Summary
Ein Protokoll für die Etablierung eines gentechnisch veränderten Mausmodells von Darmkrebs durch segmentale Adeno-Cre-Infektion und deren Überwachung durch hochauflösende Koloskopie wird vorgestellt.
Abstract
Trotz der Vorteile der einfachen Anwendbarkeit und der Kostenwirksamkeit haben Darmkrebs-Mausmodelle, die auf der Tumorzellinjektion basieren, schwere Einschränkungen und simulieren die Tumorbiologie und die Tumorzellverbreitung nicht genau. Genetisch manipulierte Mausmodelle wurden eingeführt, um diese Einschränkungen zu überwinden; Allerdings sind solche Modelle technisch anspruchsvoll, vor allem in großen Orgeln wie dem Doppelpunkt, in dem nur ein einziger Tumor gewünscht wird.
Als Ergebnis wurde ein immunkompetentes, genetisch manipuliertes Mausmodell von Darmkrebs entwickelt, das hochgradig einheitliche Tumore entwickelt und sowohl für Tumorbiologie als auch therapeutische Studien eingesetzt werden kann. Die Tumorentwicklung wird durch chirurgische, segmentale Infektion des distalen Dickdarms mit Adeno-Cre-Virus in zusammengesetzten mutomenten Mäusen initiiert. Die Tumoren können leicht durch Koloskopie erkannt und überwacht werden. Wir beschreiben hier die chirurgische Technik der segmentalen Adeno-Infektion vonDer Dickdarm, die Überwachung des Tumors durch hochauflösende Koloskopie und präsentieren die daraus resultierenden kolorektalen Tumoren.
Introduction
Darmkrebs (CRC) ist nach wie vor eine der führenden Ursachen für krebsbedingten Tod in den westlichen Ländern. 1 Während die Prognose von Patienten mit Frühphasenkrankheit gut ist, werden in späteren Stadien viele Tumore diagnostiziert, bei denen trotz zahlreicher Behandlungsmöglichkeiten die Prognose begrenzt ist. 2 , 3 , 4 , 5
Die Mehrheit der aktuellen Mausmodelle von CRC basiert auf der Implantation von aus Zelllinien oder Patiententumoren gewonnenen Tumorzellen in immundefiziente Mäuse. 6 , 7 , 8 Dies führt zu lokalem und je nach Injektionsstelle und den zur Injektion verwendeten Tumorzellen, manchmal metastatischen Tumoren. 9 , 10 Allerdings haben die resultierenden Xenotransplantatmodelle majoR Einschränkungen. Sie müssen in immundefizienten Mäusen etabliert werden, wodurch die komplexe Wechselwirkung zwischen dem Tumor und dem Wirtsimmunsystem eliminiert wird. Zusätzlich, da das Tumorstroma aus Wirtszellen gewonnen wird, ist die Wechselwirkung zwischen menschlichem Tumorparenchym und murinem Stroma defekt und daher nicht repräsentativ für die Erkrankung. Diese Mängel können durch die Verwendung von murinen Zelllinien zur Injektion vermieden werden. Allerdings sind nur wenige murine CRC-Zelllinien verfügbar und sind, ähnlich den meisten verfügbaren menschlichen CRC-Zelllinien, monoklonal und hoch anaplastisch. 11 Zusammenfassend sind die meisten derzeit verfügbaren CRC-Mausmodelle sehr künstlich und nicht vollständig repräsentativ für die menschliche Krankheit.
Genetisch manipulierte Mausmodelle (GEMMs) von CRC können diese Nachteile vermeiden, da sie echte Maus-Tumoren aufweisen, die durch Induktion von Schlüsselmutationen von CRC im Dickdarm entstehen. 12 , 13 ,14 Dies kann durch die Aktivierung von bedingten (floxed) Keimbahnmutationen durch Cre-Rekombinase innerhalb der kolorektalen Schleimhaut erreicht werden. Während in GEMMs von vielen anderen Tumorentitäten Keimbahn (induzierbar) Cre-Expression, die von gewebespezifischen Promotoren angetrieben wird, verwendet wird, kann Keimbahn nicht im Dickdarm verwendet werden, da dies zu einer großen Anzahl von Adenomen im gesamten Dickdarm führt, was den Tod durch gutartige Tumorbelastung verursacht Ein sehr junges Alter. Daher wird in dem hier beschriebenen Modell ein adenoviraler Vektor, der cre ausdrückt, verwendet, um ein kurzes Dickdarmsegment zu infizieren. Dies führt zur Induktion der Tumorentstehung innerhalb dieses Segments der Schleimhaut zu einem von dem Forscher definierten Zeitpunkt, was dazu führt, dass Adenome letztlich zu invasivem und metastasiertem Karzinom fortschreiten. Die Tumoren sind echte Mäusentumore, wachsen in einer intakten Mikroumgebung und sind daher in der Lage, die Gesamtheit der kolorektalen Onkogenese einschließlich der Tumor-Wirt-Interaktion und der metastatischen Kaskade zu simulieren. Dieses Modell istDaher eine attraktive Plattform für Studien der Krebsbiologie und präklinische therapeutische Studien.
Ein wesentlicher Nachteil von gentechnisch veränderten Mausmodellen von CRC ist ihre technische Komplexität. Lokale Cre-Lieferung mit rektalen Adeno-Cre-Enemen bei Mäusen, die flockige Apc-Allele tragen, wurde zuvor beschrieben; Allerdings können die Inzidenz, die Vielfalt und die Lage der Darmtumoren mit dieser Technik sehr variabel sein. 15 Daher wurde die Technik der Begrenzung der Adeno-Cre-Infektion durch chirurgische Klemmung des zu induzierenden Segments entwickelt. 13 Wir haben dieses Verfahren geändert, um den Tierschutz zu verbessern und die Sterblichkeit und die Anzahl der daraus resultierenden Tumore zu reduzieren. Mit diesem Protokoll sollten alle Labore mit Erfahrung in der kleinen Nagetierchirurgie in der Lage sein, das Modell zu reproduzieren und Tumore zu produzieren, die hochgradig reproduzierbar und leicht zugänglich für die Koloskopie sind. Je nach bedingtem mUtationen, die für die Tumorentstehung verwendet werden, können das gesamte Spektrum des Adenoms, des invasiven Karzinoms und der Metastasen beobachtet werden. Da sich die Tumoren im distalen Dickdarm befinden, ist eine serielle endoskopische Beurteilung in diesem Modell leicht möglich.
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Protocol
Die hier vorgestellten Tierversuche wurden unabhängig von einem institutionellen und einem staatlichen Tierpflege- und -nutzungsausschuss überprüft und genehmigt und nach den FELASA-Richtlinien des Föderation of Laboratory Animal Science Association (FELASA) durchgeführt. Alle möglichen Maßnahmen wurden ergriffen, um Leiden einschließlich Anästhesie und Analgesie oder, wenn nötig, vorzeitige Sterbehilfe zu minimieren.
1. Lokale Tumor-Induktion über chirurgische Adeno-Cre-Infektion
- Vorbereitung von Tieren zur Chirurgie
HINWEIS: Über die hier beschriebene Methode kann praktisch jede bedingte ("floxed") Mutation induziert werden. Die Verwendung von Mutationen in Genen, die bei Darmkrebs wie Apc, Kras oder Tp53 relevant sind, wird empfohlen. Die Effizienz der Cre-Rekombination hängt von der Größe des zu entschärfenden Konstrukts ab. Große Flox-Sequenzen werden weniger effizient ausgeschnitten. Die Rekombination aller Allele sollte in den Tumoren per PC bestätigt werdenR.- Für die Entwicklung von kolorektalen Tumoren verwenden Sie ein Kreuz der folgenden bedingten Allele für ein Basismodell von CRC (MGI Datenbanknummer in Klammern):
Apc tm2Rak (MGI: 3688435) 16
Kras tm4Tyj (MGI: 2429948) 17
Tp53 tm2Tyj (MGI: 3039263) 18 - Wenn ein Fluoreszenz-Reporter-Allel erforderlich ist ( zB um Mikrometastasen zu detektieren), verwenden Sie das folgende Allel:
Gt (ROSA) 26Sor tm6 (CAG-ZsGreen1) Hze (MGI: 3809522) 19
HINWEIS: Alle oben genannten Stämme sind über das NCI Mouse Repository oder das Jackson Laboratory erhältlich. Es ist kein Fasten erforderlich, da alle verbleibenden Fäkalien vor der adenoviralen Infektion gespült werden können. Präoperatives Fasten führt zu einer höheren perioperativen Mortalität und stellt einen enormen Stress für kleine Nagetiere dar. - Sevofluran bei 3 - 3,5 Vol% für Vollnarkose verwenden. Ein Verlust von tDer Zehensperre zeigt genügend Anästhesie an.
- Vor dem ersten Einschnitt injizieren Sie 0,05 mg / kg Buprenorphin subkutan.
- Die Augen der anästhesierten Maus mit ophthalmischer Salbe bedecken, um die Austrocknung der Hornhaut zu vermeiden.
- Lege die Maus in eine Rückenlage auf einen kleinen Tisch. Verwenden Sie nicht traumatische Klebebänder, um die Maus zurückzuhalten.
- Rasieren Sie den Bauch mit einem elektrischen Rasierer (Enthaarungscreme kann alternativ verwendet werden) und desinfizieren mit Alkoholtupfern oder Jod. Verwenden Sie die vom Hersteller empfohlene Kontaktzeit.
- Bedecken Sie das chirurgische Feld mit sterilen Vorhängen.
ANMERKUNG: Die Verwendung von perioperativen Antibiotika ist optional und unterliegt institutionellen Richtlinien. - Verwenden Sie sterile Einmal- oder Sterilisiergeräte für alle chirurgischen Eingriffe.
- Für die Entwicklung von kolorektalen Tumoren verwenden Sie ein Kreuz der folgenden bedingten Allele für ein Basismodell von CRC (MGI Datenbanknummer in Klammern):
- Mittellinie Laparotomie und Exposition des Dickdarms
- Verwenden Sie eine Schere (Skalpelle können alternativ verwendet werden), um eine Mittellinie zu machen(~ 15 mm) der Haut auf dem Unterbauch.
- Die Bauchmuskulatur mit Pinzette aufnehmen und mit einer Schere sorgfältig einarbeiten und damit die Bauchhöhle öffnen.
- Identifizieren Sie den distalen Dickdarm, berühren Sie ihn nur mit atraumatischer Pinzette. Klemmen Sie den Dickdarm mit einer empfindlichen Klemme ( zB eine Micro Serrefine Gefäßklemme) ca. 15 mm proximal vom Anus.
HINWEIS: Achten Sie besonders auf die Verwundbarkeit des Dickdarms. Perforation führt unweigerlich zu Peritonitis und Sepsis und erfordert eine Sterbehilfe des Tieres.
- Segmentale Koloninfektion mit Adeno-Cre Virus
- Setzen Sie ein flexibles Teflonrohr transanal vor und bringen Sie es vorsichtig vor, bis es die Lumenverschlüsse erreicht hat, die durch die Klemme erreicht wurden, die zuvor bei 15 mm vom Analrand angeordnet wurde. Verwenden Sie keine überschüssige Kraft, da dies zu einer Perforation führen kann.
- Cannulieren Sie die Röhre mit einer 30G Kanüle, verbinden Sie eine Standard 1 ml Spritze und spülen Sie das ColoN mit normaler Kochsalzlösung, um die restliche Fäkalien zu evakuieren. Dies kann mehrere ml Kochsalzlösung erfordern.
- Sobald der distale Dickdarm leer ist, entfernen Sie den Schlauch und ersetzen ihn mit einem frischen Teflonschlauch und positionieren ihn wieder direkt distal zur Klammer, wie oben beschrieben.
- Schließe den Dickdarm mit einer zweiten Klemme ~ 3 mm distal zur proximalen Klemme ( dh über das eingesetzte Rohr, ~ 12 mm vom Analrand), was zu einem 3 mm isolierten Segment führt, das infiziert werden soll.
HINWEIS: Für die distale Okklusion des Segments haben sich die Koronararterienclips von Fogarty als geeignet erwiesen, da sie gummiert sind, was zu einer engen Okklusion des Dickdarms führt, trotz der intraluminalen Röhre zwischen den Klemmenästen. - Verwenden Sie eine zweite Spritze (Standard 1 ml mit einer 30G Kanüle), um sorgfältig 50 - 80 μl 0,25% Trypsin-EDTA in das geklemmte Dickdarmsegment zu injizieren und für 10 min zu inkubieren. Lassen Sie die Kanüle und die Spritze an der Teflonröhre befestigt, um zu verhindern, dass die Flüssigkeit zurückleckt.
- Zuerst die distale Klemme entfernen und dann die Trypsinröhre.
- Spülen Sie den distalen Dickdarm mit ~ 500 μl normaler Kochsalzlösung, um das restliche Trypsin zu entfernen.
- Legen Sie eine neue Teflonröhre ein, setzen Sie die distale Klemme wieder ein und legen Sie das Dickdarmsegment mit 50 - 80 μl adenoviraler Lösung auf (10 11 Plaque-bildende Einheiten (PFU) / ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung) und inkubieren für 30 min ( Fig. 2A ).
HINWEIS: Verschütten Sie keine Viruslösung als Kontakt mit Adeno-Cre kann zu Tumorentwicklung in jedem Gewebe von bedingt mutierten Mäusen führen. - Die Klemmen und das Rohr entfernen.
- Verschluss des Bauches und postoperative Erholung
- Schließen Sie die Bauchwand mit 6-0 schnell resorbierbare laufende su(Z. B. Polydioxanon (PDS)).
- Schließen Sie die Haut mit chirurgischen Wundclips.
- Legen Sie die Maus auf den Heizkissen auf 38 ° C, bis er sich vollständig von der Anästhesie erholt hat.
- Einen weiteren Bolus von 0,05 mg / kg Buprenorphin ip 12 h nach der Operation verabreichen, gefolgt von zusätzlichen Buprenorphin-Bolus alle 12 Stunden, wenn nötig.
- Überwachen Sie die Mäuse mindestens einmal täglich auf Anzeichen von Not durch Tumorwachstum.
2. Koloskopie
ANMERKUNG: Abhängig von den bedingten Mutationen führt die adenovirale Infektion innerhalb von 2 - 4 Wochen zu endoskopisch sichtbaren Tumoren. Daher die erste postoperative Koloskopie 2 Wochen nach der adenoviralen Induktion durchführen und alle 2 Wochen wiederholen. Für die murine Koloskopie wird ein handelsübliches System empfohlen. 20
- Vorbereitung der Tiere für die Koloskopie
HINWEIS: Kein Fasten ist requirEd. Die verbleibende Fäkalmaterie ist gewöhnlich im distalen Dickdarm gut geformt und kann während der Koloskopie über den Tumor hinausgeschoben werden, wodurch der stressige Prozeß des wiederholten Fastens unnötig wird.- Sevofluran bei 3 - 3,5 Vol% für Vollnarkose verwenden. Ein Verlust des Zehenkolbenreflexes zeigt eine ausreichende Anästhesie an.
- Bedecken Sie die Augen der anästhesierten Mäuse mit ophthalmischer Salbe, um die Austrocknung der Hornhaut zu vermeiden.
- Beschränken Sie die Mäuse in einer Rückenlage auf einem kleinen Tisch.
- Koloskopie
- Legen Sie den Umfang (Durchmesser 1,9 mm, Länge 10 cm) in den Darmtrakt durch den Anus und sorgfältig insufflate Luft unter visuelle Kontrolle, um den Dickdarm zu strecken. Nicht mehr Luft verdampfen als für die Untersuchung erforderlich.
HINWEIS: Für die Luftinsufflation kann die Antibeschlagluftpumpe des Koloskopiesystems verwendet werden. Wenn keine Anti-Nebel-Luftpumpe vorhanden ist, kann jede andere Luftpumpe mit sehr niedrigen Druckeinstellungen verwendet werden oder vorSsurisierte Luft mit einem empfindlichen Druckreduzierventil. Kohlendioxid (CO 2 ) führt leicht zu einer Azidose bei kleinen Nagetieren und muss daher vermieden werden. - Schieben Sie den Geltungsbereich vorsichtig vor, bis eine Schleimhautläsion im distalen Dickdarm identifiziert werden kann ( Abbildung 1A - 1D ).
- Speichern Sie endoskopische Bilder für spätere Auswertung. Ein endoskopisches Scoring-System für intraluminale Tumore wurde zuvor beschrieben. 20
- Entfernen Sie vorsichtig den Bereich und legen Sie die Maus auf den Heizkissen auf 38 ° C, bis er sich vollständig von der Anästhesie erholt hat.
- Legen Sie den Umfang (Durchmesser 1,9 mm, Länge 10 cm) in den Darmtrakt durch den Anus und sorgfältig insufflate Luft unter visuelle Kontrolle, um den Dickdarm zu strecken. Nicht mehr Luft verdampfen als für die Untersuchung erforderlich.
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Representative Results
Wenn sie adäquat durchgeführt werden, entwickeln> 85% der Tiere Tumore. Die Sterblichkeit des hier präsentierten chirurgischen Verfahrens beträgt <5%, die Sterblichkeit der Koloskopie ist praktisch nicht vorhanden. In der Mehrzahl der Mäuse wird eine einzige Läsion nachgewiesen; In etwa 30% können 2 - 3 kleine Adenome nachgewiesen werden, die in der Regel innerhalb von 2 - 3 Wochen nach der Tumorinduktion zu einem einzigen Tumor verschmelzen.
Der Phänotyp und das biologische Verhalten der resultierenden Tumoren hängt stark von den bedingten Mutationen der Tiere ab. Der lokale cre-vermittelte Knockout von Apc reicht aus, um die Tumorentzündung zu induzieren und führt zunächst zu einem Adenom, das 2 - 4 Wochen nach adenoviraler Infektion nachgewiesen werden kann und das innerhalb von 12 - 16 Wochen zum invasiven Adenokarzinom fortschreitet. Dieser Prozess kann durch Hinzufügen einer bedingten onkogenen Kras-Mutation (Kras G12D) beschleunigt werden, die daraus resultierenden Tumoren schnell zu invasivem FortschrittAdenokarzinom Bei der Zugabe von onkogenem Tp53 R172H gelangen die Tumoren schnell zu einem invasiven und metastatischen Karzinom. Das Überleben hängt stark vom Genotyp der Tumoren ab; Das mediane Überleben beträgt in der Regel etwa 80 - 200 Tage nach der Tumorinduktion. Die Todesursache in der großen Mehrheit der Fälle ist ein großes Darmobjekt, das neben dem Tumorwachstum liegt.
Die Tumoren können einfach und wiederholt über die Koloskopie ( Abbildung 1 ) ohne großen Stress für die Tiere überwacht werden.
Die Krankheitsmanifestationen sind dem menschlichen CRC sehr ähnlich. Die Tiere entwickeln Adenome und schließlich Adenokarzinome des distalen Kolons ( Abb. 2B, 2C, 2F ). Abhängig von dem bedingten Genotyp der Mäuse metastasieren die Tumore auch das Peritoneum ( Abbildung 2D ) die Leber ( Abbildung 2E ) und selten Ly die Lungen (nicht gezeigt). Wenn ein Cre Reporter-Allel ( z. B. ZSGreen 19 ) verwendet wird, können alle Tumormanifestationen leicht identifiziert werden. Das ZSGreen-Reporter-Allel verfügt über einen fluoreszierenden Protein-Ausdruck, der hell genug ist, um bei Tageslicht sichtbar zu sein ( Abbildung 1B , Abbildung 2C ).
Histologisch sind 95% der sich entwickelnden Tumoren Adenokarzinome. Etwa 5% der Tumoren sind mesenchymalen Ursprungs, z. B. Fibrosarkom oder Leiomyosarkom, die sich vermutlich aus Stromazellen entwickeln, die versehentlich mit Adeno-Krebs infiziert wurden. Die Histomorphologie der Adenokarzinome ähnelt stark dem menschlichen CRC und zeigt das gesamte Spektrum von nicht-invasivem Adenom bis zum Adenokarzinom, das umgebende Strukturen eindringt ( Abbildung 3A - 3C ).
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Abbildung 1. Kolonoskopische Bilder von kolorektalen Tumoren (bedingte Allele des Tieres in Klammern).
A. Normaler distaler Dickdarm B. Früher Adenom 2 Wochen nach Adeno-Cre-Infektion. Beachten Sie die grüne Farbe aufgrund eines GFP-Reporter-Allels in dieser Maus. (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Gt (ROSA) 26Sor tm6 (CAG-ZsGreen1) Hze ). C. Spätes Adenom (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj ). D. Colorektales Adenokarzinom (wie durch Pathologie nach den Koloskopiebildern diagnostiziert, Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Tp53 tm2Tyj ). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 2. A. Intraoperative Situs Beachten Sie den großen, gummierten Fogarty-Clip an der Unterseite und den transanal eingesetzten Schlauch für die Adeno-Cre-Injektion (roter Pfeil). B. Colorektaler Tumor (weißer Pfeil) mit aufeinanderfolgenden Dickdarmobstruktionen 8 Wochen nach Adeno-Cre-Infektion (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Tp53 tm2Tyj ). C. Colorektaler Tumor (weißer Pfeil) 10 Wochen nach Adeno-Cre-Infektion (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Gt (ROSA) 26Sor tm6 (CAG-ZsGreen1) Hze ). Beachten Sie die grünliche Farbe durch ein grünes fluoreszierendes Protein (GFP) Reporter Allel in dieser Maus. D. Peritoneale Karzinose (schwarze Pfeile) in der GEMM (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Tp53 tm2Tyj ). Leber und Darm wurden entfernt, um die Nieren und das Zwerchfell zu entlarven. E. Brutto-Lebermetastasen im GEMM 12 Wochen nach Adeno-Cre inFection (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj ). F. Colon mit Tumor nach Entfernung aus dem in Abbildung 2C dargestellten Tier. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figure 3. Hämatoxylin / Eosin (H / E) Gefärbte Abschnitte von Colorektaltumoren aus der GEMM.
A. Übergangszone von normaler Schleimhaut bis zum Adenokarzinom mit Infiltration von Schleimhaut, Submukosa und Muscularis mucosae (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj ). B. Übergangszone von der normalen Darmschleimhaut zum invasiven Adenokarzinom (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj ). C. Hochgradiges Adenokarzinom mit Infiltration des umgebenden Gewebes (Apc tm2Rak, Kras tm4Tyj , Tp53 tm2Tyj ). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Während sie im Allgemeinen leicht zu erzeugen und zu pflegen sind, sind klassische CRC-Mausmodelle, die auf Zelllinieninjektion basieren, künstlich und können die menschliche Krankheit nicht vollständig rekapitulieren. Infolgedessen wurden GEMMs entwickelt. Die erste CRC-GEMM war die Apc Min- Maus, die eine heterozygote Nullmutation im Apc-Gen beherbergt und damit die menschliche Erbkrankheit familiäre adenomatöse Polyposis (FAP) nachahmt. 21 Apc Min Mäuse entwickeln jedoch unweigerlich mehrere Darmadenome, die nicht auf den Dickdarm beschränkt sind; Auch die Zeit und die genaue Lage der Adenombildung ist zufällig und die Tumore entwickeln sich selten zu malignen Läsionen, da die Maus an gutartiger Tumorbelastung stirbt, bevor die Adenome fortschreiten können. Daher ist die Apc Min Maus ein Modell von FAP, nicht sporadischen CRC. Andere Modelle präsentieren Mutationen in DNA-Mismatch-Reparatur-Genen. 22 , 23 Obwohl einige von diesenMäuse sind hervorragende Modelle für erblichen Magen-Darm-Krebs, sie stellen keine sporadischen Darmkrebs dar.
Abgesehen von der zugrunde liegenden genetischen Veränderung ist es der Ort der genetischen Läsion, die Modelle von sporadischen und syndromalen Darmkrebs auseinandersetzt. Alle oben genannten Modelle weisen Mutationen auf, die konstitutiv aktiv sind oder im ganzen Dickdarm oder sogar im gesamten Gastrointestinaltrakt induziert werden. Dies führt dazu, dass die Bildung von multiplen Adenomen, die nicht repräsentativ für menschliches sporadisches CRC ist, kaum durch Koloskopie beurteilbar ist und darüber hinaus den Tumoren in der Regel nicht genügend Zeit gibt, sich zu entwickeln, bevor das Tier der umfangreichen Tumorbelastung unterliegt. Daher muss ein Mausmodell für sporadischen Darmkrebs eine lokale Aktivierung der kolorektalen Tumorentstehung enthalten.
Die in der hier präsentierten GEMM entstandenen Tumoren sind streng auf das chirurgisch geklemmte und adeno-cre-infizierte Segment beschränktDes Dickdarms Dies führt zur Bildung eines einzelnen Tumors, der für die Erkennung und Überwachung durch Koloskopie leicht zugänglich ist. Darüber hinaus macht die distale Lage Darm-Obstruktion eine späte Komplikation des Tumorwachstums, so dass die Tumoren in invasive und je nach Genotyp, metastasiertem Karzinom entwickeln, bevor das Tier erfordert Euthanasie. Ein weiterer Vorteil der segmentalen Krebsinfektion ist die unbeeinflusste Umgebung. Während in Apc Min und anderen erblichen Mausmodellen die umgebende Schleimhaut und sogar die Stromazellen dieselben genetischen Aberrationen wie die Tumore erleiden, entwickeln sich die Tumore im hier vorgeschlagenen Modell im normalen Kolonepithel und Stroma. Dies ermöglicht eine realistischere Tumor-Host-Interaktion und molekulare Studien ohne Einschränkungen. Darüber hinaus ist der Zeitpunkt der Tumorinduktion in diesem Modell gut definiert. Während in der Apc Min Maus, entwickeln sich nach dem "zweiten Hit" Tumore, bei denen das zweite Apc-Allel stochast ist____...........................................
Allerdings kommt dieses Modell auch mit Einschränkungen. Die Überquerung mehrerer Allele in ein Modell erfordert enorme Zeit und Ressourcen; Darüber hinaus können oft nicht alle Nachkommen für die Experimente aufgrund eines ungeeigneten Genotyps verwendet werden. Das Verfahren selbst erfordert Praxis und ist zeitaufwändig. Die Herstellung von Adeno-Cre-Virus-Suspension mit ausreichend hohen Titern und in großen Mengen ist kostenintensiv. Daher ist dieses Modell nicht geeignet, alle anderen CRC-Mausmodelle zu ersetzen und wird auf Laboratorien mit einem deutlichen Fokus auf GEM-Modelle beschränkt.
Das Protokoll selbst ist technisch anspruchsvoll, aber mit einigen Schulungen nicht-chirurgischen Personal können die Verfahren angemessen durchführen. Der kritische Schritt während der adeno-cre iNfektion ist das Aufblasen des geklemmten Darmsegments - überschüssiger intraluminaler Druck führt zu Perforation, unzureichender Druck verringert die Rate der erfolgreichen Infektion. Dieser Schritt erfordert Training.
Ein Protokoll für die adenovirale Infektion des distalen Dickdarms wurde von Hung et al. Vor. 13 Das hier dargestellte Protokoll unterscheidet sich von dem vorgenannten Protokoll in mehreren Schlüsselaspekten. Da es häufig die Darmperforation in unerfahrenen Händen verursacht, wird der mechanische Abrieb der Schleimhaut vor der Adeno-Cre-Inkubation in dem vorliegenden Protokoll übersprungen. Dies führt zu einer reduzierten Rate der Tumorbildung, die jedoch durch erhöhte Virus-Titer entgegengewirkt werden kann. Auf diese Weise kann die Rate der mesenchymalen Tumore auch reduziert werden, da ohne Schleimhautabrieb weniger mesenchymale Zellen innerhalb der Darmwand einem Adeno-Cre ausgesetzt sind.
Auch im Gegensatz zu dem oben genannten Protokoll 13 das hierBeschriebenes Protokoll empfiehlt nicht über Nachtfasten vor Chirurgie oder Koloskopie. Stattdessen wird die Darmspülung oder, im Falle einer Koloskopie, eine einfache mechanische Manipulation verwendet, um die restlichen Fäkalien zu entfernen. Diese Verfeinerung des Protokolls verbessert das Tierschutz drastisch. Das Nachtnagel ist ein sehr stressiges Verfahren für kleine Nagetiere, von denen bekannt ist, dass sie den murinen Stoffwechsel stark beeinflussen und damit auch die experimentellen Ergebnisse beeinflussen. 24 , 25 Diese unerwünschten Effekte des Nachtfastens können im hier dargestellten Manuskript vermieden werden.
Ein weiterer wichtiger Unterschied zwischen dem hier vorgestellten Protokoll und dem Protokoll von Hung et al. Ist die Länge des geklemmten (und damit infizierten) Segments. Während das hier beschriebene Protokoll eine kurze Länge (~ 3 mm) empfiehlt, hat Hung et al. Empfehlen Sie 20 mm des distalen Dickdarms, um infiziert zu werden. Die kürzere Segmentlänge wurde gewählt, um die Anzahl zu reduzierenVon rekombinierten Krypten und damit daraus resultierenden Tumoren. Da die Mehrheit der Patienten mit sporadischem CRC einen einzigen Tumor und nicht mehrere Tumore entwickelt, erhöht diese Maßnahme die klinische Relevanz des Modells. Die Rate der Tumorbildung scheint nicht von der reduzierten Oberfläche des infizierten Dickdarms betroffen zu sein.
Zukünftige Anwendungen dieser Technik umfassen alle Protokolle, die eine lokale Cre-Rekombination innerhalb der Darmschleimhaut erfordern. Die meisten Anwendungen in der Krebsforschung umfassen bedingte Onkogene, die zur Bildung von kolorektalen Tumoren führen; Allerdings können auch alle anderen Anwendungen, wie z. B. die Induktion von Reporterkonstrukten innerhalb der Darmschleimhaut, mit dem hier vorgestellten Protokoll erreicht werden.
Abschließend stellt die hier vorgestellte Kombination eines hochentwickelten genetisch manipulierten Mausmodells von Darmkrebs zusammen mit der Möglichkeit einer hochauflösenden Koloskopie zur Erkennung und Überwachung der sich entwickelnden Tumore darS eine hervorragende Einstellung, um die Biologie und Behandlung von CRC zu studieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit widmet sich der Erinnerung an Professor Moritz Koch.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents / consumables | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
| Normal saline 0.9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
| Aqua ad injectabilia | B. Braun Melsungen AG | 235144 | |
| Ad5CMV-Cre (adenovirus, c = 2E+11 PFU/mL) | Gene Transfer Vector Core University of Iowa |
||
| 15 mL, 50 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
| Eppendorf tubes 1.5 mL/ 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72,695,400 | |
| Petri dish PS 100/15 mm (sterile, Nuclon) | Fisher Scientific GmbH | 10508921/ NUNC150350 | |
| 1 mL Syringe (without dead volume) - Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
| 30G injection needle | BECTON DICKINSON | 304000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analgesia / anesthesia | |||
| Sevoflurane (Sevoflurane AbbVie) | AbbVie Germany GmbH & Co. KG | - | |
| Medical oxygen | Air Liquide Medical GmbH | - | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Indivior Eu Ltd. | - | |
| Bepanthen - ophthalmic ointment | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
| Table Top Research Anesthesia Machine x/O2 Flush w/ Sevoflurane Vaporizer | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Cellulose swabs | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
| Insulin syringe EMG 1 mL (with 30G cannula) | B. Braun Melsungen AG | 9161627S | |
| Fine Bore Tubing (bore: 0.28 mm/ diameter: 0.61mm) | Smiths Medical Deutschland | 800/100/100 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Iris Scissor - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| AutoClip Kit | Fine Science Tools | 12020-00 | |
| PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
| Curved Micro Serrefine Vascular Clamp | Fine Science Tools | 18055-05 | |
| Fogarty Spring Clips | Edwards | CDSAFE 6 | |
| Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
| Isis - Hair shaver | Aesculap - Braun | - | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colonoscopy | |||
| Cold Light Fountain XENON 175 SCB | Karl Storz | 20132101-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| Fiber Optic Light Cable | Karl Storz | 69495NL | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM Three-Chip Camera Head | Karl Storz | 20221030 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM SLII Camera Control Unit | Karl Storz | 20223011-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| 15" Flat Screen Monitor EndoVue | Karl Storz | 9415NN | Karl Storz Coloview System Mainz |
| HOPKINS Straight Forward Telescope diameter 1.9 mm; length 10 cm autoclavable fiber optic light transmission incorporated |
Karl Storz | 64301AA | |
| Protection and Examination Sheath | Karl Storz | 61029C |
References
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