Summary
O pó de bambu foi pré-tratado com NaOH e hidrolisado enzimaticamente. O hidrolisado de bambu foi utilizado como matéria-prima para ácido 2,3-butanodiol, R -acetato, ácido 2-cetoglucónico e produção de ácido xilónico por Klebsiella pneumoniae .
Abstract
O bambu é uma biomassa importante e o hidrolisado de bambu é usado por Klebsiella pneumoniae como matéria-prima para produção química. Aqui, o pó de bambu foi pré-tratado com NaOH e lavado até um pH neutro. A celulase foi adicionada ao pó de bambu pré-tratado para gerar o hidrolisado, que continha 30 g / L de glicose e 15 g / L de xilose e foi utilizado como fonte de carbono para preparar um meio para produção química. Quando cultivadas em condições microaeróbicas, 12,7 g / L de 2,3-butanodiol foi produzido pelo tipo selvagem K. pneumoniae . Em condições aeróbicas, 13,0 g / L de R- acetona foi produzida pelo mutante BudC de K. pneumoniae . Uma mistura de 25,5 g / L de ácido 2-cetoglucónico e 13,6 g / L de ácido xilónico foi produzida pelo mutante BudA de K. pneumoniae em uma fermentação controlada com pH de dois estágios com alta suplementação com o ar. Na primeira fase de fermentação, a cultura foi mantida a um pH neutro; Após o crescimento celular, a fermentaçãoN prosseguiu para o segundo estágio, durante o qual a cultura foi deixada a tornar-se ácida.
Introduction
Klebsiella pneumoniae é uma bactéria que cresce bem em condições aeróbicas e anaeróbicas. K. pneumoniae é um importante microorganismo industrial usado para produzir muitos produtos químicos. 1,3-propanodiol é um produto químico valioso que é usado principalmente como um monómero para sintetizar tereftalato de politrimetileno. O tereftalato de politrimetileno é um poliéster biodegradável que apresenta melhores propriedades do que o 1,2-propanodiol, o butanodiol ou o etilenoglicol 1 . 1,3-propanodiol é produzido por K. pneumoniae utilizando glicerol como substrato em condições de oxigenação limitada 2 . O 2,3-butanodiol e os seus derivados têm aplicações no domínio dos plásticos, da produção de solventes e da borracha sintética e podem ser utilizados como biocombustíveis 3 . Com a glicose como substrato, o 2,3-butanodiol é o principal metabolito da linhagem 4 do tipo selvagem. 2,3-butanodiol é sintetizadoDe piruvato. Em primeiro lugar, duas moléculas de piruvato se condensam para produzir o a-acetolactato; Esta reação é catalisada pela a-acetolactato sintase. O α-acetolactato é então convertido em acetoin por a-acetolactato descarboxilase. A R- acetona pode ser ainda reduzida ao 2,3-butanodiol quando catalisada pela butanodiol desidrogenase. Um método eficiente de substituição de genes adequado para K. pneumoniae foi explorado, e muitos mutantes foram construídos 5 , 6 , 7 . Um mutante de budC , que perdeu a sua 2,3-butanodiol desidrogenase, acumula níveis elevados de acetoin em caldo de cultura. A aceetona é utilizada como aditivo para aumentar o sabor dos alimentos 8 . Quando BudA , que codifica α-acetolactato descarboxilase, é mutado, o ácido 2-cetoglucônico se acumula no caldo. O ácido 2-cetoglucónico é utilizado para a síntese de ácido eritórbico (ácido isoascórbico), Um antioxidante usado na indústria alimentar 9 . O ácido 2-cetoglucónico é um intermediário da via de oxidação da glicose; Nesta via, localizado no espaço periplásmico, a glicose é oxidada para o ácido glucônico e depois oxidada para o ácido 2-cetoglucônico. O ácido glucónico e o ácido 2-cetoglucônico produzido no periplasma podem ser transportados para o citoplasma para o metabolismo adicional. A acumulação de ácido 2-cetoglucônico é dependente de condições ácidas e uma suplementação aérea mais favorável à produção de ácido 2-cetoglucônico 10 . Gluconato desidrogenase, codificado por gad , Catalisa a conversão de ácido glucônico em ácido 2-cetolgucônico. O mutante gad de K. pneumoniae produziu altos níveis de ácido glucônico em vez de ácido 2-cetoglucônico, e esse processo também depende de condições ácidas. O ácido glucónico é um ácido orgânico a granel e é usado como aditivo para aumentar as propriedades do cimento 11. A oxidação de glicose para o ácido glucónico é catalisada pela glicose desidrogenase. A xilose também é um substrato adequado de glicose desidrogenase. Quando a xilose é utilizada como substrato, K. pneumoniae produz ácido xilónico 12 .
A produção química usando biomassa como matéria-prima é um tema candente na biotecnologia 13 . Os principais componentes da biomassa são celulose, hemicelulose e lignina. No entanto, estes compostos macromoleculares não podem ser catabolizados diretamente pela maioria dos microorganismos (incluindo K. pneumoniae ). A celulose e as hemiceluloses na biomassa devem ser hidrolisadas para glicose e xilose e podem então ser utilizadas por microorganismos. A presença de lignina em lignoceluloses cria uma barreira protetora que impede a hidrolização de biomassa por enzimas. Assim, um processo de pré-tratamento que remove lignina e hemicelulose e reduz a cristalinidade da celulose é sempre realizado durante a utilização da biomassa por microfoneRoorganismos. Muitos métodos de pré-tratamento foram desenvolvidos: pré-tratamentos ácidos, alcalinos, amoníacos e a vapor são comuns.
O bambu é abundante em regiões tropicais e subtropicais e é um importante recurso de biomassa. Aqui, a preparação de hidrolisado de bambu e produção química usando hidrolisado de bambu são apresentados
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Protocol
1. Preparação de hidrolisado de bambu
- Adicione 5 g de pó de bambu a 40 mL de uma solução de NaOH para se obter uma concentração final de 10% (g / g) num balão de 250 mL. Use uma série de soluções de NaOH variando de 0,05 M a 0,50 M em incrementos de 0,05 M.
- Incubar a mistura durante 60 minutos a 60 ° C ou 100 ° C num banho de água. Incubar a 121 ° C em uma autoclave.
- Após a incubação, deixe a mistura em repouso durante 4 horas à temperatura ambiente. Em seguida, retire o sobrenadante. Adicione 100 mL de água fresca e misture.
- Repita esta lavagem 5-6 vezes, até que o pH do sobrenadante atinja 6,8. Use o sólido obtido para o próximo passo de hidrólise enzimática.
- Para hidrólise, ajuste 50 mL da mistura acima a pH 5,0 usando H 2 SO 4 a 98%. Em seguida, adicione 0,5 mL de atividade de papel de filtro 200 (FPU) / mL de celulase.
NOTA: A proporção final de celulase para bambu shSeriam 20 FPU por 1 g de bambu. - Incubar a mistura a 50 ° C por 36 h em um agitador.
NOTA: Após a hidrólise, alguns sólidos permanecerão na mistura. - Obter um hidrolisado claro por centrifugação a 7.690 xg durante 5 min.
- Quantifique a glicose, a xilose e outros produtos químicos com um sistema de cromatografia líquida de alta pressão equipado com um detector de índice de refração e um detector de matriz de fotodiodo. Use uma coluna HPX-87H (300 mm x 7,8 mm) e uma fase móvel de solução 5 mM de H 2 SO 4 a uma taxa de fluxo de 0,8 mL / min 12 .
- Para um grande volume de preparação de hidrolisado, misture 2 kg de pó de bambu e 18 L de NaOH 0,25 M em um tanque de aço inoxidável de 30 L.
- Incubar o tanque a 121 ° C em uma autoclave durante 60 min. Após a incubação, lave a mistura com 40 L de água em um tanque de plástico de 60 L. Repita esta lavagem 5 vezes.
- Use água para ajustar o bambu lavado total a um volume de 20 L.Ajuste o pH da mistura para 5,0 utilizando 98% de H 2 SO 4 .
- Hidrolisar enzimicamente a mistura em um banho de água de agitação modificado, equipado com um agitador mecânico para garantir que a mistura esteja bem distribuída. Adicionar 200 mL de celulase de 200 FPU / mL e incubar a mistura a 50 ° C durante 36 h.
- Após hidrólise, centrifugar a mistura a 4.700 xg durante 10 min.
2. Produção de 2,3-butanodiol por Wildtype K. pneumoniae
- Use 3 L de hidrolisado de bambu como solvente para preparação média.
- Preparar um meio de fermentação contendo 4 g / L de licor íngreme de milho, 2 g / L (NH 4 ) 2 SO 4 , 6 g / LK 2 HPO 4 , 3 g / L KH 2 PO 4 e 0,2 g / L de MgSO4. Ajuste o pH do meio para neutro usando NaOH 2,5 M. Use um biorreator de 5 L contendo 3 L de meio de fermentação autoclavada para fermentação.
- Use K. pneumoniaeCélulas armazenadas em um refrigerador de baixa temperatura de -80 ° C.
- Para a cultura de semente, incubar um balão de 250 mL contendo 50 mL de meio Luria-Bertani (LB) durante a noite a 37 ° C, com agitação a 200 rpm. Use meio LB contendo 10 g / L de triptona, extracto de levedura 5 g / L e NaCl 10 g / L.
NOTA: A densidade celular da cultura de semente deve atingir OD 2 (densidade óptica a 600 nm). - Inocular um balão de 50 mL da cultura de semente no biorreator. Manter a cultura a pH 6,0 e 37 ° C. Use uma taxa de suplementação de ar de 2 L / min e uma taxa de agitação de 250 rpm, criando uma condição microaeróbica.
- Coletar amostras de 5 mL a cada 2 h durante a fermentação e analisá-las com cromatografia líquida de alta pressão para determinar as concentrações químicas no caldo 4 .
- Monitore o álcali adicionado ao biorreator online usando MFCS / DA.
NOTA: Os ácidos orgânicos são produzidos no processo de fermentação, umE adiciona-se NaOH para manter o pH da cultura estável. O volume de álcali adicionado representa a quantidade de ácido produzido. Quando os planaltos de linha alcalina, o processo é concluído, quer por causa do esgotamento da fonte de carbono ou morte celular.
- Monitore o álcali adicionado ao biorreator online usando MFCS / DA.
3. Produção de R- acetona pelo mutante BudC de K. pneumoniae
- Prepare um meio para a produção de acetoinina contendo 4 g / L de licor de milho, 2 g / L (NH4) 2SO4, 3 g / L de acetato de sódio, 0,4 g / L de KCl e 0,1 g / L de MgSO4.
- Use K. pneumoniae-ΔbudC para a produção de R- acetato. Repita as etapas 2.4-2.5.
NOTA: o budC codifica 2,3-butanodiol desidrogenase. K. pneumoniae-ΔbudC perde a atividade de 2,3-butanodiol desidrogenase e produz R- acetona em vez de 2,3-butanodiol. - Manter a cultura a pH 6,0 e 37 ° C. Use uma taxa de suplementação de ar de 4 L / min e uma agitaçãoN taxa de 450 rpm, uma condição aeróbica.
NOTA: A suplementação de oxigênio é maior do que a produção de 2,3-butanodiol. - Ensaiar as amostras como no passo 2.6.
4. Produção de ácido 2-Ketogluconic pelo budA Mutant de K. pneumoniae
- Para a produção de ácido 2-cetoglucônico, use o mesmo meio que a produção de R- acetato.
- Use K. pneumoniae-ΔbudA para produção de ácido 2-cetoglucônico. Repita as etapas 2.4-2.5.
NOTA: budA codifica α-acetolactate descarboxilase. K. pneumoniae-ΔbudA perde a atividade da α-acetolactato descarboxilase e produz ácido 2-cetoglucônico, usando glicose como substrato.
NOTA: a síntese de ácido 2-cetoglucônico é um processo dependente da condição ácida. Uma fermentação em dois estágios foi desenvolvida para a produção de ácido 2-cetoglucônico 10 ; Na primeira fase, a cultura de semente é inoculada no biorreator. - Ensaiar as amostras como no passo 2.6. Usando o hidrolisado de bambu como fonte de carbono.
NOTA: A glicose no meio é convertida em ácido 2-cetoglucônico, e a xilose é convertida em ácido xilônico. Assim, é obtida uma mistura de ácido 2-cetoglucónico e ácido xilónico.
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Representative Results
Neste protocolo, o bambu foi pré-tratado usando álcali. Os parâmetros de incubação ótimos - uma temperatura de 121 ° C e 0,25 M de NaOH - foram determinados nas Figuras 1 e 2 . O bambu pré-tratado foi hidrolisado enzimaticamente e as concentrações de glicose e xilose obtidas no hidrolisado foram medidas. Temperaturas mais altas favoreceram a produção de açúcar, portanto, 121 ° C foi selecionada como a temperatura ideal. A glicose e a xilose produzidas no hidrolisado aumentaram com a concentração de NaOH na faixa de 0,05-0,25 M. Outros aumentos na concentração de NaOH não tiveram efeito positivo na produção de açúcar. Assim, o NaOH a 0,25 M foi selecionado como a concentração ideal.
Figura 1: O efeito da temperatura de pré-tratamento em glicose e xilose conCentração em hidrolisado de bambu. Coluna vermelha: glicose; Coluna azul: xilose. Temperaturas mais altas favoreceram a produção de açúcar e 121 ° C foi selecionado para a preparação de hidrolisado de grande volume. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Figura 2: O efeito da concentração de NaOH utilizada durante o pré-tratamento na concentração de glicose e xilose no hidrolisado de bambu. Linha vermelha: glicose; Linha azul: xilose. A glicose e a xilose produzida no hidrolisado aumentaram com a concentração de NaOH na gama de 0,05-0,50 M e 0,25 M foi selecionado para a preparação de hidrolisado de grande volume. Por favor, clique em elePara ver uma versão maior dessa figura.
Cerca de 20 g / L de glicose e 10 g / L de xilose foram produzidos durante o hidrolisado na hidrólise enzimática à escala do balão; Foram obtidas 30 g / L de glucose e 15 g / L de xilose a partir da preparação de hidrolisado de grande volume. Isso ocorreu porque a preparação em grande volume foi realizada em um agitador de banho de águas abertas, e alguma água evaporada no processo, levando à concentração do hidrolisado. A glicose e xilose no hidrolisado de bambu foram utilizados por K. pneumoniae como fontes de carbono para a produção química. Outros compostos no hidrolisado foram: celobiosa (1,4 g / L), arabinose (8,9 g / L), ácido acético (1,9 g / L) e ácido fórmico (0,2 g / L).
O 2,3-butanodiol foi produzido por K. pneumoniae em condições microaeróbicas ( Figura 3 ). O processo foi dividido em dois períodos. No fPrimeiro, as células utilizaram glicose para produzir 7,6 g / L de 2,3-butanodiol, enquanto o nível de xilose no caldo permaneceu inalterado. A glicose estava exausta às 8 h, e desta vez marcou a mudança para o próximo período. No segundo período, a xilose no caldo foi utilizada pelas células e um adicional de 5,1 g / L de 2,3-butanodiol foi produzido. A produção de 2,3-butanodiol foi mais lenta no segundo período. No final do processo, um total de 12,7 g / L de 2,3-butanodiol foi produzido. Os subprodutos deste processo foram ácido láctico, ácido acético e etanol. O ácido lático e o etanol foram sintetizados principalmente no primeiro período (quando a glicose foi utilizada como fonte de carbono), e o ácido acético foi sintetizado continuamente.
Figura 3: produção de 2,3-butanodiol usando hidrolisado de bambu como matéria-prima. Linha vermelha: glicose; Linha azul: xilose; MaLinha de genta: 2,3-butanodiol; Linha laranja: ácido láctico; Linha preta: ácido acético; Linha verde: etanol. A glucose e a xilose no hidrolisado foram ambas utilizadas para a síntese de 2,3-butanodiol, mas a glicose foi utilizada primeiro, seguida de xilose. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
A R- acetoin foi produzida pelo mutante BudC de K. pneumoniae sob condições aeróbicas ( Figura 4 ). Como na produção de 2,3-butanodiol pela cepa do tipo selvagem, a glucose e depois a xilose foram utilizadas em sequência por K. pneumoniae-ΔbudC . A xilose foi esgotada às 16 h e a taxa de consumo foi mais rápida que a produção de 2,3-butanodiol pelo tipo selvagem. A produção de R- acetato foi de 13 g / L no final do processo, e os subprodutos foram 2,3-butanodiol, ácido acético e eThanol.
Figura 4: Produção de R- acetona utilizando hidrolisado de bambu como matéria-prima. Linha vermelha: glicose; Linha azul: xilose; Linha violeta: acetoin; Linha magenta: 2,3-butanodiol; Linha preta: ácido acético; Linha verde: etanol. A glicose e a xilose no hidrolisado foram ambas utilizadas para a síntese de R- acetona, e seu uso foi em sequência. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
O ácido 2-cetoglucónico e o ácido xilónico foram produzidos pelo mutante budA de K. pneumoniae ( Figura 5 ). Este processo exigiu um suplemento de ar alto. A glicose no meio foi primeiramente convertida em gluconatoIc ácido, que acumulou no caldo. O ácido glucônico atingiu um nível máximo de 15 g / L às 8 h de cultura, e depois disso, sua concentração diminuiu. Não foi produzido ácido 2-cetoglucónico até 6 h na cultura. Foi então sintetizado a uma taxa elevada, e o ácido 25 g / L de 2-cetogluconc foi produzido no final do processo. A xilose no meio foi convertida em ácido xilónico; Esta reação começou mais tarde do que a conversão de glicose para o ácido glucônico. Algum ácido acético foi produzido como um subproduto durante o processo.
Figura 5: ácido ácido 2-ketoglucônico e produção de ácido xilônico usando hidrolisado de bambu como matéria-prima. Linha vermelha: glicose; Linha laranja: ácido glucônico; Linha magenta: ácido 2-cetoglucônico; Linha azul: xilose; Linha preta: ácido acético; Linha verde: etanol. A glicose no hidrolisado foi convertida em ácido glucônicoE foi ainda convertido em ácido 2-cetoglucônico. A xilose no hidrolisado foi convertida em ácido xilónico. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
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Discussion
K. pneumoniae pertence ao gênero Klebsiella na família Enterobacteriaceae . K. pneumoniae é distribuído amplamente em ambientes naturais, como solo, vegetação e água 14 . A cepa de K. pneumoniae de tipo selvagem utilizada nesta pesquisa foi isolada do solo e é usada para a produção de 1,3-propanodiol 15 . K. pneumoniae e os mutantes desta espécie produzem muitos produtos químicos sob diferentes condições.
O pH da cultura eo suplemento de ar são fatores-chave que afetam a produção química por K. pneumoniae . Wildtype K. pneumoniae produz 2,3-butanodiol como principal catabolito a pH 6. No entanto, o ácido 2-cetoglucônico muda para o catabolito principal quando cultivado a pH 5 ou inferior 9 . Aumentar o suplemento de ar diminui a síntese de 2,3-butanodiol, enquanto a síntese de R- acetona é melhorada 8 et al. 16 , que é fácil de realizar no laboratório, especialmente na escala de litros.
Temperaturas de pré-tratamento mais altas favorecem a produção de açúcar durante a hidrólise enzimática. O tratamento a ≤ 100 ° C foi realizado num banho de água e a 121 ° C numa autoclave. Estes dois equipamentos são comuns em laboratórios, e vários litros de líquido foram processados em cada lote. Temperaturas mais altas requerem reatores de alta pressão. Por exemplo, nosso laboratório possui reatores de alta pressão de 50 mL e 1-L, mas os volumes desses reatores limitam seu uso durante os pré-tratamentos de biomassa.
A preparação de hidrolisado de bambu mostrada nesta pesquisa foi fácil de realizar em frascos. No entanto, quando feito em grande volume, obtiveram-se, por vezes, níveis mais baixos de glicose e xilose. A mistura de hidrólise deve estar bem distribuída. A precipitação da biomassa levaria a menores níveis de hidrólise.
Ao contrário da glicose pura e da xilose, o hidrolisado de biomassa é contaminado por muitos produtos químicos tóxicos que podem inibir o crescimento de microorganismos. Muitos métodos foram desenvolvidos para remover esses inibidores, mas aumentam os custos do processo e tendem a reduzir os rendimentos do açúcar 17 . Nesta pesquisa, nenhum trabalho especial foi feito para remover inibidores. Utilizando o hidrolisado de bambu gerado neste trabalho como matéria-prima, a produtividade (0,95 g / Lh) e a razão de conversão (0,25 g / g) de glicose para 2,3-butanodiol durante a primeira fase, quando a glicose foi consumida, foram menores Do que quando a glicose purificada foi utilizada como fonte de carbono, relatada anteriormente (1,4 g / Lh e 0,3 g / gm, respectivamente) 4 . A produtividade de 2,3-butanedDurante a segunda etapa, quando a xilose foi consumida, foi mais lenta do que na primeira etapa. No entanto, a razão de conversão de xilose em 2,3-butanodiol atingiu 0,34 g / g, o que foi maior do que quando a glicose purificada foi utilizada como fonte de carbono 4 . A produção de R- acetona utilizando o hidrolisado de bambu como matéria-prima teve proporções de conversão de produtividade e substrato de 0,92 g / Lh e 0,29 g / g, respectivamente. Ambas as razões foram menores do que quando a glicose purificada foi utilizada como substrato (1,7 g / Lh e 0,34 g / g, respectivamente) 8 . A produtividade e a razão de conversão do ácido 2-cetoglucônico neste estudo foram 2,3 g / Lh e 0,91 g / g, respectivamente, menores que quando a glicose purificada foi utilizada como fonte de carbono (4,2 g / Lh e 1 g / g, respectivamente ) 10 .
A xilose é o segundo açúcar mais abundante na natureza após a glicose. Ao contrário da glicose, a xilose não é facilmente utilizada pela maioria dos microorganismos. Neste studY, a xilose foi totalmente consumida por K. pneumoniae para produção química. 2,3-butanodiol, R -acetato, ácido 2-cetoglucónico e ácido xilónico são todos produtos químicos valiosos, e seus processos de produção variam de condições microaeróbicas a altamente aeróbicas. Os resultados da fermentação aqui indicam que os açúcares no hidrolisado de bambu são fontes de carbono adequadas para crescimento de K. pneumoniae e produção química sob diferentes condições.
O uso de hidrolisado de biomassa como matéria-prima é um método promissor para a produção química. No entanto, ainda existem muitas deficiências que devem ser superadas, como a grande quantidade de água necessária para lavar a biomassa pré-tratada e o longo tempo necessário para a hidrólise enzimática.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (Grant No. 21576279, 20906076) e o Programa de Iniciativa de Pesquisa KRIBB (KGM2211531).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| autoclave | SANYO | 3780 | |
| bioreactor | Sartorius stedim biotech | Bostat Aplus | |
| agitator | IKA | RW 20 | |
| water bath shaker | Zhicheng | ZWY-110X50 | |
| high performance liquid chromatograph system | Shimadzu Corp | 20AVP | |
| centrifuge | Hitachi | CR22G III | |
| Bamboo powder | purchased from Zhejiang Province, China | mesh number, 50 | |
| cellulase | Youtell Biochemical, Shandong, China | 200 PFU/mL |
References
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