Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

الهندسة الحيوية من أنسنة نخاع العظام ميكرونفيرونمنتس في الماوس والتصور من خلال التصوير لايف

Published: August 1, 2017 doi: 10.3791/55914
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Haematopoietic Stem Cell Laboratory, The Francis Crick Institute
* These authors contributed equally

Summary

يتم تقديم طريقة لإنشاء وصورة حية مختلفة ناسخ نخاع العظام أنسنة في الفئران. استنادا إلى مكانة داعمة التي أنشأتها خلايا الوسيطة الإنسان، وإضافة الخلايا البطانية البشرية يدفع تشكيل الأوعية البشرية، في حين أن إضافة ربمب-2 يدفع تشكيل الإنسان-الماوس خيالية نسيج العظام ناضجة.

Abstract

الخلايا الجذعية المكونة للدم البشرية (هسس) تقع في نخاع العظام (بم) المتخصصة، وهي شبكة معقدة متعددة العوامل من مكونات إنتاج السيتوكينات، وعوامل النمو، والمصفوفة خارج الخلية. قدرة هسس على البقاء هادئة، تجديد الذات أو التفريق، واكتساب الطفرات وتصبح خبيثة يعتمد على التفاعلات المعقدة التي تنشأ مع مكونات انسجة مختلفة. لمراقبة الحديث المتبادل بين هسس الإنسان والمكان بم الإنسان في الظروف الفسيولوجية والمرضية، قمنا بتصميم بروتوكول لنموذج إكتوبيكالي وصورة مكانة بم أنسنة في الفئران العوز المناعي. وتبين لنا أن استخدام المكونات الخلوية المختلفة يسمح لتشكيل الهياكل أنسنة وفرصة للحفاظ على المدى الطويل إنغرافتمنت الإنسان المكونة للدم. باستخدام اثنين من الفوتون المجهري، يمكننا أن نعيش صورة هذه الهياكل في الموقع في قرار خلية واحدة، وتوفير أداة جديدة قوية للتوصيف الوظيفي للإنسان بم مالبيئة ودورها في تنظيم تكون الدم الطبيعي والخبيث.

Introduction

يتم تنظيم قرارات مصير الخلية لوحظ في مقصورات الخلايا الجذعية بإحكام من قبل العوامل الجوهرية والخارجية. على وجه الخصوص، فمن المسلم به الآن على نطاق واسع أن المكروية بم يلعب دورا أساسيا في السيطرة على التبديل في هسس من هادئة إلى حالة نشطة، وكذلك في تجديد الذات أو التمايز مصير القرار 1 . وعلاوة على ذلك، تشير النتائج الأخيرة إلى أن الأورام الخبيثة الدموية تؤثر على وظيفة المكروية بم، مشيرا إلى وجود الحديث المتبادل النشط بين المقصورات 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6 . على الرغم من التقدم المحرز مؤخرا، لا تزال هناك العديد من الأسئلة الرئيسية حول كيفية مساهمة نشاط مكونات محددة بم-نيش في سلوك هسك والتحول الخبيث.

المكروية بم هي متغاير للغاية خليط معقدة ومتكاملة من العديد من أنواع الخلايا المختلفة، ولكل منها وظائف متخصصة. و البطانية وفيرة (إيك) ومكون الأوعية الدموية تنظيم المغذيات ودوران الأيض، ودخول وخروج الخلايا المختلفة من وإلى بم، والعديد من وظائف هسك 7 ، 8 . خلايا انسجة اللحمة الوسيطة (مسس)، وهي مجموعة غير متجانسة من الخلايا الجذعية غير المتمايزة والأسلاف التي ترتكب من خلال ثلاثة أنواع مختلفة من الأنساب ( أي عظمية، غضروفية، أديبوجينيك)، هي عنصر أساسي آخر في مكانة بم. هذه اللجان الدائمة المحلية توطين سواء في المناطق الوسطى من بم وبالقرب من المنطقة إندوستيل. قد تكون مرتبطة مع هياكل الأوعية الدموية والمتورطين في تنظيم وظيفة هسك 9 ، 10 ، 11 ، 12 ، 13 ،"> 14 ، 15 .

وتشير العديد من التقارير إلى أن هسس يقيمون في مواقع محددة مختلفة داخل النخاع وأن وظيفتهم قد تعتمد على توطينها بدقة. معظم المعرفة الحالية بشأن هسس وتفاعلها مع المكروية بم مستمد من دراسات الفئران 1 . استخدام نماذج طعم أجنبي وقد وسعت هذه المعرفة ل هسس الطبيعية والخبيثة الإنسان، إنغرافتينغ داخل بم الفئران من الفئران المناعية 16 ، 17 ، 18 ، 19 ، 20 . على الرغم من أن هذا يمثل نموذجا صالحا، فإنه لا يزال يقدم العديد من التحديات، مثل الحاجة إلى شرط الماوس المتلقي في معظم الحالات للسماح الإنسان هسك صاروخ موجه و إنغرافتمنت أو حاجز عبر الأنواع وأثره غير مفهومة جيدا على التفاعلات خلية الخلية و المهام.

وكان استخدام الأجسام المضادة تحييد والفئران المعدلة وراثيا، جنبا إلى جنب مع زرع الأعضاء، دورا أساسيا في تسليط الضوء على الحوار المعقدة التي هسس الإنسان إنشاء مع ميكرونفيرونمنتس بهم. وقد أدخلت مقدمة وتطوير إنترافيتال ثنائي الفوتون المجهري متحد البؤر هذه الدراسات خطوة إلى الأمام، مما يسمح للتصوير المباشر، عالية الدقة، وديناميكية من نخاع العظام 19 و 20 و 21 و 22 ويوفر أداة قوية ل فونكتيونال توصيف المكروية بم ودوره في تنظيم وظيفة هسك. من أجل الالتفاف على بعض المشاكل الناشئة في النماذج التقليدية زرع الأعضاء، وقد تم تقديم مفهوم هندسة هيكل بم أنسنة إلى الواجهة. دمج المواد الحيوية ومفاهيم زرع الخلايا، وقد أظهرت تقارير جدوى محاكاة العظام البشرية مأرو المكروية في المناطق متباينة 23 ، 24 ، 25 ، 26 ، 27 . هذا يفتح إمكانية استخدام الهندسة الحيوية في نماذج الفأر لدراسة الدم الطبيعي والخبيث البشري 28 ، 29 ، 30 ، 31 ، 32 ، 33 ، 34 ، 35 ، 36 ، 37 ، 38 ، 39 ، أورام الأورام، ورم خبيث 40 ، 41 ، 42 ، 43 ، 44 .

استنادا إلى الخبرة السابقة في هندسة أنسجة العظام وفي الجسم الحي التصوير 19 ، 22 ، 45 ، 46 ، 47 ، 48 ، 49 ، 50 ، 51 ، 52 ، نحن تصف بروتوكول إلى الهندسة الحيوية وصورة حية عضوي النمط الأنسجة بم الإنسان. هذه الهياكل تنشأ من زرع خلايا انسجة مستمدة من الإنسان إلى السقالات المستندة إلى الكولاجين تحت الجلد المطعمة في الفئران عوز المناعة. في تقرير سابق، أثبتنا أن مسس الإنسان ضمان تشكيل المكروية الإنسان كافية ل إنغرافتمنت من خلايا المكونة للدم البشرية 45 . وعلاوة على ذلك، هنا نحن تصف كيف شارك في زرع المكونات البشرية الخلوية بم الأخرىمثل الخلايا البشرية البطانية (هيك) و / أو السيتوكينات الهامة لتكوين العظام (على سبيل المثال، HBMP2)، والتعاون مع همسكس لتوليد ميكرونفيرونمنتس أنسنة مختلفة، والتي يمكن أن تكون حية تصويرها في الموقع .

Protocol

أجريت جميع التجارب على الحيوانات تحت بل 70/8904، التي وافقت عليها وزارة الداخلية في المملكة المتحدة ووفقا للمبادئ التوجيهية أبحاث السرطان في المملكة المتحدة. تمت الموافقة على استخدام دم الحبل السري البشري (أوب) وعينات سرطان الدم النخاعي البشري الأولي (أمل) من قبل اللجنة الأخلاقية لشرق لندن بعد الحصول على الموافقة وتم تنفيذها وفقا لإعلان هلسنكي.

1. الهندسة الحيوية القائم على الكولاجين السقالات مع خلايا المكونة للدم وانسجة الإنسان

ملاحظة: يجب تنفيذ البروتوكول بأكمله في ظروف معقمة ومع المواد المعقمة. وسط الخلية ثقافة 1 يتوافق مع المتوسطة همسك (ميم-α، P / S، و 10٪ همسك-فبس). (M199، 20٪ فبس، P / S، 10MM هيبيس، 50 ميكروجرام / مل الهيبارين، 2 ملي غلوتامين و 50 ميكروغرام / مل إغس) وثلاثة مستنبت خلية 3 يتوافق مع خلية الخلية المكونة للدم (H5100 و P / S).

  1. إعداد السري الحبل الدم م(سب-منكس) أو أمل الأولي (نخاع العظام أو الأطراف المنوية الدم) باستخدام التدرج الكثافة فيكول-باك، وفقا لبروتوكولات راسخة 53 .
    1. ل مكافحة غسل الأموال، استنزاف الخلايا التائية باستخدام OKT.3 الأجسام المضادة. احتضان 4 ميكروغرام من OKT.3 لكل 1 × 10 6 أمل منس لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل غسل الخلايا في برنامج تلفزيوني. إذا لزم الأمر، كريوبريزرف من الشركات المتعددة الجنسيات في فبس مع 10٪ دمسو في 2 × 10 8 خلايا لكل مل.
  2. إعداد همسك (ثقافة المتوسطة 1) و إيك (ثقافة المتوسطة 2) الثقافات الخلية. خلايا همس لوحة (انظر جدول المواد ) على قوارير ثقافة الخلية العادية في المتوسطة همسك. لوحة إكس (انظر جدول المواد ) على السطوح الكولاجين 1 المغلفة في وسط المفوضية الأوروبية.
  3. في 85-90٪ التقاء الخلية إزالة المتوسطة، وغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني، وإضافة الحل التربسين إدتا (20 ميكرولتر لكل سم 2 ).
    1. بعد 5 دقائق، تحقق من فصل الخلايا. استعادة الخلايا عن طريق تمييع 1:3 مع خلية ثقافة المتوسطة. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق وإعادة تعليق في المتوسطة المقابلة لكل نوع من الخلايا وعد الخلايا باستخدام غرفة نيوبور.
    2. استخدام الخلايا في 2 × 10 6 - 10 7 خلايا لكل مل. إذا كان كل من أنواع الخلايا تحتاج إلى استخدامها معا، مزج همسك و إيك تعليق في نسبة 1: 1.
  4. نقل تعليق الخلية إلى حقنة الأنسولين.
  5. باستخدام مشرط، وقطع الإسفنج الجيلاتين معقمة (على سبيل المثال، جلفوم) سقالة الأولي (20 مم × 60 مم × 7 ملم) إلى 24 قطعة من حجم مماثل (6.6 ملم × 7.5 مم × 7 ملم؛ الشكل 1A و B ).
  6. إعادة السقالات الجيلاتين عن طريق الغمر في برنامج تلفزيوني (5 دقائق).
  7. واحدا تلو الآخر، وضعت بلطف السقالات على الأنسجة المعقمة لإزالة بس الزائدة. نقل السقالات إلى بئر واحدة من لوحة 24 جيدا (سطح مرفق منخفضة جدا) واستخدام حقنة لحقن 50 ميكرولتر تحتوي على 10 5 - 10 6 خلايا (همسك آلواحد أو بالاشتراك مع هيك؛ الشكل 1C ).
  8. كرر الخطوة 1.7 مع كل سقالة حتى يتم فرز كل السقالات المطلوبة مع خلايا انسجة.
  9. احتضان لمدة 1 ساعة داخل حاضنة ثقافة الخلية (37 درجة مئوية و كو 2 5٪).
  10. ملء كل جيدا مع 3 مل من خلية ثقافة المتوسطة 1 ( الشكل 1D ) والعودة السقالات إلى حاضنة ثقافة الخلية (37 درجة مئوية و كو 2 5٪) للحضانة بين عشية وضحاها. استخدام خلية ثقافة المتوسطة 2 إذا تم استخدام إكس في السقالات.
  11. ذوبان سب-منك وعزل خلايا CD34 + منها بعد بروتوكول CD34 + القسم المناسب. تعليق خلايا CD34 + المحددة في المتوسطة 3 واعتمادها في غرفة نيوبور.
    ملاحظة: هنا، تم استخدام الخلايا في تركيز 2 × 10 6 خلايا لكل مل.
    1. إذا تم استخدام عينات أولية مشتقة من المريض، ذوبان الجليد الخلايا، وتمييع لهم 1:10 في فبس، الطرد المركزي لهم لمدة 5 دقائق في 300زغ، ريسوسبيند الخلايا في بس-2٪ فبس، إضافة المضادة CD3 الأجسام المضادة البشرية (2 - 4 ميكروغرام لكل 10 6 خلايا)، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 x ج و ريسوسبيند في وسط الخلية المكونة للدم تستكمل مع السيتوكينات (20 نانوغرام / مل المحببة مستعمرة عامل تحفيز (G-كسف)، 20 نانوغرام / مل إيل-3، و 20 نانوغرام / مل ثرومبوبوييتين (تبو)) .
  12. كرر الخطوات 1،7-1،9 ولكن في هذه الحالة البذور 1 × 10 5 خلايا المكونة للدم البشري بدلا من مكونات انسجة، على النحو الوارد أعلاه.
    1. ملء جيدا مع 3 مل من خلية ثقافة المتوسطة 3 ( الشكل 1D ) والعودة السقالات إلى حاضنة ثقافة الخلية (37 درجة مئوية و كو 2 5٪) للحضانة بين عشية وضحاها. استخدام مزيج 1: 1 من وسائل الإعلام ثقافة الخلية 2 و 3 إذا تم استخدام إكس في السقالات.
  13. لعامل الإنسان المؤتلف فقط بروتين-2 (ربمب-2) السقالات الناقل البروتين، وضع بلطف السقالات واحدا تلو الآخر على الأنسجة المعقمة لإزالة P الزائدةBS. نقل السقالات إلى بئر واحدة من ش أسفل، لوحة 96 جيدا ( الشكل 1E ) وإضافة 5 ميكرولتر من ربمب-2، تغطي تماما السقالة.
    1. إضافة 20 ميكرولتر من الثرومبين تليها 20 ميكرولتر من الفيبرينوجين، وتغطي تماما سقالة في كل مرة ( الشكل 1F ). كرر الإجراء لكل سقالة حتى يتم التعامل مع جميع السقالات المطلوبة ومن ثم احتضان لمدة 5-10 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تحقق ما إذا كان التخثر قد شكلت بنجاح.

2. الجراحية زرع السقالات الهندسة الحيوية

ملاحظة: هنا، إما الذكور أو الإناث، استخدمت الفئران نسغ 6- إلى 12 أسبوعا. كما الحيوانات هي عوز المناعة، وينبغي أن يتم جميع الإجراءات في ظروف معقمة. الخطوات 2.10 - 2.13 تتعلق استراتيجيات البقاء والرعاية ما بعد الجراحة.

  1. 60 - 120 دقيقة قبل الجراحة، تحت الجلد إدارة الدواء الألم (كاربروفين، 5 ملغ / كغ من وزن الجسم / الماوس).
  2. تخدير التخدير في غرفة مع 0.5٪ إيسوفلوران و 2 L / دقيقة O 2 . وينبغي رصد الفئران بشكل مستمر أثناء الإجراء. نقل الحيوان إلى منطقة العمليات الجراحية في وضعية عرضة من أجل الحصول على سهولة الوصول إلى الخلف. إبقاء الحيوان تحت التخدير باستخدام مخروط الأنف توريد 1.5٪ إيسوفلوران و 2 L / دقيقة O 2 . الحفاظ على الماوس تحت التخدير أثناء الإجراء الجراحي وكثيرا ما تحقق من حالة الحيوان.
  3. في حين أنها تحت التخدير، واستخدام هلام العيون على عيون الماوس لمنع جفاف، والحفاظ على الماوس عند 37 درجة مئوية.
  4. حلاقة المنطقة الجراحية على الجزء الخلفي من الماوس باستخدام الانتهازي الكهربائية. لتعقيم الجلد، تراجع طرف القطن في كلوريكسيدين المخفف (المخفف 1:10 في برنامج تلفزيوني) واستخدام هذه النصيحة لتنظيف سطح الجلد. كرر هذا الإجراء مرتين.
  5. باستخدام ملقط معقم ومشرط (أو مقص)، وجعل 0.5-7،7 سم الأمامي إلى الخلفي شق كامل من الجلد. استخدام ملقط إدراجهاتحت الأنسجة تحت الجلد لجعل جيب.
  6. إدراج سقالة تحت الجلد، والتأكد من أن يتم وضعها في عمق الجيب ( الشكل 1G و H ). إغلاق شق مع الغراء الجراحي ( الشكل 1I و J ).
  7. لعلاج الألم بعد الجراحة، تحت الجلد إدارة البوبرينورفين (0.1 ملغ / كغ من وزن الجسم).
  8. أثناء الانتعاش، ووضع الحيوان على جانبها في قفص قبل تحسنت ورصد الانتعاش حتى لوحظ السلوك العادي.
  9. تمييع دواء الألم في الماء (كاربروفين، 0.1 ملغ / مل من الماء) وتوفيره للحيوانات ومياه الشرب لمدة 4 أيام بعد الجراحة.
  10. تحقق الحيوان والجرح في كثير من الأحيان خلال فترة 48 ساعة بعد الجراحة عن الآثار السلبية المحتملة.

3. العلاجات الماوس، القتل الرحيم، واسترجاع عينة للتصوير

ملاحظة: يتم تنفيذ تحليل السقالات بين8 و 24 أسبوعا بعد الزرع.

  1. 60 دقيقة قبل التصوير، والحفاظ على الماوس المزروع دافئة في مربع التدفئة في 37 درجة مئوية، عن طريق الوريد إدارة 100 ميكرولتر من المناعي البشري لمنع مواقع غير محددة.
  2. 30 دقيقة قبل التصوير، عن طريق الوريد إدارة 10 ميكروغرام (لكل الماوس) من الأجسام المضادة المحددة لتسمية الخلايا ذات الاهتمام.
  3. 5 دقائق قبل التصوير، عن طريق الوريد إدارة 15 ميكرولتر (المخفف في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني) من 655 نانومتر فلوروفور المسمى، وكيل تجميع السفن (655-فبا) لتصور الهياكل الوعائية.
  4. الموت ببطء الماوس عن طريق خلع عنق الرحم.
  5. باستخدام مقص حاد، وجعل شق الجلد طولية على الجزء الخلفي من الماوس، بالقرب من موقع زرع الأصلي.
  6. مع مساعدة من ملاقط مقص، بعناية فصل الجلد من جيب تحت الجلد حيث تم زرع سقالة.
  7. عقد السقالة مع ملاقط وإبلانت بلطف من الجلد عن طريق قطع الغشاء المتبقية أالأنسجة ند المحيطة سقالة باستخدام مقص. انظر أمثلة من السقالات ليتم استردادها في الشكل 2 .
  8. تأمين السقالة مع الغراء لاصق سريع المفعول إلى لوحة التصوير (طبق بتري 35 مم × 10 ملم) وملء مع محلول ملحي (بس) في درجة حرارة الغرفة.
  9. للحصول على السقالات بمب، قبل ملء لوحة مع برنامج تلفزيوني، واستخدام ميكرودريل الجراحية لسطح العظام العظام تحت المجهر المجهري. وهذا يسمح التصور فلورفور وعالية الدقة التقاط الصور. استخدام نتوءات 1.2- أو 1.6 ملم، اعتمادا على حجم السقالة.
    ملاحظة: سوف يدرك المستخدم كم لحفر اعتمادا على سمك العظام. بشكل عام، كما السقالات بمب هي الأوعية الدموية، والعظام تغيير اللون قليلا وتصبح أكثر الأحمر عند الاقتراب من سمك الصحيح للتصوير.
  10. إدراج لوحة على مرحلة المجهر متحد البؤر.

4. لايف التصوير باستخدام اثنين من الفوتون ميكروسكسخ

ملاحظة: عند استخدام أجهزة الكشف غير ديسكاند (ند)، استخدم دائما المنزلق ند للتصوير لتوجيه مضان إلى ند. يتم توفير التكوين المجهر في الشكل 3 .

  1. التبديل على المجهر والكمبيوتر، بدء تشغيل البرنامج عن طريق النقر على "بدء النظام"، والذهاب إلى وضع "اكتساب".
  2. ضع علامة في المربع "عرض الأدوات اليدوية". في "الليزر" التبديل القائمة "على" ليزر اثنين الفوتون والسماح لها في الاحماء والاستقرار.
  3. في القائمة "إعداد التصوير"، في وقت واحد تفعيل "وضع القناة" و "تبديل المسار كل إطار." في القائمة "مسار الضوء"، حدد "غير ديسكاند" "و" شعاع رئيسي الفاصل مبس 760+ ". ضع علامة لتنشيط أربعة ندس وضبط التكوين كما هو موضح في الشكل 3 .
    ملاحظة: مع هذا التكوين، وإشارة الكولاجين من هياكل العظام (ثانيةتوليد متجانسة أوند، شغ) في 380-485 نانومتر، فيتس-hCD31 + الخلايا البطانية البشرية و AF488- HCD45 + خلايا المكونة للدم البشري في 500-550 نانومتر، و 655-فبا في 640-690 نانومتر.
  4. في القائمة "القنوات"، تعيين "الطول الموجي الليزر" إلى 890 نانومتر والطاقة إلى 50٪. تعيين "كسب (ماستر)" إلى 500-600، و "الإزاحة الرقمية" إلى 0، و "كسب الرقمية" إلى 15 لكل قناة. اضبط هذه القيم بعد بدء عملية الاستحواذ.
  5. في "وضع الاكتساب"، إعداد المعلمات المطلوبة للحصول على صور عالية الدقة دون الإضرار الأنسجة وتبييض فلوروفوريس. اضبط "وضع المسح الضوئي" على "فريم" و "فريم سيز" إلى "x512 y512 و" ستيب ستيب "إلى 1 و" سبيد "إلى 9 و" أفيراجينغ نومبر "إلى 8 و" بيت ديبث "إلى" 8 بت " الوضع "إلى" الخط "و" الاتجاه "إلى" ثنائية الاتجاه "و" الطريقة "إلى" يعني ".
    1. تعيين "زوأوم "إلى 1 للمسح الأولي للصورة، وزيادة إذا لزم الأمر للتركيز على مناطق معينة.
  6. وضع لوحة تحتوي على سقالة على المسرح المجهر تحت 20X، 1.0 نا عدسة الغمر بالماء وانخفاض العدسة حتى يلمس محلول ملحي. تعيين التركيز من العدسة على سقالة باستخدام العدسات المجهر، وذلك باستخدام مصباح كمصدر للضوء.
  7. قم بتفعيل قائمة "Z-ستاك"، وحدد الوظيفة "فيرست / لاست"، وحدد الفاصل الزمني المطلوب بين شريحتين متتابعتين فرعيتين (على سبيل المثال، 2-ميكرون Z-ستاك). الحفاظ على فترات ثابتة داخل Z- المكدس.
  8. حدد "مباشر" لصورة مسح حي للعينة وضبط "كسب الرقمية" و "الإزاحة الرقمية" للتعرض الأمثل. لتصور قنوات متعددة في نفس الوقت، حدد وظيفة "سبليت".
  9. في القائمة "المرحلة"، بينما في وضع "لايف"، مسح الصورة و "الأقسام" المناطق بين(روي)، مثل موقع الخلايا المكونة للدم البشرية والهياكل الوعائية. عند اكتمال المسح الضوئي للعينة، انتقل إلى أول عائد استثمار لبدء التصوير.
  10. في وضع "ليف"، قم بتعيين الجزء العلوي والسفلي من المكدس Z ثلاثي الأبعاد الذي يحيط بالمنطقة محل الاهتمام باستخدام الدوال "سيت فيرست" و "سيت لاست". بمجرد الانتهاء، تعيين المركز، "C." بدء اكتساب عائد الاستثمار مع زر "بدء التجربة". انظر أمثلة من الصور في الشكل 4 ، الشكل 5 ، والشكل 6 .
  11. بمجرد اكتساب كاملة، حفظ الصورة في المجلد المعين. الانتقال إلى عائد الاستثمار التالي وكرر الخطوة 4.10. مرة واحدة في التجربة كاملة، وإزالة لوحة التصوير من المجهر، وفصل بعناية العينة من لوحة، وتنظيف أي الغراء المتبقية.
  12. إعداد العينة لتقنية التحليل التالية.

5. بروسسين بروبلينز للأنسجة والمناعية

ملاحظة: تتم معالجة العينات وفقا للبروتوكول الموصوفة في تقنيات المختبر العامة جوف 54 تصف تثبيت العينة، والتضمين، وعمليات سيكتيونينغ. وينبغي أن تعالج عينات تشكيل العظام لمدة 7 أيام في وكيل إيدتا القائم على إزالة الكلس بين عمليات التثبيت والتضمين. الحل حجب / بيرمابيليزاتيون هو 10 ملي بس الرقم الهيدروجيني 7.4 العازلة مع 1٪ تريتون X-100، 1٪ ألبومين المصل البقري (بسا)، و 10٪ مصل الماعز العادي (نغس).

  1. وضع شرائح في زيلين لمدة 10 دقيقة)، زيلين لمدة 5 دقائق، و 100٪ من الإيثانول لمدة 5 دقائق، و 70٪ من الإيثانول لمدة 5 دقائق، و 50٪ من الإيثانول لمدة 5 دقائق، و H 2 O لمدة 5 دقائق.
  2. نقل شرائح إلى مستضد القائم على سترات كشف العمل حل.
  3. يغلي شرائح لمدة 15 دقيقة والسماح لهم لتبريد لدرجة حرارة الغرفة.
  4. غسل شرائح في 10 ملي بس حل الرقم الهيدروجيني 7.4 مع 1٪ تريتون X-100 (5 دقائق، 3 مرات).
  5. نقل سامبليس إلى حجب / بيرمابيليزاتيون حل واحتضان لمدة 30 دقيقة.
  6. إضافة الأجسام المضادة الأولية المخفف في حجب / بيرمابيليزاتيون حل واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  7. غسل شرائح في 10 ملي بس حل الرقم الهيدروجيني 7.4 مع 1٪ تريتون X-100 (5 دقائق، 3 مرات).
  8. إضافة الأجسام المضادة الثانوية المخفف في حجب / بيرمابيليزاتيون حل لمدة 1 ساعة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
  9. يغسل مع H 2 O (5 دقائق، 3 مرات).
  10. للحد من مضان الخلفية، تزج شرائح في السودان حل العمل الأسود لمدة 10 دقيقة، في الظلام وفي درجة حرارة الغرفة.
  11. غسل شرائح في H 2 O (5 دقائق، 3 مرات).
  12. جبل شرائح باستخدام المتوسطة الفلورسنت تصاعد مع دابي (0.5 ميكروغرام / مل).
  13. تخزين شرائح في 4 درجات مئوية وتحقق من أن وسط تصاعد جافة قبل إجراء التصوير الفلورسنت. انظر أمثلة الصور في الشكل 7 .

Representative Results

في الشكل 1 ، يتم عرض صور تمثيلية من البذر خلية سقالة وعمليات زرع. في الشكل 1C ، لاحظ أن الخلايا يتم حقن مباشرة في سقالة. في الشكل 1G ، لاحظ أن يتم إجراء شق في الجزء الخلفي من الماوس، حيث يتم إنشاء جيب تحت الجلد ويتم زرع سقالة. ويبين الشكل 2 مورفولوجيا الإجمالي من السقالات المختلفة زرعها في الفئران نسغ واسترجاعها بعد 8 أسابيع. لاحظ الأوعية الدموية طفيف في همسك السقالات المصنف ( الشكل 2A ). شارك البذر من إكس الإنسان مع همسس في سقالة يسمح لتشكيل الأوعية الدموية أكثر ملاءمة في السقالات ( الشكل 2B ). أخيرا، وجود ربمب-2 يدفع تكوين العظام. السقالات استرجاعها هي أكبر في هذه الحالة، وأنها تشكلت من قبلالعظام تشبه الأنسجة الصلبة.

ويبين الشكل 3 إعداد التكوين قناة على المجهر للعيش التصوير مع ند (التفاصيل في أسطورة الشكل). الشكل 4 والفيديو 1 تظهر خلايا المكونة للدم البشرية في السقالات المغلفة همسك. تم الكشف عن السقالات 8 أسابيع بعد الزرع وبعد التلقيح عن طريق الوريد من الأجسام المضادة AF488-HCD45 و 655-فبا. هذا الإجراء يسمح لتصور الخلايا المكونة للدم زرع الإنسان وهيكل الأوعية الدموية من قبل اثنين من الفوتون المجهري متحد البؤر. في هذه الحالة، تظهر الصور الأوعية الدموية (655-فبا) في السقالات و إنغرافتمنت على المدى الطويل من الخلايا المكونة للدم البشري (AF488-hCD45) في حمة سقالة. الشكل 5 والفيديو 2 تتوافق مع السقالات البشرية المصنفة مع هيكس و همسس. 8 أسابيع بعد الجراحة، و إكسلانتيد السقالات بعد إنترافنأوس التلقيح من الأجسام المضادة فيتس-HCD31 و 655-فبا، وتم الحصول على الصور مع المجهر متحد البؤر ثنائي الفوتون، كما ذكر من قبل. تظهر الصور مشاركة هيكس في تشكيل السفن في السقالة، مما أدى إلى الأوعية الدموية الخيمياء الفئران البشري.

ويبين الشكل 6A بيانات تمثيلية من النهج المستخدم لتحفيز تشكيل العظام في سقالات مسك. على غرار الأرقام السابقة، بعد 8 أسابيع من الزرع، تم إجراء التلقيح عن طريق الوريد من 655-فبا، تم استرجاع السقالات، وتم الحصول على الصور مع اثنين من الفوتون المجهر متحد البؤر. رابم-2-السقالات حفز تحفز تشكيل الأنسجة العظمية، والتي يمكن تصور بسبب شغ (اللون سماوي في الصور) التي يقدمها الكالسيوم في العظام. تظهر الصور المقدمة أيضا تشكيل تجاويف والأوعية الدموية الأنسجة إندوستيل، والتي تشبه إلى حد كبير الأنسجة إندستول بم. في الشكل 6B والفيديو 3 ، هيكس زرع مشترك مع همسكس. تم استرداد السقالات بعد التلقيح عن طريق الوريد من الأجسام المضادة فيتس-hCD31 و 655-فبا، واثنين من الفوتون الصور المجهري متحد البؤر تظهر مشاركة هيكس في الأوعية الدموية في سقالة العظام تشكيل.

ويبين الشكل 7 صور تمثيلية من الأنسجة، وهو إجراء يؤدي إلى دعم النتائج الموصوفة سابقا. تظهر الصور المناعية الأوعية الدموية الماوس، هيكس، همسكس، وطويلة الأجل إنغرافتيد خلايا المكونة للدم البشرية في الهياكل سقالة. تم إصلاح السقالات المستردة من الفئران واستخدامها لمناعي. في ربمب-2 الناقل السقالات العظام تشكيل ( الشكل 7D -F )، لاحظ التشكل من الأنسجة، وتشبه نخاع العظام ناضجة مع الأنسجة الدهنية. في هذا السقالة العظام تشكيل، وتبين لنا أن همسس هي الخلايا الليفية، والتي من شأنها أن تشير رقبعة أنها تساهم في الأنسجة التي شكلت حديثا كخلايا انسجة. وتبين لنا أيضا التعبير علامة شحمية الإنسان، والتي من شأنها أن تشير إلى أن همسكس تساهم أيضا في تشكيل الأنسجة الدهنية.

شكل 1
الشكل 1. صور الممثل من زرع الخلايا وعمليات زرع. أ) السقالة الأولي وطريقة القطع باستخدام مشرط. ب) 24 قطعة تم الحصول عليها من السقالة الأولية. ج) سقالة الخلية طريقة البذر باستخدام حقنة. د) السقالات المزروعة بالخلايا مع وسط الاستزراع، جاهزة لزرعها. إف) خطوات محددة للسقالات العظام تشكيل: E) سقالة يجري نقلها إلى 96 جيدا، لوحة u- أسفل و F) صورة ممثلة من الطريقة المستخدمة لإضافة rhbMP2، الثرومبين، والفيبرينوجين إلى سقالة. غ) سورجي عملية زرع كال تحت التخدير العام: G) الجرح التي تم إنشاؤها في الجلد وزرع سقالة، H) طريقة زرع، و إيج) الجرح إغلاق الإجراء باستخدام الغراء الجراحي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. مختلف السقالات المستردة من الفئران. صور ممثل للسقالات مسك (يسار)، مسك + إيك السقالات (الأوسط)، و مسك + إيك + بمب السقالات (يمين). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

4 / 55914fig3.jpg "/>
الشكل 3. تكوين القناة. يتم عرض الإعداد مرشح المجهر. أ) هناك أربعة وحدات الكشف عن ند: في الوحدة الأولى، وهناك نوعان من مكعبات مرشح. وحدات الثانية والثالثة لديها واحد مرشح مكعب لكل منهما؛ وآخر وحدة لا يوجد لديه مكعب (لا تستخدم). أول أنبوب المضاعفات الضوئية (بمت) هو للقناة الحمراء البعيدة (640 - 690 نانومتر)، مما يعكس أطوال موجات أقل؛ التالية هي 380 - 485 نانومتر، 500 - 550 نانومتر، و 555 - 625 نانومتر (النظام هو دائما من أقل إلى أطوال موجية أعلى). ب) الانبعاثات فلورفور للكشف مع تكوينات أعلاه (لون مشفرة). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4
الشكل 4. مسك سقالة s السماح لتشكيل مكانة للخلايا المكونة للدم البشرية. A) و B) 3D إعادة بناء Z- مداخن اتخذت بعد إكسبلانت، بعد التلقيح عن طريق الوريد مع AF488-HCD45 (الأخضر)، لتسمية الخلايا المكونة للدم البشرية، و 655-فبا (أرجواني) م لتسمية الأوعية الدموية. أشرطة مقياس تمثل 20 ميكرون في A و B (لوحات العليا) و 5 ميكرون في B (لوحات أقل). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيديو 1
فيديو 1. مسك سقالات تسمح لتشكيل مكانة للخلايا المكونة للدم البشرية . 3D إعادة الإعمار من الخلايا المكونة للدم البشري (AF488-hCD45) المرتبطة الأوعية الدموية (655-فبا) في سقالة مسك (هياكل الكولاجين: شغ، سماوي). كل كومة التدابير 140 × 140 ميكرون.إف = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914video1.mov" تارجيت = "_ بلانك"> الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)

الشكل 5
الشكل 5. المشاركة الإنسانية البشرية في تشكيل سفن إنسانية في سقالات مسك. 3D إعادة بناء الأوعية الدموية (655-فبا) واصطف من قبل إكس من أصل الإنسان (فيتس-hCD31) في سقالات مسك + إيك. تمثل الحانات مقياس 20 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيديو 2
فيديو 2. المشاركة الإنسانية الإنسان في تشكيل السفن الإنسانية في سقالات مسك. 3D إعادة الإعمار من إكس الإنسان (فيتس-hCD31) بطانة فا سكولاتور (655-فبا) في سقالات مسك + إيك. كل كومة التدابير 240 × 240 ميكرون. الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)

الشكل 6
الشكل 6. ربمب-2 السقالات الناقل لها السطوح العظام والأنسجة الوعائية أنسنة على غرار نخاع العظام. أ) 3D إعادة الإعمار من مسك + بمب السقالات تظهر تشكيل هياكل العظام (شغ-سماوي) والأوعية الدموية (655-فبا). أشرطة مقياس تمثل 100 ميكرون (يسار)، 70 ميكرون (وسط)، و 50 ميكرون (يمين). ب) 3D إعادة الإعمار من مسك + إيك + بمب السقالات تظهر الأوعية أنسنة (655-فبا) واصطف مع إكس البشري (فيتس-hCD31). تمثل الحانات مقياس 50 ميكرون (يسار) و 30 ميكرون (الوسط واليمين).14 / 55914fig6large.jpg "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيديو 3
فيديو 3. ربمب-2 السقالات الناقل لها السطوح العظام والأنسجة الوعائية أنسنة مماثلة لنخاع العظام. 3D إعادة الإعمار من مسك + فيرا + بمب سقالة (العظام: شغ؛ الأوعية: 655-فبا؛ إكس الإنسان: فيتس-hCD31). كل كومة يقيس 600 × 600 ميكرون. الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)

الشكل 7
الشكل 7. صور الممثل من المناعي نفذت على السقالات الثابتة. أف) الدراسات المناعية التي أجريت لتحديد موقع الخلايا البشرية زرعها طn السقالات. أس) السقالات زرعها مع هيكس، همسكس، و هسس. دف) السقالات تشكيل العظام مزروع مع هيكس، همسكس، و هسس. قنوات اللون هي كما يلي: أد) الإنسان إيك (hcd31) والفأر هيكل الأوعية الدموية (إندوموسين، إيندوم)، بي) همسكس (هفيمنتين، هفيم) والفأر خلايا الأوعية الدموية (إندوموسين، إيندوم)، ج) خلايا المكونة للدم البشري (hcd45) والأوعية الدموية الماوس (إندوموسين، إندوم)، و F) البروتين الدهني التمايز ذات الصلة البشرية (هادرب) والأوعية الدموية الماوس (إندوموسين، إندوم). أشرطة مقياس تمثل 10 ميكرون (A و C)، 20 ميكرون (B و E)، و 40 (D و F) ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

أهمية فيما يتعلق بالطرق القائمة:

في هذا البروتوكول، وصفنا طريقة لتوليد ميكرونفيرونمنتس أنسنة مختلفة في الفئران وتصور بنيتهم ​​عن طريق اثنين من الفوتون المجهري والأنسجة. البيانات التمثيلية المقدمة تبين جدوى النهج، وذلك باستخدام خلايا انسجة مختلفة لهندسة الأنسجة أنسنة. بروتوكول لديه تطبيقات محددة لدراسة الخلايا المكونة للدم البشرية ونخاع العظام المشتق الخلايا المتخصصة في الظروف العادية والمرضية. وتشمل هذه التطبيقات دراسة تطور النسيلي، وفحص المخدرات، والتداخل المتبادل بين هسس الإنسان ومكونات انسجة. في المجال الناشئ للهندسة الأنسجة، وقد اقترحت عدة نهج بديلة. وتشمل مقاربات ملاحظة تطوير الهياكل 3D أنسنة بم في المختبر 55 ، 56 ، 57 ،s = "كريف"> 58 ، 59 ، 60 ، 61 ، 62 ، 63 والكسب غير المشروع مثلي من السقالات بم أنسنة في الفئران 64 . نهجنا لديه ميزة الجمع بين كل من تعقيد النظام في الجسم الحي مع سهولة الوصول التشريحية من الكسب غير المشروع الأنسجة أنسنة.

التعديلات وتحري الخلل وإصلاحه:

مصدر التباين في هذا البروتوكول يمكن العثور عليها في اختيار الخلايا المستخدمة لبذور السقالات. في عملنا، استخدمنا همسكس بم المشتقة. ومع ذلك، يمكن الحصول على خلايا الوسيطة من عدة أنسجة، والتي قد تظهر خصائص مميزة اعتمادا على الأصل. لذلك، يمكن النظر في استخدام همسس المستمدة من أجهزة مختلفة. ومع ذلك، يجب اختبار قدرتها على تشكيل أنسجة العظام في الجسم الحي قبل استخدامها في هذا صيستخدم هذا البروتوكول المتاحة تجاريا مصدر الخلايا البطانية البشرية ( أي E4ORF1-ترانسدوسد هوفيك). في الآونة الأخيرة، تم الإبلاغ عن استخدام الخلايا البطانية الخاصة بالأعضاء لأغراض مختلفة 65 ، 66 . وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هيكس الأولية المستمدة من بم تمثل تحسنا للاهتمام للبروتوكول. ولذلك، فإن استخدام مصادر مختلفة من الخلايا البطانية قد تنتج مختلفة في نتائج الجسم الحي .

استخدمنا نسغ الفئران المتلقي المناعة لصالح زرع السقالات المتوافقة مع البشر وتجنب رفض الأنسجة. نحن لا نستبعد إمكانية استخدام هذا البروتوكول لمهندس الأنسجة خارج الرحم نخاع العظام في سلالات الماوس الأخرى. في الواقع، ربم-2 يمكن أن تحفز تكوين العظام في نماذج الثدييات المختلفة 47 ، 48 ، 49 ، 50 52 . ومع ذلك، فإن الاختلافات في بقاء الخلية والزرع على المدى الطويل من المرجح أن يلاحظ باستخدام سلالات / نماذج مختلفة.

توقيت الانتعاش سقالة يمكن أيضا أن تكون مرنة، وهذا يتوقف على الغرض النهائي من التجربة. في بروتوكول المقدمة، ونحن استعادة العينات في 8-12 أسابيع بعد زرع لتقييم إنغرافتمنت المكونة للدم على المدى الطويل. لدراسة الخطوات المبكرة للإنسان تشكيل بم المتخصصة (على سبيل المثال، تشكيل نسيج عظمي غضروفي 47 أو تطوير الأوعية الدموية)، ويمكن اختيار نقاط زمنية مختلفة.

يشار إلى تقنية التصوير الحي وصفنا في هذا البروتوكول للتصوير على المدى القصير من إكسلانتس. ينبغي النظر في استخدام لغرفة معايرتها للحفاظ على درجة حرارة الفسيولوجية، توتر الأوكسجين، وتركيز CO 2 في حالات التصوير على المدى الطويل، مثل لدراسة السلوكيات الحركة.

شارع الحرجةإبس ضمن البروتوكول:

ومن بين التحديات المتعلقة بالبروتوكول، نسلط الضوء على المهارات التقنية المطلوبة لبعض الخطوات. وينبغي استخدام الخلايا الوسيطة والخلايا البطانية في أرقام مرور الخلايا منخفضة. وإلا، فإنها لن تكون قادرة على دعم الإنسان المكونة للدم الخلية إنغرافتمنت في الجسم الحي أو للمشاركة في دي نوفو الأوعية الدموية وتشكيل العظام في الجسم الحي . نوصي باستخدام همسكس و هيكس في الممرات 1 - 5. إعداد سقالة وخلايا البذر الخطوات تتطلب المهارات الأساسية خلية الثقافة والمعرفة من خصائص الخلايا المحددة المستخدمة في هذا الإجراء. بروتوكول الجراحة هو واضح جدا ولكن يتطلب بعض الممارسة. صيانة بيئة معقمة لتجنب تلوث السقالات المزروع في الفئران العوز المناعي أمر بالغ الأهمية لضمان نجاح التجربة. عينة إكسلانت والتصوير الحي تتطلب الممارسة الجراحية (وخاصة بالنسبة لاستخدام ميكرودريل) ومعرفةنظام المجهر. وأخيرا، معالجة العينات والأنسجة تتطلب معرفة أساسية من التقنيات التي سيتم استخدامها.

قيود التقنية:

النهج الذي وصفنا يسمح لتصور الخلايا المكونة للدم الإنسان الحية البذر المكروية نخاع العظام المكروية، مع الخلايا البطانية البشرية تشكيل هياكل الأوعية الدموية والخلايا الوسيطة تشكيل العظام / نخاع العظام الفضاء. كما يتم تشكيل الأنسجة في الجسم الحي ، والسقالة المهندسة النهائية لا تزال تكون خيالية (الإنسان والفئران). وينبغي أن تؤخذ هذه المسألة في الاعتبار، كما أن الأنسجة الخيميائية قد لا تحاكي تماما الإنسان نخاع العظام تعقيد والبيئة.

السقالات المزروع لها حجم محدود (حاولنا بحد أقصى 6.6 × 7.5 × 7 مم)، وبالتالي، فهي قادرة على استضافة عدد محدود من الخلايا لزرع الأعضاء. كما أن العدد المطلق للخلايا المستعادة سيكون محدودا. وبالتالي، ينبغي أن عدد من السقالات المزروعتحسب كدالة لعدد الخلايا المطلوبة للتجربة.

تطبيق التصوير وصفنا مفيد بشكل خاص لمراقبة مساحات كبيرة من الأنسجة الحية على أعماق 150-200 ميكرون من السطح دون تعطيل العمارة وإلحاق الضرر بالخلايا. لذلك، فإنه لا يسمح لتصور السقالة كله. إذا كان مطلوبا مسح كامل من الأنسجة، ومناهج القياسية المناعي سيكون أكثر ملاءمة.

تطبيقات المستقبل:

الاتجاه المستقبلي لهذا النموذج الحيوي سوف يكون لزيادة تعقيد المكونات البشرية في الأنسجة. وقد تقدمت المعرفة وتوصيف البشرية بم المتخصصة في السنوات الأخيرة 67 ، ويمكن أن يكون البروتوكول وصفها منصة مثيرة للاهتمام لدراسة وظيفة هذه المكونات الخلوية الجديدة والعوامل القابلة للذوبان، وكذلك دورها في دعم طبيعي / الخبيثةالنمل هسس.

وعلاوة على ذلك، فإن تقنية التصوير يوفر إمكانية التصوير إنترافيتال من السقالات في الدراسات الطولية، الأمر الذي يتطلب تحسينات تقنية في تصوير السقالات في الفئران الحية، تخدير، مع الانتعاش بعد الجراحة. وسيتطلب هذا النهج اتخاذ خطوات إضافية ويجري حاليا التحقيق فيه في المختبر.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

نشكر الموظفين في المرافق الأساسية في معهد فرانسيس كريك (مرفق البحوث البيولوجية، في فيفو التصوير والتجريبية علم التشريح) ويولاندا سافيدرا توريس ومرسيدس سانشيز-غارزون، الأطباء البيطريون في كريك و لري على التوالي، على مساعدتهم القيمة. نحن ممتنون للدكتور W. غراي لقراءة المخطوطة نقديا. تم دعم دب من قبل زمالة البحوث غير السريرية من إها. وقد تم دعم هذا العمل من قبل معهد فرانسيس كريك، الذي يتلقى تمويله الأساسي من أبحاث السرطان في المملكة المتحدة (FC001045)، ومجلس البحوث الطبية في المملكة المتحدة (FC001045)، و الترحيب الثقة (FC001045).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ficoll-Paque Ge Healthcare 17-1440-03
Cd34 positive selection Kit Stemcell 18056 Store a 4°C.
Magnet Stemcell 18000
Anti-human CD3 antibody, clone OKT-3 Bioxcell BE0001-2 Store at 4°C. Used for T cell depletion in primary AML samples. 
Cytokines (IL3, G-CSF, and TPO) PeproTech 200-03, 300-23 and 300-18 For doing the stock: Dilute each one of the cytokines in 100 μL of water and mix them. Add 200 μL, do alicuots of 45 μL and Store at -20 °C.
DMSO Sigma D4540
FBS Life technologies 10270106 Heat-inactivate at 56 °C during 30 min, do aliquots and freeze down. Warm in 37 °C water bath before use.
MEM-α Invitrogen 32571-028 Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
Myelocult H5100 corning 5100 Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
199 Gibco 41150-020 Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
hMSC-FBS, Heat-inactivated Gibco 12662-029 Store at -20 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
P/S Sigma-Aldrich P0781 Store at -20 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
ECGS Millipore 02-102 Dilute in culture media and use 0.22 mm filter.
HEPES Sigma-Aldrich S1558-50ML Store at 4 °C.
Heparin Sigma-Aldrich H3149 Store at 4 °C.
Glutamine Gibco 25030 Store at -20 °C.
Collagen 1 coated cell culture plate corning 354505
Trypsin-EDTA solution Thermo-Fisher 25200056 Store at -20 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
hMSC Lonza PT-2501 Alternatively, hMSCs we also kindly provided by Dr. Dosquet (University Paris Diderot, Paris) from human bone marrow obtained during orthopaedic surgery under ethical approval 10-038 from IRB00006477. 
VeraVec HUVEC endothelial cells Angiocrine bioscience hVera101 Alternatively, other human endothelial cell source may be used.
Human hematopoietic cells Umbilical Cord blood or primary Acute Myeloid Leukemia (AML) samples were obtained from the Royal London Hospital (London, UK) after informed consent and protocol of use was approved by the East London Ethical Committee and carried out in accordance with the Declaration of Helsinki. 
Gelfoam, Size 12 - 7mm Pfizer 00009-0315-08 Alternative supplier: Febelco
PBS Thermo-Fisher 10010023
Surgical material Multiple Sterile forceps, tweezers and sharp scissors.
Sterile tissues Heat-sterilize paper tissues.
1 mL Syringe with needle of 25G Terumo SS+01H25161
Ultra Low Attachment Multiple Well Plates Corning 3473 or 3471
BMP2 Noricum rhBMP-2 Dilute at 5 mg/mL in acetic acid 50 mM and store at 4 °C.
Thrombin Sigma T8885 Dilute in CaCl2 2%, 500 mL per vial, and store at 4 °C.
Fibrinogen Sigma F3879 Dilute at 4 mg/100 mL in PBS. Store at -20 °C. Warm before use.
Tissue-culture dishes 35 mm x 10 mm Falcon 353001
U-Botton 96 well plate Falcon 353077
NSG mice The Jackson Laboratory 5557 NSG mice were a kind gift from Dr Leonard Shultz (The Jackson Laboratory).
Chlorhexidine G9 Dilute 1:10 before use
Carprofen Pfizer Rimadyl 5 mg/kg of mouse
Buprenorphine Alstoe Vetergesic 0.1 mg/kg of mouse body weight
Isoflurane Abbott B506 Induction of anaesthesia 2%, maintenance 1%
Trimmer Wella Contura HS61
Surgical glue 3M Vetbond
carbomer (polyacrylic acid) as Ophthalmic gel Novartis Viscotears Liquid Gel
Human Normal Immunoglobulin Gammaplex 10g vial 100 mL/mouse intravenously, 30 min before infusion of specific antibody.
NT-QTracker Invitrogen Q21021MP Vessel-pooling agent. Administrate 15 mL/mouse intravenously 5 min before imaging.
AF488-hCD45 Biolegend 304017 100 mL/mouse intravenously, 30 min before imaging.
FITC-hCD31 BD Pharmigen 555445 100 mL/mouse intravenously, 30 min before imaging.
Super glue Loctite Super Glue
Micro-Drill Kit IDEAL - Fisher Scientific NC9010016
Microsurgical microscope No specific brand/company is adviced.
LSM 710 NLO Zeiss Upright confocal microscope with motorized stage, two-photon laser and 20X 1.0 NA water immersion lens. Alternatively, a microscope with similar specifications could be used.
MaiTai “High Performance” fully automated 1-box 517 mode-locked Ti:Sapphire laser with DeepSee dispersion compensation Spectra-Physics
Formalin solution, neutral buffered, 10%  Sigma-Aldrich HT501128
Ethanol Sigma-Aldrich 32294
Osteosoft Millipore 1.01728.1000
Polysine slices Thermo scientific J2800AMNZ
Antigen unmasking solution Vector H-3300 Store at 4 °C. Dilute 1:100 in H2O for working solution.
Triton 100x Sigma-Aldrich T9284
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A96470 Store at 4 °C.
Normal Goat serum (NGS) Sigma-Aldrich G9023 Store at 4 °C.
Endomucin Antibody Santa Cruz sc-65495 Store at 4 °C.
hVimentin antibody Santa Cruz sc-6260 Store at 4 °C.
hCD31 antibody DAKO M0823 Store at 4 °C.
hCD45 antibody DAKO M0701 Store at 4 °C.
ADRP (Perilipin2) antibodies-online ABIN283918 Store at 4 °C.
Goat anti mouse secondary antibodies Invitrogen A11029 or A11005 Store at 4 °C.
Goat anti Rabbit secondary antibodies Invitrogen A11037 or A11008 Store at 4 °C.
Goat anti Rat secondary antibodies Invitrogen A11007 or A21247 Store at 4 °C.
Sudan Black Sigma S2380 Prepare a stock of 1% sudan black in ethanol 70%. Store at RT. Prepare working solution of 0.1% sudan black in ethanol 70% and filter using filter-paper before use.
DAPI Sigma D8417 Prepare stock in H20 at 100 mg/mg. Store at 4 °C.
Fluorescent mounting media Dako S3023 Add DAPI before use (1:400 from DAPI stock).
Cover glass VWR 631-0147

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoggatt, J., Kfoury, Y., Scadden, D. T. Hematopoietic Stem Cell Niche in Health and Disease. Annu Rev Pathol. 11, 555-581 (2016).
  2. Hanoun, M., et al. Acute myelogenous leukemia-induced sympathetic neuropathy promotes malignancy in an altered hematopoietic stem cell niche. Cell Stem Cell. 15 (3), 365-375 (2014).
  3. Frisch, B. J., et al. Functional inhibition of osteoblastic cells in an in vivo mouse model of myeloid leukemia. Blood. 119 (2), 540-550 (2012).
  4. Zhang, B., et al. Altered microenvironmental regulation of leukemic and normal stem cells in chronic myelogenous leukemia. Cancer Cell. 21 (4), 577-592 (2012).
  5. Schepers, K., et al. Myeloproliferative neoplasia remodels the endosteal bone marrow niche into a self-reinforcing leukemic niche. Cell Stem Cell. 13 (3), 285-299 (2013).
  6. Krause, D. S., et al. Differential regulation of myeloid leukemias by the bone marrow microenvironment. Nat Med. 19 (11), 1513-1517 (2013).
  7. Mendez-Ferrer, S., Scadden, D. T., Sanchez-Aguilera, A. Bone marrow stem cells: current and emerging concepts. Ann N Y Acad Sci. 1335, 32-44 (2015).
  8. Boulais, P. E., Frenette, P. S. Making sense of hematopoietic stem cell niches. Blood. 125 (17), 2621-2629 (2015).
  9. Ding, L., Morrison, S. J. Haematopoietic stem cells and early lymphoid progenitors occupy distinct bone marrow niches. Nature. 495 (7440), 231-235 (2013).
  10. Kunisaki, Y., et al. Arteriolar niches maintain haematopoietic stem cell quiescence. Nature. 502 (7473), 637-643 (2013).
  11. Pinho, S., et al. PDGFRalpha and CD51 mark human nestin+ sphere-forming mesenchymal stem cells capable of hematopoietic progenitor cell expansion. J Exp Med. 210 (7), 1351-1367 (2013).
  12. Mizoguchi, T., et al. Osterix marks distinct waves of primitive and definitive stromal progenitors during bone marrow development. Dev Cell. 29 (3), 340-349 (2014).
  13. Zhou, P., Wang, Y., Li, D., Hu, S. Y., Chen, G. H. Therapeutic efficacy of mixed hematopoietic stem cell transplantation for pediatric hematologic diseases. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. 22 (2), 434-439 (2014).
  14. Sugiyama, T., Kohara, H., Noda, M., Nagasawa, T. Maintenance of the hematopoietic stem cell pool by CXCL12-CXCR4 chemokine signaling in bone marrow stromal cell niches. Immunity. 25 (6), 977-988 (2006).
  15. Tzeng, Y. S., et al. Loss of Cxcl12/Sdf-1 in adult mice decreases the quiescent state of hematopoietic stem/progenitor cells and alters the pattern of hematopoietic regeneration after myelosuppression. Blood. 117 (2), 429-439 (2011).
  16. Pearce, D. J., et al. AML engraftment in the NOD/SCID assay reflects the outcome of AML: implications for our understanding of the heterogeneity of AML. Blood. 107 (3), 1166-1173 (2006).
  17. Sanchez, P. V., et al. A robust xenotransplantation model for acute myeloid leukemia. Leukemia. 23 (11), 2109-2117 (2009).
  18. Uzan, B., et al. Interleukin-18 produced by bone marrow-derived stromal cells supports T-cell acute leukaemia progression. EMBO Mol Med. 6 (6), 821-834 (2014).
  19. Foster, K., et al. Different Motile Behaviors of Human Hematopoietic Stem versus Progenitor Cells at the Osteoblastic Niche. Stem Cell Reports. 5 (5), 690-701 (2015).
  20. Hawkins, E. D., et al. T-cell acute leukaemia exhibits dynamic interactions with bone marrow microenvironments. Nature. 538 (7626), 518-522 (2016).
  21. Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).
  22. Lassailly, F., Foster, K., Lopez-Onieva, L., Currie, E., Bonnet, D. Multimodal imaging reveals structural and functional heterogeneity in different bone marrow compartments: functional implications on hematopoietic stem cells. Blood. 122 (10), 1730-1740 (2013).
  23. Holzapfel, B. M., Wagner, F., Thibaudeau, L., Levesque, J. P., Hutmacher, D. W. Concise review: humanized models of tumor immunology in the 21st century: convergence of cancer research and tissue engineering. Stem Cells. 33 (6), 1696-1704 (2015).
  24. Scotti, C., et al. Engineering of a functional bone organ through endochondral ossification. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (10), 3997-4002 (2013).
  25. Scotti, C., et al. Recapitulation of endochondral bone formation using human adult mesenchymal stem cells as a paradigm for developmental engineering. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (16), 7251-7256 (2010).
  26. Kuznetsov, S. A., et al. Single-colony derived strains of human marrow stromal fibroblasts form bone after transplantation in vivo. J Bone Miner Res. 12 (9), 1335-1347 (1997).
  27. Bianco, P., Robey, P. G. Skeletal stem cells. Development. 142 (6), 1023-1027 (2015).
  28. Vaiselbuh, S. R., Edelman, M., Lipton, J. M., Liu, J. M. Ectopic human mesenchymal stem cell-coated scaffolds in NOD/SCID mice: an in vivo model of the leukemia niche. Tissue Eng Part C Methods. 16 (6), 1523-1531 (2010).
  29. Groen, R. W., et al. Reconstructing the human hematopoietic niche in immunodeficient mice: opportunities for studying primary multiple myeloma. Blood. 120 (3), e9-e16 (2012).
  30. Chen, Y., et al. Human extramedullary bone marrow in mice: a novel in vivo model of genetically controlled hematopoietic microenvironment. Blood. 119 (21), 4971-4980 (2012).
  31. Reinisch, A., et al. A humanized bone marrow ossicle xenotransplantation model enables improved engraftment of healthy and leukemic human hematopoietic cells. Nat Med. 22 (7), 812-821 (2016).
  32. Sontakke, P., et al. Modeling BCR-ABL and MLL-AF9 leukemia in a human bone marrow-like scaffold-based xenograft model. Leukemia. 30 (10), 2064-2073 (2016).
  33. Theocharides, A. P., Rongvaux, A., Fritsch, K., Flavell, R. A., Manz, M. G. Humanized hemato-lymphoid system mice. Haematologica. 101 (1), 5-19 (2016).
  34. Antonelli, A., et al. Establishing human leukemia xenograft mouse models by implanting human bone marrow-like scaffold-based niches. Blood. 128 (25), 2949-2959 (2016).
  35. Holzapfel, B. M., et al. Tissue engineered humanized bone supports human hematopoiesis in vivo. Biomaterials. 61, 103-114 (2015).
  36. Reinisch, A., et al. Epigenetic and in vivo comparison of diverse MSC sources reveals an endochondral signature for human hematopoietic niche formation. Blood. 125 (2), 249-260 (2015).
  37. Lee, J., et al. Implantable microenvironments to attract hematopoietic stem/cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (48), 19638-19643 (2012).
  38. Lee, J., Heckl, D., Parekkadan, B. Multiple genetically engineered humanized microenvironments in a single mouse. Biomater Res. 20 (19), 1-13 (2016).
  39. Ho, M. S., Medcalf, R. L., Livesey, S. A., Traianedes, K. The dynamics of adult haematopoiesis in the bone and bone marrow environment. Br J Haematol. 170 (4), 472-486 (2015).
  40. Bersani, F., et al. Bioengineered implantable scaffolds as a tool to study stromal-derived factors in metastatic cancer models. Cancer Res. 74 (24), 7229-7238 (2014).
  41. Thibaudeau, L., et al. Mimicking breast cancer-induced bone metastasis in vivo: current transplantation models and advanced humanized strategies. Cancer Metastasis Rev. 33 (2-3), 721-735 (2014).
  42. Holzapfel, B. M., et al. Species-specific homing mechanisms of human prostate cancer metastasis in tissue engineered bone. Biomaterials. 35 (13), 4108-4115 (2014).
  43. Thibaudeau, L., Holzapfel, B. M., Hutmacher, D. W. Humanized mice models for primary bone tumor and bone metastasis research. Cell Cycle. 14 (14), 2191-2192 (2015).
  44. Thibaudeau, L., et al. A tissue-engineered humanized xenograft model of human breast cancer metastasis to bone. Dis Model Mech. 7 (2), 299-309 (2014).
  45. Abarrategi, A., Foster, K., Hamilton, A., Mian, S., Passaro, D., Gribben, J., Mufti, G., Bonnet, D. Versatile humanized niche model enables study of normal and malignant human hematopoiesis. J Clin Invest. 127 (2), (2017).
  46. Abarrategi, A., et al. In vivo ectopic implantation model to assess human mesenchymal progenitor cell potential. Stem Cell Rev. 9 (6), 833-846 (2013).
  47. Rubio, R., et al. Bone environment is essential for osteosarcoma development from transformed mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32 (5), 1136-1148 (2014).
  48. Abarrategi, A., et al. Multiwall carbon nanotube scaffolds for tissue engineering purposes. Biomaterials. 29 (1), 94-102 (2008).
  49. Abarrategi, A., et al. Gene expression profile on chitosan/rhBMP-2 films: A novel osteoinductive coating for implantable materials. Acta Biomater. 5 (7), 2633-2646 (2009).
  50. Abarrategi, A., et al. Biological properties of solid free form designed ceramic scaffolds with BMP-2: in vitro and in vivo evaluation. PLoS One. 7 (3), e34117 (2012).
  51. Abarrategi, A., et al. Chitosan scaffolds for osteochondral tissue regeneration. J Biomed Mater Res A. 95 (4), 1132-1141 (2010).
  52. Abarrategi, A., et al. Improvement of porous beta-TCP scaffolds with rhBMP-2 chitosan carrier film for bone tissue application. Tissue Eng Part A. 14 (8), 1305-1319 (2008).
  53. Prasain, N., Meador, J. L., Yoder, M. C. Phenotypic and functional characterization of endothelial colony forming cells derived from human umbilical cord blood. J Vis Exp. (62), (2012).
  54. JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Histological Sample Preparation for Light Microscopy. J Vis Exp. , (2016).
  55. Hong, J. K., Yun, J., Kim, H., Kwon, S. Three-dimensional culture of mesenchymal stem cells. Tissue Eng Regen Med. 12 (4), 211-221 (2015).
  56. Bara, J. J., et al. Three-dimensional culture and characterization of mononuclear cells from human bone marrow. Cytotherapy. 17 (4), 458-472 (2015).
  57. Dong, H. W., Qin, S., Rafailovich, M., Ma, Y. Developing an Optimal Biofunctional Scaffold for Hematopoietic Stem Cell Quiescent Maintenance and Expansion. N Am J Med Sci. 8 (2), (2015).
  58. Raic, A., Rodling, L., Kalbacher, H., Lee-Thedieck, C. Biomimetic macroporous PEG hydrogels as 3D scaffolds for the multiplication of human hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 35 (3), 929-940 (2014).
  59. Miyoshi, H., Morita, M., Ohshima, N., Sato, C. Expansion of mouse hematopoietic progenitor cells in three-dimensional cocultures on frozen-thawed stromal cell layers formed within porous scaffolds. Exp Hematol. 43 (2), 115-124 (2015).
  60. Cuddihy, M. J., Wang, Y., Machi, C., Bahng, J. H., Kotov, N. A. Replication of bone marrow differentiation niche: comparative evaluation of different three-dimensional matrices. Small. 9 (7), 1008-1015 (2013).
  61. Sharma, M. B., Limaye, L. S., Kale, V. P. Mimicking the functional hematopoietic stem cell niche in vitro: recapitulation of marrow physiology by hydrogel-based three-dimensional cultures of mesenchymal stromal cells. Haematologica. 97 (5), 651-660 (2012).
  62. Leisten, I., et al. 3D co-culture of hematopoietic stem and progenitor cells and mesenchymal stem cells in collagen scaffolds as a model of the hematopoietic niche. Biomaterials. 33 (6), 1736-1747 (2012).
  63. Ferreira, M. S., et al. Cord blood-hematopoietic stem cell expansion in 3D fibrin scaffolds with stromal support. Biomaterials. 33 (29), 6987-6997 (2012).
  64. Baldwin, J. G., et al. Periosteum tissue engineering in an orthotopic in vivo platform. Biomaterials. 121, 193-204 (2017).
  65. Rafii, S., Butler, J. M., Ding, B. S. Angiocrine functions of organ-specific endothelial cells. Nature. 529 (7586), 316-325 (2016).
  66. Seandel, M., et al. Generation of a functional and durable vascular niche by the adenoviral E4ORF1 gene. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (49), 19288-19293 (2008).
  67. Medyouf, H. The microenvironment in human myeloid malignancies: emerging concepts and therapeutic implications. Blood. 129 (12), 1617-1626 (2017).

Tags

البيولوجيا التنموية، العدد 126، التصوير الحي، المجهر ثنائي الفوتون، نخاع العظام، سدى، المكروية، مكانة إنسانية، الخلايا الجذعية المكونة للدم البشرية، سرطان الدم البشري، الأوعية الدموية، الخلايا البطانية، خلايا انسجة الوسيطة، BMP2
الهندسة الحيوية من أنسنة نخاع العظام ميكرونفيرونمنتس في الماوس والتصور من خلال التصوير لايف
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Passaro, D., Abarrategi, A., Foster, … More

Passaro, D., Abarrategi, A., Foster, K., Ariza-McNaughton, L., Bonnet, D. Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging. J. Vis. Exp. (126), e55914, doi:10.3791/55914 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter