Summary
フライ概歩行リズムに見られる時空間特徴を定量化する手法である. します。定量化を実現するには、マルチ パラメトリック モデル波形と飛ぶ活動をフィッティングします。モデル パラメーターは、形状と朝のサイズと夜の毎日の活動のピークをについて説明します。
Abstract
ほとんどの動物と植物の概日時計は行動および分子プロセスを調整し、毎日の明暗サイクルに同期させます。この一時的なコントロールの根底にある根本的なメカニズムが広くミバエショウジョウバエをモデル生物.として使用ハエで時計は複数日の歩行記録を分析することによって, 通常。このような記録を示しています活動の 2 つのピークを持つ複雑な二峰: 夜明けのまわりで起こる朝ピークと夕暮れ時に発生するピークの夜。これらの 2 つのピーク一緒には、正弦波振動と非常に異なっている波形観測時計に加えてメカニズムある行動データで観測されたパターンの生産に大きな影響を及ぼすことを示唆している時計遺伝子を形成。ここで飛ぶ活動の時空間パターンを数学的に示す最近開発された計算方法の使用についての指示を提供します。4 つの指数言葉と形状と朝のサイズおよび活動の夜のピークを完全に記述する 9 つの独立したパラメーターで構成されるモデル波形と活動データをメソッドに適合します。抽出されたパラメーターは、フライの歩行リズムの一般的な観察のバイモーダル活動パターンの根底にある基板の速度論的解明を助けることができます。
Introduction
概日時計約 24 時間周期で内因性の生化学的発振器です、ほとんどすべての動物と植物の1,2。時計は、生物の内部プロセスと外部ライト暗い周期に動作を同期するのに役立ちます。体内時計の遺伝子構造は、1960 年代から広く研究されているミバエ、キイロショウジョウバエを用いたします。この昆虫の体内時計の中核は、4 つの蛋白質から成り: 期間、タイムレス、クロック、およびサイクル。一緒に他の分子のこれらのコア コンポーネントは、時計遺伝子3,4のほぼ正弦波の振動を生成するフィード バック ループを形成します。ハエの体内時計では、個々 のチューブ5の中間を渡る単一の赤外線ビームを飛ぶアクティビティが検出される、複数日の歩行記録を使用して広く検討されています。記録典型的なハエがよく区別ピークをもつ複雑な二峰: 夜の終わりから開始し、最大は、ライトがオン; 朝のピーク (M)一日の終わりから始まり、最大は、ライトをオフに6夜ピーク (E)。興味深いことに、このような行動の記録の形が観測された時間的パターンに貢献する付加的なメカニズムのアクションを示唆して、分子レベルで観察される単純な正弦波振動と非常に異なって。これらの隠されたメカニズムについて、時系列パターンの定量的説明計算ツールを開発しました。
私たちの仕事の歩行リズムはフライの活動パターンを模した波形に基づいて定義されます。活動の観察されたリズミカルな変化をモデル化する単純な正弦波を使用できない、ため録音に見られるすべての顕著な特徴をキャプチャする最も単純な 1 つを選択する様々 な信号波形をテストしました。ショウジョウバエ概日行動は、多くの場合アクティブ化および非アクティブ化の7の指数パターンがあります時計ニューロンの活動によって制御されます。指数のダイナミクスと、データの視覚的な分析指数の条件 9 つの独立したパラメーターで 4 つの指数から成ると飛ぶ活動パターン8を密接に似ているモデルを構築する私たちの動機。運動データに加えて、そのパワー スペクトルを分析もできます。典型的な飛行活動のスペクトルは、高調波 T02、T03、等、概日周期 T0で期待される基礎的ピークに加えて複数のピークを示しています。フーリエの定理によると純粋な正弦波だけより複雑な波形は (図 1) のプライマリの期間の高調波で複数スペクトルのピークを表示しながらパワー スペクトルのピークを生成します。多ピーク スペクトル データ飛ぶ活動8の非正弦波の時空間パターンを考えると、したがって、数学的に予想される、複数振動の期間の存在を必ずしも意味しません。重要なは、提案モデル波形のスペクトルはまた一次周期、高忠実度モデル説明飛ぶデータを時間と周波数の両方を強調するためハエの歩行録音と同様のすべての高調波でピークを示しています。
数分以内飛ぶ活動時間解像度でデータが騒々しい、生データから直接パラメーターを抽出する困難に表示されます。長い時間間隔に合算データは騒音レベルを減らすことができますが、モデルのパラメーターの推定に影響を与えることができる方法でデータを変更することができます。我々 したがって、録音のパワー スペクトルからモデル関数8 (参照8の追加ファイル 1 を参照) のフーリエ変換から計算された予想されるスペクトルの解析式を使用してパラメーターを取得します。パワー スペクトルからのパラメーターの取得は、このアプローチには、ビニングまたは生アクティビティ データのフィルタ リングなどの任意の追加操作することがなく正確なパラメーター値が得られます。モデルとアプリケーションを野生型と変異型のデータの数学的な詳細は、参照8で説明されます。プロトコルはここで計算ツールを使用する手順に焦点を当てて紹介。
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Protocol
1 測定飛行運動を使用してショウジョウバエ活動モニター (ダム)
注: 詳細については、参照 5 を参照してください。
。- 個々 の準備は 1 つの端に食物と一緒にチューブを飛ぶ、他のコットンします。食品とは、食品の乾燥を防ぐためにシーリングをします。
- は、50 mL ビーカーにはえの食糧の 5-6 g を置きます。それを溶けやすくするために小さな断片に食べ物をカット
- ゴムバンドを接続 32 個々 のガラス チューブ 。
- ビーカーに食品をすべて 5 10 15 s. 停止電子レンジの電子レンジで加熱することによって溶かす s 食品の等しい融解ようにビーカーを慎重に振ると 。 食べ物はまだ液体食品とビーカーに準備の個々 のチューブを入れている間は
- 。彼らは同じように満ちているので、チューブを上下に移動します 。
- 許可を冷やすのため、約 1 h. の固める食品
- 食品が固体、ビーカーから食糧とチューブを削除します 。
- シールのワックスを使用して食品を含む端。まず、慎重にきれいなペーパー タオルを使用してチューブを押してワックスに対してチューブ。視覚的に、シールの品質をチェックし、必要に応じて繰り返してシール再び 。
- 綿でチューブのもう一方の端を閉じる; 綿は、ハエを維持管でロックされている間、通過する空気を許可します 。
- 各個々 の管で 1 つのフライを配置し、ダムの管を配置します 。
- の場所は、一定の温度と湿度を維持するインキュベーターで監視します。実験に基づく、適切な照明条件を設定します。
- /暗い実験が全体の実験の明暗サイクルにハエを保つため。分析測定の最初の日は使用しないでください 。
- 暗黒実験のため最初に同調し、時計の同期の明/暗条件で 2 日間ハエを保持し、暗黒に切り替えた。解析で暗黒の最初の日からの測定値を使用しないでください 。
- 解析に使用することができますデータの少なくとも 4 日間を収集します
。 メモ: ダム システムはモニターですべてのハエの歩行記録と 1 つのファイルに出力されます 。
2。データ分析
- 複数飛ぶアクティビティが 1 つのファイルに出力ファイルのモニター; 各ファイルは、1 つの列をする必要があります分割 ' .txt ' 個々 のフライ歩行測定ファイル 。
- 実行 ' ModelFitPS3.m ' 次の入力パラメーターを持つ Matlab コマンド ウィンドウで関数:
- の サンプリング、データ サンプリング時間間隔を秒単位で設定します。たとえば、アクティビティでは、毎分を測定した場合入力 60 として、サンプリング 。
- Bin_interval 分をデータは視覚化に適したビン分割される; 推奨箱間隔は 20-30 分の時間間隔を設定
- 傾向、入力 " 1 " データ基準の傾向を示す場合、" 0 "; それ以外の場合の傾向とデータは 2 次多項式を適合し、データからそれを引いて最初前が 。
- ポップアップ ウィンドウで飛ぶアクティビティが 1 つのファイルを選択します
。 注: 最初のプロット、データのパワー スペクトルと理解活動のプロットではないです。プロットのパワー スペクトルから決定一次周期 T 0: 概日ピークにマウスの左ボタンまたは第 2 高調波のピークをマウスの右ボタンでクリックして (T 0 の周り/2). - オープン データ プロットのチェックかどうかは朝と夜のピークも可視化します。ない場合は、グラフの任意の場所右クリックし、新しい bin_interval 値ダイアログ ボックスでを入力する bin_interval 値を変更します。プログラムは、間隔の新しい値を使用してデータを再描画されます。Bin_interval 値を受け入れるがどこでもグラフをクリック左します 。
- プログラムは再度データを再描画し、活動の最初の 5 日を表示します。このプロットでは、(時々 1 つまたは 2 つの日をスキップする必要は) 分析で使用される最初の M ピークをクリックします
。 注: プログラムが選んだ朝ピークからグラフを再描画されます。青と赤のラインが表示されます E ピークと次の日 M ピークのおおよその位置、それぞれステップ 2.4 に定める期間に基づいてします 。
- 同じグラフ モデルとデータの予備的なフィット感のためのデータを選択: 次の点をクリックして (この注文; クリックした位置、下部に赤い星を表示に注意してください): (i) トップの M ピーク;(ii) 末 M ピーク;(iii); E ピークの開始(iv); E ピークの上(v) 末 E ピーク;(次の日の M ピークの頂上 vi).
- プログラムが今パワー スペクトルを示すに注意してください
。 注: x 軸は周波数で与えられた今。- パワー スペクトルで開いたウィンドウでのモデルのパワー スペクトルの解析的な式をフィッティングに使用する点を選択します。手順 2.4 で検出された期間は、赤い線でマークされます。点列のフィッティングを選択するには、最初約は、2.4 の手順と同様、主な期間を決定します。継ぎ手を指すので、一次期間微調整スライダーを使用して値 (スライダーを移動した後表示されます赤い円で示されて) ピーク値が閉じられます 。
- ビジュアル ピーク選択後クリックして " 同意 " プログラムは、モデル パラメーターを計算する解析式と選択したポイントをフィットします 。
- パラメーターとスペクトル適合エラーがファイルに保存されている注 " model_fit_parameters.txtŔ プログラム、運動データとそのパワー スペクトルのフィットを付けて 2 数字がまた 。
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Representative Results
ここで紹介した方法は、フライの歩行パターンで主な機能の定量化をことができます。4 つの指数言葉で構成されるモデルとアクティビティ データのあてはめによる定量化を行います
モデルでは、アクティビティのパターンを記述する 9 つの独立したパラメーターを持っています。パラメーター bMD、b氏、bED、a と bの小胞体は、夜の崩壊 (ED)、夕方上昇 (ER)、それぞれ朝崩壊 (MD) の朝上昇 (氏) のレートを定義します。パラメーター T0定義概日周期、TMと TE M と E のピークの幅を定義し、HMと HE M と E のピークの高さを定義します。
パラメーターの値は、いくつかの手順 (図 2) でフィルターされていないデータから取得されます。まず、概日周期活動パワー スペクトル (プロトコル手順 2.4) から決定されます。その後、予備的なパラメーター値は、F(t) (プロトコル手順 2.5 2.6) それに合う記録運動から抽出されます。これらの値は、F(t) のフーリエ変換で派生8 (文献8の追加ファイル 1) 解析的表現データのパワー スペクトルに合うための初期の推測として機能します。
どこ Tn = T0/n、n = 1,2,3...、T0は概日周期 (プロトコル手順 2.7 2.8)。スペクトルのフィットを使用して、モデルのパラメーターは、フィルターまたはビニングなし飛ぶ歩行から抽出されます。パワー スペクトルのフィッティングには、F(t),すなわち, フライの歩行リズムのモデルの最終形態を構築する使用されるモデルのパラメーターの最終的な値が生成されます。
モデル b パラメーターに、正または負のいずれか対応する指数の用語の曲率を反映しています。パラメーター bMDと b小胞体は、指数が凸と負指数が凹面に、b氏と bEDのパラメーターは肯定的な指数は凹面と負のとき肯定的な指数は凸形であり。一般に、M ピークを示す指数 b パラメーターが増加を示します遅い上昇または低下と b パラメーターの増加指数 E ピークを記述する、高速の上昇または低下を示します。
図 3は、このアルゴリズムによって得られるフィットの例を示します。T0と T010 T02 から高調波スペクトルのピークが備わっています (図 3 a)。他の高調波は通常、有意水準 0.05 のより低い高さを持っており、したがってに分析では使用しません。スペクトルのフィットから得られるパラメーターは、飛ぶ運動 (図 3 b赤) モデルの構築に使用されます。メソッドには、野生型ハエ (図 3、トップ パネル) と変更された期間 (図 3中間と下部パネル) と概日リズム変異体の両方が動作します。その他の例およびモデルと基になる生物学間の接続、Lazopuloらを参照してください。8フィッティング処理からの結果は、次の順序でファイルに保存されます: bMD、b氏、bERbEDT0TM/T0TE/T0HM, HE (表 1)。プログラムでは、スペクトルのフィット、'Err' データのパワー スペクトルの最大の正方形で規格化した残基 (二乗残差和) の正方形の合計として計算される適合エラーを出力ファイルに保存されます。
図 1.異なる波形のスペクトルを電源します。フーリエの定理によると正弦波だけより複雑な波形正方形または鋸歯状波など一次周期の高調波で追加のピークを示すパワー スペクトルの単一のピークを示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.パラメーター抽出アルゴリズムの概略図。最後のパラメーター値は、パワー スペクトルをフィッティングから取得されます。フィッティング処理を開始値に敏感にすることができます、ので、アルゴリズムは歩行データから算出した速報値を使用し、パワー スペクトルを用いた更新します。最後のパラメーターの値は、データに最も当てはまる F(t) を構築する使用されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.定量化する手法の代表的な結果飛ぶモデル波形を用いた歩行します。パワー スペクトルの最初の 10 のピークをフィッティングから (A) モデルのパラメーターを抽出します。(B) 活動のモデルを構築する得られたパラメーターが使用されます。メソッドは、野生型のハエ (トップ パネル) または短い (中間パネル) と長い (底面) 概日リズム変異に適用できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| ハエの遺伝子型 | bMD (1 月分) | b氏(1 月分) | bED (1 月分) | bER (1 月分) | T0 (分) | TM/T0 | TE/T0 | HM | HE |
| 野生型 | 0.0094 | 0.2077 | -0.0383 | 0.0606 | 1438 | 0.1528 | 0.0833 ときた | 5.2238 | 8.7185 |
| 短いの概日リズム変異 | 0.015 |
テーブル 1。図 3に示すスペクトルのフィッティングから抽出されたパラメーターの例です。の表に示すように、"model_parameters.txt"ファイルに最後のパラメーターの値を出力します。
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Discussion
この作品は、フライの歩行パターンの定量的説明計算ツールを使用する手順を示します。ツールは、一緒に形状と M と E のピークのサイズを記述する 4 つの指数言葉から成る数学モデルと歩行データをフィットします。モデル パラメーターの最終値は生データの使用は、ビニングまたはフィルタ リング データがパラメーター値に課すことができる artefactual の効果を避けることが、データのパワー スペクトルにフィッティングから取得されます。モデル パラメーターは、さらに研究飛ぶ運動や活動のピークを生じさせるメカニズムを使用できます。
管継手の品質は、2 つの方法で評価できる: フィット パワー スペクトルのパラメーターと共に計算適合エラー (二乗残差和) を使用して、目視による。フィットの品質に影響を与える重要な要因の 1 つは、概日周期 T0 (プロトコル手順 2.8) の決定です。この値を T0ピーク電力スペクトルとモデルのパラメーターの推定に影響を与えます。フィットの品質に影響を与えるもう一つの重要なステップは TM以降の適合の予備データ (プロトコル手順 2.7)、開始点の選択と TE値はこの選択によって定義されます。ユーザーは、TMと TEを定義するアクティビティの別の日を選択することで複数、フィットの結果を参照できます。
私たちのモデルは、アクティビティの 2 つの顕著なピークとよく記載されているクロック制御型自発行動を模倣した焦点です。この現象は、光/暗いと暗黒条件の両方実験のこれらの 2 つのタイプに適用可能なアプローチになります。ただし、モデルに入れないアカウントいくつかの光/暗い実験で観測された駆動バースト活動の光。別の制限は、ユーザーの入力 (プロトコル手順 2.7 2.9) を必要とするモデルのパラメーターの抽出から発生します。パラメーター T TE、MT0は、ユーザー入力から取得されます、のでフライの各アクティビティは手動で分析されるべき。さらに、個々 の活動ではなく、人口平均記録、平均の手順は、フライの歩行運動の多くの重要な個体差を非表示にするので、メソッドを使用することをお勧めします。それは飛ぶ活動を個別に分析することにより、ハエの数が多いため面倒に思えるかもしれませんが、ユーザーは動物のグループの内でパラメーター変動の程度に関する貴重な統計情報を取得します。これらの利点を無視するには、人口平均飛行歩行の生成および平均パラメーター値を取得することを分析することが可能です。
この作業で使用するモデルは、我々 の以前の研究8から波形の改良版です。以前のモデルとは異なり、それぞれ HMと HE、 M および E のピーク高さの別のパラメーターがそれ。朝および夕方のピークは通常異なる高さを持っているので、新しいモデルは予想通り飛ぶアクティビティ データと良好に一致を示します。
この分析は、赤外線ビームを用いた測定運動を飛行する制限はありません。ビデオ追跡などの他のメソッドは、指数上昇と崩壊9動態を示す M と E のピークを持つフライの毎日の活動のパターンが類似を生成します。ここで説明したツールは、これらの代替のデータ セットと同様に容易に適用できます。
ここで説明されているメソッドを定量化行動出力を接続することを目標にフライの歩行記録を調節するメカニズムに日常の行動を飛ぶし、バイモーダル活動パターンを制御します。M その図形識別ニューロンと基板を目的といくつかの最近の研究と E 活動ピーク10,11。調査官は、特定の神経細胞のグループの活動を操作し、高さと E ピークの位相の変化を観察することによってその夜ピークの形成における役割を分析します。私たちのモデルは、パラメーター HEは、TE E ピークの高さを与えるピーク幅とパラメーター b小胞体および bEDピーク形状を記述するを決定します。参照8に従って、生化学的なコンテキストで HE可能性があります NPF と ITP、神経ペプチドのレベルの測定中 b小胞体および bEDリリースの劣化率を表す可能性があります。一緒に、これらのパラメーターにすることができます活用将来的に良く飛ぶ運動リズムにおけるバイモーダル パターンの統合表現に向かって信号引き起こされると飛ぶ動作を接続する研究。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
ビデオ コンテンツのヘルプについてスタニスラフ Lazopulo に感謝しております。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Activity Monitor | TriKinetics | DAM2, DAM5 | Measures fly locootion using single infrared beam |
| MatLab | Mathworks | Computing environment and programming language, MatLab should include Optimization and Symbolic Math toolboxes | |
| Drosophila melanogaster | per[S], per[L], iso31(wild type) | Our analysis can be performed with fly mutants of any circadian period |
References
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