Summary
تمت معالجة مسحوق الخيزران مسبقا مع هيدروكسيد الصوديوم وتحلل إنزيميا. تم استخدام هدروليزيت من الخيزران كمادة وسيطة ل 2،3-بيوتانيديول، R -acetoin، 2-كيتوغلوكونيك حمض، وإنتاج حمض الزيلونيك بواسطة كليبسيلا الرئوية .
Abstract
الخيزران هو الكتلة الحيوية الهامة، ويستخدم هيدروليزات الخيزران من قبل كليبسيلا الرئوية كمادة وسيطة لإنتاج الكيميائي. هنا، تم معالجة مسبقة مسحوق الخيزران مع هيدروكسيد الصوديوم وغسلها إلى درجة الحموضة محايدة. تمت إضافة سيلولاز إلى مسحوق الخيزران السابق التصنيع لتوليد هدروليزات التي تحتوي على 30 غ / ل غلوكوز و 15 غ / L زيلوز وتم استخدامها كمصدر للكربون لإعداد وسيلة لإنتاج الكيماويات. عندما استزرع في ظروف ميكرويروبيك، تم إنتاج 12.7 غرام / لتر 2،3-بيوتانيديول من قبل ويلديب K. الرئوية . في الظروف الهوائية، تم إنتاج 13.0 جم / لتر R -acetoin من قبل متحولة بودك من K. الرئوية . تم إنتاج خليط من 25.5 جم / لتر 2 كيتوغلوكونيك حمض و 13.6 غرام / لتر من حمض الهيلونيك من قبل متحولة بودا من K. الرئوية في مرحلتين، وتخمير التحكم في درجة الحموضة مع مكملات الهواء عالية. في المرحلة الأولى من التخمير، تم الحفاظ على الثقافة في درجة الحموضة محايدة. بعد نمو الخلايا، وفيرمنتاتيون انتقل إلى المرحلة الثانية، حيث سمح للثقافة أن تصبح حمضية.
Introduction
كلبسيلا الرئوية هي بكتيريا تنمو بشكل جيد تحت كل من الظروف الهوائية واللاهوائية. K. بنيومونياي هو كائن حيوي صناعي مهم يستخدم لإنتاج العديد من المواد الكيميائية. 1،3-بروبانديول هو مادة كيميائية قيمة التي تستخدم أساسا كمونومر لتجميع تيريفثالات بوليتريمثيلين. بولي تريميثيلين تيريفثالات هو البوليستر القابلة للتحلل التي تعرض خصائص أفضل من تلك من 1،2-بروبانديول، بوتانيديول، أو الإيثيلين جلايكول 1 . يتم إنتاج 1،3-بروبانديول من قبل K. الرئوية باستخدام الجلسرين كركيزة في ظروف محدودة الأكسجين 2 . 2،3-بيوتانديول ومشتقاته لها تطبيقات في مجال البلاستيك، وإنتاج المذيبات، والمطاط الصناعي، ولديها القدرة على استخدامها كوقود حيوي 3 . مع الجلوكوز كما الركيزة، 2،3-بيوتانيديول هو المستقلب الرئيسي لسلالة ويلديب 4 . 2،3-بوتانيديول هو توليفإد من البيروفات. أولا، جزيئين من البيروفات تتكثف لإنتاج α-أسيتولاكتات. يتم تحفيز هذا التفاعل من قبل α- أسيتولاكتات سينزاس. ثم يتم تحويل α-أسيتولاكتات إلى أسيتوان بواسطة α-أسيتولاكتات ديكاربوكسيلاس. R -acetoin يمكن تخفيضها إلى 2،3-بيوتانيديول عندما تحفزها نازعة بيوتانيديول. وقد تم استكشاف طريقة فعالة استبدال الجينات مناسبة ل K. الرئوية ، وقد شيدت العديد من المسوخ 5 ، 6 ، 7 . وهناك طفرة بودك ، التي فقدت نشاطها هيدروجيناز 2،3-بيوتانيديول، وتتراكم مستويات عالية من الأسيتوين في مرق الثقافة. يستخدم أسيتوين كمادة مضافة لتعزيز نكهة الطعام 8 . عندما بودا ، الذي يشفر α- أسيتولاكتات كربوكسيل، يتم تحور، 2-كيتوغلوكونيك حمض يتراكم في المرق. 2-كيتوغلوكونيك حمض يستخدم لتوليف حمض الإريثوربيك (حمض إسواسوربيك)، وهو مضاد للأكسدة المستخدمة في صناعة المواد الغذائية 9 . 2-كيتوغلوكونيك حمض هو وسيط من مسار أكسدة الجلوكوز. في هذا المسار، وتقع في الفضاء بيريبلاسميك، يتم أكسدة الجلوكوز إلى حمض الغلوكونيك ثم مزيد من أكسدة إلى 2-كيتوغلوكونيك حمض. حمض الجلوكونيك وحمض 2 كيتوغلوكونيك المنتجة في بيريبلازم يمكن نقلها إلى السيتوبلازم لمزيد من عملية التمثيل الغذائي. تراكم حمض 2 كيتوغلوكونيك يعتمد على الظروف الحمضية، ومكملات الهواء أعلى تفضل إنتاج حمض 2 كيتوغلوكونيك 10 . غلوكونات نازعة، مشفرة بواسطة جاد ، يحفز تحويل حمض الغلوكونيك إلى 2-كيتولغوكونيك حمض. إن الطفرة الجينية ل K. بنيومونياي تنتج مستويات عالية من حمض الغلوكونيك بدلا من حمض 2-كيتوغلوكونيك، وهذه العملية تعتمد أيضا على الظروف الحمضية. حمض الجلوكونيك هو حمض عضوي بالجملة ويستخدم كمواد إضافية لزيادة خصائص الاسمنت 11 - وتحفز الأكسدة الجلوكوز إلى حمض الغلوكونيك من نازعة الجلوكوز. زيلوز هو أيضا الركيزة مناسبة من نازعة الجلوكوز. عندما يستخدم زيلوز كركيزة، K. الرئوية تنتج حمض الزيلونيك 12 .
ويعتبر الإنتاج الكيميائي باستخدام الكتلة الحيوية كمواد وسيطة موضوعا ساخنا في التكنولوجيا الحيوية 13 . المكونات الرئيسية للكتلة الحيوية هي السليلوز، هيميسيلولوز، واللجنين. ومع ذلك، فإن هذه المركبات الجزيئات لا يمكن أن يتأثر مباشرة من قبل معظم الكائنات الحية الدقيقة (بما في ذلك K. الرئوية ). السيلولوز و هيميسيلولوسيس في الكتلة الحيوية يجب تحلل إلى الجلوكوز و زيلوز، ثم يمكن استخدامها من قبل الكائنات الحية الدقيقة. وجود اللجنين في لينوسلولوسيس يخلق حاجز وقائي يمنع تحلل الكتلة الحيوية من الانزيمات. وبالتالي، يتم إجراء عملية المعالجة التي تزيل اللجنين و هيميسيلولوسيس ويقلل من تبلور السليلوز دائما أثناء استخدام الكتلة الحيوية بواسطة هيئة التصنيع العسكريroorganisms. وقد تم تطوير العديد من الأساليب المعالجة: حمض، القلوية، الأمونيا، والمعالجة بالبخار شائعة.
الخيزران وفيرة في المناطق الاستوائية وشبه الاستوائية، وهو مورد الكتلة الحيوية الهامة. هنا، يتم عرض إعداد هيدروليزات الخيزران وإنتاج المواد الكيميائية باستخدام هدروليزات الخيزران
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد هدروليزيت الخيزران
- إضافة 5 غرام من مسحوق الخيزران إلى 40 مل من محلول هيدروكسيد الصوديوم لتحقيق 10٪ (ز / ز) التركيز النهائي في قارورة 250 مل. استخدام سلسلة من حلول هيدروكسيد الصوديوم تتراوح من 0.05 M إلى 0.50 M في الزيادات من 0.05 M.
- احتضان الخليط لمدة 60 دقيقة عند 60 درجة مئوية أو 100 درجة مئوية في حمام مائي. احتضان عند 121 درجة مئوية في الأوتوكلاف.
- بعد الحضانة، وترك الخليط للوقوف لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة. ثم، إزالة طاف. إضافة 100 مل من المياه العذبة والمزيج.
- كرر هذا الغسيل 5-6 مرات، حتى الرقم الهيدروجيني للطاف يصل 6.8. استخدام الصلبة التي تم الحصول عليها للخطوة التالية من التحلل الأنزيمي.
- للتحلل المائي، وضبط 50 مل من الخليط أعلاه إلى الرقم الهيدروجيني 5.0 باستخدام 98٪ H 2 سو 4 . ثم، إضافة 0.5 مل من 200 نشاط ورقة مرشح (فبو) / مل السليلوز.
ملاحظة: النسبة النهائية من السليلوز إلى الخيزران شيجب أن يكون 20 فبو لكل 1 غرام من الخيزران. - احتضان الخليط في 50 درجة مئوية لمدة 36 ساعة في شاكر.
ملاحظة: بعد التحلل المائي، سوف تبقى بعض الصلبة في الخليط. - الحصول على هدروليزات واضحة بواسطة الطرد المركزي في 7،690 x ج لمدة 5 دقائق.
- تحديد كمية الجلوكوز، زيلوز، وغيرها من المواد الكيميائية مع نظام كروماتوجراف السائل ذات الضغط العالي مجهزة كاشف مؤشر الانكسار وكاشف مجموعة الضوئي الضوئي. استخدام عمود هكس-87H (300 مم × 7.8 مم) ومرحلة المحمول من 5 ملي H 2 سو 4 حل بمعدل تدفق 0.8 مل / دقيقة 12 .
- لكمية كبيرة من التحضير هدروليزات، مزيج 2 كجم من مسحوق الخيزران و 18 L من هيدروكسيد الصوديوم 0.25 M في خزان الفولاذ المقاوم للصدأ 30 لتر.
- احتضان الدبابة في 121 درجة مئوية في الأوتوكلاف لمدة 60 دقيقة. بعد الحضانة، وغسل الخليط مع 40 لتر من الماء في خزان بلاستيكي 60 لتر. كرر هذا الغسيل 5 مرات.
- استخدام المياه لضبط مجموع الخيزران غسلها إلى حجم 20 L.ضبط درجة الحموضة من الخليط إلى 5.0 باستخدام 98٪ H 2 سو 4 .
- إنزيميا تحلل المزيج في حمام الماء الهزاز المعدل، ومجهزة محرض الميكانيكية لضمان أن الخليط موزعة بشكل جيد. إضافة 200 مل من 200 فبو / مل السليلوز واحتضان الخليط في 50 درجة مئوية لمدة 36 ساعة.
- بعد التحلل المائي، الطرد المركزي الخليط في 4،700 x ج لمدة 10 دقيقة.
2. 2،3-بوتانيديول الإنتاج من قبل ويلديب K. الرئوية
- استخدام 3 لتر من هيدروليزات الخيزران كما المذيبات لإعداد المتوسطة.
- إعداد وسط تخمير يحتوي على 4 غرام / لتر خمور الذرة حاد، 2 غرام / لتر (نه 4 ) 2 سو 4 ، 6 ز / لك 2 هبو 4 ، 3 جم / لتر خ 2 بو 4 ، و 0.2 جم / لتر مغسو 4 . ضبط الرقم الهيدروجيني للوسط إلى محايدة باستخدام 2.5 M هيدروكسيد الصوديوم. استخدام المفاعل الحيوي 5-L تحتوي على 3 L من وسط التخمير تعقيمها للتخمير.
- استخدام K. الرئويةالخلايا المخزنة في -80 درجة مئوية درجة حرارة منخفضة الثلاجة.
- لثقافة البذور، واحتضان قارورة 250 مل تحتوي على 50 مل من لوريا-بيرتاني (لب) وسط بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، مع اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة. استخدام المتوسطة لب تحتوي على 10 غرام / لتر تريبتون، 5 جم / لتر استخراج الخميرة، و 10 غ / L كلوريد الصوديوم.
ملاحظة: كثافة الخلية من ثقافة البذور يجب أن تصل أود 2 (الكثافة البصرية في 600 نانومتر). - تطعيم قارورة واحدة من 50 مل من ثقافة البذور في المفاعل الحيوي. الحفاظ على الثقافة في درجة الحموضة 6.0 و 37 درجة مئوية. استخدام معدل مكملات الهواء من 2 لتر / دقيقة ومعدل الإثارة من 250 دورة في الدقيقة، وخلق حالة ميكرويروبيك.
- جمع 5 مل عينات كل 2 ساعة أثناء التخمير وتحليلها مع ارتفاع ضغط السائل اللوني لتحديد تركيزات كيميائية في مرق 4 .
- مراقبة القلوية تضاف إلى المفاعل الحيوي على الانترنت باستخدام مفكس / دا.
ملاحظة: يتم إنتاج الأحماض العضوية في عملية التخمير، أند هيدروكسيد الصوديوم يضاف للحفاظ على درجة الحموضة الثقافة مستقرة. حجم القلوية المضافة يمثل كمية من حمض المنتجة. عندما الهضاب خط الهضبة المضافة، يتم الانتهاء من العملية، إما بسبب استنفاد مصدر الكربون أو موت الخلايا.
- مراقبة القلوية تضاف إلى المفاعل الحيوي على الانترنت باستخدام مفكس / دا.
3. R -acetoin الإنتاج من قبل بودك متحولة K. الرئوية
- إعداد وسط لإنتاج الأسيتوين التي تحتوي على 4 غرام / لتر الذرة الخمور حاد، 2 غرام / لتر (نه 4 ) 2 سو 4 ، 3 جم / لتر خلات الصوديوم، 0.4 جم / لتر بوكل، و 0.1 جم / لتر مغسو 4 .
- استخدام K. بنيومونياي ΔbudC لإنتاج R -acetoin. كرر الخطوات من 2.4 إلى 2.5.
ملاحظة: بودك ترميز 2،3- بيوتانيديول نازعة. K. بنيومونياي-ΔbudC يفقد نشاط نازعة 2،3-بيوتانيديول وتنتج R -acetoin بدلا من 2،3-بيوتانيديول. - الحفاظ على الثقافة في درجة الحموضة 6.0 و 37 درجة مئوية. استخدام معدل مكملات الهواء من 4 لتر / دقيقة و أجيتاتيون معدل 450 دورة في الدقيقة، حالة الهوائية.
ملاحظة: مكملات الأكسجين أعلى من إنتاج 2،3-بيوتانيديول. - فحص العينات كما في الخطوة 2.6.
4. 2-كيتوغلوكونيك إنتاج حمض من قبل بودا متحولة من K. الرئوية
- بالنسبة لإنتاج حمض 2 كيتوغلوكونيك، استخدم نفس الوسط لإنتاج R -acetoin.
- استخدام K. بنيومونياي- ΔbudA لإنتاج حمض 2-كيتوغلوكونيك. كرر الخطوات من 2.4 إلى 2.5.
ملاحظة: بودا ترميز α-أسيتولاكتات كربوكسيل. K. بنيومونياي-ΔbudA يفقد نشاط α-أسيتولاكتات كربوكسيل وتنتج 2-كيتوغلوكونيك حمض، وذلك باستخدام الجلوكوز كركيزة.
ملاحظة: 2-كيتوغلوكونيك توليف حمض هو عملية تعتمد على حالة الحمضية. وقد تم تطوير التخمير على مرحلتين لإنتاج حمض 2 كيتوغلوكونيك 10 ؛ في المرحلة الأولى، يتم تلقيح ثقافة البذور في المفاعل الحيوي. - فحص العينات كما في الخطوة 2.6. باستخدام هدروليزات من الخيزران كمصدر الكربون.
ملاحظة: يتم تحويل الجلوكوز في المتوسطة إلى 2-كيتوغلوكونيك حمض، ويتم تحويل زيلوز إلى حمض زيلونيك. وهكذا، يتم الحصول على خليط من حمض 2-كيتوغلوكونيك وحامض الزيلونيك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذا البروتوكول، كان بريتراتد الخيزران باستخدام القلويات. تم تحديد معلمات الحضانة المثلى - درجة حرارة 121 ° C و 0.25 M هيدروكسيد الصوديوم - في الشكلين 1 و 2 . تم تحلل الخيزران المسبق المعالجة بشكل انزيمي، وتم قياس تركيزات الجلوكوز والزيلوز التي تم الحصول عليها في هدروليزات. وكانت درجات الحرارة الأعلى مفضلة لإنتاج السكر، لذا تم اختيار 121 درجة مئوية كدرجة حرارة مثالية. ازدادت نسبة الجلوكوز والزيلوز المنتجة في هدروليزات مع تركيز هيدروكسيد الصوديوم على نطاق 0،05-0،25 م. ولم يكن للزيادة الأخرى في تركيز هيدروكسيد الصوديوم أي تأثير إيجابي على إنتاج السكر. وهكذا، تم اختيار هيدروكسيد الصوديوم في 0.25 M باعتباره التركيز الأمثل.
الشكل 1: تأثير درجة حرارة المعالجة الأولية على الجلوكوز و زيلوز كونالترشيح في هدروليزات الخيزران. العمود الأحمر: الجلوكوز. العمود الأزرق: زيلوز. وكانت درجات الحرارة المرتفعة مفضلة لإنتاج السكر، وتم اختيار 121 درجة مئوية لتحضير هدروليزات كبير الحجم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تأثير تركيز هيدروكسيد الصوديوم المستخدمة أثناء المعالجة على تركيز الجلوكوز والزيلوز في هدروليزات الخيزران. الخط الأحمر: الجلوكوز. الخط الأزرق: زيلوز. زاد الجلوكوز و زيلوز المنتجة في هدروليزات مع تركيز هيدروكسيد الصوديوم على مدى 0.05-0.50 M، و 0.25 M تم اختياره لتحضير هدروليزات كبيرة الحجم. يرجى النقر عليهإعادة لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم إنتاج حوالي 20 غرام / لتر الجلوكوز و 10 غرام / لتر زيلوز خلال هدروليزات في القارورة مقياس التحلل الأنزيمي. تم الحصول على 30 غ / L الجلوكوز و 15 غ / L زيلوز من إعداد هدروليزات كبيرة الحجم. وكان ذلك لأن إعداد كبير الحجم تم إجراؤها في شاكر حمام المياه المفتوحة، وبعض المياه تبخرت في هذه العملية، مما أدى إلى تركيز هدروليزات. تم استخدام الجلوكوز والزيلوز في هدروليزات الخيزران من قبل K. الرئوية كمصادر الكربون لإنتاج المواد الكيميائية. المركبات الأخرى في هدروليزات هي: سيلوبيوس (1.4 جم / لتر)، أرابينوس (8.9 جم / لتر)، حمض الخليك (1.9 جم / لتر)، وحامض الفورميك (0.2 جم / لتر).
تم إنتاج 2،3-بيوتانيديول من قبل K. الرئوية في ظروف ميكرويروبيك ( الشكل 3 ). وقسمت العملية إلى فترتين. في صأولا، تم استخدام الجلوكوز من قبل الخلايا لإنتاج 7.6 غرام / لتر 2،3-بوتانيديول، في حين أن مستوى زيلوز في مرق ظلت دون تغيير. تم استنفاد الجلوكوز في 8 ساعات، وهذه المرة تميز التحول إلى الفترة التالية. في الفترة الثانية، تم استخدام زيلوز في المرق من قبل الخلايا، وتم إنتاج 5.1 غرام / لتر 2،3-بيوتانيديول إضافية. وكان إنتاج 2،3-بيوتانيديول أبطأ في الفترة الثانية. وفي نهاية العملية، تم إنتاج ما مجموعه 12.7 جم / لتر 2،3-بيوتانديول. وكانت المنتجات الثانوية لهذه العملية حمض اللاكتيك وحمض الخليك والإيثانول. تم تصنيع حمض اللاكتيك والإيثانول بشكل رئيسي في الفترة الأولى (عندما تم استخدام الجلوكوز كمصدر للكربون)، وتم تصنيع حمض الأسيتيك بشكل مستمر.
الشكل 3: إنتاج 2،3-بيوتانيديول باستخدام هدروليزات الخيزران كمادة وسيطة. الخط الأحمر: الجلوكوز. الخط الأزرق: زيلوز؛ أماهخط جينتا: 2،3-بوتانيديول؛ خط البرتقال: حمض اللاكتيك. خط أسود: حمض الخليك. الخط الأخضر: الإيثانول. تم استخدام الجلوكوز و زيلوز في هدروليزات على حد سواء ل 2،3-بوتانيديول التوليف، ولكن تم استخدام الجلوكوز أولا، تليها زيلوز. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم إنتاج R- أسيتوان من قبل متحولة بودك من K. الرئوية تحت الظروف الهوائية ( الشكل 4 ). كما في إنتاج 2،3-بيوتانيديول من سلالة ويلديب، تم استخدام الجلوكوز ثم زيلوز في تسلسل من قبل K. الرئوية-ΔbudC . تم استنفاد زيلوز في 16 ساعة، وكان معدل الاستهلاك أسرع من ذلك في إنتاج 2،3-بيوتانيديول من قبل ويلديب. وكان إنتاج R -acetoin 13 غرام / لتر في نهاية العملية، وكانت المنتجات الثانوية 2،3-بيوتانيديول، حامض الخليك، و ethanol.
الشكل 4: إنتاج R -acetoin باستخدام هدروليزات الخيزران كمادة وسيطة. الخط الأحمر: الجلوكوز. الخط الأزرق: زيلوز؛ خط البنفسج: أسيتوان؛ خط أرجواني: 2،3-بوتانيديول؛ خط أسود: حمض الخليك. الخط الأخضر: الإيثانول. كان كل من الجلوكوز والزيلوز في هدروليزات تستخدم لتجميع R -acetoin، وكان استخدامها في تسلسل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم إنتاج 2-كيتوغلوكونيك حمض وحامض الزيلونيك من قبل متحولة بودا من K. الرئوية ( الشكل 5 ). تتطلب هذه العملية تكملة الهواء عالية. تم تحويل الجلوكوز في الوسط لأول مرة إلى الجلوكونحامض جيم، والتي تراكمت في مرق. وصل حمض الغلوكونيك إلى الحد الأقصى من 15 جم / لتر في 8 ساعات من الثقافة، وبعد ذلك، انخفض تركيزه. لم يتم إنتاج حمض 2-كيتوغلوكونيك حتى 6 ساعات في الثقافة. ثم تم تصنيعه بمعدل مرتفع، وتم إنتاج 25 غرام / لتر 2 كيتوغلوكونك حامض بنهاية العملية. تم تحويل زيلوز في المتوسط إلى حمض زيلونيك. بدأ هذا التفاعل في وقت لاحق من تحويل الجلوكوز إلى حمض الغلوكونيك. تم إنتاج بعض حمض الأسيتيك كمنتج ثانوي أثناء العملية.
الشكل 5: حمض 2 كيتوغلوكونيك وإنتاج حمض الزيلونيك باستخدام هدروليزات الخيزران كمادة وسيطة. الخط الأحمر: الجلوكوز. خط البرتقال: حمض الجلوكونيك. خط أرجواني: 2-كيتوغلوكونيك حمض؛ الخط الأزرق: زيلوز؛ خط أسود: حمض الخليك. الخط الأخضر: الإيثانول. تم تحويل الجلوكوز في هدروليزات إلى حمض الجلوكونيكوتم تحويله كذلك إلى حمض 2 كيتوغلوكونيك. تم تحويل زيلوز في هدروليزات إلى حمض زيلونيك. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
K. الرئوية ينتمي إلى جنس كليبسيلا في الأسرة إنتيروباكترياسي . K. الرئوية توزع على نطاق واسع في البيئات الطبيعية مثل التربة، والنباتات، والمياه 14 . تم عزل سلالة K. الرئوية K. الرئوية المستخدمة في هذا البحث من التربة، وتستخدم لإنتاج 1،3-بروبانديول 15 . K. الرئوية والمسوخ من هذا النوع تنتج العديد من المواد الكيميائية في ظل ظروف مختلفة.
درجة الحموضة الثقافة ومكملات الهواء هي العوامل الرئيسية التي تؤثر على الإنتاج الكيميائي من قبل K. الرئوية . ويلديب K. الرئوية تنتج 2،3-بيوتانيديول كما كاتابوليت الرئيسي في الرقم الهيدروجيني 6. ومع ذلك، 2-كيتوغلوكونيك يتغير حمض إلى كاتابوليت الرئيسي عندما مثقف في درجة الحموضة 5 أو أقل 9 . زيادة الملحق الهواء يقلل 2،3-بوتانيديول التوليف، في حين يتم تحسين التوليف R -acetoin 8 وآخرون. 16 ، والتي من السهل أن تؤدي في المختبر، وخاصة على نطاق لتر.
ارتفاع درجات الحرارة المعالجة المسببة لصالح إنتاج السكر خلال التحلل الأنزيمي. وأجري العلاج في ≤ 100 درجة مئوية في حمام مائي وفي 121 درجة مئوية في الأوتوكلاف. هذه القطعتين من المعدات شائعة في المختبرات، وعدة لترات من السائل تمت معالجتها في كل دفعة. ارتفاع درجات الحرارة تتطلب مفاعلات الضغط العالي. على سبيل المثال، مختبرنا لديه 50-مل و 1-L مفاعلات الضغط العالي، ولكن حجم هذه المفاعلات تحد من استخدامها خلال المعالجة الأولية للكتلة الحيوية.
كان التحضير هدروليزات الخيزران هو مبين في هذا البحث من السهل أن تؤدي في القوارير. ومع ذلك، عند القيام به في حجم كبير، تم الحصول على مستويات أقل من الجلوكوز والزيلوز في بعض الأحيان. يجب أن يتم توزيع خليط التحلل بشكل جيد. ومن شأن هطول الكتلة الحيوية أن يؤدي إلى انخفاض مستويات التحلل المائي.
وخلافا للجلوكوز النقي والزيلوز، تلوث الكتلة الحيوية هدروليزات من قبل العديد من المواد الكيميائية السامة التي قد تمنع نمو الكائنات الحية الدقيقة. وقد تم تطوير العديد من الأساليب لإزالة مثل هذه المثبطات، ولكنها تضيف إلى تكاليف المعالجة وتميل إلى خفض غلة السكر 17 . في هذا البحث، لم يتم عمل خاص لإزالة المثبطات. وباستخدام هدروليزات الخيزران المولدة في هذا العمل كمواد وسيطة، كانت الإنتاجية (0.95 جم / ل) ونسبة التحويل (0.25 جم / جم) من الجلوكوز إلى 2.33 بيوتانديول خلال المرحلة الأولى، عند استهلاك الجلوكوز، كانت أقل من عندما تم استخدام الجلوكوز المنقى كمصدر الكربون، وذكرت سابقا (1.4 غرام / ل و 0.3 غرام / غم، على التوالي) 4 . إنتاجية 2،3-بوتانيدإيول خلال المرحلة الثانية، عندما كان يستهلك زيلوز، كان أبطأ مما كان عليه في المرحلة الأولى. ومع ذلك، فإن نسبة التحويل من زيلوز إلى 2،3-بوتانيديول وصلت إلى 0.34 غرام / غرام، وهو أعلى مما كان عليه عند استخدام الجلوكوز المنقى كمصدر الكربون 4 . وكان إنتاج R -acetoin باستخدام هدروليزات الخيزران كمادة وسيطة الإنتاجية ونسب التحويل الركيزة من 0.92 غرام / ل و 0.29 غرام / غرام، على التوالي. وكان كل من هذين النسبين أقل مما كان عليه عند استخدام الجلوكوز المنقى كركيزة (1.7 جم / ل و 0.34 جم / جم، على التوالي) 8 . كانت الإنتاجية ونسبة التحويل من حمض 2-كيتوغلوكونيك في هذه الدراسة 2.3 غ / ل و 0.91 غم / غرام، على التوالي، أقل من عندما تم استخدام الجلوكوز المنقى كمصدر الكربون (4.2 جم / ل و 1 جم / جم، على التوالي ) 10 -
زيلوز هو ثاني أكثر وفرة السكر في الطبيعة بعد الجلوكوز. على عكس الجلوكوز، لا يستخدم بسهولة من قبل معظم الكائنات الحية الدقيقة زيلوز. في هذا مسمارذ، زيلوز استهلكت تماما من قبل K. الرئوية للإنتاج الكيميائي. 2،3-بوتانيديول، R -acetoin، 2-كيتوغلوكونيك حمض، وحامض الزيلونيك كلها المواد الكيميائية قيمة، وعمليات إنتاجها تختلف من ميكرويروبيك إلى الظروف الهوائية للغاية. نتائج التخمير هنا تشير إلى أن السكريات في هدروليزيت الخيزران هي مصادر الكربون المناسبة لنمو K. الرئوية والإنتاج الكيميائي في ظل ظروف مختلفة.
ويعد استخدام هدروليزات الكتلة الحيوية كمواد وسيطة طريقة واعدة لإنتاج المواد الكيميائية. ومع ذلك، لا تزال هناك العديد من أوجه القصور التي يجب التغلب عليها، مثل كمية كبيرة من المياه اللازمة لغسل الكتلة الحيوية سابقة التجهيز وكمية طويلة من الوقت اللازم لتحلل الانزيم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (منحة رقم 21576279، 20906076) وبرنامج مبادرة البحوث كريب (KGM2211531).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| autoclave | SANYO | 3780 | |
| bioreactor | Sartorius stedim biotech | Bostat Aplus | |
| agitator | IKA | RW 20 | |
| water bath shaker | Zhicheng | ZWY-110X50 | |
| high performance liquid chromatograph system | Shimadzu Corp | 20AVP | |
| centrifuge | Hitachi | CR22G III | |
| Bamboo powder | purchased from Zhejiang Province, China | mesh number, 50 | |
| cellulase | Youtell Biochemical, Shandong, China | 200 PFU/mL |
References
- Zeng, A. P., Biebl, H. Bulk chemicals from biotechnology: the case of 1, 3-propanediol production and the new trends. Adv Biochem Eng Biotechnol. 74, 239-259 (2002).
- Wei, D., Wang, M., Jiang, B., Shi, J., Hao, J. Role of dihydroxyacetone kinases I and II in the dha regulon of Klebsiella pneumoniae. J Biotechnol. 177, 13-19 (2014).
- Celińska, E., Grajek, W. Biotechnological production of 2,3-butanediol-current state and prospects. Biotechnol Adv. 27 (6), 715-725 (2009).
- Chen, C., Wei, D., Shi, J., Wang, M., Hao, J. Mechanism of 2, 3-butanediol stereoisomer formation in Klebsiella pneumoniae. Appl Microbiol Biotechnol. 98 (10), 4603-4613 (2014).
- Wei, D., Wang, M., Shi, J., Hao, J. Red recombinase assisted gene replacement in Klebsiella pneumoniae. J Ind Microbiol Biotechnol. 39 (8), 1219-1226 (2012).
- Wei, D., Sun, J., Shi, J., Liu, P., Hao, J. New strategy to improve efficiency for gene replacement in Klebsiella pneumoniae. J Ind Microbiol Biotechnol. 40 (5), 523-527 (2013).
- Chen, C., et al. Inhibition of RecBCD in Klebsiella pneumoniae by Gam and its effect on the efficiency of gene replacement. J Basic Microbiol. 56 (2), 120-126 (2016).
- Wang, D., et al. R-acetoin accumulation and dissimilation in Klebsiella pneumoniae. J Ind Microbiol Biotechnol. 42 (8), 1105-1115 (2015).
- Wei, D., Xu, J., Sun, J., Shi, J., Hao, J. 2-Ketogluconic acid production by Klebsiella pneumoniae CGMCC 1.6366. J Ind Microbiol Biotechnol. 40 (6), 561-570 (2013).
- Sun, Y., et al. Two-stage fermentation for 2-ketogluconic acid production by Klebsiella pneumoniae. J Microbiol Biotechnol. 24 (6), 781-787 (2014).
- Wang, D., et al. Gluconic acid production by gad mutant of Klebsiella pneumoniae. World J Microbiol Biotechnol. 32 (8), 1-11 (2016).
- Wang, C., et al. Production of xylonic acid by Klebsiella pneumoniae. Appl Microbiol Biotechnol. 100 (23), 10055-10063 (2016).
- Kumar, P., Barrett, D. M., Delwiche, M. J., Stroeve, P. Methods for pretreatment of lignocellulosic biomass for efficient hydrolysis and biofuel production. Ind Eng Chem Res. 48 (8), 3713-3729 (2009).
- Brisse, S., Grimont, F., Grimont, P. A. The genus Klebsiella. The Prokaryotes. , Springer. 159-196 (2006).
- Hao, J., Lin, R., Zheng, Z., Liu, H., Liu, D. Isolation and characterization of microorganisms able to produce 1, 3-propanediol under aerobic conditions. World J Microbiol Biotechnol. 24 (9), 1731-1740 (2008).
- Hong, E., et al. Optimization of alkaline pretreatment on corn stover for enhanced production of 1.3-propanediol and 2, 3-butanediol by Klebsiella pneumoniae AJ4. Biomass Bioenerg. 77, 177-185 (2015).
- Pienkos, P. T., Zhang, M. Role of pretreatment and conditioning processes on toxicity of lignocellulosic biomass hydrolysates. Cellulose. 16 (4), 743-762 (2009).
