Summary
Caractériser le fonctionnement des récepteurs odorants sert un élément indispensable dans le processus de deorphanization. Nous décrivons une méthode permettant de mesurer l’activation des récepteurs odorants en temps réel à l’aide d’un test de cAMP.
Abstract
La taille énorme des familles mammifères odorant du récepteur (OR) présente des difficultés à trouver leurs ligands apparentés parmi de nombreux produits chimiques volatils. Pour efficacement et précisément deorphanize ORs, nous combinons l’utilisation d’une lignée de cellules hétérologues d’exprimer les mammifères ORs et un plasmide génétiquement modifié biocapteur permettant de mesurer la production d’AMPc en aval de l’activation d’OR en temps réel. Ce test peut être utilisé pour écran odorisants contre ORs et vice versa. Interactions positives odorant-récepteur à partir des écrans peuvent être confirmées par la suite en testant contre diverses concentrations d’odeurs, générant des courbes concentration-réponse. Ici, nous avons utilisé cette méthode pour effectuer un criblage à haut débit d’un composé odorant contre une bibliothèque OR humain exprimés dans les cellules Hana3A et a confirmé que le récepteur répond positivement est le récepteur apparenté du composé d’intérêt. Nous avons trouvé cette méthode de détection de haut débit pour être efficaces et fiables pour évaluer l’activation de l’OR et nos données fournissent un exemple de son utilisation possible dans les études fonctionnelles d’OR.
Introduction
Le sens de l’odorat joue un rôle important dans la survie des animaux qu’ils comptent sur leurs capacités olfactives pour procurer de la nourriture, éviter les prédateurs et le danger, distinguer les espèces et sélectionnez mate1,2. La réalisation de ces fonctions dépend les récepteurs odorants (RUP), qui sont exprimés individuellement à la surface ciliaire des neurones sensoriels olfactifs (OSNs) située dans l’épithélium olfactif (OE). SRO constitue la plus grande famille de la superfamille des récepteurs (GPCR) G-protéine a couplé avec environ 400 et 1200 divers OR gènes chez les humains et les souris, respectivement3,4,5. RUP activé par odorisants conduire à une augmentation taux d’AMPc intracellulaires via l’activation séquentielle d’olfactif G-protéine (Golf) et tapez III l’adénylyl cyclase (ACIII). L’augmentation qui en résulte du niveau d’AMPc intracellulaire pourrait fonctionner comme un second messager, qui ouvre le canal de nucléotides bloquées sur la surface des cellules, provoquant l’afflux des cations dont Ca2 + et les potentiels d’action et le lancement en fin de compte neuro-potentiel transmission et perception olfactive. Le processus de détection et de discrimination un grand nombre de substances odorantes par ORs est considéré comme la première étape de la perception olfactive6,7.
Étant donné que Buck et Axel8 tout d’abord avec succès cloné récepteurs odorants et élucidé le mécanisme de la perception olfactive initiée par ORs, deorphanization de la famille de l’OR est devenu l’un des points chauds dans ce domaine. Diverses méthodes in vivo, ex vivo et in vitro pour mesurer l’activation de l’OR ont été déclarés9,10,11,12. Une méthode traditionnelle utilisée Ca2 + imagerie suivie de single-cell RT-PCR sur OSNs permis l’identification de différents ORs à aliphatiques composés malodorants13,14,15. Plus récemment, l’avènement des analyses à grande échelle transcriptome a favorisé le développement de méthodes plus haut débit en vivo . Le dosage de Kentucky identifié souris eugénol et muscone-favorisant l’ORs avec l’utilisation de la S100a5-tauGFP journaliste souris souche et microarray analysis9. Selon la diminution des niveaux d’ARNm de l’OR après exposition odorant, la technologie de rêve employé une approche transcriptomique afin de déterminer les profils activation OR dans les deux espèces de vertébrés et non-vertébré16. De même, compte tenu de la phosphorylation de S6 activations neuronales, la Matsunami groupe séquencée ARNm de ribosome phosphorylés immunoprécipitation pour identifier les réactifs ORs12. Enfin, le groupe Feinstein a rapporté souris super renifleur qui pourraient servir de plate-forme pour étudier l’odeur codage en vivo, connu comme la technologie de MouSensor17.
Dans le domaine in vitro , le défi de la mise en culture OSNs a fait un système d’expression hétérologue qui imite ou expression fonctionnelle in vivo une solution idéale pour effectuer un dépistage à grande échelle de produits chimiques odorantes pour ORs. Néanmoins, étant donné que les lignées de cellules cultivées d’origines non-olfactifs diffèrent des OSNs natifs, ou protéines sont conservées dans le réticulum endoplasmique et incapable de faire le trafic vers la membrane plasmique, entraînant perte de récepteur fonction18 et la dégradation de l’OR , 19. pour résoudre ce problème, importants travaux ont été faits pour répliquer l’expression fonctionnelle d’OR sur la membrane cellulaire dans les lignées cellulaires hétérologue. Krautwurst et coll. d’abord attaché les 20 premiers acides aminés de la rhodopsine (Rho-tag) à la N-terminale de la protéine de l’OR et cela favorisé l’expression de la surface cellulaire de certains ORs de cellules humaines embryonnaires de rein (HEK)20. En procédant à une analyse en série de (SAGE) Bibliothèque analyse l’expression génique de OSNs unique, Saito et al. tout d’abord cloné transportant des récepteurs protéiques (RTP) membres de la famille, RTP1 et RTP2 et la protéine réceptrice de l’enrichisseur expression 1 (REEP1) qui a facilité le trafic d’OR à la membrane cellulaire et améliorés de réponses véhiculées par les odorants des RUP dans les cellules HEK293T 21. se fondant sur ces constatations, le groupe Matsunami réussi à établir la lignée de cellules Hana3A, stablement transfected avec RTP1, RTP2, REEP1 et Gαolf dans HEK293T et transitoirement transfectées avec ORs Rho-tag, efficaces ou fonctionnels expression. Les études ont révélé 1) une forme plus courte de RTP1, RTP1S, qui pourrait plus fermement favorisent ou fonction que la protéine originale de RTP1 et 2) le récepteur muscarinique de l’acétylcholine, type 3 (M3R) qui pourrait augmenter l’activité d’OR par l’intermédiaire de l’inhibition de la β-arrestine-2 recrutement, qui ont été introduits dans le système d’expression hétérologue pour optimiser expérimental sortie22,23.
Plusieurs méthodes de détection ont été utilisés pour quantifier l’activation des récepteurs dans les systèmes hétérologues. Le dosage de la phosphatase alcaline placentaire sécrétées (SEAP) travaille avec une enzyme de journaliste transcriptionnellement réglementée par des éléments de réponse de l’AMPc (CREs), ce qui en fait une option intéressante pour évaluer l’activation de l’OR. La fluorescence est facilement détectée dans un échantillon de milieu de culture après l’incubation avec SEAP détection réactif24. En utilisant cette méthode, les fonctions d’ORs comme une classe secondaire des récepteurs chemosensoriels exprimée dans la trace de OE-les récepteurs associés à amine (TAARs) ont été caractérisent25,26,27. Une autre méthode courante, le dosage de la luciférase, utilise un gène rapporteur luciférase de firefly sous le contrôle de l’élément de réponse de l’AMPc (CRE). Luminescence générée par la production de la luciférase procure un moyen efficace et robuste de quantifier OR activation10,11,28.
Des tests en temps réel de cAMP aussi sont sont répandues dans la surveillance dynamiquement la fonction des RCPG hétérologues ou endogènes. Un exemple de ces tests avancés tire parti d’une variante de biocapteur génétiquement codé, qui possède un domaine de liaison au cAMP fusionné à une forme mutante de la luciférase. Lorsque le cAMP se lie, le changement conformationnel aboutit à l’activation de la luciférase, luminescence d'où peut ensuite être mesurée avec un lecteur de chimiluminescence29,30. La technologie en temps réel de cAMP a été signalée pour l’orphelin hors des récepteurs de l’odeur humaine dans les cellules HEK293 et NxG de 108CC15âne = « xref » > 31,32,33, ainsi que dans le Hana3A dérivé de HEK293T cellules34,35. Le groupe Krautwurst a également décrit en détail la technologie cAMP en temps réel afin de convenir aux bi-directionnel à grande échelle ou la projection des approches32,33.
Nous décrivons ici un protocole permettant de mesurer l’activation d’OR à l’aide d’un essai en temps réel de cAMP dans les cellules Hana3A. Dans ce protocole, la luminescence des cellules vivantes préalablement équilibrés est cinétiquement mesurée pendant 30 min après le traitement par certains composés volatils, ce qui représente une analyse plus efficace et plus précise de l’activation d’OR qui sont moins sensibles aux artefacts qui se produisent dans l’environnement cellulaire avec temps prolongé et la toxicité cellulaire induite par l’odeur. Cette mesure en temps réel permet un dépistage à grande échelle des ORs et des ligands, ainsi que la caractérisation des paires d’OR-ligand spécifiques d’intérêt. En utilisant cette méthode, nous avons avec succès identifié OR5AN1 comme le récepteur de la muscone composés de musc en réalisant une projection contre 379 ORs humaines et en confirmant par la suite le résultat du dépistage positif.
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Protocol
1. Culturing et Maintenance des cellules Hana3A
- cellules de maintenir dans 10 mL de milieu essentiel minimum (MEM) avec 10 % sérum bovin fœtal (SVF), 100 µg/mL la pénicilline-streptomycine et 1,25 µg/mL amphotéricine B dans un 100 mm boîte de Petri de cellules dans un incubateur de culture cellulaire de 37 ° C avec 5 % de CO 2. Avec chaque autre passage, ajouter 1 puromycine µg/mL pour maintenir la transfection stable des plasmides (voir Introduction).
Remarque : Effectuez toutes les étapes de culture cellulaire dans une classe II hotte biologique de sécurité afin d’assurer un environnement stérile. - Sous-culture à un ratio de 10 à 20 % dans les 100 mm plats tous les jours 2-3.
2. Placage de cellules pour la Transfection
- observer les cellules de Hana3A sous un microscope à contraste de phase pour assurer la viabilité des cellules et d’estimer confluent.
- Aspirer tous les moyen de la boîte de Petri cell.
- Laver les cellules en ajoutant 10 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sur la plaque, agitant le plat et aspirer le PBS.
- Ajouter 3 mL de 0.05 % trypsine-acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA) sur la plaque. Mélanger pendant 1 min ou jusqu'à ce que toutes les cellules sont à flot.
Remarque : Observer l’évolution de cellules détacher le fond de la plaque sous le microscope comme nécessaire. - Désactiver la trypsine en ajoutant 5 mL de MEM avec 10 % FBS et pipette up et down pour briser les morceaux de cell Mass
Remarque : Pour l’électrodéposition avant la transfection, le support utilisé ne doit pas contenir antibiotiques. Ajout d’antibiotiques peut-être diminuer l’efficacité de transfection. - Transférer une quantité appropriée de cellules dans un tube de mLl-15 selon le nombre de plaques à transfecter. Pour chaque plaque à 96 puits, plaque 2 x 10 6 cellules ou environ 1/5 d’un plat de confluentes 100 mm 100 %, ce qui donne un nombre de cellules de 2 x 10 4 cellules par puits ou d’une densité d’environ 15 à 30 % confluence / puits. Centrifuger les tubes à 200 x g pendant 5 min et aspirer le surnageant sans déranger le culot cellulaire.
Remarque : Calculer le montant exact des cellules pour être ensemencés sur des plaques de 96 puits afin d’éviter les recouvrant ou undergrowing des cellules avant stimulation. - Ajouter une quantité appropriée de MEM avec 10 % FBS dans le 15 mL tube et Pipeter de haut en bas pour briser les morceaux de la cellule de masse. Pour chaque plaque à 96 puits, remettre en suspension les cellules avec 6 mL de MEM avec 10 % BF.
Remarque : Veillez à ne pas à générer des bulles d’air dans le tube. - Ajouter les cellules en suspension dans un réservoir. À l’aide d’une pipette multicanaux, pipette 50 µL de cellules sur chaque puits d’une plaque de 96 puits. Incuber une nuit à 37 ° C, avec 5 % de CO 2.
3. Transfection des plasmides
- avant la transfection, observer les cellules plaqués pour assurer une bonne confluence d’environ 30 à 50 % par puits sous un microscope à contraste de phase et de revenir à l’incubateur.
- Préparer à l’avance la Rho-tag OR construct 11 , 21 , 22 , 28, le facteur accessoire construit (RTP1S 22 , 36 et M3R 23), et la variante de biocapteur construire 29 , 30 par miniprep. Quantifier la concentration d’ADN par un spectrophotomètre et ajuster des concentrations d’ADN plasmidique (par exemple, à 100 ng/µL) avec de l’eau distillée si nécessaire.
- Préparation des mélanges de la Transfection
- prépare un mélange de transfection de plasmide dans 500 µL de MEM pour chaque plaque de 96 puits selon le tableau 1.
Remarque : Lorsque différents ORs sont testés sur la même plaque 96 puits, le volume de la mélange de transfection et la quantité d’ADN ajouté plasmidique doit être adapté en fonction du nombre de puits transfectées avec un donné ou. - Préparer un mélange de transfection dans un tube avec 18 µL de réactif de transfection de médiation lipidique dans 500 µL de MEM.
- prépare un mélange de transfection de plasmide dans 500 µL de MEM pour chaque plaque de 96 puits selon le tableau 1.
- Mélanger le mélange de plasmide avec le mélange de transfection par pipetage de haut en bas. Incuber à température ambiante pendant 15 min.
- Arrêter la réaction en ajoutant 5 mL de MEM avec 10 % BF.
- Étalé une épaisse couche d’essuie-tout stérile dans la hotte de la culture cellulaire. Prendre une plaque à 96 puits avec des cellules de l’incubateur. Doucement et à plusieurs reprises Appuyez sur la plaque à l’envers sur la pile de papier essuie-tout afin que le milieu est complètement absorbé par le papier absorbant.
Remarque : Ne pas avec force ou brusquement taper la plaque comme on pourrait perdre des cellules. - Transférer 50 µL du mélange combiné transfection dans chaque puits de la plaque à 96 puits et incuber pendant la nuit pendant 18 à 24 heures à 37 ° C, avec 5 % de CO 2.
Remarque : Un calendrier de transfection et stimulation temps géré doit précéder la mesure lorsque plus d’une plaque à 96 puits sont testés dans une expérience afin d’avoir toutes les plaques mesurées après la transfection fois et le temps de pose stimulation.
4. Stimulation et instruments de mesure ou activité à l’aide du test de cAMP en temps réel
- observer les cellules transfectées sous un microscope à contraste de phase pour assurer une bonne confluence de 50 à 80 % par puits et revenir à l’incubateur.
- Préparer le moyen de stimulation en ajoutant 10 mM hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acide (HEPES) et 5 mM de glucose à Hank ' s Balanced Salt Solution (HBSS).
- Décongeler les aliquotes de réactif de substrat essai cAMP en temps réel sur la glace. Réactif de substrat de magasin à-80 ° C à 55 µL par tube en tubes PCR. Utiliser 1 tube par plaque.
- Préparer 2 % solution de l’équilibration en mélangeant 55 µL de réactif au substrat et 2750 µL de solution de glucose/HEPES/HBSS.
- Étalé une épaisse couche de papier absorbant sur le banc. Doucement et à plusieurs reprises Appuyez sur la plaque à l’envers sur du papier absorbant afin que le milieu de la transfection est complètement absorbé par le papier absorbant.
- Laver les cellules par pipetage 50 µL de solution de HBSS/HEPES/glucose dans chaque cupule.
- Taper doucement et à plusieurs reprises la solution HBSS/HEPES/glucose de la plaque à 96 puits.
- Pipette 25 µL de solution d’équilibration de 2 % à chaque puits et incuber à température ambiante dans l’obscurité pendant 2 h.
- Préparer à l’avance de 1 M de solutions odorant dans le DMSO et conserver à-20 ° C jusqu'à ce que.
- Avant la fin de la période d’incubation, diluer les solutions mères odorant à des concentrations de travail en milieu de stimulation HBSS/HEPES/glucose.
Remarque : Les concentrations des dilutions odorant préparées dans cette étape doivent être doublées pour obtenir les concentrations finales correctes dans chaque puits. - à l’aide d’une chimiluminescence lecteur et avant l’ajout de la substance odorante, mesurer le niveau de luminescence basale de la plaque pour 2 fois de suite à un taux de 1000 ms par bien 34.
- Rapidement retirer la plaque du lecteur plaque et ajouter des dilutions de substance odorante 25 µL à chaque puits et commencer immédiatement la mesure de la luminescence continue de tous les puits pendant 20 cycles dans les 30 min.
NOTE : Pipette avec précaution pour éviter de contaminer les voisins puits lors de l’utilisation de différentes substances odorantes et/ou des concentrations différentes de la même odorisants dans la même assiette.
5. Analyse des données
- Exporter les données depuis le logiciel de lecteur de plaque chimiluminescence.
- Calculer normalisé réponse OR pour chaque point de temps à l’aide de la formule
(luminescence N – luminescence basale) / (luminescence plus haut – luminescence basale)
où N = valeur de la luminescence d’un certain bien ; basal = valeur moyenne luminescence des deux basales valeurs de la luminescence ; plus haut = valeur la plus élevée luminescence d’une plaque ou un ensemble de plaques.
Remarque : Selon le but de l’expérience, autres représentations graphiques peuvent être adoptées. Par exemple, pour le dépistage des essais (voir Figure 1) et pour générer des courbes concentration-réponse, la valeur de la luminescence d’un certain puits à un point de temps désirée pendant la mesure cinétique, telles que la valeur maximale ou la le montant final, peut être utilisé.
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Representative Results
Muscone est le principal composant aromatique du musc naturel. Récentes études OR5AN1 identifié comme un récepteur humain pour muscone et autres composés de musc macrocycliques issus d’homologie avec la souris ou, MOR215-1, clonée à partir des glomérules muscone réagissant en comportement souris37,38. En sélectionnant le répertoire OR humain, notre groupe et le groupe Touhara également identifié OR5AN1 comme un récepteur majeur pour deux macrocycles composés de musc, cyclopentadecanone et muscone, respectivement, à l’aide de la luciférase test système38,39 .
Utilisant le test de cAMP en temps réel décrit ici, nous avons projeté le répertoire OR humain contre 30 µM muscone (Figure 1). Parmi les 379 RUP humains projetés, OR5AN1 a émergé avec une réponse importante à muscone, tandis que les autres les ORs et les témoins négatifs (contrôle non-odeur et le contrôle de vecteur vide) ne montrent pas une réponse significative. Le contrôle positif a testé OR5AN1 contre 30 µM musc mesure, un ligand pour OR5AN1 (données non publiées) et a été utilisée pour normaliser la muscone en faveur des RUP. Pour la représentation graphique de ce jeu de données, nous avons choisi le point de temps lors de la lecture de luminescence maximale a été enregistrée par OR5AN1 contre 30 µM mesure de musc.
Nous avons ensuite examiné la relation concentration-effet de l’odeur-paire d’OR avec 3 concentrations différentes de muscone. Pour chaque concentration de muscone testé, pendant les 20 premières min après addition de la muscone, la réponse de OR5AN1 augmente progressivement et puis atteint un plateau dans les 10 dernières min (Figure 2 a), alors que la trace pour le contrôle non-odeur addition (0 µM muscone) est restée relativement plat. Des concentrations plus élevées de la muscone évoquée par des réponses de OR plus forts que les inférieures, qui se distingue tout au long de la mesure. En utilisant le dernier point de temps de la mesure cinétique, nous avons généré une courbe dose-réponse et la concentration de 50 % de la valeur de l’effet maximal (EC50) de la courbe est estimée à 20,82 µM (Figure 2 b).
Figure 1 : Dépistage des ORs humaines de muscone.
379 ORs humaines uniques ont été projetés contre 30 µM muscone utilisant l’analyse en temps réel de cAMP. Couleur des blocs le long de la x-axe indiquent différentes familles d’OR humains. Chaque colonne sur le x-axe représentant un seul type d’OR sauf pour les trois dernières colonnes, qui sont la réponse de OR5AN1 à 30 µM musc mesure (un témoin positif), la réponse de OR5AN1 à la solution de HBSS/HEPES/glucose (un contrôle négatif non-odeur), et la réponse de Rho-pCI à 30 µM muscone (témoin négatif un vecteur vide), de gauche à droite. y-axe représente luminescence normalisée à 30 min après l’addition de la substance odorante quand la réponse a atteint son maximum pour le contrôle positif (N = 3). Toutes les réponses sont normalisées au témoin positif. Barres d’erreur représentent la moyenne de l’écart-type (SEM). Pour plus de clarté, seule erreur positive barres s’affichent. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Mesures cinétiques de la réaction de OR5AN1 à muscone.
(A) en temps réel mesures d’activation de OR5AN1 par muscone de différentes concentrations et un témoin négatif non-odeur ont été effectuées dans les 30 minutes d’addition odorant. Flèche indique le point de temps d’ajout de la substance odorante. B courbe concentration-réponse de OR5AN1 contre muscone à 30 min après l’addition de la substance odorante. y-axes représentent luminescence normalisée (N = 3). Toutes les réponses sont normalisées à la réponse plus haute à 100 µM muscone. Barres d’erreur représentent SEM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Plasmide | Montant par plaque à 96 puits (µg) |
| Rho- ou | 5 |
| RTP1S | 1 |
| M3R | 0,5 |
| variante de biocapteur cAMP | 1 |
Tableau 1 : Composantes du mélange transfection.
Par quantité de plaque à 96 puits de la Rho-OR, RTP1S, M3R et les plasmides variant de biocapteur cAMP en temps réel.
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Discussion
Mesurer avec exactitude l’activation de l’OR après une exposition à une certaine substance odorante est la première étape en déchiffrant le codage de l’information olfactive. Les expériences montré dans cet étude représentent qu'un exemple de la façon dont on peut identifier, en utilisant un in vitro système d’expression OR, ORs sensibles parmi le répertoire OR humain pour la substance odorante d’intérêt et ensuite caractériser les récepteurs pharmacologie à l’aide de différentes concentrations du produit chimique. Nos résultats confirment les OR5AN1 comme un récepteur de bona fide de la muscone. Cela est conforme à un précédent rapport39 et fournit des preuves supplémentaires de la spéculation que seul un petit nombre de récepteurs est impliqué en sentant le musc odeur27,40. En comparaison avec les données de dépistage de Sato-Akuhara et coll. qui est généré par l’analyse de luciferase sur un système d’expression hétérologue ou similaires, nos résultats de dépistage ont montré légèrement pire ratio signal-bruit. Outre les variations inhérentes aux différentes techniques impliqués, la différence dans le résultat pourrait être dû au fait que nous avons utilisé une concentration plus faible de la muscone (30 µM et 100 µM). En fait, la valeur de la courbe concentration-réponse de OR5AN1 contre muscone que via l’analyse en temps réel de cAMP, nous avons obtenu les50 ce est dans le même ordre de grandeur que celui que Sato-Akuhara et coll. obtenu dans leur système de dosage de luciférase, démonstration des résultats comparables pour le même hétérologue OR système d’expression même quand les méthodes de détection différentes sont utilisées. Dans une autre étude, notre groupe a trouvé que le système des camps en temps réel peut être légèrement plus sensible que le système de gène rapporteur luciférase pour apprécier la sélectivité OR2T11, étant donné qu’un nombre restreint de substances odorantes étaient actif uniquement dans l’ancien, mais pas dans ce dernier système35. En comparaison avec la série des données rapportées par ghxgvhgh et al. 31 sur OR1A1 contre (+)-carvone, nos données sur OR5AN1 contre muscone a montré un retard dans le temps nécessaire pour atteindre le plateau qui peut-être en résulter directement les différentes sortes d’ORs et des composés malodorants utilisé. Dans d’autres données d’essai en temps réel de cAMP signalées dans notre groupe, nous avons également montré que des heures de pointe selon l’ORs et des composés malodorants34,35. En outre, différentes lignées cellulaires utilisées pour exprimer des ORs, différente substrat utilisé, les variantes plasmides différents biocapteurs cAMP en temps réel, une sensibilité différente du lecteur de plaques de chimiluminescence, et/ou des conditions expérimentales différentes, comme la variation de température de la pièce, tous pourraient contribuer aux variations de la sortie de la luminescence.
L’analyse en temps réel de cAMP présente plusieurs avantages par rapport aux autres méthodes permettant de mesurer l’activation de l’OR. Tout d’abord, similaire à l’analyse de gène de journaliste luciferase, l’analyse en temps réel de cAMP constitue un moyen supplémentaire en vitro d’identification haut débit des répertoires OR répondant aux substances odorantes. Les écrans récepteurs et/ou odorantes à grande échelle par l’analyse en temps réel de cAMP peuvent offrir une grande quantité d’informations sur les récepteurs-odeur appariement à l’aide d’un petit nombre de plaques. Quand avancé luminomètres et robots de pipetage sont disponibles, le protocole de 96 puits décrit ici peut être facilement amélioré à un format de 384 puits, dans lequel encore moins l’ADN plasmidique et réactifs sont nécessaires par unité de production de données. Deuxièmement, la méthode en temps réel de cAMP est capable de mesurer les changements dans la concentration intracellulaire d’AMPc en temps réel. Alors que la plupart des essais utilisés pour mesurer l’activité d’OR à ce jour sont fluorescence ou chimiluminescence dotés d’endpoint détection nécessitant une lyse cellulaire, le cAMP en temps réel de dosage isimplemented dans des conditions non-lytique, cellules vivantes qui sont plus proches de l’endogène situation et permettre un suivi des changements dans les taux d’AMPc. En troisième lieu, une durée relativement courte est nécessaire pour exécuter la méthode en temps réel. Une autre méthode d’analyse de haut-débit de fonction ou, qui repose sur une expression du gène rapporteur luciférase, a besoin de 4 h supplémentaires après la stimulation de l’odeur pour terminer une expérience. Dans certains cas, peut entraîner un intervalle d’incubation prolongée odeur odeur toxicité potentielle aux cellules, qui est effectivement atténuée sous exposition transitoire. En outre, dans les expériences de plus longue durée, les risques de contamination des puits voisins par volatilisation lors de l’utilisation de différentes substances odorantes et/ou différentes concentrations de la substance odorante même dans la même assiette sont aussi augmentés. Détection immédiate après l’addition de l’odeur fait l’essai en temps réel de cAMP un paradigme rapid et fiable.
Les limites du cAMP en temps réel d’analyse pour mesurer ou activation se présente comme suit. Tout d’abord, notre essai in vitro est issu d’une lignée de cellules HEK293T dérivé qui ne dispose pas de beaucoup de molécules endogènes des neurones sensoriels olfactifs natives. En outre, les protéines solubles et enzymatiques conversions qui se produisent dans le mucus nasal peuvent se lient aux substances odorantes et/ou influencer l’affinité de l’OR pour les substances odorantes. Par conséquent, activation du système hétérologue peut différer de la situation in vivo en termes de sensibilité et l’optimisation des odeurs. Deuxièmement, l’identification de SRO pour une substance odorante donnée exige un répertoire entier d’OR d’au moins une espèce donnée. SRO est une grande famille des RCPG et le nombre de protéines d’OR chez les humains et les souris sont très gros4,5,41. Beaucoup de temps et d’effort peuvent être impliqués dans le clonage chaque répertoire d’OR d’intérêt. Troisièmement, même si le système d’expression hétérologue OR inclut OR séquence modifications (par exemple, la balise de Rho) et quelques-unes des protéines clés ou accessoires (tels que RTP1S et M3R), nous soupçonnons que pas tous les ORs sont fonctionnellement exprimés sur la membrane cellulaire de la Cellules HEK293T dérivées. Par conséquent, l’absence de réponses à un certain odorisant in vitro n’empêche pas nécessairement ou réponse en vivo, dû au fait que certains ORs n’est peut-être mal exprimée à la surface cellulaire et incapables de reconnaître leurs ligands. Ainsi, chaque fois que possible en temps réel cAMP devrait être utilisé en conjonction avec d’autres dosages in vitro et in vivo pour obtenir des résultats plus probants.
Plusieurs étapes critiques il faudrait plus d’attention au cours de l’essai en temps réel de cAMP. Tout d’abord, pour des expériences impliquant la luminescence en général, la température est un facteur clé qui affecte le résultat de l’expérience que les hausses de température abaisse basales et induits des niveaux de rendement lumineux et baisses de température augmentent rendement lumineux. Donc, l’équilibration les plaques à la température de fonctionnement stationnaire de l’anémomètreNT avant addition odorant est nécessaire pour éviter l’influence sur les résultats dus aux changements de température. Deuxièmement, la concentration du réactif en temps réel test cAMP substrat doit être ajustée selon la situation réelle. Lorsque la luminescence basale ne parvient pas à atteindre le seuil de détection le plus bas du lecteur de plaque chimiluminescence, on devrait considérer augmenter les concentrations de substrat pour augmenter le signal. Enfin, en dépit d’être une lignée de cellules adhérentes, Hana3A cellules peuvent se détacher pendant l’expérience. Lors de l’aspiration ou ajouter du médium, placer les pointes de pipette sur le côté du puits peut minimiser les perturbations de la monocouche cellulaire. Il est également important de plaque dans une densité adéquate et uniforme pour éviter l’envahissement des cellules sous forme de taches denses de cellules, les cellules ont tendance à décoller pendant le changement de milieu.
En plus d’identifier OR(s) pour une substance odorante d’intérêt, l’analyse en temps réel de cAMP peut également être utilisé pour dépister les ligands apparentés pour une opération donnée OR lorsque des bibliothèques de produits chimiques sont disponibles. Enfin, lorsqu’on utilise les types de cellule appropriée et des conditions de transfection, le test peut également permettre la détection d’activation de GPCR surexprimée ou endogène et donnent des courbes de réponse dépendante de la concentration des agonistes et des antagonistes.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Le travaux ont été subventionnés par la Chinese National Science Foundation (31070972), la Science et la technologie Commission of Shanghai Municipality (16ZR1418300), le programme novateur recherche équipe de Shanghai Municipal Education Commission, le Shanghai Eastern Scholar Program (J50201) et le Programme National de recherche fondamentale de la Chine (2012CB910401).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| FBS | Gibco | 10099-141 | |
| GloSensor cAMP reagent | Promega | E1290 | |
| pGloSensor-20F cAMP plasmid | Promega | E1171 | |
| Hana3A cells | available from authors upon request | ||
| HBSS, without calcium or magnesium | GIBCO | 14175095 | |
| HEPES | Hyclone | SH30237 | |
| Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| M3R plasmid | cloned into a mammalian expression vector such as pCI | ||
| MEM, with EBSS and L-glutamine | Hyclone | SH30024 | |
| Muscone | Santa Cruz | sc-200528 | |
| Musk tibetene | Sigma-Aldrich | S359165 | |
| OR plasmids | cloned with a Rho-tag into a mammalian expression vector such as pCI | ||
| PBS, without calcium or magnesium | Cellgro | 21-040-CV | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| Plasmid miniprep kit | Tiangen | DP103-03 | |
| Puromycin | Sigma | P8833 | |
| RTP1S plasmid | cloned into a mammalian expression vector such as pCI | ||
| Trypsin-EDTA | Hyclone | SH30236 | |
| 0.2-mL PCR tube | Axygen | PCR-02-C | |
| 1.5-mL Eppendorf tube | Eppendorf | ||
| 15-mL 17 mm x 120 mm conical tube | BD Falcon | 352096 | |
| 8-well and/or 12-well multichannel pipetman | Eppendorf | ||
| 96-well flat-bottomed white cell culture plate | Greiner | 655098 | |
| 100 mm x 20 mm cell culture dish | BD Falcon | 353003 | |
| Class II biological safety cabinet with laminar flow | |||
| Cell culture incubator, with 5% CO2 | |||
| Centrifuge, with swinging bucket rotor for 15-ml conical tubes | |||
| Infinite F200 plate reader | Tecan | ||
| Phase-contrast microscope with x10 and x20 objectives | |||
| Spectrophotometer | |||
| Sterile reagent reservoirs for multichannel distribution | |||
| Sterile paper towel |
References
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