어 다른 질병을 유발할 수 있습니다 ² . Ca ²⁺ 시그널링 시스템의 속도와 복잡성 때문에, 중심에서 endo- (ER)와 sarcoplasmic reticulum (SR)을 이용하여 빠른 속도론으로 포유류 발현을 위해 최적화 된 유 전적으로 암호화 된 Ca ²⁺ 프로브가 필요합니다 다른 세포에서 전지구 및 국부적 인 Ca ²⁺ 변화를 관찰 ³ .

ER과 SR, 근육 세포의 대응, 주요 세포 내 칼슘 ^{2 +} 저장 organelles 있으며 칼슘 ^{2 +} 싱크대 역할을 칼슘 ^{2 +} 신호 ⁴ 증폭하는 데 도움이됩니다. ER / SR은 신호의 송수신기 역할을하는 Ca ²⁺ 시그널링에서 필수적인 부분입니다. 리아 노딘 수용체 (RyR)와 이노시톨 1,4,5- 트리 포스페이트 수용체 (IP ₃ R)는 Ca ^{2+ 6} 에 의해 조절되는 ER / SR 막에 위치한 Ca ²⁺ 방출 수용체이다. 다른 약제는 이러한 수용체의 기능을 직접 또는 간접적으로 자극합니다. 4- 클로로 -m- 크레졸 (4-cmc)은 RyR의 강력한 효능 제이며, SRCa2 방출을 유도하기 위해 카페인보다 10 배 더 높은 감도를 가지며,이 둘 모두 RyR- 중재 된 Ca2 ⁺ 방출을 연구하는데 규칙적으로 사용된다 건강하고 병든 세포 ⁷ . ATP는 IP ₃ 중재 된 칼슘 ^2+를 증가시킵니다.IP ₃ R ⁸ 을 통해 임대하십시오. ATP는 purinergic receptor P2YR, G-protein coupled receptor (GPCR)와 결합하여 IP ₃ R에 결합하여 ER ^{3 , 10} 으로부터 Ca ²⁺ 를 유리시키는 IP ₃ 의 생산을 촉발한다. sarco-endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) 펌프는 세포 내 Ca ²⁺ 를 감소시키고 ER / SR 루멘으로 이온을 능동적으로 펌핑하여 ER / SR을 재충전하는 ER / SR 막에 위치한 P 형 ATPase 펌프입니다 ¹¹ . SERCA 펌프의 특이적인 억제제는 아스 페르 길 루스 (Aspergillus ) 및 페니실린 (Penicillium)으로부터의 Thapsigargin , Thapsia garganica 및 CPA (cyclopiazonic acid)를 포함 한다. CPA는 펌프에 대한 친 화성이 낮고 Ca ²⁺ 액세스 포인트 ^12를 가역적으로 차단합니다. 다른 한편, aps시 가르 긴은 M3 헬릭스에서 나노 몰과 함께 F256 잔기의 칼슘 ²⁺ 프리 펌프에 돌이킬 수 없게 결합한다ar 친화 ^{도 11} . Ca ²⁺ 자극 사건과 관련된 변화를 분석하고 정량화하는 것은 여전히 ​​도전 과제입니다. ER / SR은 Ca ²⁺ 신호의 전파에 중요한 역할을하는 주요한 세포 내 Ca ²⁺ 함유 구획이기 때문에 많은 연구가 ER / SR Ca ²⁺ 신호 전달 ⁵ 에 초점을 맞추고 있습니다.

합성 Ca ²⁺ 염료의 생성은 칼슘 ^{2 +} 영상의 현장 및 실습을 발전시키는 데 도움이되었습니다. Mag-Fura-2와 같은 염료가 다른 세포에서 구획화 된 Ca ²⁺ 를 측정하는 데 널리 사용되었지만 13,14,15 염색 불균일 로딩, 광 표백 및 특정 세포 소기관을 타깃으로 할 수없는 것과 같은 한계가 있습니다 . 녹색 형광 단백질 (GFP)의 발견과 형광 단백질 -기반의 칼슘 ^{2 +} 프로브는 칼슘 ^{2 +} 전진 ¹⁶ 의 분야를 추진하고 있습니다. 기존 GECI의 일부는 황색 형광 단백질 (YFP), 시안 형광 단백질 (CFP), 칼 모듈 린 및 M13 결합 펩타이드 ^{17 , 18을 포함} 하는 포스터 공명 에너지 전달 (FRET) 쌍입니다. 트로포 닌 C 기반 GECI는 CFP와 Citrine의 FRET 쌍과 단일 형광 단 프로브 ^{19 , 20 , 21로 사용할 수} 있습니다. GCaMP2와 R-GECO와 같은 다른 것들은 calmodulin과 관련된 단 하나의 형광 단 센서이다 ^{22 , 23} . Ca ²⁺ 결합 도메인 ²⁴ 에서 발견되는 여러 Ca ²⁺ 결합 부위와 관련된 K _d 와 협동 결합의 좁은 튜닝의 한계를 극복하기 위해 새로운 종류의 칼슘 원sors는 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP) ^{25 , 26} 의 발색단 민감한 위치에서 베타 배럴의 표면에 칼슘 ^{2 +} 바인딩 사이트를 설계하여 만들어졌습니다. CatchER라고 불리는이 고도의 센서는 ~ 0.18 mM의 Kd, 확산 한계 근처의 아크 및 700 s ^-1 의 아크 _오프 를 가지고 있습니다. CatchER는 HeLa, HEK293 및 C2C12와 같은 다른 포유류 세포주에서 수용체 매개 ER / SR 칼슘 방출을 모니터링하는 데 사용되었습니다. 그것의 빠른 동력학 때문에, CatchER는 FDB에서 탈분극 2 초 후에 더 많은 칼슘 ²⁺ 가 SR에 남아 있음을 밝히기 위해 젊고 오래된 Friend Virus B NIH Jackson (FVB) 생쥐의 flexor digitorum brevis (FDB) 근육 섬유에 사용되었습니다. 젊은 쥐의 섬유와 비교 한 늙은 쥐의 섬유 ²⁷ . 포유 동물의 칼슘 이미징에서 그 적용을 방해하는 37 ° C에서 낮은 형광을 극복하기 위해우리는 CatchER ⁺ 라는 CatchER의 개선 된 버전을 개발했습니다. CatchER ⁺ 는 포유류 세포에서 더 잘 응용되기 위해 37 ℃에서 향상된 형광성을 나타냅니다. 추가적인 돌연변이가 CatchER에 통합되어 37 ° C ^{28 , 29} ° C에서 열 안정성과 형광성을 향상시켜 CatchER ⁺ 를 만들 수 있습니다. CatchER ⁺ 는 CatchER ³⁰ 보다 신호 대 잡음비 (SNR)가 6 배 증가합니다.

여기에서 CatchER ⁺ 를 이용한 HEK293 및 C2C12 세포의 배양 및 형질 감염에 대한 프로토콜과 ER / SR 수용체 매개 형 과도 현상을 모니터링하는 방법이 제시됩니다. 대표적인 결과는 4-cmc, CPA 및 ATP로 처리 된 HEK293 세포에서 발현 된 CatchER ⁺ 에 대해 나타내었다. 우리는 또한 C2C12 myoblast 세포와 qua에서 CatchER ⁺ 의 in situ Kd를 결정하기위한 프로토콜을 제공한다기초 [Ca ²⁺ ]의 함량.

Protocol

1. 슬라이드 준비

1. 장소 당 22cm x 40mm 유리 현미경 슬라이드 6cm 세포 문화 요리, 접시 당 1 슬라이드.
2. 멸균 후드에서 살균하기 위해 15-20 분 동안 자외선 (UV) 빛에 각 슬라이드뿐만 아니라 6cm 요리의 각 측면을 노출.
3. parafilm으로 내부 슬라이드로 접시를 덮고 4 ° C에서 사용할 준비가 될 때까지 보관하십시오.

2. 배지, 완충액, 용액 및 시약의 준비

1. 탈 이온수에 행크의 균형 소금 용액 (HBSS) 1 L를 준비하고 10 MM HEPES, 5 MM NaHCO ₃ 및 1 MM EGTA를 추가합니다. NaOH로 pH 7.2-7.3으로 조정한다. 0.22 μm 필터를 가진 완충액을 오토 클레이브 한 병에 넣습니다.
2. 탈 이온수에서 고 포도당 Dulbecco Modified Eagle 's Medium (DMEM) 900 mL를 준비한다. 44 MM NaHCO ₃ 를 첨가하고 HCl로 pH 7.2-7.3을 조정한다. Autoclaved 병에 0.22 μm의 필터와 미디어를 필터링합니다. 태아 보비 100 mL를 넣는다.(FBS)을 첨가하여 FBS 농도를 10 %로 만든다. 4 ° C에서 보관하십시오.
3. 탈 이온수에서 세포 내 버퍼 (125 MM KCl, 25 MM NaCl, 10 MM HEPES, 0.2 MM CaCl ₂ , 0.5 MM EGTA, 0.2 MM MgCl ₂ )의 1 L을 준비하고 7.25로 산도를 조정합니다. 최종 [칼슘 ²⁺ ]는 ~ 100nM입니다. 사용하기 전에 0.5 mM ATP를 첨가하십시오. 실내 온도에 보관하십시오.
4. 탈 이온수에 링거 완충액 (121 MM NaCl, 2.4 MM K ₂ HPO ₄ , 0.4 MM KH ₂ PO ₄ , 10 MM HEPES 및 1.2 MM MgCl ₂ ) 1 L를 준비하고 pH를 7.2로 조정합니다. 실내 온도에 보관하십시오. 50 ML 튜브로 나누어지는 50 ML을 사용하고 1.8 MM 칼슘 ^{2 +} 및 10 MM 포도당을 추가하십시오.
5. 탈 이온수에서 1L의 KCl 헹굼 용액 (125mM KCl, 25mM NaCl, 10mM HEPES, 0.2mM MgCl ₂ )을 준비하고 pH를 7.25로 맞 춥니 다.
6. 디메틸 술폭 사이드 (DMSO) 1 mL에 이오 노마 이신 5 mg을 녹인다. Microtubes에 나누어지는 30 μL 및 -20에 저장6; C.
7. CPA를 DMSO에 녹여 시클로 피아 존산 (CPA) 스톡을 준비하십시오. apoptosis를 방지하기 위해 세포에 첨가 된 CPA에 대해 DMSO의 최종 비율이 1 % 이하인지 확인하십시오. 여과 된 H ₂ O에 용해시켜 37 ℃에서 밤새 녹인 후 20 mM 4- 클로로 -m- 크레졸 (4-cmc)을 준비한다. 100mM로 여과 된 H ₂ O에 용해시켜 ATP 스톡을 준비한다.
8. 원위치 K _d 를 결정하기 위해, 1 mM EGTA, 0.2 mM, 0.6 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 50 mM 및 100 mM Ca ²⁺ 를 각각 100 mL mM EGTA 스톡 및 1M CaCl2 스톡을 탈 이온수에 용해시켰다.

3. 세포 배양

1. 문화 C2C12 myoblast 및 HEK293 세포 멸균 자외선 후드에있는 10cm 세포 배양 접시를 사용하여 각각에 대한 ATCC 프로토콜.
   참고 : C2C12 세포는 myoblast가 differentia 시작하기 때문에 ~ 70 % 이상의 합류보다 성장 허용해서는 안됩니다te로 myotubes. HEK293과 C2C12 세포는 쉽게 자라며 세포의 완전성을 유지하기 위해 100 % 이상의 농도로 성장하지 않아야합니다. 또한, 세포 건강을 보존하기 위해 실험을 위해 사용하기 전에 세포를 10 배 이상 통과 시켜서는 안됩니다.

4. HEK293 세포의 형질 감염

1. HEK293 세포를 멸균 된 22mm x 40mm 유리 현미경 슬라이드에 6cm 접시에 넣어서 형질 감염 당일 ~ 70 %의 합류가되도록하십시오.
2. 다음날, 감소 된 혈청 배지 ( 예 : Opti-MEM)에서 2 μg의 CatchER ⁺ cDNA와 1 : 3 (중량 / 부피) DNA : 형질 전환 시약 비율을 사용하여 세포를 형질 감염시키는 형질 전환 시약에 대한 제조업체의 프로토콜을 따르십시오.
3. 접시에서 DMEM 미디어를 비우고 감소 혈청 미디어 3 ML을 추가합니다. DNA : transfection 시약 혼합물을 접시에 넣고 37 ℃에서 4 ~ 6 시간 동안 배양합니다.
4. 인큐베이션 후, 세포를 HBSS 5-6 mL로 세척한다. HBSS f 삭제ROM 접시를 교체하고 신선한 DMEM 3 ML로 교체하고 GECI의 표현을 허용하기 위해 48 시간 동안 37 ° C에서 그들을 품어.
5. C2C12 myoblast 세포의 형질 감염
   1. C2C12 myoblast 세포의 경우, 접시 (1-2 mL)의 바닥을 덮을만큼 충분한 trypsin을 첨가하여 세포를 트립신 처리하십시오. 접시의 바닥에서 세포를 느슨하게 트립신 수 있도록 2-6 분 37 ° C 배양기에 접시를 놓습니다.
   2. 부화가 완료되면 트립신을 제거하고 DMEM 8 ML에있는 세포를 대기음. DMEM으로 철저히 피펫 세포를 고르게 분산시키고 재현 탁하고 최종 합류가 60 %가되도록 DMEM 3 mL가 들어있는 6 cm 세포 배양 접시에 멸균 된 coverslips 위에 뿌린다.
   3. 4.2-4.3 단계에서 설명한대로 세포를 transfect하십시오. 37 ° C에서 24 시간 동안 품어 낸다.
   4. 4.4 단계를 반복하십시오.

5. 슬라이드 및 형광 현미경의 제작

1. m을 켭니다.icroscope 및 광원을 선택한 다음 Simple PCI 프로그램을 엽니 다. 현미경이 15-20 분 동안 또는 전하 결합 소자 (CCD) 카메라가 -65 ° C까지 냉각 될 때까지 기다립니다. 기다리는 동안 챔버를 준비하고 세포와 함께 슬라이드.
2. 면봉으로 얇은 층의 실런트로 로우 프로파일 오픈 다이아몬드 욕조 영상 실을 덮으십시오.
3. 인큐베이터에서 transfected 세포를 포함하는 슬라이드를 가져 가라. 37 ℃로 예열 된 10 mM 포도당과 1.8 mM Ca ²⁺ 가있는 링거 완충액 1 mL로 부드럽게 3 회 씻어 낸다.
4. 세포가 말라는 것을 막기 위해 접시에 링거 완충액 1 mL를 놓고 접시에서 슬라이드를 꺼내기 위해 집게를 사용하십시오. 슬라이드의 가장자리를 실험실 조직에 접촉하여 과도한 용액을 실험실 조직에 흡수시킵니다. 그런 다음 셀이 그리스를 향하게하여 그리스가 들어있는 챔버의 측면에 놓고 드라이버를 사용하여 스테이지 마운트 위에 챔버를 고정시킵니다.
5. 1 추가챔버에 스테이지를 장착하고 나머지 현미경 셋업을 완료하는 동안 세포가 건조되는 것을 방지하기 위해 챔버에 링거 완충액 (mL)을 넣었다. 일단 진공 흡입 호스가 챔버에 부착되면 챔버가 보유하는 최종 용적은 ~ 450 μL입니다.
6. 현미경 대물 렌즈를 40X 오일 침지 대물 렌즈로 전환하십시오.
7. 렌즈 종이와 렌즈 세정액을 사용하여 세척하고 건조시킵니다. 목적을 문지르지 마십시오. 표면이 깨끗해질 때까지 살살하십시오.
8. 1 방울의 침지 오일을 목표물에 첨가하십시오.
9. 현미경 스테이지에 마운트를 놓고 진공 팁을 챔버에 추가하십시오. 일단 진공 흡입 호스가 챔버에 부착되고 켜지면 챔버가 보유하는 최종 용적은 ~ 450 μL입니다. 이 최종 볼륨은 챔버의 측면과 수평입니다. 과충전으로 인해 용액이 목표로 쏟아지는 것을 막기 위해 실험 중에 챔버 용액이 수평을 유지하는 것이 필수적입니다.
10. 명 시야 모드를 사용하여 게인을 175로 조정하고 노출 시간을 0.03 초로 조정하여 셀을 초점에 맞 춥니 다.
11. 세포가 집중되면 488 nm 여기를 사용하여 형광 모드로 전환합니다. 노출 시간을 0.07 초로 변경하십시오. 이미지에 적절한 형광으로 건강한 세포가 충분한 시야를 찾습니다.
12. 시야가 선택되면 형광 및 명 시야 모드로 사진을 찍습니다.
13. 셀에서 관심 영역 (ROI)에 동그라미를 치거나 전체 셀을 선택 영역에서 강도를 기록합니다.

6. 이미징 약물 유발 칼슘 ^{2 +} 과도 및 현장 K _d 보정

1. 5 초마다 1로 설정된 프레임 속도로 강도 측정을 시작하십시오.
2. 베이스 라인 강도가 20-30 프레임 (100-150 초) 동안 안정되도록하십시오. 필요한 경우 fr을 줄입니다.ames / s이 단계 동안 photobleaching을 방지합니다.
3. 200 μM의 최종 농도를 만들기 위해 ~ 450 μL의 최종 챔버 볼륨을 기반으로 20 MM 주식에서 필요한 4-cmc의 금액을 계산합니다. 필요에 따라 주식을 희석하십시오.
4. 조심스럽게 챔버에서 링어 완충액 60 μL를 취하여 미세 원심 분리 튜브에 넣으십시오. 이 용액으로 계산 된 4-cmc의 양을 희석하고 챔버에 다시 추가하여 이미지화되는 세포로부터 의도 된 반응을 유발하십시오.
5. 계산 된 양의 4-cmc를 미세 원심 분리 관에 넣고 피펫 팅으로 혼합하십시오.
6. 시야각 위에 솔루션을 부드럽게 추가하는 동시에 강도 측정에서 이벤트 마커를 추가하십시오.
7. 약물이 수용체에 결합하고 신호가 감소 할 때까지 기다린 다음 1.8mM Ca ²⁺ 와 10mM 포도당이 포함 된 3-6mL의 링거 완충액으로 동시에 닦으십시오. 동시에 이벤트 마커를 추가하십시오. 챔버 체적이 450 & lt;# 181; L이고 진공 상태로 연결되어 있으며 3-6 mL의 완충액을 첨가하여 이전 약물이 함유 된 용액을 씻어 내고 새롭게 첨가 된 용액으로 교체합니다.
8. 각 분석에 대해 transfected 세포의 새로운 슬라이드를 사용하여 100 μM ATP 및 15 μM CPA에 대해 6.1-6.7을 반복하십시오.
9. 측정이 완료되면 Simple PCI 프로그램의 강도 측정 창에서 데이터 수집을 종료하십시오.
10. 세포의 형광 및 명 시야 사진을 찍습니다.
11. 실험을 위해 데이터 파일을 엽니 다. 필요한 경우 강도 값을 다시 계산하기 위해 관심있는 셀 또는 영역을 다시 표시하십시오.
12. C2C12 myoblast 세포 에서 in situ K _d 를 결정하기 위해서는 section 4.2와 section 5에 명시된 protocol을 따르고 chamber에 0 mM Ca ²⁺ Ringer 's buffer 1 mL를 넣는다.
    1. 15-30 초 동안 세포 내 완충액에 0.002-0.005 % saponin으로 세포를 침투시켜 모든 세포를 비우십시오.CatchER ⁺ 는 세포질에있을 수 있습니다. 10 μm의 ionomycin와 KCl 버퍼에 1 ML EGTA 3 ~ 6 ML로 세포를 씻으십시오. 고원에 도달 할 때까지 강도를 줄이십시오.
    2. 10 μm의 ionomycin와 KCl 버퍼 3 ~ 6 ML로 씻어 강도가 안정되도록, 다음 각 칼슘 ^{2 +} 단계 2.7에서 자세한 솔루션을 추가합니다. 각 추가 사이의 강도가 고원에 도달하도록 허용하십시오.
13. 기초 [Ca ²⁺ ] 정량을 위해 센서를 보정하려면 단계 6.12를 따르십시오. 최소 및 최대 형광 강도를 얻으려면 단계 2.7에서 EGTA와 100 MM 칼슘 ^{2 +} 버퍼를 사용하십시오.

7. 데이터 처리

1. 강도 측정 데이터의 스프레드 시트 파일을 다운로드하십시오.
2. 각 셀의 데이터를 기준 강도 (F / F ₀ )로 표준화합니다. 모든 그래프 프로그램에서 정규화 된 데이터 대 시간을 플롯합니다.
3. % 변화를 계산하려면 표준화 된 피크 값을 빼십시오.1을 곱하고 100을 곱합니다. 여러 셀을 이미징 한 경우 평균 및 표준 편차를 계산합니다.
4. 신호대 잡음비, SNR을 계산하려면 실험에서 저장 한 이미지 파일을 ImageJ와 같은 이미지 처리 소프트웨어에서 열고 시그널, 감염된 세포 및 노이즈, 배경을 측정합니다. 방정식 SNR = 신호 / 잡음을 사용하여 SNR을 계산하십시오.
5. 수집 된 형광 이미징 데이터 에서 현장 K _D 를 계산하려면 각 칼슘 ^{2 +} 농도와 EGTA (0 MM 칼슘 ^{2 +} )의 추가 후 평원을 포함하는 평균 데이터를 평균. θ = (F - F _min ) / (F _max - F _min )을 사용하여 분수 채도 (상대 강도)를 계산하십시오. 여기서 θ는 상대 강도, F는 임의 지점에서의 형광, F _min 은 최소 형광 강도, Fmax는 최대 형광 강도이며, t의 강도 변화를 확인합니다.그는 최소 강도와 비교하여 칼슘 ^2+를 첨가하여 탐침한다. 모든 그래프 및 곡선 피팅 프로그램에서 [Ca ²⁺ ]에 대한 상대 강도 데이터를 플롯합니다. 임의의 그래프 및 곡선 적합 프로그램에 대해 _변환 된 1 : 1 결합 방정식 θ = [M _T ] / (K _d + [M _T ])를 사용하여 K _d 를 계산하십시오. M _T 는 총 금속 농도이다.
6. 6.13에 요약 된 보정에서 기본 칼슘을 정량하기 위해 1 mM EGTA (F _min ) 및 100 mM Ca ²⁺ (F _max )를 첨가 한 후 평형을 구성하는 강도 데이터를 평균화합니다. 기본 칼슘을 계산하기 위해 교정 공식 [Ca ²⁺ ] = K _d ([F - F _min ) / (F _max - F)]를 사용하십시오.

Representative Results

이 섹션은 다른 수용체 매개 경로를 통해 ER / SR 칼슘 ^{2 +의} 변화를 모니터링하기 위해 최적화 된 ER / SR 타겟 GECI CatchER ⁺ 를 사용하여 이전에 설명한 방법을 사용하여 달성 된 결과를 설명합니다.

그림 1 은 200 μM 4-cmc로 자극 된 RyR을 통한 ER 비우기를 보여줍니다. 4-cmc는 RyR의 항진제입니다. 약물의 첨가는 CatchER ⁺ 형광 강도의 감소로 측정 된 ER 칼슘의 감소를 유도한다. 표시된 바와 같이, 여기에 약술 된 프로토콜은 ER Ca ²⁺ 의 변화에 ​​대한 정보를 제공하는 CatchER ⁺ 를 사용하여 수용체 매개 Ca ²⁺ 과도의 시각화 및 측정을 가능하게합니다.

도 2에 도시 된 바와 같이, 1가역적으로 SERCA 펌프를 차단하기 위해 5 μM CPA는 고원을 형성하는 형광 강도를 크게 감소시킵니다. SERCA 펌프의 기능이 억제됨에 따라, ER Ca ²⁺ 방출 채널은 여전히 ​​활발하게 Ca ²⁺ 를 세포질로 방출하여 형광 강도를 감소시킨다. 세포는 CPA를 1.8 mM Ca ²⁺ 및 10 mM 포도당이 함유 된 링거 완충액으로 세척 한 후 회복됩니다. 이 결과는 CatchER ⁺ 가 SERCA 펌프에 특이적인 Ca ²⁺ 과도 현상을 모니터링 할 수있는 능력을 확인합니다.

그림 3 은 CatchER ⁺ 로 transfected HEK293 세포에서 200 μm의 ATP와 IP ₃ R의 간접 활성화에 대한 대표적인 데이터를 보여줍니다. ATP는 P2P 수용체 인 G-protein coupled receptor에 결합하여 IP ₃ 를 생성하고 IP ₃ R을 통해 Ca ²⁺ 방출을 활성화시킨다.가 작 으면 200 μM ATP를 첨가하면 신호 강도가 눈에 띄게 감소합니다. 1.8 mM Ca ²⁺ 및 10 mM 글루코스가 함유 된 링거 완충액으로 세포를 세척하면 응급실을 다시 채우고 신호가 기준선으로 되돌아 갈 수 있습니다. 이 결과는 CatchER ⁺ 가 간접 자극을 통해 IP ₃ R 매개의 칼슘 방출을 모니터링하는 능력을 강조합니다.

도 4 에서, CatchER ⁺ 를 C2C12 근육 아세포 세포로 형질 감염시켜 현장 Kd를 결정 하였다 . 데이터는 프로토콜에 요약 된대로 수집되었습니다. C2C12 myoblast 세포를 0.005 % saponin으로 15-30 초 동안 permeabilized 한 다음 10 μM ionomycin이 포함 된 KCl 완충액에서 1 mM EGTA로 세척 하였다. 다양한 Ca ²⁺ 농도를 10 μM 이오 노마 이신을 함유하는 KCl 완충액에서 제조하고 계단식 방식으로 첨가 하였다. 데이터는 1 : 1 바인드를 사용하여 표준화되고 적합화되었습니다.방정식. 평균 K _d 는 7 개의 세포에서 3.1 ± 1.4 mM이었다. CatchER ⁺ 의 약한 친 화성은 ER 또는 SR과 같은 높은 Ca ²⁺ 세포 기관에서 Ca ²⁺ 를 감지 할 수있게합니다. SR에서 염기성 [Ca ²⁺ ]를 결정하기 위해 C2C12 세포를 0.005 % 사포닌으로 15-30 초간 침투시키고 KCl 완충액으로 세척 한 다음 10 μM 이오 노 마이신을 함유 한 KCl 완충액에서 1 mM EGTA로 세척하여 F _min . EGTA를 KCl 완충 용액으로 세척 한 후, 10 μM 이오 노 마이신 (ionomycin)을 함유 한 100 mM Ca2 ⁺ 의 _최대 , Fmax를 가했다. 기초 Ca ²⁺ 는 0.4 ± 0.2 mM로 계산되었다.

그림 1 : HEK293 세포에서 4-cmc를 사용하여 RyR을 자극. ( A ) 4-cmc의 RyR 활성화에 대한 묘사. ( B ) HEK293 세포의 강도 기록ER에서 국한시킨 CatchER ⁺ 로 형질 감염시키고, 200 μM 4-cmc로 처리 하였다. 4-cmc로 RyR을 자극하면 [Ca ²⁺ ] _ER 의 감소와 직접적으로 관련되는 정규화 된 형광 강도가 감소합니다. n은 이미징 된 세포의 수를 나타냅니다. 평균 신호 감소는 12.0 ± 2.2 %였다. Ringer 's 완충액에 1.8 mM Ca ²⁺ 가 존재 함으로 인하여 조기 회복 강도에 반영된 응급실 재충전이 촉진되었다. 삽입 된 그림은 4 cmc로 치료 전후의 세포를 보여줍니다. SNR은 4.3 ± 0.8로 계산되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2 : 가역적 SERCA p를 사용하여 [Ca ²⁺ ] _ER의 감소HEK293 세포에서 ump 억제제 CPA. ( A ) CPA에 의한 SERCA 펌프의 억제. ( B ) 15 μm의 CPA로 치료 한 ER에 국한 CatchER ⁺ 로 transfected HEK293 세포의 라이브 영상. Ca ²⁺ 가 IP ₃ R과 RyR을 통해 여전히 흐를 수 있기 때문에 CPA로 SERCA 펌프를 차단하면 [Ca ²⁺ ] _ER 의 감소와 직접적으로 관련되는 정규화 된 형광 강도가 감소합니다. n은 이미징 된 세포의 수를 나타냅니다. 삽입 된 그림은 처리 전후에 CatchER ⁺ 로 형질 전환 된 HEK293 세포입니다. 평균 신호 감소는 21.0 ± 0.3 %였다. Ringer 's 완충액에 1.8 mM Ca ²⁺ 가 존재 함으로 인하여 조기 회복 강도에 반영된 응급실 재충전이 촉진되었다. SNR은 5.5 ± 0.8로 계산되었다. 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.이 그림.

그림 3 : ATP는 HEK293 세포에서 [Ca ²⁺ ] _ER 을 감소시킵니다. ( A ) purinergic 수용체 P2YR을 통해 ATP와 IP ₃ R의 간접 활성화의 도식. P2YR은 ATP 바인딩시 IP ₃ 을 생성하는 GPCR입니다. IP ₃ 는 IP ₃ R을 활성화시켜 ER에서 칼슘 방출을 자극합니다. ( B ) 200 μM ATP로 처리 한 CatchER ⁺ 로 트랜 스펙 션 된 HEK293 세포의 실시간 영상, ER에 국한. ATP로 P2Y 수용체를 통해 IP ₃ R을 간접적으로 자극하면 [Ca ²⁺ ] _ER 의 감소와 직접적인 상관 관계가있는 정상화 된 형광 강도가 감소합니다. n은 이미징 된 세포의 수를 나타냅니다. 평균 신호 감소는 6.0 ± 3.0 %였다. SNR은 c6.7 ± 2.7로 계산되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4 : C2C12 myoblast 세포에서 CatchER ⁺ 의 in situ K _d . CatchER +로 트랜 스펙 션 된 permeabilized C2C12 myoblast 세포에서 수집 된 정규화 된 강도에 대한 대표적인 추적. 세포를 15-30 초 동안 세포 내 완충액에 0.005 % 사포닌으로 침투시켰다. EGTA 및 Ca ²⁺ 용액은 KCl 완충액에서 제조되었고, n은 이미징 된 세포의 수를 나타낸다. ( A ) 삽입 형광 이미지는 치료 전후의 세포를 대표한다. 10 μM의 존재하에 0.3, 0.6, 2, 5, 10, 20, 50 및 100 mM Ca ²⁺ 를 투과성 C2C12 근육 아세포 세포에 첨가 하였다이오 노마 이신은 3.1 ± 1.4 mM의 K _d 를 얻는다. ( B ) 삽입 형광 이미지는 각각 10 μm의 ionomycin과 1 MM EGTA 및 100 MM 칼슘 ^{2 +의} 추가 후 최소 및 최대 값에서 세포의 대표입니다. 기초 Ca ²⁺ 는 0.4 ± 0.2 mM로 계산되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

CatchER ⁺ 와 같은 형광 프로브의 라이브 싱글 셀 이미징은 수용체 아고 니스트 또는 길항제에 대한 반응으로 각 세포에서 복잡한 ER / SR Ca ²⁺ 신호 전달 프로세스를 분석하는 효과적인 기술입니다. 이 기술은 Fura-2에 필요하거나 CatchER ⁺ 와 Rhod-2를 함께 사용하여 ER과 cytosolic calcium change를 동시에 모니터링하는 것과 같이 동시에 여러 파장을 사용하여 이미징하는 데 유용합니다. 이 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 세포 형질 감염은 이미징의 생존 능력에 큰 영향을 줄 수 있습니다. 낮은 형질 감염률은 칼슘 반응을 모니터링하기위한 GECI의 발현이 불충분해질 수 있습니다. 한편, CatchER ^+의 과발현은 합성 칼슘 염료와 관련된 문제인 ER / ER Ca ²⁺ 에 대한 완충 효과를 가지지 않습니다. Ca ²⁺ 프로브의 완충 효과는 세포 소기관의 [Ca ²⁺ ], p의 K _drobe와 측정에 필요한 프로브의 농도. Cytosolic [Ca ²⁺ ]는 일반적으로 낮은 nanomolar 범위에 있지만, 필요한 probe 농도는 비슷한 범위에 있습니다. 이 경우 색소 농도의 양과 세포질 칼슘을 완충하는 능력이 세포 영상에 중요한 관심사였습니다. 대조적으로 ER / SR [Ca ²⁺ ]는 우리가 다른 포유류 세포주 ²⁵ 를 결정할 때 micromolar에서 millimolar 범위의 100에 해당한다. CatchER ⁺ 의 0.1-1 μM 발현이 ER 칼슘의 검출을 가능하게하는데 충분하기 때문에, CatchER의 완충 효과는 무시할 만하다. 따라서, CatchER ⁺ 는 luminal ER / SR Ca ^{2+ 32} 에 대한 완충 효과없이 높은 [Ca ²⁺ ] 환경에서 Ca ²⁺ flux를 모니터링 할 수 있습니다.

배양 시간과 같은 여러 요인이 GECI의 형질 감염 효율에 영향을 미칠 수있다.e 형질 전환 시약, 배양 온도 및 세포의 confluency. 슬라이드에서 세포를 파종 할 때 세포의 밀집도가 영상 품질에 상당한 영향을 줄 수 있습니다. confluency가 낮 으면 낮은 셀 수 (n)와 통계 정확도가 떨어지며 높은 수준의 confluency는 겹쳐진 셀 레이어로 이어져 이미징에서 큰 변수를 생성합니다. 형질 감염의 시간과 온도는 세포 유형에 따라 최적화되어야합니다. 또한 감소 된 혈청 배지로 DMEM을 첨가하는 것은 세포 사멸을 방지하기 위해보다 긴 형질 감염 시간에 최적입니다. 포유류 세포에서 원래의 GECI CatchER 형광은 배양되고 형질 감염되었을 때 단지 30 ° C였습니다. CatchER의 형광은 37 ℃에서의 발현에 성공적으로 최적화되고 개선되어 새로운 개선 된 CatchER ^+를 만들었습니다. EGFP에 대한 항체를 사용하는 웨스턴 블랏을 수행하여 Ca ²⁺ 프로브의 발현을 확인할 수 있습니다.

게다가, 나thod와 시약 전달의 일관성이 중요합니다. 시약은 관류, 소량의 확산 또는 기계적 펌프에 의해 챔버에 추가 될 수 있으며, 이들 모두는 상이한 반응을 유도 할 수 있습니다. 슬라이드 위에 놓일 챔버 바닥에 밀봉 제 그리스 층을 도포하여 용액 챔버를 적절히 밀봉해야합니다. 올바른 파장을 프로브에 대해 선택해야합니다. CatchER ^+의 여기 및 방출 파장은 각각 395/488 nm 및 510 nm입니다. 세포 이미징의 경우 488nm 만이 여기에 사용되어 자외선이 세포에 악영향을 미치지 않도록합니다. 따라서 488 nm에서 여기하고 510 nm에서 방출을 수집하는 광학 필터를 사용하면 CatchER ⁺ 로 이미지를 만들 때 사용할 수 있습니다. Photobleaching을 방지하기 위해 프레임과 같은 광도와 빛의 노출을 최적화하기위한 노력이 집중 될 수 있습니다 ³³ .

이 프로토콜은 eff를 분석하는 데 이상적이지만CatchER ₊ Ca ²⁺ ER / SR 형광 탐침을 사용하여 ER / SR 변화의 요법, 어떤 실험에서 예상대로 제한이 있습니다. 단세포 라이브 영상은 작은 세포 틀을 분석하기 때문에 세포 수 (n)는 평균 1 ~ 100 개의 세포에서 달라질 수 있지만 큰 세포주에서는 더 낮을 수 있습니다. 이는 여러 번의 시도없이 세포 수와 통계적으로 다양한 결과를 유도합니다. n> 6은 통계적 정확성을 위해 필요합니다. 더 큰 n을 얻으려면 많은 요리가 이미지화되어야하거나 다른 기술을 동시에 사용해야합니다. 또한 CatchER ⁺ 는 단일 파장의 ER / SR 칼슘 ²⁺ 프로브이기 때문에 신호가 정량화 될 수없는 다른 단일 파장 프로브 및 염료의 문제를 야기하며 신호가 세포의 파괴와는 반대로 사실인지는 알지 못합니다 아티팩트 및 비례 시스템과 비교할 때 더 큰 소음 ³⁴ .

이 연구는 이러한 최적화 된 칼슘 ^{2 +} 프로브가수용체 매개 ER / SR Ca ²⁺ 방출을 모니터링하기 위해 다른 세포 유형 또는 조직 유형에 적용될 수 있습니다. CatchER ⁺ 는 단일 파장의 ER / SR 칼슘 ²⁺ 탐침입니다. 따라서 실험 매개 변수와 설정이 정량적 측정에 일관성을 유지하는 것이 중요합니다. 칼슘 농도와 세포주의 칼슘 센서의 Kd의 상세한 교정은 정량 분석을위한 추가 중요한 측정입니다.

이러한 개발 된 칼슘 센서는 ER / SR 내의 특정 위치를 타겟으로하여 다양한 생물학적 및 병리학 적 조건에서 글로벌 칼슘 ²⁺ 변화와 비교하여 존재하는 다양한 칼슘 ^{이온 +} 과도 현상을 모니터링 할 수 있습니다. 이러한 발견은 칼슘 ^{2 +} 관련 질병 진단을위한 미래의 도구를 제공하기 위해 칼슘 ²⁺ 영상 및 프로브 디자인 분야를 계속 추진할 것입니다. 보고 된 프로토콜과 개발 된 센서는 약물 d칼슘 신호 전달과 관련된 질병에 대한 예방책.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-Chloro-3-methylphenol (4-CmC)	Sigma-Aldrich	C55402
515DCXR dichroic mirror	Chroma Technology Corp.	NC338059
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A26209
Calcium chloride dihydrate	EMD Millipore	102382
Corning tissue-culture treated culture dishes (100 mm)	Sigma-Aldrich	CLS430167
Corning tissue-culture treated culture dishes (60 mm)	Sigma-Aldrich	CLS430166
Cyclopiazonic Acid (CPA)	EMD Millipore	239805
D(+)-Glucose	ACROS Organics	41095-0010
Dow Corning 111 Valve Lubricant & Sealant	Warner Instruments	64-0275
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D7777
Ethylenebis(oxyethylenenitrilo) tetraacetic Acid (EGTA)	ACROS Organics	409911000
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher	26140087
Fisherbrand Cover Glasses 22x40 mm	Fisher Scientific	12-544B
Hanks’ Balanced Salts (HBSS)	Sigma-Aldrich	H4891
HEPES, Free Acid, Molecular Biology Grade	EMD Millipore	391340
Immersion Oil without autofluorescence	Leica	11513859
Ionomycin, Free Acid	Fisher Scientific	50-230-5804
Leica DM6100B inverted microscope with a cooled EM-CCD camera	Hamamatsu	C9100-13
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	ThermoFisher	11668019
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	ThermoFisher	L3000015
Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber	Warner Instruments	RC-26GLP
Magnesium Chloride Hexahydrate	Fisher Scientific	M33-500
Opti-MEM	ThermoFisher	51985034
Potassium Chloride	EMD Millipore	PX1405
Potassium Phosphate, Dibasic	EMD Millipore	PX1570
Potassium Phosphate, Monobasic	EMD Millipore	PX1565
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
SimplePCI Image Analysis Software	Hamamatsu	N/A
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific	S233-3
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271-500
Sterivex-GV 0.22 µm filter	EMD Millipore	SVGVB1010
Till Polychrome V Xenon lamp	Till Photonics	N/A
Trypsin (2.5%), no phenol red (10x)	ThermoFisher	15090046