Summary
このプロトコルでは、顕微鏡下で胚パターン形成の検査続く胚珠クリアランスを介してシロイヌナズナの胚発生を観察するためのメソッドについて説明します。
Abstract
彼らの開発の高い予測可能な性質を与えられて、シロイヌナズナ胚として使用されている、モデル植物の形態形成の研究。ただし、早い段階の植物の胚は小さく、観察・分析が困難、ほとんどの細胞を含みません。モデル生物のシロイヌナズナを用いた顕微鏡下で植物胚におけるパターン形成の手法が記載されています。ホイヤーのソリューションを使用して新鮮な胚珠のクリアランス、胚の形態と細胞数の観察、発達段階には、微分干渉顕微鏡倍油浸漬レンズ 100 を使用してによって決められるかもしれません。また、タグ付きの緑色蛍光タンパク質 (GFP) と特定のマーカー蛋白質の表現は、共焦点レーザ走査型顕微鏡により胚形成の間にセル identity の指定に注釈を付ける監視だった。したがって、細胞・分子レベルでは、野生型植物胚におけるパターン形成を観察して野生型植物胚致死突然変異胚におけるパターン形成を比較することによって胚パターン形成における特定遺伝子の役割を特徴付けるには、このメソッドを使用できます。したがって、メソッドは、シロイヌナズナの胚発生の特性評価に使用できます。
Introduction
胚より高い植物の開発の最も早いイベントです。細胞分裂と分化厳格な遺伝子管理1,2の下で受精卵から胚形態。シロイヌナズナの胚は、胚発生の間に細胞分裂の順序が予想されるパターンは3,4あるため形態形成の制御の研究に有用なモデルです。ただし、複数のセルを 1 つを含むシロイヌナズナ胚は観察して分析するのには小さすぎます。さらに、ある特定の遺伝子の突然変異は胚致死5胚のそれらの遺伝子の重要な役割を示す可能性があります。胚致死突然変異体におけるパターン形成の解析という必須遺伝子は胚発生を調節する分子機構を理解するための基礎を提供します。
詳細な方法は、直接顕微鏡観察によってモデル植物シロイヌナズナの胚パターン形成の特性評価のためここで記述されます。メソッドには、胎児の観察に続いて胚珠クリアランスが含まれます。胚致死突然変異体の特性評価についても述べる.
さまざまな発達段階で胚の形態は、ホイヤーのソリューション6,7でクリアされている胚珠を使用して顕微鏡による直接決定できます。このような胚珠展示高屈折;したがって、メソッドをクリアこの胚珠は差動干渉の対照 (DIC) 顕微鏡で観察する必要があります標本で特に有利です。
さらに、胚発生時に特定のセルまたはセルの限られた数で表現される遺伝子は、胚の細胞を識別するマーカーとして使用できます。したがって、共焦点レーザ走査型顕微鏡を使用してマーカーの GFP 付けられた蛋白質の発現を監視することによって胚発生の間に細胞の identity の指定を付けることができます。逆に、胚発生中に不明な機能遺伝子 -GFP融合の発現パターンを観察し、胚のパターン形成とその遺伝子の発現の間のリンクを提供できますシロイヌナズナの胚発生に必要な新しい遺伝子の同定を容易にします。
ここで説明する方法は、胚致死性の変異体の表現型を特徴付けると胚細胞レベルでの影響を受けた遺伝子の影響を判断するにも使えます。さらに、野生型と変異型の植物間の胚発生中にマーカー遺伝子の発現パターンの比較と組み合わせて、メソッドは胚8,9に関与するシグナル伝達経路の分子機構についての手がかりを得ることができます。確かに、 naa10の植物に適用した、変異における脳下垂体の異常分裂が胚5中のオーキシンの分布の変化によって引き起こされることが分かった。
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Protocol
注: このプロトコルは 3 つの部分: 1) DIC 顕微鏡を用いた野生型シロイヌナズナ胚のパターン形成の観察2)、胚パターン形成を介して共焦点レーザー走査顕微鏡を用いたマーカー蛋白質発現の観察評価・ 3) (例としてnaa10変異体を使用して) 胚発生における特定遺伝子の役割を決定します。
1. 胚珠クリア
- 植物材料の準備
注: ここで説明されているプロトコルは健康な植物を育てる方法の例健康な植物を育てるための他の方法はまた働きます。- 1.5 mL チューブに 100 種を追加し、消毒 5 分反転種子チューブ数回種子とソリューションが十分に混合された表面の種子を完全に殺菌することを確保するために 1.5% ナトリウム次亜塩素酸 (ミックス 85 mL の水で 10% 塩素 15 mL) の 1 つの mL を追加します。
- チューブの下に 30 の遠心分離によって種子を強制的に 1,200 x g で s が、上澄みを除去し、残留ナトリウム次亜塩素酸を削除するベンチで 4 回滅菌水で種を洗います。
- 4.4 g 培地、培 (MS) 基底塩の混合物とショ糖の 10 g を純水 1 L に追加します。塩とスクロースを分解する混合物をかき混ぜなさい。MS のショ糖にゲル化剤、Phytagel などの 3 g を追加 ph 5.8 1 m コ、ソリューションを調整し、121 ° C、15 分 MS 培地で溶液を滅菌します。
- MS 培地 30 mL を MS 培地プレートを生成する 12 cm 培養皿に注ぐ。
- MS 板に種子を滅菌を置きます。プレートを生育室に転送して、シード成層 (暗闇の中の 4 ° C で 3 日) 後長日条件 (16 h、光と暗闇の中で 8 h の 18 ° C の 22 ° C) の下でプレート。
- 成長の 8 日後のトレイに土 (ミックス栄養豊富な土とバーミキュ ライト 1:1 の比率で) に植物を転送、水損失を防ぐために 5 日間の白、透明な蓋付きトレイを蓋をして植物のガラス化を避けるためにギャップを残します。
- トレイのふたを取るし、長日条件 (1.1.5 参照) の下でウォークイン チャンバー内で植物を栽培します。6:00 に光をオンし、オフで 22:00。ウォークインの商工会議所での成長の約 20 日の間、植物が開花して siliques を生産します。
- 花蕾での種の位置にスレッドは 20:00 花房内の茎マーク (最初の 3 番目の花のつぼみには使用しないでください; 通常これらのつぼみから生成された siliques は少数の中止された種子を開発し、異常胚珠に通常の割合を変更この可能性があります)。8:00 次の朝に花を開くとマークの芽として胚珠の受粉の先頭を定義します。
- ホイヤーの溶液の調製
- 50 mL チューブに抱水クロラールの 24 g を追加し、(抱水クロラールのソリューションは、光の下で安定しておりません) アルミ箔で完全にチューブをラップします。
- 次に、上記のソリューションに 9 mL の純水とグリセリンの 3 mL を追加し、抱水クロラールを溶解する管を振る。ホイヤーのソリューションをするためには、任意の気泡を除去するために室温で一晩放置チューブをしましょう。
- 胚珠の分離とのクリアランス
- 顕微鏡のスライド ガラスに両面粘着テープの部分を接続します。表面に垂直な pseudoseptum とスライドの受粉 (DAP) 日後の所望の数の成長 silique を場所します。心皮 (図 1 aと1 b) を分割し、やすくなります。
- 注射針、pseudoseptum の両側の心皮を分割し、silique の胚珠が (図 1と1 D) 万国実体写真の下に表示されるようにスライドに 2 つの解剖の心皮を添付します。
- スライド ガラスにホイヤーの液の 70 μ L を分注、浸すことによってホイヤーのソリューションを先の細いピンセットの先端を湿らせてください。使用して、万国実体写真、移動胚珠 Hoyer のソリューションにスライドに胚をきれいにピンセットで。任意の気泡を生成を避けるためにゆっくりスライドする観察を適用します。
- 室温で (より成熟した胚珠より多くの時間が必要) 2-12 h の暗い部屋のボックスに完成したスライドを置きます。(1-2 DAP) 2/4 細胞期胚は、4 h 後八分と球状初期 (3 DAP) 間の胚を観察できる中 2 h 後顕微鏡で観察できます。12 時間後より成熟胚 (4-8 DAP) が観察できます。
- 顕微鏡の DIC 関数を使用してクリアされた胚珠を調べます。低消費電力フィールド (10 X) の下で胚を見つけ、開発の胚の細胞のパターンを観察する高出力フィールド (100 倍油浸漬レンズ) に変更します。
- 発達段階別に胚を確認します。
2. 胚パターン形成と細胞マーカー発現の観測によるアイデンティティのキャラクタリゼーション
- 植物材料の準備
- プロモーターとマーカー遺伝子やホルモンの応答の要素のシーケンスを符号化を複製し、( GFP) などの蛍光タンパク質を融合次に、バイナリのベクター (pCambia1300) などに構成要素を挿入します。ここでは、オーキシン応答要素DR5は、例10として表示されます。
- アグロバクテリウムによる野生型植物に結果のDR5 GFPプラスミドを導入-変換11を介する。MS 培地プレート hygromycin T1 植物を選ぶ (50 mg/mL 母液の希釈 1:1, 000)。遺伝子組換え植物は、長い根を展示、1.1.5 に記載されている条件の下で成長の 8 日後の 2 つのロゼット葉を生成します。
- 遺伝子組換え植物を土に転送、1.1.6 1.1.7 で示されているように、それらを養います。
- 独立した t1 から T2 の種子を収集します。MS hygromycin 板に種をまく、 DR5 GFPの挿入 (敏感な植物に抵抗力がある植物の比になる約 3:1) の 1 つのコピーを運ぶ植物を選択し、土壌にそれらを転送します。
- 1.1.6 1.1.7 で示されているように、T2 植物を栽培します。
- T2 植物から T3 種子を収集します。MS hygromycin 板に種をまく、ホモ接合体の遺伝子組換え植物 (hygromycin 抵抗を展示、すべての単一の行からの植物) を選択し、土壌にそれらを転送します。
- 1.1.8 で示されているように、ホモの T3 植物の花蕾をマークします。
- GFP 信号の観察
- 47 ml の 6% グリセリン溶液を生成する超純水のグリセロールの 3 mL を混ぜます。
- 両面粘着テープの一部をガラス顕微鏡スライドに添付し、1.3.1 に示すように、silique を修正します。
- 注射針で、pseudoseptum の両側の心皮を分割、1.3.2 に示すよう堅実下スライドに 2 つの解剖の心皮を取り付けます。
- スライド ガラスの上に 6% のグリセロールの 30 μ L を分注、先の細いピンセットを使用してソリューションに切り裂かれた心皮から胚珠のすべてを配置します。スライドにそっと観察を配置します。
- 種皮と胚乳それぞれの胚珠には、胚の GFP の信号の観測を防ぐことができます、胚胚珠から抽出します。迅速かつ慎重にスライドをタップ (より成熟した胚珠は、スライドに適用する以下の力) 胚珠から胎児を押し出す。
- GFP 蛍光共焦点レーザー顕微鏡のスライドを確認します。低消費電力フィールド (10 X) の下で分離胚を見つけるとその場所を記録し、488 に励起光源を設定することによって胚におけるDR5 GFP発現を観察する高出力フィールド (100 倍油浸漬レンズ) に変更 GFP 信号の検出のための nm。
- さらに分析に適した T3 ラインを選択する胚の GFP 発現を検出します。
3 胚珠クリアランスとマーカー蛋白質観察で胚致死突然変異体の胚パターン形成の物理特性: 例としてNaa10
- Naa10突然変異体植物の胚パターン形成
- 1.1.1-1.1.7 に示されているように、植物材料を準備します。
- Naa10を識別する+/−植物遺伝子特定のプライマーの5としてマークを用いた PCR によるなぁ10 の花蕾+/− 1.1.8 に記載されている植物します。
- 胚珠のクリアランスとなぁ10 の顕微鏡検査を実行+/−胚 1.2 と 1.3 で示される。
- Naa10胚を使用してマーカー蛋白質解析
- 2.1 2.2 で説明されている手順を使用して適切なDR5 GFPトランスジェニックは行を取得します。
- ホモなのなぁ10 DR5 GFPトランスジェニック一線を越え+/− なぁ10 を取得する工場+/− naa10を特徴付ける (遺伝子特定の PCR で識別) F2 世代で GFP 蛍光マーカーのホモ接合体である植物+/−5ホモDR5 GFPラインを使用して顕微鏡下で GFP シグナルを観察し、。
- なぁ10 の花芽をマーク+/− DR5 GFP 2.1.7 に示すようのホモ接合体である植物。
- DR5 GFP 2.2 に示すようにホモがnaa10胚の GFP の信号を検索します。
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Representative Results
直接顕微鏡下で胚を観察し胚発生の間に細胞の identity の指定特定のマーカーにコメントを付ける、胚形成の間に特定の遺伝子の役割を特徴付けるこのペーパーで説明する方法を使用できます。
胚 (成熟した棒を歩いてステージに細長い受精段階) から野生型シロイヌナズナにおけるパターン形成の解析から代表の結果は、図 2のとおりです。胚珠クリアランス後 DIC 顕微鏡 (図 2) によりさまざまな発達段階で胚を識別できること。DR5 GFPの発現パターンは、共焦点レーザ走査型顕微鏡胚におけるオーキシンの分布を調べるし、シロイヌナズナの胚発生におけるオーキシンの潜在的な役割を確認する (図 3) の下で胚発生中に記録されました。
このプロトコルは、胚発生時に特定の遺伝子の役割を特徴づけるも使用できます。ここでは、例としてシロイヌナズナの胚発生におけるNaa10の役割を検討しました。脳下垂体の異常分裂 ( Naa10野生型植物、図 4における脳下垂体の横の非対称分裂と比較で脳下垂体の斜めと垂直部) を認めた.球状の段階でオーキシンの分布はほとんどNaa10胚でほぼ統一され、野生型胚 (図 5) と比較すると、下垂体の広範な信号を保持します。Naa10の胚発生に必要であり、それがシグナル伝達経路シロイヌナズナのオーキシンによる胚発生に関与する可能性が示唆されました。
図 1:シロイヌナズナSilique 郭清の模式図。両面粘着テープの切れ端で (A) スライド ガラスに取り付けられた silique を取付けました。(B) A のボックスの拡大画像2 架空線は、分割する場所を表します。(C) D (D) 分割 silique のイメージのボックスに分割 silique の拡大画像。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: DIC 顕微鏡による野生型 (コル-0)シロイヌナズナの胚発生の検討。(A) Elongated 受精卵。(B) A 1 細胞期胚 1 DAP。(C) A 2/4 細胞期胚 2 DAP。(D) 3 で八分期胚 DAP。(E) A 一方期胚 3 DAP で。(F) 4 で初期の球状胚胚 DAP。(G) A 5 DAP で後半球状胚の胚。(H) A 心期胚 6 DAP で。(私) 7 DAP で魚雷期胚。(J) 8 DAP でステッキ期胚。スケール バー = 10 μ m. この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: DR5 (コル-0) 野生型シロイヌナズナ胚での発現パターン。(、-d) GFP 信号。(A ~ D)明視野画像イメージをマージします。DR5は野生型球状ステージ、およびA(4 DAP) と心 (bとB、6 DAP) 段階の胚のルート棒に表現されました。DR5は胚の子葉のヒント (cとC、7 DAP) と (dとD、8 DAP) 成熟の野生型胚の血管も表現されました。スケール バー = 50 μ m. この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: は、シロイヌナズナの胚発生におけるNaa10の役割の性格描写。野生型工場 (A) 下垂体の正常な分裂。Naa10突然変異系統の下垂体の異常な部門には白線 (脳下垂体の斜め編) (B) と (C) (脳下垂体の垂直分割) が付いています。スケール バー = 10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 球状胚 (コル-0) 野生型シロイヌナズナとNaa10胚のDR5表現パターンです。(aとb)GFP を通知します。(AとB)明視野画像イメージをマージします。DR5は野生型球状胚の胚(、および)のルート棒に表現されました。DR5は球状胚Naa10胚にほぼ均一に表現された、(bとB) 野生型と比較して下垂体の広範な信号を保持します。スケール バー = 50 μ m. この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
胚珠のクリアランスは、細胞分裂を検出およびシロイヌナズナの胚の形態を評価するための便利なメソッドこの手法を使用して、胚が DIC 顕微鏡5,12の下で直接観察できます。胚珠のクリアランスのための重要なステップは、1.3.4 のステップです。1.3.4 の手順で胚珠クリアランスに必要な時間変数です。2/4 細胞期胚はホイヤーのソリューションで 2 時間後 12 時間後不明瞭な見た目に対し明確に観察できます。したがってより成熟した胚珠は、通関に必要な時間が長くなります。
2.2.5 ステップで胚珠、胚を特定のスライドに適用されるフォースの量は重要です。あまりにも多くの力を適用しない場合の胚の粉砕が可能ただし、胚については、胚珠から押し出されますことはできませんあまりにも少し力を使用する場合。私たちの経験より成熟した胚珠が、以下の力が必要です。魚雷段階および成熟胚は、オープンの注射針を使用して胚珠を剥離によって直接分離できます。授粉の細胞の一部は、分離プロセス中に分離胚の破壊が、失われたまたは不完全な授粉からの蛍光信号があります。このメソッドのもう一つの制限は、前に 4 細胞期胚を彼らがあまりにも小さいと胚珠フラグメントによってシールドを押し出しの胚から見つけることが難しかったです。
発達段階と胚の形態はある特定の遺伝子の突然変異によって影響を受けます次の胚珠クリアランス顕微鏡によるそのような効果を示すことができます。このアプローチは特定の遺伝子仲介する胚5によって分子機構の理解に役立ちます。胚発生中に不明な機能遺伝子 -GFP融合の発現パターンを観察することで、胚のパターン形成とその遺伝子の発現の間のリンクを提供し、13シロイヌナズナの胚発生に必要な新しい遺伝子の識別を容易します。したがって、ここで説明したプロトコルでは、シロイヌナズナの胚発生の特性評価のための基本的な方法を提供します。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
博士ジェシカ Habashi は、批判的に読む原稿を感謝いたします。私たちはDR5 GFPの試金のローカリゼーションを実行するイメージング センター、ライフ サイエンス、首都師範大学 (中国北京) の大学の博士 Xianyong 盛を感謝します。この作品は北京市政府科学財団からの助成金によって支えられた (CIT & TCD20150102)、中国の国家自然科学基金 (31600248) から。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloral Hydrate | Sigma | 15307 | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Hygromycin | Roche | 10843555001 | |
| Growth chamber | Percival | CU36L5 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss Oberkochen | Zeiss Image M2 | camera: AxioCam 506 color |
| Confocal Laser Scanning Microscopy | Zeiss Oberkochen | Zeiss LSM 5 | filters: BP 495 - 555 nm |
| Stereoscope | Zeiss Oberkochen | Axio Zoom V16 | camera: AxioCam MRc5 |
| nutrient-rich soil | KLASMANN, Germany | ||
| 50-mL tube | Corning Inc. | ||
| 1.5-mL tube | Corning Inc. | ||
| 10% sodium hypochlorite solution | Domestic analytical reagent | ||
| sucrose | Domestic analytical reagent | ||
| KOH | Domestic analytical reagent | ||
| glycerol | Domestic analytical reagent | ||
| culture dish | Domestic supplies | ||
| vermiculite | Domestic supplies | ||
| glass slide | Domestic supplies | ||
| syringe needle | Domestic supplies | ||
| fine-tipped tweezers | Domestic supplies | ||
| super clean bench | Domestic equipment |
References
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