Summary
L’examen échocardiographique est fréquemment utilisée chez les souris. Appareils à ultrasons à haute résolution coûteux ont été développés à cet effet. Ce protocole décrit une procédure échocardiographique abordable combinée avec histologique morphométrique des analyses pour déterminer la morphologie cardiaque.
Abstract
Un nombre croissant de modèles de souris génétiquement modifiées sont apparues ces dernières années. En outre, le nombre d’études pharmacologiques réalisées chez la souris est élevé. Caractérisation phénotypique de ces modèles murins nécessite également l’examen de la fonction cardiaque et de la morphologie. L’échocardiographie et l’imagerie par résonance magnétique (IRM) sont des méthodes couramment utilisées pour caractériser la fonction cardiaque et la morphologie chez la souris. Échocardiographiques et IRM des équipements spécialisés pour utilisation dans les petits rongeurs est coûteuse et nécessite un espace dédié. Ce protocole décrit les mesures cardiaques chez des souris en utilisant un système échocardiographique clinique avec une sonde vasculaire humaine de 15 MHz. Des mesures sont effectuées sur des souris adultes anesthésiés. Au moins trois séquences d’images sont enregistrées et analysées pour chaque animal en mode M dans la vue de court-axe parasternale. Par la suite, un examen histologique cardiaque est effectué et cardiomyocyte diamètres sont déterminés sur l’hématoxyline-éosine - ou germe de blé agglutinine (WGA)-paraffine coupes colorées. Densité de navire est déterminée morphométrique après immunomarquage Pecam-1. Le protocole a été appliquées avec succès à des études pharmacologiques et différentes génétiques des modèles animaux en conditions basales, ainsi qu’après infarctus expérimental par la ligature permanente de la gauche (d’artère coronaire descendante antérieure DAL). Dans notre expérience, étude échocardiographique est limitée aux animaux anesthésiés et est réalisable chez la souris adulte pesant au moins 25 g.
Introduction
Il existe une grande variété de modèles de souris génétiquement modifiées, et le nombre d’études pharmacologiques chez la souris est élevée1,2. Échographie et l’IRM sont des méthodes couramment utilisées pour la caractérisation phénotypique de la fonction cardiaque et de la morphologie chez ces souris modèles3. Le protocole présenté vise à analyser la fonction cardiaque et la morphologie chez la souris adulte. Il combine échocardiographiques, histologiques et immunohistochemical des mesures. L’examen échocardiographique est employé couramment dans la souris4,5,6,7,8,9,10,11, 12. Pachon et al. 11 identifié 205 études publiées dans Circulation, Circulation Research, American Journal of Physiology - coeur et la physiologie circulatoireet Recherche cardiovasculaire entre 2012 et 2015 qui a utilisé un examen échocardiographique chez les animaux.
L’échocardiographie est utilisé pour identifier des phénotypes cardiaques chez les souris génétiquement modifiées5,6,13,14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22, ainsi qu’analyser la fonction cardiaque chez l’hypertrophie chronique induite par la surcharge, l’ischémie myocardique et les modèles de cardiomyopathie chez la souris (évaluées à12). Équipement d’échocardiographie améliorée permet à la la mesure standard du ventricule gauche (LV) systoliques et diastoliques dimensions, Doppler tissulaire, échographie de contraste myocardique et l’évaluation de la fonction régionale de LV et réserve coronarienne 12. idéalement, l’examen échocardiographique doit être effectué chez des souris conscientes afin d’éviter les effets négatifs de l’anesthésie sur la fonction contractile, système nerveux autonome contrôle réflexe, et11la fréquence cardiaque. Néanmoins, cette approche est limitée par l’obligation de former les animaux ; difficultés à maintenir la température du corps stable ; artefacts de mouvement ; stress ; très hautes fréquences cardiaques ; et l’exigence d’au moins deux chercheurs réaliser l’expérience, en particulier si un grand nombre d’animaux est incriminés. Fait intéressant, une étude récente a indiqué aucune différence des paramètres échocardiographiques chez des animaux entraînés et inexpérimentées de19. Nous effectuons des mesures échocardiographiques chez les souris anesthésiés. Protocoles d’anesthésie différents seront discutés ci-dessous.
Bien que l’échocardiographie résolution standard (> 10 MHz) est suffisante pour mesurer LV systolique et diastoliques dimensions et la fonction cardiaque chez la souris adulte, la méthode est limitée dans sa description des phénomènes structurels sous-jacents. Ainsi, nous combinons les mesures in vivo avec histologique et immunohistological analyses pour mesurer, par exemple, densité de diamètre et navire cardiomyocyte. Autres études histologiques et immunohistological, telles que la détermination de la prolifération, l’examen de l’apoptose, mesures de taille d’infarctus, détermination de la fibrose et l’expression des marqueurs spécifiques, peuvent également être effectuées sur le même type de traité des tissus mais ne font pas l’objet du présent protocole. La combinaison de in vivo l’examen échocardiographique avec analyse histologique permet de mieux comprendre supplémentaires altérations structurelles sous-jacentes. Dans une étape supplémentaire, nous pouvons compléter ces mesures par des études moléculaires et ultra-structurale. Des analyses histologiques non seulement terminer l’examen échocardiographique mais également devient indispensables lorsque la résolution de l’échocardiographie n’est pas suffisante. C’est particulièrement le cas dans les modèles de souris génétiquement modifiées qui sont embryonnaires létale23,24.
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Protocol
les expériences décrites ici ont été effectuées en conformité avec les lois pertinentes bien-être animal institutionnels et Français, lignes directrices et politiques. Ils ont été approuvés par le Comité d’éthique Français (Comité Institutionnel d ' l Ethique Pour ' Animal de Laboratoire ; numéro RCE/2012-106).
1. échocardiographie
- déterminer le poids du corps de la souris à l’aide d’une balance de laboratoire standard en le tenant par la queue légèrement pour assurer un positionnement correct.
- Anesthésier l’animal par l’injection intrapéritonéale (i.p.) de 50 mg/kg pentobarbital 25 , 26.
NOTE : Tout autre type d’anesthésie peut être utilisé si le même protocole est utilisé tout au long de l’étude. Avantages et inconvénients seront analysés ci-dessous. - Remettre la souris dans sa propre cage et attendre jusqu'à ce qu’il ne répond pas, il montre une respiration régulière, et les réflexes du pied arrière sont absents. Pour tester ceci, presser un pied légèrement et observer si la jambe se rétracte toujours.
- Raser le côté gauche du thorax et de l’aisselle gauche à l’aide d’un rasoir commercial de rodent.
Remarque : L’utilisation d’un rasoir rongeur dédié permet l’élimination complète des poils de souris fine pour éviter toute interférence dans l’évaluation échocardiographique. Crèmes dépilatoires commerciales ou des solutions il faut éviter, car ils sont généralement parfumées, qui perturberont l’animal après qu’il se réveille. Éviter le rasage excessive, car cela augmente la perte de chaleur. - Mettre l’animal dormant sur une dalle chaude située à 40-42 ° C en position côté gauche peu profonde, avec la tête à 12 o ' horloge et la queue à 6 o ' horloge. Fixer le bras gauche, jambe gauche et la queue avec du ruban.
- Appliquer préchauffée échocardiographie gel sur la poitrine rasée et la tête du capteur de.
- Place le transducteur parasternale gauche, orientez vers le côté droit du cou pour obtenir une vue d’axe à deux dimensions (2D) parasternale au niveau du muscle papillaire. Tourner le transducteur de 90° vers la droite pour obtenir une vue d’axe court au niveau du muscle papilary. Utiliser un réglage de profondeur minimale et un zoom pour maximiser la qualité et la cadence image. Régler la vitesse de balayage au maximum.
- Pour obtenir ces paramètres, le zoom différents et la définition des options de profondeur peut-être être utilisé, selon la machine et les logiciels. Images de mode M Records guidage 2D en court axe voir 27. Reportez-vous à la Figure 1 a et B 27.
Remarque : prendre soin de ne pas appliquer une pression excessive sur la poitrine, car cela peut entraîner une bradycardie.
- Pour obtenir ces paramètres, le zoom différents et la définition des options de profondeur peut-être être utilisé, selon la machine et les logiciels. Images de mode M Records guidage 2D en court axe voir 27. Reportez-vous à la Figure 1 a et B 27.
- Série record au moins 3 de 3 boucles de cine battement de coeur pour chaque animal.
Remarque : Pour le logiciel d’un échocardiographe utilisé dans cette étude, appuyez sur la " Acquire/Save " bouton une seule fois. Cette méthodologie est spécifique pour les échographies cardiaques avec ce logiciel particulier. Autres logiciels peuvent être utilisés avec des machines différentes. - Après le gel de bons enregistrements, essuyer l’échocardiographie du thorax de la souris, coussin chauffant et transducteur. Retirer le ruban de membres et queue.
- Laissez la souris sous observation sur le coussin chauffant, recouvert de tissu afin d’éviter d’inutiles exposition et chaleur perte de lumière, jusqu'à ce qu’il réveille vers le haut
- Remettre l’animal dans sa cage.
- Analyse des images de mode M vue court-axe parasternale pour déterminer la fonction et les dimensions ventriculaires gauches de (LV) enregistrées. Mesurer l’épaisseur de la paroi antérieure de LV en systole et diastole (LVAWs et LVAWd), les LV télésystoliques et télédiastoliques diamètres internes (LVIDs et LVIDd) et l’épaisseur de paroi postérieure de LV (LVPW) dans la systole et la diastole (LVPWs et LVPWd) en utilisant le identification de l’interface sang-tissus sur les images stockées.
- Mesurer les dimensions diastoliques au moment de l’apparentes dimensions diastoliques maximales de LV et LV télésystolique dimensions lors de l’excursion systolique plus antérieure de la paroi postérieure de la LV. Touchez l’écran tactile sur le " Analyze " icône et ensuite sur la " LVAWd " icône. Positionner le pied à coulisse électronique sur l’interface entre la cavité ventriculaire droite et de la paroi antérieure de LV en diastole.
- Placer le pied à coulisse électronique sur l’interface entre la paroi antérieure du LV et la cavité de LV pour obtenir l’épaisseur de paroi antérieure diastolique LV ; le logiciel passera directement à la fin de diastole mesure interne du LV.
- Placer l’étrier sur l’interface entre la cavité de LV et la paroi postérieure du LV pour obtenir le diamètre télédiastolique interne LV ; le logiciel basculera sur la mesure d’épaisseur de paroi postérieure LV.
- Placer l’étrier sur l’interface entre la paroi postérieure de la LV et le péricarde pour obtenir l’épaisseur de paroi postérieure diastolique LV. Pour les dimensions systoliques LV, touchez l’écran tactile sur le " LVAWs " icône et position le pied à coulisse électronique sur l’interface entre la cavité ventriculaire droite et de la paroi antérieure de LV en systole.
- Placer le pied à coulisse électronique sur l’interface entre la paroi antérieure du LV et la cavité de LV pour obtenir l’épaisseur de paroi antérieure systolique LV. Répétez le processus tel que décrit ci-dessus pour le diamètre télésystolique interne LV et l’épaisseur de paroi postérieure systolique LV. Utiliser la pointe convention adoptée par l’American Society of Echocardiography pour tracer les frontières endocardiques et épicardique 13 , 27.
NOTE : Paramètres de la fonction contractile LV seront automatiquement calculées à l’aide de mesures antérieures. La fraction de raccourcissement (FS) LV est défini comme FS (%) = [(LVIDd-LVIDs)/LVIDd] x 100. La fraction d’éjection de LV (EF) est calculée avec la formule modifiée de Teicholz, où Fe (%) = [(LVIDd3-LVIDs3)/LVIDd 3] x 100 12. Se référer à la Figure 1 a et B. - Stocker les données sur les disques compacts ou les clés USB et de faire des copies de sauvegarde.
- Import, analyser et exporter les données en utilisant le logiciel approprié.
Remarque : Après ces mesures de référence, l’expérience peut être suspendue. Si vous effectuez une comparaison directe entre animaux knock-out et de type sauvage, procéder à des analyses histologiques 6. Pour Cre-ERT2 ; lignées de souris LOX/lox, continuer le lendemain avec induction de tamoxifène par injection intrapéritonéale, décrit 5 ,, 24. Si l’induction expérimentale de l’infarctus du myocarde par la ligature de l’artère coronaire gauche 5 , 28, la chirurgie peut être effectuée directement après les mesures échocardiographiques, quand les souris sont sous anesthésie. Dans le cas contraire, un délai minimum d’une semaine entre deux tours de l’anesthésie devrait être maintenu afin de limiter le taux de létalité post-opératoire.
2. Préparation des échantillons de coeur pour une évaluation histologique
- sacrifier les animaux par dislocation cervicale. Mesurer leurs poids corporel. Désinfecter la poitrine et l’abdomen à l’aide d’un tampon imbibé d’alcool 70 %.
- Faire une incision transversale dans la peau 1 cm distal au sternum. Avec une pincette émoussé, retirer la peau du thorax, se déplaçant dans la direction de la tête. Maintenez le sternum légèrement avec une pince fine et ouvrir le diaphragme en insérant l’extrémité arrondie de ciseaux fines.
- Couper la cage thoracique sur les deux côtés parallèles au sternum. Déplacez le sternum en direction de la tête. Localiser le coeur dans le thorax. Tenez le tronc vasculaire du cœur avec la pince fine et coupe ci-dessous à l’aide des ciseaux.
- Ouvrir le coffre et le coeur entier hors de la cage thoracique de l’accise, mesurer le poids du cœur et d’établir un cœur-à-corps poids ratio 4 , 5 , 6 , 23 , 29 , 30 < /sup >.
- Fix coeur dans 2 mL de solution de 10 % de formol tamponné neutre dans des tubes de 15 mL durant la nuit à 4 ° C.
ATTENTION : Danger ! Travail avec des solutions de formol doit être effectué sous une hotte chimique ; porter des gants et des lunettes de sécurité.
Remarque : Étant donné que la composition du tampon pour les solutions de formol varie avec les différents fournisseurs, utilisez le même fournisseur tout au long de l’étude. - Le lendemain, découper les cœurs dans le plan transversal, au milieu et transférez-les dans cassettes pour l’enrobage de paraffine, qui est effectuée dans le laboratoire de pathologie à l’aide d’un appareil automatisé encastrement.
- Effectuer sectionnement.
- Paraffine section bloque sur une épaisseur de 3 µm à l’aide d’un microtome et flotteur contenant l’eau distillée de bain dans une eau à 40 ° C.
- Transférer les sections sur les diapositives. Laisser les lames sécher jusqu’au lendemain dans un incubateur à 37 ° C et les stocker à 4 ° C jusqu’au prêt à l’emploi.
Remarque : Le protocole peut être suspendu ici jusqu'à ce que l’utilisateur est prête pour la coloration (étape 3).
- Deparaffinize et réhydrater le tissu glisse.
- Déposer les lames dans la coloration des pots avec des insertions de verre dans un four à 55 ° C pendant 10 min faire fondre de la paraffine.
- Déparaffiner les diapositives de deux changements de 200 mL de xylène ou substitut du xylène de 5 min chacun.
ATTENTION : Très inflammable et toxique ! Travailler sous une hotte chimique ; porter des gants et des lunettes de sécurité. - Transférer les lames à 200 mL d’alcool à 100 %. Apporter deux modifications pendant 3 min chaque et transférer une fois par le biais de 200 mL d’alcool à 95 % pour 3 min.
ATTENTION : Inflammable ! Tenir à l’écart des sources d’inflammation ; ne pas fumer. - Rincer deux fois dans 200 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de 5 min chacun et passez à l’étape 3, 4 ou 5.
3. L’hématoxyline et éosine coloration
- rincer les lames avec leurs sections dans l’eau distillée.
- Tacher les noyaux avec solution hématoxyline pendant 8 min.
- Rincer à l’eau courante pendant 10 min.
- Tache avec la solution d’éosine pendant 2 min.
- Dehydrate trois fois pendant 2 min à 100 % d’éthanol (EtOH). Effacer trois fois pendant 2 min dans le xylène ou substitut du xylène. Montage sur un support de montage à base de xylène.
- Photographier les diapositives et mesurer le diamètre du cardiomyocyte au niveau du noyau dans des coupes longitudinales du septum interventriculaire. Mesurer au moins 100 cellules par section et trois sections par cœur.
4. WGA coloration
- Incuber les lames obtenues à l’étape 2.7 avec tétraméthylrhodamine (ou autres colorants fluorescents)-conjugué WGA (1/100 dans du PBS) pendant 60 min à température ambiante dans une chambre humide.
- Laver trois fois avec du PBS pour chaque 5 min.
- Mont avec fluorescence montage média contenant DAPI. Conserver à 4 ° C dans l’obscurité avant analyse.
ATTENTION : Porter des lunettes de protection et des gants résistant aux produits chimiques compatibles. - Photographier les diapositives.
- Utiliser un microscope à fluorescence épi-illumination et filtre définit pour DAPI et tétraméthylrhodamine (voir la Table des matières). Réglez l’ouverture à la valeur maximale et la luminosité d’auto-exposition.
- Acquire séparer les images à un grossissement de x 400 pour les canaux rouges et bleu. Ouvrez les images dans ImageJ. Ajuster la luminosité et de contraste si nécessaire (Image > Adjust > luminosité/contraste).
- La valeur chaque image 8 bits (Image > Type > 8-bit). Superposer les images DAPI et WGA. Utiliser la couche bleue pour DAPI et le canal rouge pour WGA ; régler les canaux verts et gris None (Image > couleur > fusionner canaux) 31.
- Déterminer les diamètres de cardiomyocyte au niveau du noyau dans des sections transversales du septum interventriculaire.
- Définir l’échelle des images dans ImageJ. À cette fin, photographier un objet de taille connue (par exemple, une chambre hémocytomètre au même grossissement que les sections de coeur ; étape 4.4).
- Utiliser l’outil linéaire pour tracer une ligne du début à la fin de la structure connue (Analyze > définissez échelle).
Remarque : La distance en pixels s’affichera automatiquement ; l’unité de longueur et de distance connue devra figurer. Aller de l’avant avec les mesures du cardiomyocyte au niveau du noyau. - Tracer une ligne droite de la membrane de WGA-positifs par le noyau DAPI-positifs sur le site en face de la membrane cellulaire de WGA-positive (Analyze > mesure). Dans la fenêtre de résultats, vérifiez que les valeurs de longueur ont un nombre significatif de chiffres après la virgule (Analyze > définir les mesures > décimales).
- Mesurer au moins 100 cellules par section et trois sections par cœur. Exporter les résultats vers Excel (cliquez sur résultats > fichier > enregistrer sous > .csv) 6 , 31.
5. Immunomarquage PECAM-1
- effectuer antigène démasquant.
Tampon
- Ajouter 1 600 mL de citrate de sodium (citrate de sodium 10 mM, 0,05 % de Tween 20, pH 6,0) dans un autocuiseur. Placer la cocotte sur la plaque chauffante et tourner à pleine puissance. Ne montez pas le couvercle de la marmite à pression, à ce stade ; Posez-le simplement sur le dessus.
ATTENTION : Chaud ! - Une fois que le tampon citrate de sodium est en ébullition, transférer les lames de l’étape 2.5 dans l’autocuiseur. Fixez le couvercle de la marmite à pression. Dès que la cuisinière a atteint la pleine pression, attendre pendant 7 min. 7 min révolues, éteignez la plaque de cuisson et placez la cocotte dans un évier vide. Activer la vanne de décharge, puis exécutez l’eau froide l’auto-cuiseur. Une fois qu’il a dépressurisé, ouvrez le couvercle et faites couler l’eau froide dans le cuiseur pendant 5 min Place les diapositives dans 200 mL de PBS.
NOTE : Alternativement, micro-ondes antigène démasquer pourrait être utilisé, bien que le risque de surchauffe augmente.
- Ajouter 1 600 mL de citrate de sodium (citrate de sodium 10 mM, 0,05 % de Tween 20, pH 6,0) dans un autocuiseur. Placer la cocotte sur la plaque chauffante et tourner à pleine puissance. Ne montez pas le couvercle de la marmite à pression, à ce stade ; Posez-le simplement sur le dessus.
- Emploi 0,3 % de peroxyde d’hydrogène dans le méthanol à activité peroxydasique endogène bloc pendant 5 min. Rincer les lames pour chaque 200 mL dans du PBS, trois fois pendant 2 min.
ATTENTION : Inflammable et toxique ! - Incuber les lames pendant 15 min en normal blocage du sérum dilué (5 % de sérum de chèvre normal dans du PBS) qui contient également un bloc avidine (4 gouttes dans 1 mL).
- Soigneusement taper le liquide provenant des sections et les incuber avec Pecam-1 anticorps de lapin, dilués 01:50 dans du PBS contenant 2,5 % de sérum de chèvre normal et 4 gouttes de bloc de biotine par mL. Incuber les lames pendant la nuit dans une chambre humide à 4 ° C.
- Laver les lames trois fois de 5 min chacun dans 200 mL de PBS. Incuber les sections avec biotinylé chèvre anti-lapin IgG anticorps dilué 1 : 200 en PBS contenant 2,5 % de sérum de chèvre normal pendant 1 h à température ambiante. Laver les lames trois fois de 5 min chacun dans 200 mL de PBS.
- Incuber tsections de He avec un système basé sur l’avidine/biotine peroxydase pendant 20 min (réactif A et réactif B doivent être combinés 30 minutes avant utilisation). Laver les lames trois fois de 5 min chacun dans 200 mL de PBS.
- Dissoudre 1 3,3 '-diaminobenzidine (DAB) et 1 urée peroxyde d’hydrogène comprimé dans 5 mL d’eau bidistillée. Incuber les sections avec DAB solution pendant environ 3 min, soigneusement suivi de l’évolution de la couleur. Arrêter la réaction de la couleur en lavant délicatement les diapositives dans 200 mL de PBS.
ATTENTION : Cancérigènes ; porter des gants résistant aux produits chimiques ! - Contre-coloration les noyaux pendant 6 min avec l’hématoxyline. Rincer à l’eau du robinet pendant 2 min. Dehydrate trois fois pendant 2 min de chaque en cours d’exécution dans 200 mL d’alcool à 100 %. Effacer trois fois pendant 2 min chaque dans 200 mL de xylène ou un substitut de xylène. Montage sur un support de montage à base de xylène.
- Photographier les diapositives (au moins dix champs au grossissement x 40 le septum interventriculaire de chaque cœur) et de mesurer la densité de zone Pecam-1 à l’aide de logiciels ImageJ librement disponibles 31. Utiliser le plugin de 32 de déconvolution de couleur pour DAB et l’hématoxyline et ajuster le contraste de l’image au même niveau.
Remarque : dans le cas où la couleur marron et violet/bleu ont un chevauchement important spectral, qui risquent d’entraîner des difficultés avec la déconvolution de couleur, on pourrait essayer différentes marques de solution de l’hématoxyline pour obtenir une coloration nucléaire clair et bleu clair. Alternativement, immunofluorescence ou comptage manuel des capillaires pourrait être réalisée.
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Representative Results
Dans la Figure 1, représentant échocardiographiques enregistrements démontrent l’utilité de l’échocardiographie pour identifier des phénotypes cardiaques chez des souris génétiquement modifiées. La différence entre une souris avec une fonction cardiaque normale (Figure 1 a) et un animal avec un ventricule gauche dilaté et la fonction ventriculaire réduite (Figure 1 b) peut facilement être identifiée. La figure 2 montre la comparaison des cardiomyocytes mesures de diamètre chez les animaux sans (Figure 2 a) et présentant une hypertrophie cardiaque (Figure 2 b) à l’aide de sections de coeur de l’hématoxyline-éosine-teinté de paraffine et les mesures de section longitudinale du tissu cardiaque. La figure 3 illustre la mesure des diamètres transversaux cardiomyocyte en utilisant des sections de paraffine WGA teinté des coeurs de contrôle souris (Figure 3 a) et les animaux présentant une hypertrophie cardiaque (Figure 3 b). La figure 4 illustre l’utilité de l’immunohistochimie Pecam-1 (coloration de substrat, brun DAB) des sections cardiaques afin de déterminer la densité de navire du tissu cardiaque normal (Figure 4 a) et les cœurs avec l’angiogenèse accrue (Figure 4 b ).
Figure 1 : Échocardiographie de résolution Standard (> 10 MHz) aux dimensions de systolique et diastolique mesure LV et la fonction cardiaque chez les souris présentant une dilatation hypertrophie cardiaque après infarctus du myocarde par rapport aux animaux témoins.
Enregistrements échocardiographiques représentatifs de souris normales et sains (A) et les animaux avec dilatation de LV et réduite fonction ventriculaire après infarctus du myocarde (Tie2-CreERT2 ; PPARβ/δ + souris tamoxifène)5 (B). Le LVAW, LVID et LVPW sont indiqués. Les barres blanches représentent systoliques et diastoliques points de mesure. Ils correspondent au curseur points définie pour les mesures et sont expliquées dans l’étape de protocole 1.12. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : sections colorés à l’hématoxyline-éosine pour mesurer les diamètres de cardiomyocyte dans les cellules des souris avec sectionnés longitudinalement dilaté animaux de contrôle et une hypertrophie cardiaques. Images représentant des diamètres de myocytes cardiaques chez des souris avec des tailles de cardiomyocyte normal (A) et les animaux avec des tailles de cardiomyocyte accrue (Tie2-CreERT2 ; PPARβ/δ + souris tamoxifène)5 (B). Les lignes noires indiquent les diamètres mesurées. Les valeurs pour chaque mesure sont représentées. Barreaux de l’échelle = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : sections colorées WGA pour mesurer les diamètres transversaux cardiomyocyte dans les sections de tissu cardiaque de souris présentant une hypertrophie cardiaque dilatée par rapport à des animaux témoins. Images représentatives pour les diamètres de myocytes cardiaques chez les souris avec taille normale cardiomyocyte (A) et les animaux avec des tailles de cardiomyocyte accrue (Tie2-CreERT2 ; PPARβ/δ + souris tamoxifène)5 (B). Les noyaux étaient Eosine au DAPI. Les lignes blanches indiquent le diamètre mesuré au niveau du noyau (en bleu). Les valeurs pour chaque mesure sont représentées. Barreaux de l’échelle = 50 µm. veuillez cliquer ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Pecam-1 immunomarquées sections pour analyser la densité de navire cardiaques chez des souris témoins et les animaux avec l’angiogenèse accrue.
Images représentatives pour navire marquage chez la souris à la densité vasculaire normale (A) et les animaux avec vascularisation accrue (Tie2-CreERT2 ; PPARβ/δ + souris tamoxifène)5 (B). Les noyaux étaient Eosine à l’hématoxyline. Les flèches pointent vers les vaisseaux Pecam-1 positives. Barreaux de l’échelle = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Différentes méthodes ont été développées pour évaluer la structure cardiaque et la fonction chez les souris, y compris l’échocardiographie, renforcement du contraste MRI, micro CT et PET scan. En raison de son rapport coût/efficacité et simplicité, échocardiographie est la technique plus largement utilisée pour l’analyse fonctionnelle de souris11. En général, en raison de la petite taille du cœur et la haute fréquence de la fréquence cardiaque chez les souris, les transducteurs avec une fréquence > MHz 10 doit être utilisé, bien que les mesures de succès ont été signalés avec 8 ou 9 MHz transducteurs4,7 . Comme la fonction cardiaque est étroitement liée à la température du corps et de la fréquence cardiaque, il est important de contrôler ces paramètres tout au long de l’étude. Placer la souris sur un coussin chauffant est essentiel pour maintenir la température du corps de l’animal anesthésié constant. Idéalement, un bloc de chauffage avec une sonde rectale pour régler la température de corps à 38 ° C doit être utilisé. Si ce n’est pas disponible, le coussin chauffant doit être défini de deux ou trois degrés au-dessus de cette valeur. Lampes de chauffage doit être évitée car ils compliquent la tâche de l’enquêteur et le risque de surchauffe des animaux.
Pour contrôler la fréquence cardiaque et la fonction cardiaque, le type d’anesthésie est très important. La plupart des études utilisent l’isoflurane, comme anesthésie est facile d’induire par inhalation dans une chambre à induction (3 % isoflurane), peut être maintenu par un masque respiratoire (isoflurane 1-2 %) et est seulement de courte durée. Autres substances couramment utilisées sont 2,2,2-tribromoethanol, pentobarbital et kétamine + xylazine mêle11,12. Étonnamment, isoflurane a été signalée à compromettre la fonction cardiaque des mesures échocardiographiques et cet effet était encore plus marqué dans la kétamine + xylazine groupe11. Kétamine seule a fonctionné mieux dans cette étude11. Gao et al. a rapporté les résultats plus reproductibles avec 2,2,2-tribromoethanol12. Les résultats ont été dans la même gamme pour l’isoflurane, 2,2,2-tribromoethanol et pentobarbital12. Aussi, le rythme cardiaque n’ont pas différé dans le 2,2,2-tribromoethanol, et le pentobarbital groupes12. Coeur et coll. ont signalé bas fréquences cardiaques dans la kétamine + groupe de xylazine comparé à la groupe 2,2,2-tribromoethanol16. Dans nos expériences à l’aide de souches différentes de souris transgéniques et l’anesthésie au pentobarbital, la fréquence cardiaque moyenne varie entre 350 et 450 bpm. Néanmoins, les fractions d’éjection sont > 80 %, ce qui correspond aux valeurs des animaux conscients,11. Les mesures échocardiographiques sous la ligne de base de notre laboratoire4,,5,6 , les conditions sont dans la même gamme que rapportées ailleurs11,12,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,26 . Contrairement au pentobarbital, kétamine et isoflurane 2,2,2-tribromoethanol sont caractérisent par la récupération et l’apparition rapide. Ainsi, la synchronisation entre l’anesthésie et les mesures échocardiographiques devrait être la même pour tous les animaux de l’étude pour éviter les différents degrés de récupération de l’anesthésie. Pentobarbital agit plus, mais présente l’inconvénient d’une petite fenêtre thérapeutique, rendant nécessaire d’ajuster la dose étroitement en ce qui concerne le poids corporel. L’anesthésie de longue durée à l’aide de pentobarbital a l’avantage que, après des mesures échocardiographiques de base, procédures chirurgicales peut être effectuée sans nécessité de ré-injection5. L’anesthésie répétitive à l’aide de pentobarbital doit être évitée car, d’après notre expérience, injections avec un intervalle de moins d’une semaine entraîné la hausse de la mortalité postopératoire.
Lorsque vous effectuez l’échocardiographie chez des souris ayant une > transducteur de 10 Mhz, la qualité des images devrait être suffisante pour déterminer la fonction globale de LV. Il faut faire plusieurs images pour chaque animal réduire les variations de battement à battement et artefacts de mouvement. Conseils d’experts d’un cardiologue formé ou un scientifique ayant une expérience en échocardiographie chez la souris doivent être posée au début pour évaluer la qualité des images. La plupart des machines de l’échocardiographie calculent EF de diamètres intérieurs LV à l’aide de la formule11,de Teicholz12. Même lorsque les dimensions de LV sont faciles à mesurer, ils fournissent une évaluation imparfaite des volumes de LV et zones car le LV ne satisfait plus à n’importe quelle forme géométrique idéale, simplifié. Ni fractionnaire fraction de raccourcissement, ni d’éjection obtenue avec la formule Teicholz est un paramètre parfait pour déterminer la fonction contractile ventriculaire, car ils sont basés sur une hypothèse géométrique et décrivent la contractilité de seulement deux murs. La fraction d’éjection évaluée avec la méthode de Simpson le biplan serait plus exacte, mais c’était impossible d’obtenir tous les animaux avec le matériel utilisé ici.
Après infarctus du myocarde, nous avons fait face à plusieurs problèmes liés à l’imagerie échocardiographique. Tout d’abord, qualité d’image a été considérablement gênée par la cicatrice de la thoracotomie. Deuxièmement, les animaux étaient beaucoup plus sensible à l’anesthésie répétée. Enfin, les mesures de volume et de la fonction LV M-mode-basé supposent que LV géométrie est homogène. En conséquence, l’utilisation de ces indices devient plus controversée en présence d’anomalies de mouvement mur LV après infarctus du myocarde.
Dans nos mains, l’utilisation d’une sonde de 15 MHz a permis l’inscription occasionnelle, mais pas systématique, d’images Doppler. Fréquences beaucoup plus élevées sont nécessaires pour déterminer la fonction régionale LV ou faire une échocardiographie de contraste myocardique, qui ne peut être obtenue avec un équipement dédié aux rongeurs12.
Étant donné les possibilités supplémentaires et une résolution plus élevée de ces systèmes de rongeurs spécifiques, on devrait considérer les utiliser à l’avenir. Les inconvénients sont les coûts plus élevés et la nécessité d’un espace dédié. Ces echocardiographs haut de gamme, dédiés au rongeur sera rentables que si assez d’animaux est incriminés et plusieurs critiques scientifiques utilisent l’équipement. Avec la formation spéciale offerte pour ces machines, ils peuvent être utilisés par les scientifiques pas experts en cardiologie. L’équipement d’échocardiographie clinique fournit une résolution limitée, comme indiqué plus haut. Néanmoins, il est toujours avec succès utilisé dans l expérimenté différentaboratories11,12; peut être facilement utilisé par des scientifiques qualifiés et cardiologues ; est plus mobile et moins exigeant sur un espace dédié ; et, en raison du nombre élevé de machines, permet l’examen des différentes solutions pour réduire les coûts (p. ex., location, obtention de matériel qui n’est pas dans l’utilisation clinique ou faire des achats brocante).
Pour les analyses histologiques, le premier point critique est afin de réduire le temps entre l’isolement de l’orgue et la fixation du tissu. Comme dans le présent protocole, la plupart des analyses histologiques et de coloration sont inspirent de microscopie photonique transmissible ; fixation de l’immersion du tissu cardiaque dans le formol est suffisante. Si la mise au point d’un projet n’est plus sur la coloration microscopique de fluorescence, on devrait considérer la fixation de la perfusion des animaux anesthésiés pour éliminer les globules rouges du tissu, qui montrent une auto-fluorescence lumineuse.
Pour éviter les variations de l’enrobage de paraffine, nous utilisons un appareil automatisé encastrement. Le point de fusion et la dureté sont différentes entre les marques de paraffine, nous recommandons d’utiliser le même fournisseur tout au long de l’étude. Paraffine sectionnement doit être effectuée sur des blocs préalablement refroidies à l’aide d’un microtome rotatif. Épaisseur de coupe doit être maintenue constante. Une épaisseur de coupe de 3 µm permet une visualisation claire des frontières de la membrane dans les sections de coeur colorés à l’hématoxyline-éosine, qui est requis pour la mesure précise des diamètres de cardiomyocyte. Comme la forme des cardiomyocytes est irrégulière, mesures doivent être réalisées au niveau du noyau. Coloration de WGA d’une autre manière de colorer la membrane cellulaire et se traduira par les mêmes valeurs que la coloration hématoxyline-éosine. Avant les analyses morphométriques, on doit définir clairement quelle partie du cœur (c'est-à-dire, mur libre ventriculaire droite ou gauche ou cloison) sera mesuré et si les sections transversales cardiomyocyte sont fixés dans l’axe court ou long. En raison de la traversière, spirale et orientation longitudinale des cardiomyocytes au cœur, il est possible d’obtenir sur les mêmes sections de longitudinal et transversal de la section transversale des cardiomyocytes. Si les diamètres longitudinales ou transversales sont mesurés sont une question de convention, aussi longtemps que les cellules sont analysés au niveau du noyau.
Dans nos études, nous avons observé un accord entre les dimensions échocardiographiques et les ratios de coeur-à-poids et cardiomyocyte tailles4,5,6, mais les mesures histologiques du cardiomyocyte taille ne sont pas toujours correspondre aux valeurs de la fraction d’éjection. Par exemple, l’entraînement physique entraîne dimensions cardiaques accrues, avec une fraction d’éjection préservée et diamètres de cardiomyocyte accrue. Toutefois, une insuffisance cardiaque décompensée se caractérise par des dimensions cardiaques accrues, avec une fraction d’éjection réduite et augmentation cardiomyocyte diamètre33. En outre, nous avons montré récemment que navire cardiaque accru densité endothéliale spécifiques surexpression de PPARβ n’aboutit pas dans l’amélioration de la fonction cardiaque en conditions basales, ni à la récupération assistée après infarctus du myocarde5 .
Pour immunohistochimie, il est important d’inclure des contrôles négatifs et à effectuer les opérations de blocage différentes prévues dans le protocole. L’étape de démasquer l’antigène dans le protocole est spécifique de l’anticorps primaire utilisé. Pour des anticorps primaires différentes, il est nécessaire déterminer si les démasquer tampons pH faible ou élevé donner lieu à un meilleur signal. Techniques de fixation différents pourraient servir à détecter un antigène spécifique. Par exemple, l’étiquetage Pecam-1 a été signalé pour fonctionner au mieux sur le tissu Zinc-fixes et paraffine, tandis que la fixation même nécessaire des mesures supplémentaires pour réduire le fond pour un anticorps de thrombomoduline34. Ainsi, nous utilisons la fixation de formol ordinaire, qui a permis d’étendre l’étude à une variété de différents antigènes. Alternative à Pecam-1 immunomarquage, isolectine B4 est fréquemment utilisé pour visualiser les vaisseaux. Outre une proportion de cellules endothéliales35, isolectine B4 étiquettes aussi glia36 et macrophages37. En outre, une variété d’antigènes peut-être servir à établir une distinction entre les cellules endothéliales artérielles et veineuses,38. Une façon élégante de visualiser fonctionnelle perfusés navires ou pour déterminer le navire la germination ou la régression est l’injection intraveineuse de lectine couplé à fluorescence, suivie de l’analyse des cryosections24. Toutefois, cette approche a largement restreint les possibilités pour détecter les antigènes supplémentaires et d’effectuer des analyses morphométriques en raison de la qualité différente des cryosections.
Sur immunostained des sections où le signal est visualisé avec DAB, la densité de la surface peut être quantitativement déterminée en utilisant les logiciels ImageJ librement disponibles. Cependant, car le signal n’est pas linéaire, le degré de coloration brune ne correspond pas exactement au niveau de l’expression de la protéine.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Le travaux ont été subventionnés par le gouvernement Français (Agence nationale de la recherche, ANR) grâce au programme « Investissements pour l’avenir » LABEX SIGNALIFE (référence ANR-11-LABX-0028-01) et de grâce à des subventions et K. d. W. de l’Association pour la Recherche sur le Cancer, Fondation de France et le Plan Cancer Inserm. D. B. et V. a. reçu des bourses de la Fondation pour la Recherche Médicale et de la ville de Nice, respectivement. Les échographies cardiaques et le capteur ont été gracieusement fournies par Philips. Nous remercions A. Borderie, S. Destrée, M. Cutajar-Bossert, A. Landouar, Martres A., A. Biancardini et S. M. Wagner pour leur aide technique qualifié.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wheat germ agglutinin (WGA) conjugated tetramethylrhodamine | Life Technologies, Molecular Probes | W849 | |
| Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody | Vectorlabs | BA-1000 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vectorlabs | SP-2001 | |
| VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard) | Vectorlabs | PK-6100 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vectorlabs | H-1200 | |
| SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4168 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma | H1009 | |
| Anti-Pecam-1 (CD31) antibody | Abcam | ab28364 | |
| Ultrasound transmission gel, Gel Aquasonic 100 | Parker | ||
| Linear ultrasound probe, L15-7io | Philips Healthcare | ||
| Echocardiograph, IE33 xMATRIX | Philips Healthcare | ||
| Microscope, Leica DMi8 | Leica | ||
| Fluorescence Filterset DAPI | Leica | 11525304 | |
| Filterset TxR | Leica | 11525310 | |
| Digital Camera, SPOT RT3 Color Slider | Spot Imaging | ||
| Imaging Software, SPOT 5.2 Advanced and Basic Software | Spot Imaging | ||
| Imaging Computer | Dell | ||
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Large Scissors | Fine Science Tools | 14501-14 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10023-00 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11650-10 | |
| Rodent shaver | Harvard Apparatus | 34-0243 | |
| cassettes for paraffin embedding | Sakura | 4155F | |
| neutral buffered Formalin | Sakura | 8727 | |
| Xylene | Sakura | 8733 | |
| Paraffine TEK III | Sakura | 4511 | |
| automated embedding apparatus, Tissue-Tek VIP | Sakura | 6032 | |
| paraffin-embedding station Tissue-Tek TEC 5 | Sakura | 5229 | |
| microtome blades,Accu-Edge S35 | Sakura | 4685 | |
| microscopy slides, Tissue-Tek | Sakura | 9533 | |
| cover slips, Tissue-Tek | Sakura | 9582 | |
| Mounting medium Tissue-Tek | Sakura | 1408 | |
| slide boxes | Sakura | 3958 | |
| eosine solution | Sakura | 8703 | |
| hematoxyline solution | Sakura | 8711 | |
| microtome, RM2125RT | Leica | 720-1880 (VWR) | |
| water bath, Leica HI1210 | Leica | 720-0113(VWR) | |
| Ethanol | VWR | ACRO444220050 | |
| 15 ml tubes | VWR | 734-0451 | |
| staining glass dish | VWR | MARI4220004 | |
| staining jars | VWR | MARI4200005 | |
| Incubator | Binder | 9010-0012 | |
| DAB and urea hydrogen peroxide tablets, SIGMAFAST 3,3′-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4293 | |
| PBS (10X) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 |
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