Summary
Echocardiographic onderzoek wordt vaak gebruikt in muizen. Dure high-resolution echografie apparaten zijn ontwikkeld voor dit doel. Dit protocol beschrijft een betaalbare echocardiographic procedure gecombineerd met histologische Morfometrische analyses om te bepalen van cardiale morfologie.
Abstract
Een toenemend aantal genetisch gemodificeerde Muismodellen beschikbaar zijn gekomen in de afgelopen jaren. Bovendien is het aantal farmacologische studies uitgevoerd bij muizen is hoog. Fenotypische karakterisering van deze Muismodellen vereist ook het onderzoek van de hartfunctie en morfologie. Echocardiografie en magnetische resonantie beeldvorming (MRI) zijn veelgebruikte benaderingen voor het karakteriseren van de hartfunctie en morfologie in muizen. Echocardiographic en MRI apparatuur gespecialiseerd voor gebruik in kleine knaagdieren duur is en een speciale ruimte vereist. Dit protocol beschrijft cardiale metingen bij muizen met behulp van een klinische echocardiographic systeem met een menselijke vasculaire sonde 15 MHz. De metingen zijn verricht op narcose volwassen muizen. Ten minste drie afbeeldingsreeksen worden geregistreerd en geanalyseerd voor elk dier in M-modus in de weergave van de korte-as parasternal. Daarna, cardiale histopathologisch onderzoek is verricht, en cardiomyocyte diameters worden bepaald op de Haematoxyline-eosine- of tarwekiemen agglutinin (WGA)-gekleurd paraffine secties. Vaartuig dichtheid is vastbesloten morphometrically na Pecam-1 immunokleuring. Het protocol is met succes toegepast op farmacologische studies en verschillende genetische diermodellen onder uitgangssituatie, alsmede na experimentele myocardinfarct door de permanente Afbinding van de linker anterior aflopende coronaire ( LAD). In onze ervaring, echocardiographic onderzoek is beperkt tot narcose dieren en is haalbaar in volwassen muizen met een gewicht van ten minste 25 g.
Introduction
Een groot aantal genetisch gemodificeerde Muismodellen zijn beschikbaar, en het aantal farmacologische studies in muizen is hoog1,2. Echocardiografie en MRI zijn veelgebruikte benaderingen voor de fenotypische karakterisering van hartfunctie en morfologie bij deze muis modellen3. Het doel van het voorgestelde protocol is hartfunctie en morfologie in volwassen muizen te analyseren. Het combineert echocardiographic, histologisch, en immunohistochemische metingen. Echocardiographic onderzoek wordt wijd gebruikt in muizen4,5,6,7,8,9,10,11, 12. Pachon et al. 11 205 studies gepubliceerd in omloop, Omloop onderzoek, American Journal of Physiology - hart en bloedsomloop fysiologieen Cardiovasculair onderzoek tussen 2012 en 2015 die geïdentificeerd gebruikt echocardiographic onderzoek bij dieren.
Echocardiografie wordt gebruikt ter identificatie van de cardiale fenotypen in genetisch gemodificeerde muizen5,6,13,14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22, evenals over het analyseren van de hartfunctie in chronische overbelasting-geïnduceerde hypertrofie, myocardiale ischemie en cardiomyopathie modellen in muizen (herzien in12). Verbeterde echocardiografie apparatuur staat voor de de standaard maat van links-ventriculaire (LV) systolische en diastolische afmetingen, weefsel Doppler imaging, myocardiale contrast echografie en de beoordeling van de regionale functie LV en coronaire reserve 12. idealiter echocardiographic onderzoek moet worden verricht in de bewuste muizen om te voorkomen dat de negatieve effecten van de narcose op de contractiele functie, autonome reflex controle, en hart tarief11. Echter, deze aanpak wordt beperkt door de eis om te trainen van de dieren; moeilijkheden bij het houden van de lichaamstemperatuur stabiel; bewegingsartefacten; stress; zeer hoge cardiale frequenties; en de eis van ten minste twee onderzoekers voor het uitvoeren van het experiment, vooral als een groot aantal dieren onderzocht worden. Interessant, rapporteerde een recente studie geen verschillen in echocardiographic parameters in getrainde en ongetrainde dieren19. Wij voeren echocardiographic metingen in narcose muizen. Verschillende verdoving protocollen zullen hieronder worden besproken.
Hoewel standaardresolutie echocardiografie (> 10 MHz) is voldoende maatregel LV systolische en diastolische dimensies en hartfunctie bij volwassen muizen, de methode is beperkt in zijn beschrijving van de onderliggende structurele verschijnselen. Zo combineren we de metingen in vivo met histologische en immunohistological analyses te meten, bijvoorbeeld cardiomyocyte diameter en vaartuig dichtheid. Andere histologische en immunohistological onderzoeken, zoals de bepaling van de proliferatie, onderzoek van apoptosis, infarct grootte metingen, bepaling van fibrose, en specifieke marker expressie, kunnen ook worden uitgevoerd op hetzelfde type weefsel verwerkt, maar zijn niet het onderwerp van dit protocol. De combinatie van in vivo echocardiographic examen met histologische analyses biedt aanvullende inzichten in onderliggende structurele veranderingen. In een extra stap, kunnen we deze metingen met moleculaire en ultra structurele onderzoek voltooien. Histologische analyses niet alleen het echocardiographic onderzoek voltooien, maar ook onmisbaar geworden als de resolutie van echocardiografie niet voldoende is. Dit is vooral het geval in modellen van genetisch gemodificeerde muizen die embryonale dodelijke23,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
de experimenten die hier beschreven werden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante institutionele en Franse dierenwelzijn wetten, richtlijnen en beleid. Ze zijn goedgekeurd door de Franse ethische Commissie (Comité Institutionnel d ' Ethique Pour l ' dier de Laboratoire; nummer nvu/2012-106).
1. echocardiografie
- bepalen het lichaamsgewicht van de muis met behulp van een standaard laboratorium evenwicht terwijl het licht door de staart om de juiste positionering.
- Anesthetize het dier door de injectie intraperitoneaal (i.p.) van 50 mg/kg pentobarbital 25 , 26.
Opmerking: Een ander soort verdoving kan worden gebruikt als hetzelfde protocol wordt gebruikt in de studie. Voor- en nadelen zal worden besproken onder. - Zet de muis terug in zijn eigen kooi en wacht totdat het is koel, toont het regelmatige ademhaling en achterste voet reflexen afwezig zijn. Om dit te testen, knijp een voet iets en observeren of het been nog in de loop terugschuift.
- Scheren de linkerzijde van de thorax en de linker oksel met behulp van een commerciële knaagdier scheerapparaat.
Opmerking: Het gebruik van een speciale knaagdier scheerapparaat zorgt voor het volledig verwijderen van fijne muis haar om storing in de echocardiographic meting te voorkomen. Commerciële haar verwijdering crèmes of oplossingen moeten worden voorkomen, aangezien zij zijn meestal geparfumeerd, die het dier verstoren zal, nadat het ontwaakt. Vermijd buitensporige scheren, omdat het warmteverlies verhoogt. - Zet het slapende dier op een warme pad ingesteld op 40-42 ° C in een ondiepe linkerpagina positie, met het hoofd op 12 o ' klok en de staart op 6 o ' klok. De linkerarm, linkerbeen en staart vast met tape.
- Toepassen vooraf opgewarmd echocardiografie gel op de geschoren borst en het hoofd van de transducer.
- Plaatst de transducer parasternal links, sturen het naar de rechterkant van de hals te verkrijgen van een tweedimensionale (2D) parasternal lang-axis Bekijk op het niveau van de papillaire spier. Draai de transducer 90° rechtsom om een beeld van de korte-as papilary spier niveau te krijgen. Gebruik een minimale diepte-instelling en een zoom om te maximaliseren beeldsnelheid kwaliteit en frame. Zet de sweep-snelheid naar de maximale.
- Te verkrijgen van deze instellingen, verschillende zoom en diepte instellen van opties kan worden gebruikt, afhankelijk van de machine en de software. Record 2D-geleide beelden van de M-stand in korte-as weergeven 27 Verwijzen naar figuur 1A en B 27.
Nota: zorg om te voorkomen dat buitensporige druk uit te oefenen op de borst, omdat dit leiden bradycardie tot kan.
- Te verkrijgen van deze instellingen, verschillende zoom en diepte instellen van opties kan worden gebruikt, afhankelijk van de machine en de software. Record 2D-geleide beelden van de M-stand in korte-as weergeven 27 Verwijzen naar figuur 1A en B 27.
- 3 hart beat cine lussen voor elk dier reeks record ten minste 3.
Opmerking: Voor de echocardiograph-software gebruikt in deze studie, druk op de " ophaal/opslaan " knop eenmalig. Deze methodologie is specifiek voor de echocardiograph met deze software. Andere softwarepakketten kunnen worden gebruikt met verschillende machines. - Na succesvolle opnamen, veeg uit de echocardiografie gel van de muis thorax, verwarming pad en transducer. Verwijder de tape van de ledematen en de staart.
- Laat de muis onder observatie op de verwarming pad, bedekt met weefsel te vermijden van geen onnodige licht blootstelling en warmte verlies, totdat het kielzog omhoog
- Zet het dier terug in zijn kooi.
- Analyseren opgenomen beelden van de M-stand van parasternal korte-axis Bekijk links ventriculaire (LV) afmetingen en functie te bepalen. Meten van de dikte van de wand LV anterior in systole en de diastole (LVAWs en LVAWd), de LV interne einde-systolische en diastolische einde diameters (LVIDs en LVIDd), en de LV posterieure wanddikte (LVPW) in de systole en de diastole (LVPWs en LVPWd) met behulp van de identificatie van de weefsel-bloed-interface op de opgeslagen beelden.
- De diastolische dimensies te meten op het tijdstip van de schijnbare maximale LV diastolische afmetingen en einde-systolische afmetingen ten tijde van de meest anterior systolische excursie van de achterste muur van LV LV. Het touchscreen van de kraan op de " analyseren " pictogram en klik vervolgens op de " LVAWd " pictogram. Positie van de elektronische remklauw op het raakvlak van de rechts-ventriculaire Holte en de voorste muur van LV in diastole.
- Plaats van de elektronische remklauw op het raakvlak tussen de voorste muur van LV en de holte van de LV te verkrijgen van de LV diastolische anterior wanddikte; de software zal direct overschakelen naar de einde-diastolische binnenmaat LV.
- Positie van de remklauw op het raakvlak van de LV-Holte en de achterste muur van de LV te verkrijgen van de einde-diastolische binnendiameter LV; de software zal overschakelen naar de LV achterste muur Laagdiktemeting.
- De remklauw op de interface tussen de achterste muur van LV en het hartzakje positie te verkrijgen van de LV diastolische posterieure wanddikte. Voor LV systolische dimensies, tik op het scherm van de aanraking op de " LVAWs " pictogram en positie de elektronische remklauw op het raakvlak van de rechts-ventriculaire Holte en de voorste muur van LV in systole.
- Plaatst de elektronische remklauw op het raakvlak van de voorste muur van LV en de holte van de LV te verkrijgen van de LV systolische anterior wanddikte. Herhaal het proces zoals hierboven beschreven voor de eind-systolische binnendiameter voor LV en de LV systolische posterieure wanddikte. De toonaangevende Conventie aangenomen door de Amerikaanse maatschappij van echocardiografie gebruiken om de grenzen van endocardial en epicardial 13 , 27.
Opmerking: LV contractiele functieparameters worden automatisch berekend met behulp van de vorige metingen. De LV fractionele verkorten (FS) wordt gedefinieerd als FS (%) = [(LVIDd-LVIDs)/LVIDd] x 100. De LV ejectie fractie (EF) wordt berekend met de formule voor de gewijzigde Teicholz, waar EF (%) = [(LVIDd3-LVIDs3)/LVIDd 3] x 100 12. Verwijzen naar figuur 1A en B. - De gegevens opslaan op cd of een USB-geheugensticks en maken van back-ups.
- Invoer, analyseren, en de gegevens met behulp van de juiste software exporteren.
Opmerking: Na deze basislijnmetingen, het experiment kan worden onderbroken. Als een directe vergelijking tussen knock-out dieren en wild-type nestgenoten wilt uitvoeren, gaat u verder met de histologische analyses 6. Voor Cre-ERT2; Lox/lox muis lijnen, de volgende dag voortgezet met tamoxifen inductie door i.p. injectie, als beschreven 5 , 24. Als inducerende experimentele myocardiaal infarct door de afbinding van de linker coronaire 5 , 28, de operatie kan worden uitgevoerd direct na de echocardiographic metingen, wanneer de muizen zijn onder verdoving. Anders, een minimale vertraging van één week tussen de twee rondes van de verdoving moet worden gehandhaafd om te beperken van het aantal postoperatieve letaliteit.
2. Bereiding van de monsters van hart voor histologisch evaluatie
- offeren de dieren door cervicale dislocatie. De gewichten van hun lichaam te meten. Desinfecteren van de borst en de buik met behulp van een 70% alcohol doekje.
- Maken een dwarse incisie in de huid 1 cm distale het borstbeen. Met behulp van botte pincet, verwijder de huid van de thorax, in de richting van het hoofd. Houd het borstbeen licht met een fijne Tang en open het middenrif door het botte uiteinde van fijne schaar.
- Knippen de ribbenkast aan beide zijden parallel aan het borstbeen. Het borstbeen bewegen in de richting van het hoofd. Zoek het hart in de borstkas. Houd de vasculaire kofferbak van het hart met de fijne pincet en snijd hieronder met behulp van fijn schaar.
- Openen van de borst en accijnzen het hele hart uit de thorax, meten van het gewicht van het hart en stellen een hart-to-body gewicht verhouding 4 , 5 , 6 , 23 , 29 , 30 < /sup >.
- Fix het hart in 2 mL van de neutrale gebufferde formaline 10% oplossing in 15 mL buizen 's nachts bij 4 ° C.
Let op: gevaar! Werk met formaline oplossingen moet gebeuren in een chemische zuurkast; Draag handschoenen en veiligheidsbril.
Opmerking: Als de samenstelling van de buffer voor formaline oplossingen met verschillende leveranciers varieert, gebruiken dezelfde leverancier gedurende de studie. - De volgende dag, de harten van het dwarsvlak dat, in het midden, knippen en ze vervolgens overbrengen naar cassettes voor het insluiten van paraffine, waarop wordt uitgevoerd in het laboratorium van de pathologie met behulp van een geautomatiseerde insluiten apparaat.
- Uitvoeren segmenteren.
- Sectie paraffine blokkeert bij een dikte van 3 µm met behulp van een microtoom en drijven hen in een water van 40 ° C met gedestilleerd water bad.
- Transfer de secties op dia's. De dia's droge overnachting op een 37 ° C incubator toestaan en hen bewaren bij 4 ° C tot parasols.
Opmerking: Het protocol kan worden onderbroken hier totdat de gebruiker klaar is voor de kleuring (stap 3).
- Deparaffinize en hydrateren het weefsel slides.
- Plaats van de dia's in de potten met inzetglas in een oven van 55 ° C gedurende 10 minuten te smelten de paraffine kleuring.
- Deparaffinize de dia's in twee wijzigingen van 200 mL xyleen of xyleen substituut voor elke 5 min.
Let op: Zeer brandbaar en giftig! Werken in een chemische zuurkast; Draag handschoenen en veiligheidsbril. - Worden de dia's overbrengen in 200 mL 100% alcohol. Twee wijzigingen voor elke 3 min en breng eens via 200 mL van 95% alcohol voor 3 min.
Let op: Zeer brandbaar! Blijf uit de buurt van ontstekingsbronnen; nr-rokend. - Spoel tweemaal in 200 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voor elke 5 min en ga verder met stap 3, 4 of 5.
3. De Haematoxyline en eosine-kleuring
- spoel van de dia's met hun secties in gedestilleerd water.
- Vlekken van de kernen met haematoxyline oplossing gedurende 8 minuten
- Rinse in stromend kraantjeswater voor 10 min.
- Vlek met eosine oplossing gedurende 2 minuten
- Dehydrate drie keer gedurende 2 min. in 100% ethanol (EtOH). Schakel driemaal gedurende 2 min. in xyleen of xyleen plaatsvervanger. Mount in een medium xyleen gebaseerde montage.
- Foto van de dia's en meet de diameter van de cardiomyocyte op het niveau van de kern in lengterichting secties van het hart septum. Meten van ten minste 100 cellen per sectie en per hart driedelig.
4. WGA kleuring
- broeden van de dia's verkregen stap 2.7 met tetramethylrhodamine (of andere fluorescente kleurstoffen)-geconjugeerd WGA (1:100 in PBS) gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur in een vochtige kamer.
- Spoel driemaal met PBS voor elke 5 min.
- Mount met fluorescentie montage DAPI met media. Bewaren bij 4 ° C in het donker vóór analyse.
Let op: Draag een veiligheidsbril en compatibel chemisch bestendige handschoenen. - De dia's fotograferen.
- Gebruik een Microscoop uitgerust met fluorescentie epi-verlichting en filter ingesteld voor DAPI en tetramethylrhodamine (Zie de Tabel van de materialen). Het diafragma ingesteld op het maximum en de helderheid aan autoblootstelling.
- Ophaal aparte afbeeldingen op 400 x vergroting voor de blauwe en de rode kanalen. Open de afbeeldingen in ImageJ. De helderheid en het contrast indien nodig (afbeelding > aanpassen > helderheid/contrast).
- Elke afbeelding ingesteld op 8-bits (afbeelding > Type > 8-bits). Overlay van de afbeeldingen van de DAPI en WGA. Gebruik van het blauwe kanaal voor DAPI en het rode kanaal voor WGA; de groene en grijze kanalen ingesteld op geen (afbeelding > kleur > kanalen samenvoegen) 31.
- Bepalen de cardiomyocyte diameters op het niveau van de kern in dwarse secties van het hart septum.
- Definiëren de omvang van de beelden in ImageJ. Voor dit doel, het fotograferen van een object van bekende grootte (bijvoorbeeld een hemocytometer kamer op hetzelfde percentage als het hart secties; stap 4.4).
- Het lineaire hulpprogramma gebruiken voor het tekenen van een lijn van begin tot eind van de bekende structuur (Analyze > Stel schaal).
Opmerking: De afstand in pixels worden weergegeven automatisch; de bekende afstand en lengte-eenheid moet worden ingevoerd. Doorgaan met cardiomyocyte metingen op het niveau van de nucleus. - Een rechte lijn tekenen van het membraan van de WGA-positief door de DAPI-positieve kern op de tegenovergestelde site van de celmembraan van de WGA-positieve (Analyze > maatregel). In het resultatenvenster, zorg ervoor dat de waarden voor lengte een zinvol aantal decimalen (Analyze > Set metingen > decimalen).
- Maatregel ten minste 100 cellen per sectie en driedelig per hart. De resultaten exporteren naar Excel (Klik op resultaten > bestand > opslaan als > .csv) 6 , 31.
5. Pecam-1 immunokleuring
- uitvoeren antigeen ontmaskering.
- Toevoegen 1600 mL Natriumcitraat buffer (10 mM Natriumcitraat 0,05% Tween 20, pH 6.0) een snelkookpan. Plaats de snelkookpan op de kookplaat en zet hem op volle kracht. Beveilig niet het deksel van de snelkookpan op dit punt; gewoon het rusten bovenop.
Let op: Hot! - Zodra de buffer natriumcitraat is koken, overbrengen in de dia's vanaf stap 2.5 de snelkookpan. Beveilig de snelkookpan deksel. Zodra het fornuis volledige druk bereikt heeft, wachten op 7 min. Wanneer 7 minuten zijn verstreken, uitschakelen van de kookplaat en plaats de snelkookpan in een lege gootsteen. Activeren van de druk release klep en lopen koud water over het fornuis. Zodra het heeft-drukkend, open het deksel en lopen koud water in de snelkookpan voor 5 min. plaats de dia's in 200 mL PBS.
Opmerking: Als alternatief, magnetron antigeen ontmaskering kan worden gebruikt, hoewel het risico van oververhitting wordt groter.
- Toevoegen 1600 mL Natriumcitraat buffer (10 mM Natriumcitraat 0,05% Tween 20, pH 6.0) een snelkookpan. Plaats de snelkookpan op de kookplaat en zet hem op volle kracht. Beveilig niet het deksel van de snelkookpan op dit punt; gewoon het rusten bovenop.
- Gebruik 0,3% waterstofperoxide in methanol blok endogene peroxidase activiteit voor 5 min. spoelen de dia's voor drie keer gedurende 2 minuten elke in 200 mL PBS.
Let op: Brandbare en giftige! - Broeden van de dia's gedurende 15 min. in verdunde normale blokkerende serum (5% normale geit serum in PBS) waarin ook een avidin blok (4 druppels in 1 mL).
- Zorgvuldig Tik op de vloeistof uit de secties en incubeer hen met Pecam-1 antilichaam van konijn, verdunde 1:50 in PBS met 2,5% normale geit serum en 4 druppels van biotine blok per mL. Incubeer de dia's 's nachts in een vochtige kamer bij 4 ° C.
- Wassen de dia's drie keer voor elke 5 min in 200 mL PBS. Incubeer de secties met biotinyleerd geit anti-konijn IgG antilichamen verdund 1:200 in PBS met 2,5% normale geit serum gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Wassen van de dia's drie keer voor elke 5 min in 200 mL PBS.
- Broeden tHij secties met een peroxidase avidin/Biotine-gebaseerd systeem voor 20 min (reagens A en reagens B moeten worden gecombineerde 30 minuten voorafgaande te gebruiken). Wassen van de dia's drie keer voor elke 5 min in 200 mL PBS.
- Los 1 3,3 '-diaminobenzidine (DAB) en 1 ureum waterstofperoxide tablet in 5 mL tweemaal gedestilleerd water. Incubeer de secties met DAB oplossing voor ongeveer 3 min, zorgvuldig toezicht op de ontwikkeling van de kleur. Stoppen van de reactie van kleur door het voorzichtig wassen de dia's in 200 mL PBS.
Let op: Kankerverwekkende; chemisch bestendige handschoenen dragen! - Counterstain de kernen voor 6 min met haematoxyline. Spoel in stromend kraantjeswater voor 2 min. Dehydrate drie keer voor elke 2 min in 200 mL 100% alcohol. Schakel driemaal voor 2 min elke in 200 mL xyleen of invaller xyleen. Mount in een medium xyleen gebaseerde montage.
- Foto van de dia's (ten minste tien velden bij 40 x vergroting van het hart septum van elk hart) en meet de Pecam-1 gebied dichtheid met behulp van de vrij beschikbare ImageJ software 31. Gebruik de kleur deconvolutie 32 plugin voor DAB en haematoxyline en aanpassen van het afbeeldingscontrast op hetzelfde niveau.
Opmerking: In het geval dat de bruine en paars/blauwe kleur hebben aanzienlijke spectrale overlap, die problemen kan veroorzaken met kleur deconvolutie, men kan proberen verschillende merken van Haematoxyline oplossing voor duidelijke, lichtblauwe nucleaire kleuring. Als alternatief, immunofluorescentie of handmatig tellen van de haarvaten kon worden uitgevoerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In Figuur 1tonen representatieve echocardiographic opnames het nut van echocardiografie te identificeren cardiale fenotypes bij genetisch gemodificeerde muizen. Het verschil tussen een muis met normale hartfunctie (figuur 1A) en een dier met een verwijde linkerventrikel en verminderde LV functie (figuur 1B) kan gemakkelijk worden geïdentificeerd. Figuur 2 geeft een vergelijking van cardiomyocyte diameter metingen in dieren zonder (figuur 2A) en met hypertrofie van het hart (figuur 2B) met behulp van paraffine Haematoxyline-eosine-gekleurd hart secties en metingen van longitudinale secties van hartweefsel. Figuur 3 toont de meting van de cardiomyocyte dwarse diameters met behulp van secties van de WGA gebeitste paraffine uit hart van besturingselement muizen (Figuur 3 bis) en dieren met hypertrofie van het hart (figuur 3B). Figuur 4 toont het nut van Pecam-1 immunohistochemistry (DAB substraat, bruine vlekken) van cardiale secties om te bepalen van de dichtheid van het vaartuig van normale hartweefsel (figuur 4A) en harten met verhoogde angiogenese (figuur 4B ).
Figuur 1: Standaard-resolutie echocardiografie (> 10 MHz) maatregel LV systolische en diastolische dimensies en hartfunctie in muizen met verwijde hypertrofie van het hart na myocardinfarct ten opzichte van de controledieren.
Representatieve echocardiographic opnames van normale, gezonde muizen (A) en dieren met LV dilatatie en verminderde LV functie na een myocardinfarct (Tie2-CreERT2; PPARβ/δ + Tamoxifen muizen)5 (B). De LVAW, LVID en LVPW worden aangegeven. De witte bars vertegenwoordigen systolische en diastolische meetpunten. Zij komen overeen met de cursor punten ingesteld voor metingen en worden toegelicht in protocol stap 1.12. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: de Haematoxyline-eosine-gekleurd secties voor het meten van de cardiomyocyte diameters in lengterichting verdeelde cellen van muizen met cardiale hypertrofie en controle dieren uitgezet. Representatieve beelden van cardiomyocyte diameters in muizen met normale cardiomyocyte maten (A) en dieren met verhoogde cardiomyocyte maten (Tie2-CreERT2; PPARβ/δ + Tamoxifen muizen)5 (B). De zwarte lijnen geven de gemeten diameters. De waarden voor elke meting worden vertegenwoordigd. Schaal bars = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: WGA gebeitste secties voor het meten van de dwarse diameters cardiomyocyte in secties van hartweefsel van muizen met verwijde hypertrofie van het hart versus controledieren. Representatieve beelden voor cardiomyocyte diameters in muizen met normale cardiomyocyte grootte (A) en dieren met verhoogde cardiomyocyte maten (Tie2-CreERT2; PPARβ/δ + Tamoxifen muizen)5 (B). Kernen werden counterstained met DAPI. De witte lijnen geven de gemeten diameters op het niveau van de kernen (blauw). De waarden voor elke meting worden vertegenwoordigd. Schaal bars = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Pecam-1 immunolabeled secties voor het analyseren van de cardiale vaartuig dichtheid in controle muizen en dieren met verhoogde angiogenese.
Representatieve beelden voor het vaartuig labelen in muizen met normale vasculaire dichtheid (A) en dieren met verbeterd vascularisatie (Tie2-CreERT2; PPARβ/δ + Tamoxifen muizen)5 (B). Kernen werden counterstained met haematoxyline. De pijlen wijzen naar Pecam-1-positieve vaartuigen. Schaal bars = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Verschillende methoden hebben ontwikkeld om te evalueren van de cardiale structuur en functie in muizen, met inbegrip van echocardiografie, contrast-enhanced MRI, micro CT en PET-scan. Vanwege de kosteneffectiviteit en eenvoud is echocardiografie de meest gebruikte techniek voor functionele analyse in muizen11. In het algemeen, vanwege de kleine omvang van het hart en de hoge frequentie van de hartslag bij muizen, omvormers met een frequentie > 10 MHz moet worden gebruikt, hoewel succesvol metingen hebben gemeld met 8 of 9 MHz omvormers4,7 . Zoals cardiale functie nauw aan lichaamstemperatuur en cardiale frequentie verwant is, is het belangrijk om te controleren van deze parameters tijdens de studie. Plaatsen van de muis op een verwarming pad is essentieel voor het constant houden van de lichaamstemperatuur van de narcose dier. In het ideale geval moet een gecontroleerde verwarming pad met een rectale sonde om in te stellen van de lichaamstemperatuur tot 38 ° C worden gebruikt. Als dit niet beschikbaar is, moet de verwarming pad worden ingesteld op twee tot drie graden boven deze waarde. Verwarming lampen moet worden voorkomen, aangezien ze bemoeilijken de taak voor de onderzoeker en het risico op oververhitting van de dieren.
Om te controleren de hartslag en de hartfunctie, is het type van anesthesie uiterst belangrijk. De meeste studies gebruik Isofluraan, zoals verdoving gemakkelijk is te veroorzaken bij inademing in de zaal van een inductie (3% Isofluraan), via een inademing masker (1-2% Isofluraan) kan worden gehandhaafd, en slechts van korte duur is. Andere gebruikte stoffen zijn 2,2,2-tribromoethanol, pentobarbital en ketamine + xylazine mengt11,12. Verrassend, Isofluraan is gemeld aan de hartfunctie in echocardiographic metingen in gevaar brengen, en dit effect werd nog duidelijker in de ketamine + xylazine groep11. Ketamine alleen werkte het beste in deze studie11. Gao et al.. de meest reproduceerbare resultaten met 2,2,2-tribromoethanol12gemeld. De resultaten waren in hetzelfde bereik voor Isofluraan 2,2,2-tribromoethanol en pentobarbital12. Ook, hartslag waren niet anders in de 2,2,2-tribromoethanol en pentobarbital12groepen. Hart et al. rapporteerde lagere tarieven van het hart in de ketamine + xylazine groep in vergelijking met de groep van 2,2,2-tribromoethanol16. In onze experimenten met behulp van verschillende transgene muis spanningen en pentobarbital anesthesie, de gemiddelde hartslag varieerde tussen de 350 en 450 bpm. Niettemin, uitwerpen breuken waren > 80%, hetgeen overeenkomt met de waarden in de bewuste dieren11. Echocardiographic metingen onder omstandigheden van onze laboratorium4,5,6 in hetzelfde bereik als zijn basislijn gemeld elders11,,12,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,26 . In tegenstelling tot pentobarbital, worden ketamine en Isofluraan 2,2,2-tribromoethanol gekenmerkt door snelle begin en herstel. Dus moet de timing tussen narcose en de echocardiographic metingen hetzelfde zijn voor alle dieren in de studie om te voorkomen dat verschillende graden van terugwinning van anesthesie. Pentobarbital langer werkt, maar heeft het nadeel van een klein therapeutisch venster, waardoor het noodzakelijk wordt om de dosis strak met betrekking tot lichaamsgewicht. De langdurige narcose met behulp van pentobarbital heeft het voordeel dat, na echocardiographic basislijnmetingen, chirurgische ingrepen kan worden uitgevoerd zonder de noodzaak voor opnieuw injectie5. Repetitieve anesthesie met behulp van pentobarbital moet worden vermeden als, in onze ervaring, injecties met een tussenpoos van minder dan één week resulteerde in verhoogde postoperatieve sterfte.
Bij het uitvoeren van echocardiografie bij muizen met een > 10 Mhz transducer, de kwaliteit van de foto's zou voldoende moeten zijn om te bepalen van globale LV functie. Meerdere foto's moeten worden genomen voor elk dier om beat-to-beat variaties en bewegingsartefacten te verminderen. Deskundig advies van een opgeleide cardioloog of een wetenschapper met ervaring in echocardiografie bij muizen moet worden gevraagd aan het begin om te evalueren van de kwaliteit van de beelden. Meeste echocardiografie machines berekenen EF van interne diameter LV met behulp van de Teicholz formule11,12. Zelfs wanneer LV afmetingen eenvoudig zijn te meten, geven ze onvolmaakt eenbeoordeling van LV volumes en gebieden omdat de LV niet aan een ideale, vereenvoudigde geometrische vorm voldoet. Noch fractionele verkorting noch ejectie fractie verkregen met de formule Teicholz is een perfecte parameter om te bepalen van LV contractiele functie, zoals ze zijn allebei gebaseerd op een geometrische aanname en beschrijven van de contractility van slechts twee muren. Ejectie fractie beoordeeld met de dubbeldekker Simpson's methode zou nauwkeuriger, maar dit was onmogelijk te verkrijgen in elk dier met de hier gebruikte apparatuur.
Wij geconfronteerd na myocardinfarct, verschillende problemen in verband met de echocardiographic beeldvorming. Eerst, werd de beeldkwaliteit sterk gehinderd door het litteken Thoracotomie. Ten tweede, dieren waren veel gevoeliger voor herhaalde anesthesie. Ten slotte, M-modus-gebaseerde LV volume en functie metingen aannemen dat LV geometrie homogeen is. Dientengevolge, wordt het gebruik van deze indexcijfers controversiëler in aanwezigheid van LV muur beweging afwijkingen na een myocardinfarct.
In onze handen, het gebruik van een 15-MHz-sonde toegestaan voor de occasionele, maar niet systematische, opname van Doppler beelden. Veel hogere frequenties zijn vereist om te bepalen van LV regionale functie of myocardiale contrast echocardiografie, die alleen kan worden verkregen met apparatuur gewijd aan knaagdieren12uitvoeren.
Gezien de extra mogelijkheden en de hogere resolutie van deze knaagdier-specifieke systemen, moet men overwegen ze in de toekomst te gebruiken. Nadelen zijn de hogere kosten en de noodzaak van een speciale ruimte. Deze high-end, knaagdier-dedicated echocardiographs zullen winstgevend zijn, alleen als genoeg dieren onderzocht zijn en de apparatuur voor het gebruiken van een kritisch aantal wetenschappers. Met de speciale opleiding aangeboden voor deze machines, kunnen ze worden gebruikt door wetenschappers niet deskundig in de cardiologie. De klinische echocardiografie apparatuur biedt een beperkte resolutie, zoals hierboven vermeld. Toch is het nog steeds succesvol gebruikt in verschillende ervaren laboratories11,12; gemakkelijk kan worden gebruikt door geschoolde wetenschappers en cardiologen; is meer mobiel en minder streng zijn op een speciale ruimte; en, als gevolg van het hoge aantal machines, zorgt voor de behandeling van de verschillende beschikbare opties te reduceren van kosten (bijvoorbeeld huren, verkrijgen van uitrusting die niet in klinische gebruik of tweedehands aankopen).
Voor histologisch analyses is het eerste kritieke punt om de tijd tussen orgel afzondering en fixatie van het weefsel te minimaliseren. Zoals in dit protocol, zijn de meeste kleuring en histologische analyses gebaseerd op doorvallend licht microscopie; onderdompeling fixatie van het hartweefsel in formaline is voldoende. Als een project richt zich meer op de fluorescentie microscopische kleuring, moet men overwegen de perfusie fixatie van narcose dieren te verwijderen van de rode bloedcellen van het weefsel, die lichte auto-fluorescentie vertonen.
Om te voorkomen dat de variaties in de paraffine inbedding, we gebruiken een geautomatiseerde insluiten apparaat. Aangezien het smeltpunt en hardheid tussen de merken van paraffine verschillen, wordt u aangeraden dezelfde leverancier gedurende de studie gebruiken. Paraffine afdelen moet worden uitgevoerd op vooraf gekoelde blokken met behulp van een roterende microtoom. Sectie dikte moet constant worden gehouden. Een dikte van 3-µm sectie kunt duidelijk visualisatie van membraan grenzen in de Haematoxyline-eosine-gekleurd hart secties, die nodig is voor de nauwkeurige meting van cardiomyocyte diameters. Als de vorm van cardiomyocytes onregelmatig is, moeten de metingen worden verricht op het niveau van de kern. WGA kleuring biedt een alternatieve manier om de celmembraan vlek en resulteert in dezelfde waarden als de Haematoxyline-eosine-kleuring. Voordat Morfometrische analyses, men moet duidelijk aangeven welk deel van het hart (dat wil zeggen, links of rechts ventriculaire gratis muur of septum) zal worden gemeten en of cardiomyocyte dwarsdoorsneden worden bepaald in de lange of korte as. Als gevolg van de dwarse, spiraal en longitudinale richting van cardiomyocytes in het hart is het mogelijk om te verkrijgen op dezelfde transversale gedeelte langs- en dwarswapening baanvakken cardiomyocytes. Of longitudinale of een transversale diameters zijn gemeten, is een kwestie van Conventie, zolang de cellen worden geanalyseerd op het niveau van de kern.
In onze studies, we waargenomen een overeenkomst tussen de echocardiographic afmetingen en het gewicht van het hart-to-body ratio's en cardiomyocyte maten4,5,6, maar histologische metingen van cardiomyocyte grootte niet altijd overeen met de waarden van de ejectie Fractie. Bijvoorbeeld, resulteert oefening opleiding in verhoogde cardiale afmetingen, met een bewaarde ejectie Fractie en verhoogde cardiomyocyte diameters. Gedecompenseerde hartinsufficiëntie wordt echter gekenmerkt door verhoogde cardiale afmetingen, met een verminderde ejectie Fractie en verhoogde cardiomyocyte diameter33. Bovendien toonden we onlangs dat verhoogde cardiale vaartuig dichtheid als gevolg van endotheel-specifieke overexpressie van PPARβ niet in verbeterde cardiale functie onder uitgangssituatie, noch in verbeterde herstel na myocardinfarct5 resulteert .
Immunohistochemistry is het belangrijk om op te nemen van de negatieve controles en voor het uitvoeren van de verschillende blokkerende stappen in het protocol. Het antigeen ontmaskeren stap in het protocol is specifiek voor het primaire antilichaam gebruikt. Verschillende primaire antilichamen is het noodzakelijk om te bepalen of de laag - of hoog-pH ontmaskeren buffers in een beter signaal resulteren. Verschillende fixatie technieken kunnen worden gebruikt voor het detecteren van een specifieke antigeen. Bijvoorbeeld, is Pecam-1 labeling gemeld aan werken het beste op zink-vaste, paraffine-ingebedde weefsel, terwijl de dezelfde fixatie nodig extra maatregelen ter vermindering van de achtergrond voor een antilichaam thrombomodulin34. Zo gebruiken we regelmatig formaline fixatie, waardoor voor de uitbreiding van de studie aan een verscheidenheid van verschillende antigenen. Alternatief voor Pecam-1 immunokleuring, isolectin B4 wordt vaak gebruikt voor het visualiseren van vaartuigen. Naast een deel van de endotheliale cellen35etiketten isolectin B4 ook glia36 en macrofagen37. Bovendien kan een scala aan antigenen worden gebruikt om te onderscheiden tussen de endotheliale cellen van arteriële en veneuze38. Een elegante manier om te visualiseren functionele geperfundeerd schepen of om te bepalen van schip kiemen of regressie is de intraveneuze injectie van fluorescentie-coupled lectine, gevolgd door de analyse van cryosecties24. Echter, deze aanpak grotendeels beperkt de mogelijkheden te detecteren extra antigenen en Morfometrische analyses te wijten aan de verschillende kwaliteit van de cryosecties uitvoeren.
Op immunostained secties waar het signaal is gevisualiseerd met DAB, kan de dichtheid van het gebied worden kwantitatief bepaald met behulp van vrij beschikbare ImageJ software. Echter als het signaal niet lineair is, komt de mate van bruine kleuring niet precies overeen met het niveau van eiwit expressie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Het werk werd gesteund door de Franse regering (National Research Agency, ANR) via het programma "Investeringen voor de toekomst" LABEX SIGNALIFE (referentie ANR-11-LABX-0028-01) en door subsidies aan K. D. W. van de Association pour la Recherche sur le Cancer, Fondation de France, en Plan kanker Inserm. D. B. en A. V. ontvangen beurzen van de Fondation pour la Recherche Médicale en van de stad van Nice, respectievelijk. De echocardiograph en de transducer waren vriendelijk geboden door Philips. Wij danken A. Borderie, S. Destree M. Cutajar-Bossert, A. Landouar, A. Martres, A. Biancardini en S. M. Wagner voor hun deskundige technische bijstand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wheat germ agglutinin (WGA) conjugated tetramethylrhodamine | Life Technologies, Molecular Probes | W849 | |
| Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody | Vectorlabs | BA-1000 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vectorlabs | SP-2001 | |
| VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard) | Vectorlabs | PK-6100 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vectorlabs | H-1200 | |
| SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4168 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma | H1009 | |
| Anti-Pecam-1 (CD31) antibody | Abcam | ab28364 | |
| Ultrasound transmission gel, Gel Aquasonic 100 | Parker | ||
| Linear ultrasound probe, L15-7io | Philips Healthcare | ||
| Echocardiograph, IE33 xMATRIX | Philips Healthcare | ||
| Microscope, Leica DMi8 | Leica | ||
| Fluorescence Filterset DAPI | Leica | 11525304 | |
| Filterset TxR | Leica | 11525310 | |
| Digital Camera, SPOT RT3 Color Slider | Spot Imaging | ||
| Imaging Software, SPOT 5.2 Advanced and Basic Software | Spot Imaging | ||
| Imaging Computer | Dell | ||
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Large Scissors | Fine Science Tools | 14501-14 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10023-00 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11650-10 | |
| Rodent shaver | Harvard Apparatus | 34-0243 | |
| cassettes for paraffin embedding | Sakura | 4155F | |
| neutral buffered Formalin | Sakura | 8727 | |
| Xylene | Sakura | 8733 | |
| Paraffine TEK III | Sakura | 4511 | |
| automated embedding apparatus, Tissue-Tek VIP | Sakura | 6032 | |
| paraffin-embedding station Tissue-Tek TEC 5 | Sakura | 5229 | |
| microtome blades,Accu-Edge S35 | Sakura | 4685 | |
| microscopy slides, Tissue-Tek | Sakura | 9533 | |
| cover slips, Tissue-Tek | Sakura | 9582 | |
| Mounting medium Tissue-Tek | Sakura | 1408 | |
| slide boxes | Sakura | 3958 | |
| eosine solution | Sakura | 8703 | |
| hematoxyline solution | Sakura | 8711 | |
| microtome, RM2125RT | Leica | 720-1880 (VWR) | |
| water bath, Leica HI1210 | Leica | 720-0113(VWR) | |
| Ethanol | VWR | ACRO444220050 | |
| 15 ml tubes | VWR | 734-0451 | |
| staining glass dish | VWR | MARI4220004 | |
| staining jars | VWR | MARI4200005 | |
| Incubator | Binder | 9010-0012 | |
| DAB and urea hydrogen peroxide tablets, SIGMAFAST 3,3′-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4293 | |
| PBS (10X) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 |
References
- Ormandy, E. H., Dale, J., Griffin, G. Genetic engineering of animals: ethical issues, including welfare concerns. Can Vet J. 52 (5), 544-550 (2011).
- Karl, T., Pabst, R., von Hörsten, S. Behavioral phenotyping of mice in pharmacological and toxicological research. Exp Toxicol Pathol. 55 (1), 69-83 (2003).
- Phoon, C. K., Turnbull, D. H.
- Wagner, N., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor beta stimulation induces rapid cardiac growth and angiogenesis via direct activation of calcineurin. Cardiovasc Res. 83 (1), 61-71 (2009).
- Wagner, K. D., Vukolic, A., Baudouy, D., Michiels, J. F., Wagner, N. Inducible Conditional Vascular-Specific Overexpression of Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Beta/Delta Leads to Rapid Cardiac Hypertrophy. PPAR Res. 2016, 7631085 (2016).
- Ghanbarian, H., et al. Dnmt2/Trdmt1 as Mediator of RNA Polymerase II Transcriptional Activity in Cardiac Growth. PLoS One. 11 (6), e0156953 (2016).
- Meguro, T., et al. Cyclosporine attenuates pressure-overload hypertrophy in mice while enhancing susceptibility to decompensation and heart failure. Circ Res. 84 (6), 735-740 (1999).
- de Araújo, C. C., et al. Regular and moderate aerobic training before allergic asthma induction reduces lung inflammation and remodeling. Scand J Med Sci Sports. 26 (11), 1360-1372 (2016).
- Benavides-Vallve, C., et al. New strategies for echocardiographic evaluation of left ventricular function in a mouse model of long-term myocardial infarction. PLoS One. 7 (7), e41691 (2012).
- Colazzo, F., et al. Murine left atrium and left atrial appendage structure and function: echocardiographic and morphologic evaluation. PLoS One. 10 (4), e0125541 (2015).
- Pachon, R. E., Scharf, B. A., Vatner, D. E., Vatner, S. F. Best anesthetics for assessing left ventricular systolic function by echocardiography in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308 (12), H1525-H1529 (2015).
- Gao, S., Ho, D., Vatner, D. E., Vatner, S. F.
- Mor-Avi, V., et al. Current and evolving echocardiographic techniques for the quantitative evaluation of cardiac mechanics: ASE/EAE consensus statement on methodology and indications endorsed by the Japanese Society of Echocardiography. J Am Soc Echocardiogr. 24 (3), 277-313 (2011).
- Collins, K. A., Korcarz, C. E., Lang, R. M. Use of echocardiography for the phenotypic assessment of genetically altered mice. Physiol Genomics. 13 (3), 227-239 (2003).
- Rottman, J. N., Ni, G., Brown, M. Echocardiographic evaluation of ventricular function in mice. Echocardiography. 24 (1), 83-89 (2007).
- Hart, C. Y., Burnett, J. C., Redfield, M. M. Effects of avertin versus xylazine-ketamine anesthesia on cardiac function in normal mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (5), H1938-H1945 (2001).
- Moran, C. M., Thomson, A. J., Rog-Zielinska, E., Gray, G. A. High-resolution echocardiography in the assessment of cardiac physiology and disease in preclinical models. Exp Physiol. 98 (3), 629-644 (2013).
- Fayssoil, A., Tournoux, F. Analyzing left ventricular function in mice with Doppler echocardiography. Heart Fail Rev. 18 (4), 511-516 (2013).
- Schoensiegel, F., et al. High throughput echocardiography in conscious mice: training and primary screens. Ultraschall Med. 32, Suppl 1. S124-S129 (2011).
- Yariswamy, M., et al. Cardiac-restricted Overexpression of TRAF3 Interacting Protein 2 (TRAF3IP2) Results in Spontaneous Development of Myocardial Hypertrophy, Fibrosis, and Dysfunction. J Biol Chem. 291 (37), 19425-19436 (2016).
- Jara, A., et al. Cardiac-Specific Disruption of GH Receptor Alters Glucose Homeostasis While Maintaining Normal Cardiac Performance in Adult Male Mice. Endocrinology. 157 (5), 1929-1941 (2016).
- Kerr, B. A., et al. Stability and function of adult vasculature is sustained by Akt/Jagged1 signalling axis in endothelium. Nat Commun. 7, 10960 (2016).
- Wagner, N., et al. Coronary vessel development requires activation of the TrkB neurotrophin receptor by the Wilms' tumor transcription factor Wt1. Genes Dev. 19 (21), 2631-2642 (2005).
- Wagner, K. D., et al. The Wilms' tumour suppressor Wt1 is a major regulator of tumour angiogenesis and progression. Nat Commun. 5, 5852 (2014).
- Yang, X. P., et al. Echocardiographic assessment of cardiac function in conscious and anesthetized mice. Am J Physiol. 277 (5 Pt 2), H1967-H1974 (1999).
- Rottman, J. N., et al. Temporal changes in ventricular function assessed echocardiographically in conscious and anesthetized mice. J Am Soc Echocardiogr. 16 (11), 1150-1157 (2003).
- Quiñones, M. A., et al. Recommendations for quantification of Doppler echocardiography: a report from the Doppler Quantification Task Force of the Nomenclature and Standards Committee of the American Society of Echocardiography. J Am Soc Echocardiogr. 15 (2), 167-184 (2002).
- van Laake, L. W., et al. Monitoring of cell therapy and assessment of cardiac function using magnetic resonance imaging in a mouse model of myocardial infarction. Nat Protoc. 2 (10), 2551-2567 (2007).
- Wagner, K. D., et al. The Wilms' tumor suppressor Wt1 is expressed in the coronary vasculature after myocardial infarction. FASEB J. 16 (9), 1117-1119 (2002).
- Wagner, K. D., et al. RNA induction and inheritance of epigenetic cardiac hypertrophy in the mouse. Dev Cell. 14 (6), 962-969 (2008).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Ruifrok, A. C., Johnston, D. A. Quantification of histochemical staining by color deconvolution. Anal Quant Cytol Histol. 23 (4), 291-299 (2001).
- Lazzeroni, D., Rimoldi, O., Camici, P. G. From Left Ventricular Hypertrophy to Dysfunction and Failure. Circ J. 80 (3), 555-564 (2016).
- Ismail, J. A., et al.
- Benton, R. L., Maddie, M. A., Minnillo, D. R., Hagg, T., Whittemore, S. R. Griffonia simplicifolia isolectin B4 identifies a specific subpopulation of angiogenic blood vessels following contusive spinal cord injury in the adult mouse. J Comp Neurol. 507 (1), 1031-1052 (2008).
- Ayoub, A. E., Salm, A. K. Increased morphological diversity of microglia in the activated hypothalamic supraoptic nucleus. J Neurosci. 23 (21), 7759-7766 (2003).
- Maddox, D. E., Shibata, S., Goldstein, I. J. Stimulated macrophages express a new glycoprotein receptor reactive with Griffonia simplicifolia I-B4 isolectin. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (1), 166-170 (1982).
- dela Paz, N. G., D'Amore, P. A. Arterial versus venous endothelial cells. Cell Tissue Res. 335 (1), 5-16 (2009).
