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Neuroscience

Células vivas medición de olor del Receptor activación utilizando un ensayo de campo en tiempo real

Published: October 2, 2017 doi: 10.3791/55831
Automatic Translation
*1, *1, 2,3, 1,4
1Department of Pathophysiology, Key Laboratory of Cell Differentiation and Apoptosis of National Ministry of Education, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Department of Molecular Genetics and Microbiology, Duke University Medical Center, 3Department of Neurobiology, Duke Institute for Brain Sciences, Duke University Medical Center, 4Institute of Health Science, Chinese Academy of Science/Shanghai Jiao Tong University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Caracterizar la función de receptores odorantes sirve una parte indispensable en el proceso de deorphanization. Se describe un método para medir la activación de receptores odorantes en tiempo real utilizando un ensayo de campo.

Abstract

El enorme tamaño de las familias de mamíferos odorante del receptor (o) presenta dificultades para encontrar sus ligandos afines entre los numerosos productos químicos volátiles. Para eficientemente y exactamente deorphanize ORs, combinamos el uso de una línea de células heterólogas ORs mamíferos y un plásmido biosensor genéticamente modificados para medir campo producción aguas abajo de la activación de la OR en tiempo real. Este ensayo puede utilizarse para olores de pantalla contra ORs y viceversa. Las interacciones de los receptores odorantes de las pantallas pueden confirmarse posteriormente por pruebas contra diferentes concentraciones de olor, generación de curvas de concentración-respuesta positiva. Aquí hemos utilizado este método para realizar una proyección de alto rendimiento de un compuesto oloroso contra una biblioteca OR humano expresado en las células Hana3A y confirmó que el receptor responder positivamente es el receptor cognado para el compuesto de interés. Encontramos este método de detección de alto rendimiento eficiente y confiable en la evaluación de la activación de la OR y nuestros datos proporcionan un ejemplo de su uso potencial en estudios funcionales OR.

Introduction

El sentido del olfato desempeña un papel importante en la supervivencia de animales como ellos confían en sus capacidades olfativas para obtener comida, evitar depredadores y peligros, especies y seleccionar mate1,2. La realización de estas funciones depende de los receptores de olor (RUP), que se expresan individualmente en la superficie ciliar de las neuronas sensoriales olfativas (OSNs) localizada en el epitelio olfatorio (OE). ORs constituyen la mayor familia de la superfamilia de receptores (GPCR) de la proteína G acoplada con aproximadamente 400 y 1200 diversos OR genes en humanos y ratón, respectivamente3,4,5. ORs activados por olores conducen al aumento de los niveles intracelular de cAMP a través de la activación secuencial de proteína olfatoria de G (Golf) y tipo cyclase del adenylyl III (ACIII). El mayor nivel de cAMP intracelular resultante podría funcionar como un segundo mensajero, que se abre el canal nucleotide-bloqueado en la superficie de la célula, provocando afluencia de cationes como Ca2 + y los potenciales de acción y en última instancia iniciando potencial de neuro transmisión y percepción olfativa. El proceso de detectar y discriminar una gran cantidad de olores por ORs es considerado como el primer paso de percepción olfativa6,7.

Puesto que Buck y Axel8 primero con éxito había reproducido receptores odorantes y dilucidado el mecanismo de la percepción olfativa iniciada por ORs, deorphanization de la familia de OR se convirtió en uno de los hotspots en este campo. Varios métodos in vivo, ex vivo y en vitro para medir la activación OR han sido reportados9,10,11,12. Un método tradicional que utiliza Ca2 + proyección de imagen de seguido por RT-PCR unicelular en OSNs permitió la identificación de diferentes SRO a aceites alifáticos13,14,15. Más recientemente, el advenimiento de los análisis del transcriptoma a gran escala promueve el desarrollo de métodos de alto rendimiento en vivo más. El ensayo de Kentucky había identificado ORs de eugenol y muscone-sensible al ratón con el uso de la S100a5-tauGFP reportero ratón cepa y microarrays análisis9. Basado en la disminución de los niveles de mRNA de OR después de la exposición de olor, la tecnología de sueño emplea un enfoque transcriptómicos para determinar perfiles de activación OR en ambas especies de vertebrados y no vertebrados16. Asimismo, habida cuenta de la fosforilación de S6 en activaciones neuronales, la señorita grupo secuenciado mRNAs de immunoprecipitations ribosoma fosforilada para identificar capacidad de respuesta de ORs12. Por último, el grupo de Feinstein informó ratones estupendo sniffer que podrían servir como una plataforma para estudiar olor codificación en vivo, conocido como la tecnología de MouSensor17.

En el Reino de vitro , el reto de cultivo OSNs hace un sistema de expresión heteróloga que imita OR expresión funcional en vivo una solución ideal para la investigación a gran escala de los productos químicos para ORs. Sin embargo, puesto que las líneas de cultivo de células de origen no olfativa difieren OSNs nativos, o proteínas son retenidas en el retículo endoplasmático e incapaz de tráfico a la membrana plasmática, dando por resultado OR degradación y pérdida de función del receptor18 , 19. para resolver este problema, se han realizado trabajos extensos para replicar expresión funcional OR sobre la membrana celular en células heterólogas. Krautwurst et al. primero atribuye los 20 primeros aminoácidos de la rodopsina (Rho-etiqueta) a la N-terminal de la proteína de OR y esto promovió la expresión de superficie de la célula de algunos ORs en células de riñón embrionario humano (HEK)20. Mediante la realización de un análisis de serie de análisis del gene expresión (SAGE) Biblioteca de solo OSNs, Saito et al. clonó por primera vez el transporte del receptor proteína (RTP) miembros de la familia, RTP1 y RTP2 y la proteína del receptor de expresión potenciador 1 (REEP1) que facilitó el tráfico de OR a la membrana celular y mejorada respuestas mediadas por el olor de las RUP en las células HEK293T 21. basándose en estos hallazgos, el grupo de la señorita establecido con éxito la línea celular de Hana3A estable transfected con RTP1, RTP2, REEP1 y Gαolf en HEK293T y transitorio transfected con ORs tagged Rho, eficiente o funcional expresión. Posteriores estudios revelaron 1) una forma más corta de RTP1, RTP1S, que podrían promover más robusta o función de la proteína original de RTP1 y 2) el receptor muscarínico de tipo 3 (M3R) que podría mejorar la actividad OR vía inhibición de la β-arrestin-2 contratación, los cuales fueron introducidos en el sistema de expresión heteróloga para optimizar experimental salida22,23.

Varios métodos de detección se han utilizado para cuantificar la activación del receptor en sistemas heterólogos. El ensayo de la fosfatasa alcalina placentaria secretada (SEAP) trabaja con una enzima reporter reglamentada transcripcionalmente por elementos de la respuesta de campo (CREs), convirtiéndolo en una opción atractiva para evaluar la activación de la OR. La fluorescencia se detecta fácilmente en una muestra de medio de cultivo después de la incubación con SEAP detección reactivo24. Usando este método, las funciones de RUP como una clase secundaria de receptores chemosensory en el OE-el rastro receptores asociados a aminas (Edmonton) han sido caracterizan25,26,27. Otro método común, el ensayo de luciferasa, utiliza un gen de reportero de luciferasa de luciérnaga bajo el control del elemento de respuesta cAMP (CRE). Luminiscencia generada por la producción de luciferase de medición proporciona un medio eficiente y robusto de cuantificación OR activación10,11,28.

Ensayos de campo en tiempo real también han sido ampliamente utilizados en el seguimiento dinámicamente la función de los GPCRs heterólogas o endógenas. Un ejemplo de tales ensayos avanzados aprovecha una variante genéticamente codificados biosensor, que posee un dominio de unión a campo fusionado a la forma mutante de la luciferasa. Cuando el campo se une, el cambio conformacional conduce a la activación de la luciferasa, luminiscencia que puede medirse entonces con un lector de la quimioluminescencia29,30. La tecnología de campo en tiempo real ha informado conveniente para la orfandad de los receptores de olor humano en las células HEK293 y NxG de 108CC15culo = "xref" > 31,32,33, como así como en la Hana3A HEK293T derivado células34,35. El grupo Krautwurst también describe en detalle la tecnología de campo en tiempo real para ser conveniente para enfoques a gran escala o detección bidireccional32,33.

Aquí se describe un protocolo para medir la activación OR usando un análisis de campo en tiempo real en células Hana3A. En el presente Protocolo, la luminiscencia de células vivas previamente equilibradas se mide cinéticamente por 30 min después del tratamiento con compuestos volátiles específicos, que representan un análisis más eficiente y preciso de la activación de OR que son menos susceptibles a artefactos que se producen en el entorno celular con tiempo prolongado y toxicidad celular inducida por el olor. Esta medida en tiempo real permite una proyección a gran escala de SRO y ligandos, así como caracterización de pares OR-ligando específicos de interés. Usando este método, con éxito identificamos OR5AN1 como receptor para el muscone compuesto de almizcle realizando una proyección contra 379 ORs humanas y posteriormente confirmar el resultado de la investigación positiva.

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Protocol

1. cultivo y mantenimiento de las células Hana3A

  1. mantener las células en 10 mL de medio mínimo esencial (MEM) con 10% suero fetal bovino (FBS), 100 μg/mL de penicilina-estreptomicina y 1,25 μg/mL anfotericina B en un 100 mm placa de cultivo de células en una incubadora de cultivo celular de 37 ° C con 5% CO 2. Con cada otro paso, añadir 1 puromicina μg/mL para mantener estable de la transfección de plásmidos (véase Introducción).
    Nota: Realice todos los pasos que implica el cultivo de células en una clase de gabinete de seguridad biológica II a garantizar ambiente estéril.
  2. Subcultivo en una proporción de 10-20% en 100 mm platos cada 2-3 días.

2. Recubrimiento de las células para la transfección

  1. observar las células bajo un microscopio de contraste de fase para asegurar la viabilidad de las células y para estimar la confluencia del Hana3A.
  2. Aspirar todo medio de la placa de cultivo celular.
  3. Lavar las células añadiendo 10 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en la placa, el plato se arremolinan y aspirando PBS.
  4. Añadir 3 mL de 0.05% tripsina-ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) en la placa. Mezcla durante 1 minuto o hasta que todas las células estén a flote.
    Nota: Observar el avance de las células de la parte inferior de la placa bajo el microscopio como sea necesario.
  5. Tripsina Inactivate añadiendo 5 mL de MEM con 10% FBS y pipeta hacia arriba y hacia abajo para romper trozos de Massachusetts de la célula
    Nota: Para placas antes de transfección, el medio utilizado no debe contener antibióticos. Además de los antibióticos pueden disminuir la eficacia de transfección.
  6. Transferir una cantidad apropiada de las células a un tubo de 15 mLl dependiendo del número de placas a ser transfectadas. Por cada placa de 96 pocillos, placa de 2 x 10 6 células o aproximadamente 1/5 de un plato de 100 mm confluente del de 100%, dando una cuenta de célula de 2 x 10 4 células por pozo o una densidad de aproximadamente 15-30% confluencia por pozo. Centrifugar los tubos a 200 x g durante 5 min y aspirar el sobrenadante sin perturbar el pellet celular.
    Nota: Calcular la cantidad correcta de células para ser revestidos en placas de 96 pocillos para evitar sobrecrecimiento o undergrowing las células antes de la estimulación.
  7. Agregar una cantidad apropiada de MEM con 10% FBS en la 15-mL tubo y pipeta hacia arriba y hacia abajo para romper trozos de la célula de la masa. Para cada placa de 96 pocillos, resuspender las células con 6 mL de MEM con 10% FBS.
    Nota: Tenga cuidado de no generar burbujas de aire en el tubo de.
  8. Añadir las células suspendidas en un tanque. Usando una pipeta multicanal, pipetee 50 μl de células en cada pozo de una placa de 96 pocillos. Incubar durante una noche a 37 ° C con 5% CO 2.

3. Transfección de plásmidos

  1. antes de transfección, observar las células plateadas para asegurar una adecuada confluencia de aproximadamente 30-50% bien bajo el microscopio de contraste de fase y volver a la incubadora de.
  2. Preparar con antelación el OR tagged Rho construcción 11 , 21 , 22 , 28, el factor accesorio construye (RTP1S 22 , 36 y M3R 23), y la variante de biosensor construir 29 , 30 por miniprep. Cuantificar la concentración de DNA por un espectrofotómetro y ajustar las concentraciones de ADN plásmido (p. ej., a 100 ng/μL) con agua destilada como sea necesario.
  3. Preparación de las mezclas de transfección
    1. prepara una mezcla de transfección del plásmido en 500 μl de MEM para cada placa de 96 pocillos según tabla 1.
      Nota: Cuando diferentes SRO es probados en la misma placa de 96 pocillos, el volumen de la mezcla de transfección y la cantidad de plásmido ADN añadido debe adaptarse en función del número de pozos transfected con un dado o.
    2. Prepare una mezcla de transfección en un tubo con 18 μL de reactivo de transfección mediada por lípidos en 500 μl de recordar:
  4. Mezcle la mezcla de plásmido con la mezcla de transfección mediante pipeteo arriba y abajo. Incubar a temperatura ambiente durante 15 min
  5. Detener la reacción agregando 5 mL de MEM con 10% FBS.
  6. Extienda una capa gruesa de toallas de papel estéril en la campana de la cultura de célula. Tomar una placa de 96 pocillos con células de la incubadora. Suavemente y varias veces toque la placa boca abajo en la pila de toallas de papel para que el medio es completamente absorbido por la toalla de papel.
    Nota: No con fuerza o bruscamente golpee la placa como uno podría perder células.
  7. Transferir 50 μl de la mezcla de transfección combinado en cada pocillo de la placa de 96 pocillos e incubar durante la noche por 18-24 h a 37 ° C con 5% CO 2.
    Nota: Un programa de transfección y la estimulación logró tiempo debe preceder a la medición cuando se prueban más de una placa de 96 pocillos en un experimento para tener todas las placas miden después del mismo tiempo de transfección y tiempo de exposición del estímulo.

4. Estimulación y medición o actividad usando el ensayo de campo en tiempo real

  1. observar las células transfected con un microscopio de contraste de fase para asegurar una adecuada confluencia de 50-80% por pozo y vuelva a la incubadora.
  2. Preparar el medio de la estimulación mediante la adición de 10 mM hidroxietil-1-ácido ácido (HEPES) y 5 mM glucosa a Hank ' s solución sal balanceada (HBSS).
  3. Descongelar las alícuotas de reactivo sustrato de ensayo de campo en tiempo real en el hielo. Almacenar el reactivo substrato a-80 ° C a 55 μl por tubo en tubos de PCR. 1 tubo por placa.
  4. Preparar solución de equilibrado 2% mezcla 55 μl del reactivo de sustrato y solución de glucosa HEPES de HBSS 2750 μl.
  5. Extienda una capa gruesa de toallas de papel en el Banco. Varias veces y suavemente golpee la placa boca abajo sobre la toalla de papel para que el medio de transfección es completamente absorbido por la toalla de papel.
  6. Lavar las células por Pipetear 50 μl de solución de glucosa HEPES de HBSS a cada pocillo.
  7. Grifo suavemente y varias veces la solución de glucosa HEPES de HBSS de la placa de 96 pozos.
  8. Pipeta 25 μl de la solución de equilibrio de 2% a cada uno bien e incubar a temperatura ambiente en oscuridad durante 2 h.
  9. Preparar por adelantado 1 M soluciones odorante en DMSO y almacenar a-20 ° C hasta su uso.
  10. Antes del final de la incubación, diluir las soluciones stock de olor a las concentraciones de trabajo en medio de estimulación de la HBSS/HEPES/glucosa.
    Nota: Las concentraciones de las diluciones de olor preparadas en este paso se deben duplicar para obtener las concentraciones finales correctas en cada pozo.
  11. Con un QL placa lector y antes además de odorante, medir el nivel basal de la luminescencia de la placa por 2 veces consecutivas a una velocidad de 1000 ms por bien 34.
  12. Rápidamente Retire la placa del lector de la placa y añadir diluciones de odorante de 25 μl a cada pocillo inmediatamente iniciar la medición de la luminiscencia continua de todos los pozos de 20 ciclos dentro de 30 minutos
    Nota: Pipeta cuidadosamente para evitar la contaminación los vecinos pozos al usar diferentes olores o diferentes concentraciones de los mismos odorantes en el mismo plato.

5. Análisis de datos

  1. exportar los datos desde el software de lector de placa de quimioluminescencia.
  2. Cálculo normalizado respuesta OR para cada punto de tiempo utilizando la fórmula de
    (luminiscencia N – luminiscencia basal) / (luminiscencia mayor – luminiscencia basal)
    donde N = el valor de luminiscencia de un determinado bien; basal = valor promedio de luminiscencia de los dos basales valores de luminiscencia; más alto = mayor valor de luminiscencia de un plato o un conjunto de placas de.
    Nota: Dependiendo de la finalidad del experimento, pueden adoptarse representaciones gráficas alternativas. Por ejemplo, para la detección del análisis (ver figura 1) y para la generación de curvas de respuesta a la concentración, el valor de luminiscencia de un cierto bien en un momento deseado durante la medición cinética, como el valor máximo o el valor final, se puede usar.

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Representative Results

Muscone es el principal componente aromático de almizcle natural. Recientes estudios OR5AN1 identificados como un receptor humano para el muscone y otros compuestos macrocíclicos de almizcle basadas en homología con el ratón o, MOR215-1, reproducido de glomérulos muscone-responsivo en comportarse ratones37,38. Por proyección el repertorio humano de OR, nuestro grupo y el grupo Touhara también identificado OR5AN1 como un receptor importante de dos lactonas macrocíclicas almizcle compuestos, cyclopentadecanone y muscone, respectivamente, utilizando la luciferasa ensayo sistema38,39 .

Utilizando el ensayo de campo en tiempo real que se describe aquí, defendimos el repertorio humano de OR contra 30 muscone μm (figura 1). Entre los 379 or humanos proyectados, OR5AN1 emergió con una destacada respuesta a muscone, mientras que las otras RUP y los controles negativos (el control del ninguno-olor y el control de vector vacío) no mostró una respuesta significativa. El control positivo probado OR5AN1 contra 30 μm almizcle ha, un ligando para el OR5AN1 (datos no publicados) y fue utilizado para normalizar la respuesta de las RUP a muscone. Para la representación gráfica de este conjunto de datos, seleccionamos el punto de tiempo cuando la lectura máxima luminiscencia fue alcanzada por OR5AN1 contra 30 μm almizcle ha.

A continuación examinamos la relación de respuesta a la concentración del olor de-par OR con 3 diferentes concentraciones de muscone. Para cada concentración de muscone probado, durante los primeros 20 minutos después de la adición de muscone, la respuesta de OR5AN1 aumenta gradualmente y luego tocado techo en los últimos 10 minutos (figura 2A) mientras que seguía siendo el rastro para el control de la adición del ninguno-olor (0 μm muscone) relativamente plana. Concentraciones más altas de muscone evocan respuestas de OR más fuerte que los inferiores, que es distinguible a través de la medición. Con el último punto de tiempo de la medida cinética, nos genera una curva de respuesta a la concentración y la concentración del 50% del valor máximo efecto (CE50) de la curva se estima 20,82 μm (figura 2B).

Figure 1
Figura 1: Detección de humanos ORs de muscone.
se revisaron las 379 ORs humanos únicos contra 30 muscone μm usando el ensayo de campo en tiempo real. Color de bloques a lo largo de la x-eje indican distintas familias humanas de OR. Cada columna de x-eje representa un solo tipo de OR excepto las tres últimas columnas, que son la respuesta de OR5AN1 a 30 μm almizcle ha (control positivo), la respuesta de OR5AN1 a la solución de glucosa HEPES de HBSS (un ninguno-olor control negativo), y la respuesta de Rho-pCI a 30 μm muscone (un vector vacío control negativo), de izquierda a derecha. y-axis representa luminiscencia normalizado a los 30 min después de la adición de olor cuando la respuesta alcanza un máximo para el control positivo (N = 3). Todas las respuestas se normalizan al control positivo. Barras de error representan el error estándar medio (SEM). Para mayor claridad, se muestran sólo barras de error positivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Medidas cinéticas de la respuesta de OR5AN1 a muscone.
(A) se realizaron mediciones en tiempo real de la OR5AN1 activación muscone de diferentes concentraciones y un control negativo de ninguno-olor dentro de 30 minutos de la adición de olor. La flecha indica el momento de la adición de olor. (B) concentración-curva de OR5AN1 contra muscone a los 30 min después de la adición de olor. y-ejes representan luminiscencia normalizada (N = 3). Todas las respuestas se normalizan la respuesta mayor a 100 μm muscone. Barras de error representan SEM. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Plásmido Cantidad por placa de 96 pocillos (μg)
Rho- o 5
RTP1S 1
M3R 0.5
variante de campamento biosensor 1

Tabla 1: Componentes de la mezcla de transfección.
Por la cantidad de placa de 96 pocillos de la Rho-o, RTP1S, M3R y la plásmidos variante de biosensor de campo en tiempo real.

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Discussion

Medir con precisión la activación de un OR con la exposición a un determinado odorante es el primer paso para descifrar la codificación de la información olfativa. Los experimentos se muestra en esta representan estudio que un ejemplo de cómo se puede identificar, mediante una en vitro sistema de expresión OR, or sensible entre el repertorio humano de OR para el olor químico de interés y posteriormente caracterizar el receptor Farmacología utilizando diferentes concentraciones de la sustancia. Nuestros resultados confirman OR5AN1 como un receptor de bona fide para el muscone. Esto es consistente con un anterior informe39 y proporciona evidencia adicional para la especulación que sólo un pequeño número de receptores está implicado en la detección del olor de almizcle27,40. En comparación con los datos de proyección de Akuhara Sato et al. que se genera por el ensayo de luciferasa en un sistema de expresión heterólogo o similares, nuestros resultados mostraron ligeramente peor relación señal a ruido. Además de las variaciones inherentes a las diferentes técnicas, podría ser la diferencia en la salida debido a que utilizamos una menor concentración de muscone (30 μm y 100 μm). De hecho, el valor de CE50 de la curva de respuesta a la concentración de OR5AN1 contra muscone que se obtuvieron mediante el ensayo de campo en tiempo real está en el mismo orden de magnitud como el que en su sistema de ensayo de luciferasa, Akuhara Sato et al. demostrando resultados comparables para el mismo heteróloga OR expresión sistema incluso cuando se utilizan métodos de detección diferentes. En otro estudio, nuestro grupo encontró que el sistema en tiempo real puede ser ligeramente más sensible que el sistema de gen reportero luciferasa en evaluar la selectividad del receptor de OR2T11, dado que un pequeño número de olores era activo sólo en el primero pero no en el último sistema35. En comparación con la serie de datos registrados por Geithe et al. 31 en OR1A1 contra (+)-carvona, nuestros datos en OR5AN1 contra muscone mostraron un retraso en el tiempo necesario para llegar a la meseta, que pudiera derivarse directamente de los diferentes tipos de SRO y aceites usados. En otros datos de ensayo de campo en tiempo real de nuestro grupo, también mostramos diversas veces al máximo dependiendo de la ORs y Odorantes de34,35. Además, diferentes líneas celulares utilizadas para expresar ORs, diferentes sustrato utilizado, plásmidos variante biosensor campo en tiempo real diferentes, diferente sensibilidad del lector de la quimioluminescencia, o diferentes condiciones experimentales, tales como variación en temperatura ambiente, podría contribuir a las variaciones en salida de luminiscencia.

El ensayo de campo en tiempo real muestra varias ventajas sobre otros métodos de medición de activación OR. Primera, al igual que el análisis de gen reportero luciferasa, el ensayo de campo en tiempo real ofrece un medio adicional en vitro de alto rendimiento de identificación de los repertorios de OR en respuesta a olores. Pantallas del receptor u olor a gran escala por el ensayo de campo en tiempo real pueden ofrecer una gran cantidad de información acerca del receptor del olor emparejado con el uso de un pequeño número de placas. Cuando luminómetros y pipeteo robots están disponibles, el protocolo de 96 pocillos descrito aquí puede actualizarse fácilmente a un formato 384-bien, en que incluso menos ADN plásmido y reactivos se requieren por unidad de salida de datos. En segundo lugar, el método de campo en tiempo real es capaz de medir cambios en la concentración intracelular de cAMP en tiempo real. Mientras que los ensayos más utilizados para medir actividad OR hasta la fecha son basados en fluorescencia o quimioluminiscencia punto final detección que requiere lisis celular, el campo en tiempo real Análisis isimplemented condiciones no lítico, células vivas que son más similares a la endógena situación y permiten el seguimiento de los cambios en los niveles de campo. En tercer lugar, un tiempo relativamente más corto es necesaria para llevar a cabo el método en tiempo real. Otro método de análisis de alto rendimiento de la función OR, que se basa en una expresión del gen reportero luciferasa, necesita un adicional 4 h después de la estimulación de olor para completar un experimento. En algunos casos, un intervalo de incubación prolongada de olor puede resultar en toxicidad potencial olor a las células, que se alivia con eficacia bajo exposición transitoria. Además, en experimentos de mayor duración, se aumentan las posibilidades de contaminación de los pozos vecinos por volatilización cuando se utiliza diferentes olores o diferentes concentraciones del mismo olor en el mismo plato. Detección inmediata después de adición de olor hace que el ensayo de campo en tiempo real un paradigma rápido y confiable.

Las limitaciones del campo en tiempo real de ensayo para la medición o activación es como sigue. En primer lugar, nuestro análisis en vitro se basan en una línea de células HEK293T que carece de muchas moléculas endógenas de las neuronas sensoriales olfativas nativas. Además, proteínas solubles y conversiones enzimáticas que ocurren en el moco nasal pueden enlazar con olores o influencia afinidad OR para olores. Por lo tanto, la activación en el sistema heterólogo puede diferir de la situación en vivo en términos de sensibilidad y sintonización de olor. En segundo lugar, la identificación de SRO para un determinado odorante requiere un repertorio entero de OR de por lo menos una especie dada. ORs son una gran familia de GPCRs y el número de proteínas OR en humano y ratón son muy grandes4,5,41. Considerable tiempo y esfuerzo se pueden implicar en cada repertorio OR de interés de la clonación. En tercer lugar, aunque el sistema de expresión heteróloga de OR incluye modificaciones de secuencia OR (por ejemplo, la etiqueta de Rho) y algunas de las proteínas claves o accesorios (como RTP1S y M3R), sospechamos que no todos ORs funcionalmente se expresan en la membrana celular de la Células HEK293T derivadas. Por lo tanto, la ausencia de respuestas a un determinado olor en vitro no necesariamente excluye OR respuesta en vivo, como resultado del hecho que algunas RUP puede ser mal expresado en la superficie celular y no puede reconocer sus ligandos. Por lo tanto, siempre que posible campamento en tiempo real puede usarse conjuntamente con otros ensayos in vitro e in vivo para obtener resultados más convincentes.

Varios pasos críticos deben prestarse especial atención durante el ensayo de campo en tiempo real. En primer lugar, para experimentos de la luminescencia en general, la temperatura es un factor clave que afecta el resultado del experimento como aumentos de temperatura disminuyen niveles basales e inducidos de la salida de luz y disminuye en temperatura aumenta salida de luz. Por lo tanto, pre-equilibra los platos a la temperatura de operación de estado estacionario de lo instrumeNT antes de la adición de aroma es necesario evitar la influencia en los resultados causados por cambios de temperatura. En segundo lugar, deben ajustarse según la situación real de las concentraciones de lo reactivo de substrato del ensayo de campo en tiempo real. Cuando la luminiscencia basal no alcanza el umbral de detección más bajo del lector de la quimioluminescencia, uno debe considerar el aumento de las concentraciones de sustrato para aumentar la señal. Por último, a pesar de ser una línea de células adherentes, las células Hana3A pueden separar durante el experimento. Cuando aspirando o añadiendo el medio, colocando las puntas de la pipeta en el lado del pozo puede reducir al mínimo la interrupción de la monocapa celular. También es importante a la placa de células en una densidad adecuada y uniforme para evitar sobrecrecimiento de células densas manchas de células tienden a despegarse durante el cambio de medio.

Además de identificar OR(s) de un odorante de interés, el ensayo de campo en tiempo real también se puede utilizar para detectar cognados ligandos para un dado o cuando las bibliotecas de los productos químicos están disponibles. Finalmente, cuando se utilizan tipos celulares apropiados y las condiciones de la transfección, el ensayo también puede permitir la detección de activación GPCR sobreexpresada o endógena y dar curvas de respuesta dependiente de la concentración de agonistas y antagonistas.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

El trabajo fue apoyado por la Fundación de ciencia nacional chino (31070972), ciencia y tecnología Comisión de Shangai municipio (16ZR1418300), el programa para innovadores investigación equipo de Shanghai Municipal Comisión de educación, el Shanghai oriental Programa (J50201) y el programa de investigación básica Nacional de China (2012CB910401).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amphotericin B Sigma A2942
DMSO Sigma D2650
FBS Gibco 10099-141
GloSensor cAMP reagent Promega E1290
pGloSensor-20F cAMP plasmid Promega E1171
Hana3A cells available from authors upon request
HBSS, without calcium or magnesium GIBCO 14175095
HEPES Hyclone SH30237
Lipofectamine2000 Invitrogen 11668-019
M3R plasmid cloned into a mammalian expression vector such as pCI
MEM, with EBSS and L-glutamine Hyclone SH30024
Muscone Santa Cruz sc-200528
Musk tibetene Sigma-Aldrich S359165
OR plasmids cloned with a Rho-tag into a mammalian expression vector such as pCI
PBS, without calcium or magnesium Cellgro 21-040-CV
Penicillin-streptomycin Hyclone SV30010
Plasmid miniprep kit Tiangen DP103-03
Puromycin Sigma P8833
RTP1S plasmid cloned into a mammalian expression vector such as pCI
Trypsin-EDTA Hyclone SH30236
0.2-mL PCR tube Axygen PCR-02-C
1.5-mL Eppendorf tube Eppendorf
15-mL 17 mm x 120 mm conical tube BD Falcon 352096
8-well and/or 12-well multichannel pipetman Eppendorf
96-well flat-bottomed white cell culture plate Greiner 655098
100 mm x 20 mm cell culture dish BD Falcon 353003
Class II biological safety cabinet with laminar flow
Cell culture incubator, with 5% CO2
Centrifuge, with swinging bucket rotor for 15-ml conical tubes
Infinite F200 plate reader Tecan
Phase-contrast microscope with x10 and x20 objectives
Spectrophotometer
Sterile reagent reservoirs for multichannel distribution
Sterile paper towel

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Neurobiología número 128 ensayo de campo en tiempo real receptor de olor olor células vivas medición cinética muscone
Células vivas medición de olor del Receptor activación utilizando un ensayo de campo en tiempo real
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Zhang, Y., Pan, Y., Matsunami, H., Zhuang, H. Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay. J. Vis. Exp. (128), e55831, doi:10.3791/55831 (2017).

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