Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

लाइव-कवक कोशिकाओं के सेल इमेजिंग प्रवेश के साधनों की जांच करने के लिए और रोधी संयंत्र Defensins के उपसेलुलर स्थानीयकरण

Published: December 24, 2017 doi: 10.3791/55995
Automatic Translation
1, 1, 2
1Donald Danforth Plant Science Center, 2Department of Biology, Kutztown University of Pennsylvania

Summary

संयंत्र defensins रोगजनकों के खिलाफ संयंत्र रक्षा में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । रोधी एजेंटों के रूप में इन रोधी पेप्टाइड्स के प्रभावी उपयोग के लिए, (मुआ) कार्रवाई के अपने मोड को समझना महत्वपूर्ण है । यहां, एक जीवित सेल इमेजिंग विधि इन पेप्टाइड्स के मुआ के महत्वपूर्ण पहलुओं का अध्ययन करने के लिए वर्णन किया गया है ।

Abstract

छोटे cysteine-रिच defensins सभी संयंत्रों में मौजूद मेजबान रक्षा पेप्टाइड्स के सबसे बड़े समूहों में से एक हैं । कई संयंत्र defensins इन विट्रो में शक्तिशाली कवक रोगज़नक़ों के एक व्यापक स्पेक्ट्रम के खिलाफ विरोधी गतिविधि प्रदर्शन और इसलिए ट्रांसजेनिक फसलों में रोधी एजेंटों के रूप में इस्तेमाल किया जा करने की क्षमता है । रोगों के नियंत्रण के लिए संयंत्र defensins की पूरी क्षमता का दोहन करने के लिए, यह (मुआ) कार्रवाई के अपने तंत्र स्पष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण है । उन्नत माइक्रोस्कोपी तकनीक के आगमन के साथ, लाइव सेल इमेजिंग संयंत्र defensins की रोधी मुआ की गतिशीलता को समझने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बन गया है. यहां, एक फोकल माइक्रोस्कोपी आधारित लाइव सेल इमेजिंग विधि दो फ्लोरोसेंट लेबल संयंत्र defensins महत्वपूर्ण फ्लोरोसेंट रंजक के साथ संयोजन में (MtDef4 और MtDef5) का उपयोग कर वर्णन किया गया है । इस तकनीक को वास्तविक समय दृश्य और कवक कोशिकाओं में MtDef4 और MtDef5 internalization की गतिशील घटनाओं के विश्लेषण में सक्षम बनाता है । महत्वपूर्ण बात, इस परख internalization कैनेटीक्स, प्रवेश के मोड और इन पेप्टाइड्स के उपसेलुलर स्थानीयकरण सहित जानकारी का खजाना उत्पंन करता है । अंय सेल जैविक उपकरणों के साथ, इन तरीकों गतिशीलता और इन पेप्टाइड्स के मुआ की जटिलता में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की है । इन उपकरणों को भी विभिंन कवक के खिलाफ इन पेप्टाइड्स के मुआ तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Introduction

पौधों माइक्रोबियल संयंत्र के खिलाफ रक्षा के लिए एक परिष्कृत जंमजात प्रतिरक्षा प्रणाली विकसित किया है1। वे ख्यात रोगाणुरोधी गतिविधि के साथ कई जीन इनकोडिंग होस्ट रक्षा पेप्टाइड्स एक्सप्रेस2. दरअसल, इन पेप्टाइड्स के कई विट्रो मेंरोगाणुरोधी गतिविधि प्रदर्शन3. Defensins संयंत्र किंगडम4में मेजबान रक्षा पेप्टाइड्स के सबसे बड़े समूहों में से एक शामिल हैं । इन cysteine-रिच, cationic पेप्टाइड्स micromolar सांद्रता पर कवक और oomycete रोगजनकों के खिलाफ शक्तिशाली विकास निरोधात्मक गतिविधि का प्रदर्शन और इन रोगजनकों के खिलाफ रक्षा की पहली लाइनों में से एक का प्रतिनिधित्व करते हैं5,6. उनके शक्तिशाली रोधी गतिविधि के कारण, defensins रोग प्रतिरोधी फसलों उत्पन्न करने के लिए agribiotechnological अनुप्रयोगों में शोषण किया जा सकता है । कई संयंत्र defensins के गठन के एक्सप्रेस ग्रीनहाउस और ट्रांसजेनिक फसलों के क्षेत्र परीक्षण में रोग प्रतिरोध को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है6. यह कार्रवाई के तंत्र को सुलझाना महत्वपूर्ण है (मुआ) इन रोधी पेप्टाइड्स की फसल संरक्षण के लिए प्रभावी उपकरण के रूप में पूरी तरह से अपनी क्षमता का दोहन करने के लिए । हालांकि, इन प्लांट defensins के मुआ खराब समझ रहे हैं । वर्तमान सबूत पता चलता है कि वे अलग मुआ5प्रदर्शन,6,7,8। कुछ defensins अधिनियम कवक पर extracellularly और लक्ष्य विशिष्ट कोशिका दीवार/प्लाज्मा झिल्ली निवासी sphingolipids, बाधा झिल्ली अखंडता और सक्रिय सेलुलर विषाक्तता रास्ते9,10,11. हाल ही में, तथापि, रोधी defensins कि कवक कोशिकाओं में translocate की खोज की गई है12,13,14। इनमें से कुछ defensins झिल्ली के लिए बांध-निवासी फॉस्फोलिपिड, फार्म oligomeric परिसरों और permeabilize प्लाज्मा झिल्ली15,16,17। इस प्रकार पादप defensins के मुआ के कुछ पहलुओं का आविर्भाव हुआ है. हालांकि, संयंत्र defensins की संभावना मुआ की घटनाओं की एक जटिल सेट शामिल है जो अभी तक नहीं पहचाना गया है और एक व्यापक मॉडल में एकीकृत । विशेष रूप से, इन पेप्टाइड्स के सेलुलर लक्ष्यों की हमारी समझ में एक प्रमुख अंतर रहता है ।

सूक्ष्म प्रौद्योगिकियों में हाल ही में प्रगति और नए फ्लोरोसेंट जांच के विकास के साथ, लाइव सेल इमेजिंग तकनीक अब अक्सर रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स (AMPs) के मुआ अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है । इन तकनीकों immunolocalization, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, परमाणु बल माइक्रोस्कोपी या एक्स-रे टोमोग्राफी के रूप में व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तरीकों के पूरक हैं, जो ज्यादातर को आकृति विज्ञान पर रोधी पेप्टाइड्स के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए नियोजित किया गया है और कोशिका दीवार अखंडता के अध्ययन सहित कवक कोशिकाओं के विकास, सेल विकास में परिवर्तन/शाखाकरण पैटर्न, साथ ही प्लाज्मा झिल्ली permeabilization और हत्या. फिर भी, इन अध्ययनों से एक निश्चित समय बिंदु पर समय-चूक इमेजिंग करने के लिए defensin चुनौती के जवाब में उनके गतिशील परिवर्तन की निगरानी करने के लिए एक ही कक्ष पर प्रदर्शन के बाद पेप्टाइड्स के साथ उपचार के बाद इमेजिंग कक्षों तक सीमित किया गया है । हाल के वर्षों में, लाइव सेल इमेजिंग के साथ संयोजन के रूप में फ्लोरोसेंट लेबल का उपयोग फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर वास्तविक समय दृश्य सक्षम है AMP की गतिशीलता-सूक्ष्म बातचीत । दोनों स्वाभाविक रूप से शुद्ध और रासायनिक संश्लेषित रोधी पेप्टाइड्स फ्लोरोसेंट लेबल के साथ टैग किया जा सकता है (जैसे, DyLight, rhodamine, BODIPY, या Alexa Fluor आधारित रंजक) और सीधे समय से कोशिकाओं के साथ उनकी बातचीत के दौरान मनाया चूक लाइव सेल इमेजिंग । इन लेबल किए गए पेप्टाइड्स के उपयोग से उनके मुआ के विभिन्न पहलुओं की समझ काफी बढ़ गई है, जिनमें प्रवेश की विधा, उपसेलुलर स्थानीयकरण, intracellular की तस्करी, और जीवित कवक कोशिकाओं के भीतर रोधी कार्रवाई की साइटें शामिल हैं 18.

हाल ही में, कई अध्ययनों से पता चला है कि संयंत्र defensins सहित विभिंन रोधी पेप्टाइड कवक कोशिकाओं12,14,19,20के रहने से आंतरिक हैं । इन defensins की मुआ की संभावना intracellular लक्ष्यों के साथ बातचीत शामिल है । हमने हाल ही में दो ascomycete कवक, Neurospora crassa और फ़्यूज़ेरियम graminearumमें MtDef4 defensin संयंत्र की रोधी कार्रवाई की सूचना दी है । MtDef4 फफूंद सेल प्रवेश और इन कवक में सेलुलर स्थानीयकरण के लिए अलग रास्ते का उपयोग करने के लिए दिखाया गया था14। इस अध्ययन रासायनिक संश्लेषित tetramethyl rhodamine (तमृ) का इस्तेमाल किया-महत्वपूर्ण फ्लोरोसेंट रंगों के साथ संयोजन में लेबल MtDef4 (झिल्ली चयनात्मक डाई, FM4-64; झिल्ली-permeant डाई, SYTOX ग्रीन; द सेल डेथ रिपोर्टर डाई, propidium आयोडाइड) और चयापचय अवरोधकों । इन विश्लेषणों ने MtDef4 के internalization के कैनेटीक्स का प्रदर्शन किया, intracellular परिवहन के अपने तंत्र और उसके उपसेलुलर लक्ष्य14.

यहां, लाइव सेल इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल का उपयोग कर फोकल माइक्रोस्कोपी प्रस्तुत की है । प्रोटोकॉल का इस्तेमाल फ्लोरोसेंट महत्वपूर्ण फ्लोरोसेंट के साथ संयोजन में पेप्टाइड्स लेबल का उपयोग करने के लिए संयंत्र defensin-फंगल बातचीत का अध्ययन, विशेष रूप से, translocation के रास्ते और कवक कोशिकाओं में defensins के intracellular लक्ष्य ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fluorophores के साथ Defensins का लेबल

  1. एक fluorophore है कि रोगाणुरोधी संपत्तियों पर ंयूनतम प्रभाव के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जीवित कोशिका के अंदर defensin के और स्थानीयकरण का चयन करें ।
    नोट: इष्टतम fluorophore का चयन विशिष्ट प्रायोगिक उद्देश्यों पर निर्भर करता है । वर्णक्रमीय और रासायनिक गुण, photostability, आकार और fluorophore के प्रभारी भी विचार किया जाना चाहिए ।
  2. व्यावसायिक विक्रेताओं से उपलब्ध उपयुक्त पेप्टाइड लेबलिंग किट का उपयोग करके चयनित fluorophore के साथ लेबल defensin । वैकल्पिक रूप से, रासायनिक संश्लेषित fluorophore-लेबल defensins । इस अध्ययन में, लेबल MtDef5 defensin DyLight550 के साथ एक वाणिज्यिक लेबलिंग किट का उपयोग कर के अनुसार निर्माता के प्रोटोकॉल और tetramethyl rhodamine (तमृ)-लेबल MtDef4 defensin रासायनिक रूप से संश्लेषित किया गया था ।
    नोट: यह अनुशंसित है कि रासायनिक संश्लेषित fluorophore पेप्टाइड्स (विशेष रूप से ५० अमीनो एसिड या कम की कम पेप्टाइड्स के लिए) के बाद से इस्तेमाल किया जा fluorophore एन या सी-टर्मिनल के अवशेषों के लिए संलग्न किया जा सकता है पेप्टाइड के अपने पर ंयूनतम प्रभाव सुनिश्चित करने के लिए रोगाणुरोधी गतिविधि. तीन से अधिक डाइसल्फ़ाइड बांड के साथ लंबे पेप्टाइड्स का संश्लेषण चुनौतीपूर्ण है । इस मामले में, यह अनुशंसित है कि पेप्टाइड एक उपयुक्त व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पेप्टाइड लेबलिंग किट का उपयोग कर एक इष्टतम fluorophore के साथ लेबल किया जा ।
  3. इन विट्रो में परीक्षण लेबल defensin के रोगाणुरोधी गतिविधि और जांच की जा करने के लिए कवक के खिलाफ ंयूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (MIC) निर्धारित करते हैं ।
    नोट: इस अध् ययन में एमआईसी के DyLight550-MtDef5 और टीएमआर-MtDef4 के Neurospora crassa और फ़्यूज़ेरियम graminearumके खिलाफ निर्धारित किया गया था ।

2. फंगल संस्कृतियों और विकास मध्यम

  1. Vogel के आगर मध्यम21 और 5 दिनों के लिए प्रकाश के तहत कमरे के तापमान पर मशीन से युक्त तिरछा ट्यूब के लिए एक एन crassa स्टॉक संस्कृति से conidia स्थानांतरण ।
  2. संस्कृति एफ graminearum पीएच-1 पूर्ण मध्यम (सेमी) युक्त प्लेटों पर तनाव 5 दिनों के लिए 28 º c पर22 । conidia, लगाना 4 के उत्पादन के लिए (10 मिमी व्यास) एफ के 5 दिन पुरानी संस्कृति के प्लग graminearum पीएच-1 में ५० मिलीलीटर carboxymethyl फाइबर (सीएमसी) मध्यम (15 ग्राम carboxymethyl फाइबर, 1 जी खमीर निकालने, ०.५ ग्राम MgSO4.7 एच2ओ, 1 जी एनएच 4 कोई3, और 1 जी KH2पीओ4) और 4-7 दिनों के लिए संस्कृति 28 º सी में १८० rpm पर एक रोटरी शेखर में ।

3. Conidial की तैयारी सस्पेंशन

  1. च. graminearum conidial ट्याक्सी
    1. भंवर एफ graminearum तरल संस्कृति और एक 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में निस्पंदन सामग्री (जैसे Miracloth) के दो परतों के माध्यम से १.५ मिलीलीटर कवक संस्कृति को छानने से conidia इकट्ठा । 2 मिनट के लिए एक microcentrifuge में १३,२२६ x g गति पर conidial निलंबन केंद्रापसारक ।
    2. supernatant त्यागें, और गोली धोने के लिए बाँझ पानी की 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    3. 2 मिनट के लिए एक microcentrifuge में १३,२२६ x g गति पर conidial निलंबन केंद्रापसारक । supernatant त्याग और 2x SFM (सिंथेटिक कवक मीडिया) के 1 मिलीलीटर में गोली reसस्पेंड23।
    4. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत एक hemocytometer का उपयोग कर conidia गिनती ।
    5. 2x SFM के साथ 105 conidia/एमएल के लिए conidial निलंबन समायोजित करें ।
  2. N. crassa conidial suspension
    1. बढ़ती संस्कृति की एक छोटी राशि (5 दिन पुराने) N. crassa एक microcentrifuge ट्यूब के लिए एक टीका पाश का उपयोग कर के 2 Vogel तरल माध्यम के एमएल युक्त स्थानांतरण ।
    2. भंवर conidial निलंबन और एक नया microcentrifuge ट्यूब में निस्पंदन सामग्री के माध्यम से फिल्टर ।
    3. 2 मिनट के लिए एक microcentrifuge में अधिकतम गति पर conidial निलंबन केंद्रापसारक । supernatant त्यागें और Vogel के तरल माध्यम के 1 मिलीलीटर में conidial गोली reसस्पेंड ।
    4. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत एक hemocytometer का उपयोग कर conidia गिनती ।
    5. Vogel के तरल माध्यम के साथ 105 conidia/एमएल के लिए conidial निलंबन को समायोजित करें ।

4. नमूना तैयारी और फोकल माइक्रोस्कोपी

  1. MtDef4 defensin का उपसेलुलर स्थानीयकरण कवक कोशिकाओं में
    1. पिपेट ५० µ l प्रत्येक conidial निलंबन (105 conidia/एमएल) के 10 मिमी microwell में ३५ मिमी ग्लास नीचे microwell व्यंजन. conidia के अवलोकन के लिए, सीधे अगले कदम के लिए आगे बढ़ना है, या germlings तैयारी के लिए, पिपेट ५० µ एल के एन. crassa और एफ graminearum conidia ३५ mm संस्कृति व्यंजन में और कमरे के तापमान पर 3-6 एच के लिए अंकुरित करते हैं ।
    2. प्रत्येक microwell डिश के लिए MIC पर defensin लेबल के ५० µ एल जोड़ें और २.५ एच के लिए मशीन । MIC के fluorophore-लेबल defensins यहां इस्तेमाल किया (चरण १.३) दोनों एन के लिए 3 µ मीटर है । crassa और एफ. graminearum और एमआईसी के टीएमआर-MtDef4 के एन. crassa और एफ. graminearum के लिए क्रमशः १ µ मीटर और १२ µ मी.
    3. झिल्ली के 2 µ एल जोड़ें-चयनात्मक डाई FM4-64 (अंतिम एकाग्रता: 5 µ एम) संस्कृति पकवान और 30 मिनट के लिए मशीन में और इमेजिंग के लिए फोकल माइक्रोस्कोप पर तुरंत माउंट ।
    4. सफेद प्रकाश लेजर (डब्ल्यूएलएल) का चयन करें । टीएमआर-MtDef4 और FM4-64 डाई, क्रमशः उत्तेजित करने के लिए दो लेजर स्रोतों ४८८ एनएम और ५५० एनएम का उपयोग करें । 580-700 एनएम पर टीएमआर-MtDef4 के प्रतिदीप्ति का पता लगाने और 690-800 एनएम पर FM4-64 डाई का पता लगाने ।
      नोट: अंधेरे कमरे में फोकल माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन करते हैं ।
  2. समय चूक इमेजिंग of internalization of MtDef5 defensin
    1. पिपेट ५० µ l के N. crassa and F. graminearum conidial suspension (105 conidia/एमएल) के 10 एमएम microwell में ३५ एमएम ग्लास बॉटम microwell डिश. 10 मिमी microwell अनकोट है और नीचे एक No. १.५ कवर ग्लास है । conidia के अवलोकन के लिए, सीधे अगले कदम के लिए आगे बढ़ना । germlings के अवलोकन के लिए, सूक्ष्मता के साथ आगे बढ़ने से पहले कमरे के तापमान पर 3-6 ज के लिए मशीन conidia ।
    2. डब्ल्यूएलएल चालू करा. ५५० एनएम पर लेजर लाइन का चयन करने के लिए उत्तेजित fluorophore-लेबल defensins यहां इस्तेमाल किया (१.३ कदम) और १.००% तीव्रता के साथ FM4-64 और इसी डिटेक्टरों सक्रिय करें । यहां प्रयुक्त fluorophore-लेबल defensins (चरण १.३) ५६०-६०० एनएम पर पाया गया था और ६९०-८०० एनएम पर FM4-64dye का पता लगाया गया था ।
      नोट: उच्च लेजर तीव्रता के रूप में लाइव सेल इमेजिंग के लिए कम लेजर तीव्रता का उपयोग करने के लिए जीना कवक कोशिकाओं को नुकसान हो सकता है ।
    3. माइक्रोस्कोप पर microwell डिश माउंट । शुरू में 10 एक्स उद्देश्यों का उपयोग कर कोशिकाओं को खोजने, तो उच्च आवर्धन के लिए 100x/1.44 तेल उद्देश्य के लिए स्विच ।
      नोट: xyzt के लिए स्कैन मोड सेट (z-ढेर और समय चूक मोड का संयोजन), जेड स्थिति, ज़ूम, छवि पर कब्जा, आदि की आवृत्ति
अगले कदम पर आगे बढ़ने से पहले ।
  • जोड़ें ५० µ fluorophore के एल-लेबल defensins यहां इस्तेमाल किया (चरण १.३) के MIC पर 3 µ एम और 2 µ एल की झिल्ली-चयनात्मक डाई FM4-64 (अंतिम एकाग्रता 5 µ एम) प्रत्येक microwell डिश के लिए, और शुरू समय चूक इमेजिंग । वाष्पीकरण को रोकने के लिए microwell व्यंजन में गीले फिल्टर कागज के छोटे टुकड़े रखें । छवि पर कब्जा की आवृत्ति 3 मिनट 30 एस और कुल अवधि था 2 ज 30 मिनट था ।
    नोट: माइक्रोस्कोप में बढ़ते microwell डिश के बाद defensin और fluorophore को जोड़ना ब्याज के क्षेत्र को infocus कर सकता है । इसलिए, microwell के लिए defensin और fluorophore जोड़ने के बाद, ब्याज की क्षेत्र में छवि अधिग्रहण में देरी का कारण बन सकता है जो refocused किया जा करने के लिए की जरूरत है ।
  • सभी फोकल इमेजिंग के लिए एक फोकल माइक्रोस्कोप का प्रयोग करें और एक अंधेरे कमरे में कमरे के तापमान पर माइक्रोस्कोपी बाहर ले ।

    • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    लाइव सेल इमेजिंग को ट्रैक करने के लिए किया गया था और दो defensins, MtDef4 और MtDef5 के internalization और उपसेलुलर स्थानीयकरण की तुलना, मेडिकागो truncatulaसे; कवक कोशिकाओं में । टीएमआर-MtDef4 रासायनिक संश्लेषित किया गया था जबकि MtDef5 Dylight550 (Dylight550-MtDef5) के साथ लेबल किया गया था । Conidia झिल्ली चयनात्मक डाई FM4-64 के साथ संयोजन में या तो defensin के साथ मशीन थे । चित्रा 1 से पता चलता है कि टीएमआर-MtDef4 एफ graminearumकी तुलना में एन crassa में अलग तस्करी रास्ते है । N. crassaमें, FM4-64 defensin के साथ नहीं सह स्थानीयकरण है, बल्कि vacuoles के भीतर जो defensin तनहा है की झिल्ली दाग । F. graminearumमें, दूसरी ओर, टीएमआर-MtDef4 किसी विशिष्ट झिल्ली बंधे के भीतर स्थानीयकृत नहीं है organelles लेकिन कोशिका (चित्रा 1) में फैलाना है ।

    दोनों fluorophore-लेबल defensins यहां इस्तेमाल किया (चरण १.३) और FM4-64 के साथ लेबल N. crassa कोशिकाओं की समय चूक इमेजिंग पता चलता है कि defensin उपचार के 30 से ४० मिनट के भीतर कवक कोशिकाओं में प्रवेश करने में सक्षम है (चित्रा 2) । कोशिकाओं में प्रवेश पर, fluorophore-लेबल defensins यहां इस्तेमाल किया (कदम १.३) किसी भी विशिष्ट organelle के भीतर स्थानीयकरण नहीं है, लेकिन आसानी से कोशिका में फैलाना । यह टीएमआर के विपरीत है-MtDef4 जो एन crassa कोशिकाओं में प्रवेश करती है और उपचार के 3hrs के बाद भी vesicular शरीर के भीतर फंस (चित्रा 1) रहता है ।

    Figure 1
    चित्र 1: MtDef4 में विभिंन तस्करी मार्ग है N. crassa और F. graminearum. टीएमआर-MtDef4 information in vesicular निकायों में N. crassa (A) लेकिन F. कोशिका (B) के graminearum में फैलाना है । Conidia के एन. crassa और F. graminearum 1 µ m और 12 µ m टीएमआर-MtDef4 (लाल) के साथ क्रमश:, और FM4-64 (हरा) के साथ सह-लेबल थे । छवियों के उपचार के 3 ज के बाद लिया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 2
    चित्रा 2: MtDef5 N. crassa और कोशिकाओं के अंदर फैलाना द्वारा आंतरिक है । DyLight550-MtDef5 N. crassa कोशिकाओं में आंतरिक है और कोशिका में फैलाना । N. crassa कक्ष 3 µ m DyLight550-MtDef5 (लाल) और FM4-64 (हरा) के साथ सह-लेबल किए गए थे । वीडियो 2 एच और 30 मिनट के लिए दर्ज किया गया था । MtDef5 के अलावा और शुरू छवि अधिग्रहण के बीच देरी 5 min. स्केल बार = 4 µm. कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    इस अध्ययन में, फ्लोरोसेंट लेबल रोधी defensins के उपयोग के साथ एक विश्वसनीय लाइव सेल इमेजिंग पद्धति को फफूंद कोशिकाओं में इन पेप्टाइड्स के internalization के कैनेटीक्स अध्ययन करने के लिए और अपने उपसेलुलर लक्ष्य निर्धारित करने के लिए वर्णित किया गया था । इस विधि लौकिक और स्थानिक defensins और कवक कोशिकाओं के बीच बातचीत की गतिशीलता कल्पना करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है ।

    फफूंद कोशिकाओं में पादप defensins के internalization और intracellular स्थानीयकरण का अध्ययन करने के लिए विभिन्न विधियों का प्रयोग किया गया है । इन तरीकों में, defensin-इलाज कोशिकाओं को आमतौर पर तय कर रहे है और फिर immunolocalization, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, या एक्स-रे टोमोग्राफी15,24,25के लिए संसाधित । इसके अलावा, इन तकनीकों के अधिकांश एक विशिष्ट समय बिंदु पर इमेजिंग कोशिकाओं के बजाय वास्तविक समय में एक ही रहने वाले कोशिकाओं के लिए गतिशील defensin चुनौती के जवाब में जगह ले परिवर्तन की निगरानी का उपयोग कर की तुलना में प्रतिबंधित किया गया है । कल्पना, विश्लेषण और defensins की रोधी कार्रवाई के दौरान वास्तविक समय में कवक कोशिकाओं में जगह ले जा गतिशील घटनाओं की तुलना करने की क्षमता इस तकनीक को प्रभावी और रोमांचक बनाता है । इसके अलावा, यह बेहतर समझ प्रदान करता है कि पेप्टाइड का गतिशील intracellular स्थानीयकरण समय के साथ व्यक्तिगत कवक कोशिकाओं के morphogenesis को प्रभावित करता है ।

    इस विधि के महत्वपूर्ण पहलुओं में से एक-सेलुलर महत्वपूर्ण फ्लोरोसेंट रंजक (उदा FM4-64 के साथ साथ फ्लोरोसेंट लेबल पेप्टाइड्स का उपयोग करने के लक्ष्यों का निर्धारण है; एसजी). उपसेलुलर स्थानीयकरण एक पेप्टाइड चल रही है, और सेलुलर मशीनरी में26,27में अपने संपर्क भागीदारों, समारोह और संभावित भूमिका (ओं) elucidating की ओर एक महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करता है कि पर्यावरण का निर्धारण करती है ।

    इस तकनीक की एक छोटी सी सीमा है कि फ्लोरोसेंट पेप्टाइड अक्सर unलेबल्ड पेप्टाइड के साथ तुलना में कम रोधी गतिविधि दर्शाती है । यदि पेप्टाइड एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पेप्टाइड लेबलिंग किट का उपयोग कर लेबल है और रोधी गतिविधि की पूरी तरह से नुकसान से पता चलता है, एक रासायनिक संश्लेषित पेप्टाइड पर एक छोटे से fluorophore के साथ लेबल अपने N-या C-टर्मिनस अनुशंसित है ।

    सारांश में, कवक कोशिकाओं के लाइव सेल इमेजिंग एक fluorophore-टैग defensin के साथ चुनौती दी एक प्रभावी उपकरण है कि प्रत्यक्ष, उच्च spatio एक रोधी defensin के मुआ के लौकिक संकल्प प्रदान कर सकते है । अधिक सटीक मुआ अध्ययन के लिए, इस तकनीक प्रतिदीप्ति लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (FLIM) के साथ जोड़ा जा सकता है28 जो अन्य पेप्टाइड्स, या अन्य लेबल अणुओं या सेलुलर के साथ एक पेप्टाइड के संपर्क कैनेटीक्स को मापने की अनुमति देगा वास्तविक समय में घटक । यह तरीके रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स काम जिससे कृषि और चिकित्सा में उपयोग के लिए रोधी एजेंटों के रूप में उनके विकास को गति के बारे में हमारी समझ को समृद्ध करेगा ।

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

    Acknowledgments

    हम डॉ आर हावर्ड बर्ग, डोनाल्ड Danforth संयंत्र विज्ञान केंद्र में एकीकृत माइक्रोस्कोपी सुविधा के निदेशक, उनके मार्गदर्शन के लिए और फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ मदद के लिए धन्यवाद । लेखकों के हितों की घोषणा करने का कोई विरोध नहीं है.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    FM4-64 Dye Life Technologies T13320
    DyLight 550 Antibody Labeling Kit Thermo Scientific 84530
    Glass Bottom Microwell Dishes Mat TeK P35G-1.5-10-C
    Mira cloth EMD Millipore Corp 475855-1R
    SP8-X confocal microscope Leica
    ImageJ software FiJi For Image analysis
    Imaris software Bitplane For Image analysis

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Jones, J. D. G., Dangl, J. L. The plant immune system. Nature. 444 (7117), 323-329 (2006).
    2. Tavormina, P., De Coninck, B., Nikonorova, N., De Smet, I., Cammue, B. P. A. The Plant Peptidome: An expanding repertoire of structural features and biological functions. Plant cell. 27 (8), 2095-2118 (2015).
    3. Van Der Weerden, N. L., Bleackley, M. R., Anderson, M. A. Properties and mechanisms of action of naturally occurring antifungal peptides. Cell. and Mol. Life Sci. 70 (19), 3545-3570 (2013).
    4. Van der Weerden, N. L., Anderson, M. A. Plant defensins: Common fold, multiple functions. Fungal Biol Rev. 26 (4), 121-131 (2013).
    5. De Coninck, B., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. Modes of antifungal action and in planta functions of plant defensins and defensin-like peptides. Fungal Biol Rev. 26 (4), 109-120 (2013).
    6. Kaur, J., Sagaram, U. S., Shah, D. Can plant defensins be used to engineer durable commercially useful fungal resistance in crop plants? Fungal Biol. Rev. 25 (3), 128-135 (2011).
    7. Vriens, K., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. Antifungal plant defensins: Mechanisms of action and production. Molecules. 19 (8), 12280-12303 (2014).
    8. Sagaram, U. S., Kaur, J., Shah, D. Antifungal plant defensins: Structure-activity relationships, modes of action, and biotech applications. ACS Symp. Ser. 1095, 317-336 (2012).
    9. Thevissen, K., Francois, I. E. J. A., Aerts, A. M., Cammue, B. P. A. Fungal sphingolipids as targets for the development of selective antifungal therapeutics. Curr. Drug Targets. 6 (8), 923-928 (2005).
    10. Thevissen, K., Kristensen, H. H., Thomma, B. P. H. J., Cammue, B. P. A., Francois, I. E. J. A. Therapeutic potential of antifungal plant and insect defensins. Drug Discov. Today. 12 (21-22), 966-971 (2007).
    11. Aerts, A. M., François, I. E. J. A., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. The mode of antifungal action of plant, insect and human defensins. Cell. Mol. Life Sci. 65 (13), 2069-2079 (2008).
    12. Van Der Weerden, N. L., Lay, F. T., Anderson, M. A. The plant defensin, NaD1, enters the cytoplasm of Fusarium oxysporum hyphae. J. Biol. Chem. 283 (21), 14445-14452 (2008).
    13. Lobo, D. S., Pereira, I. B., et al. Antifungal Pisum sativum Defensin 1 Interacts with Neurospora crassa Cyclin F Related to the Cell Cycle. Biochemistry. 46 (4), 987-996 (2007).
    14. El-Mounadi, K., Islam, K. T., Hernandez-Ortiz, P., Read, N. D., Shah, D. M. Antifungal mechanisms of a plant defensin MtDef4 are not conserved between the ascomycete fungi Neurospora crassa and Fusarium graminearum. Mol. Microbiol. 100 (3), 542-559 (2016).
    15. Baxter, A. A., et al. The Tomato Defensin TPP3 Binds Phosphatidylinositol (4,5)-Bisphosphate via a Conserved Dimeric Cationic Grip Conformation To Mediate Cell Lysis. Mol. and Cell. Biol. 35 (11), 1964-1978 (2015).
    16. Kvansakul, M., et al. Binding of phosphatidic acid by NsD7 mediates the formation of helical defensin-lipid oligomeric assemblies and membrane permeabilization. Proc. Natl. Acad. Sci. 113, 11202-11207 (2016).
    17. Poon, I. K. H., et al. Phosphoinositide-mediated oligomerization of a defensin induces cell lysis. eLife. 3, e01808 (2014).
    18. Muñoz, A., Read, N. D. Live-cell imaging and analysis shed light on the complexity and dynamics of antimicrobial Peptide action. Front. Immunol. 3, 248 (2012).
    19. Hayes, B. M. E., et al. Identification and mechanism of action of the plant defensin NaD1 as a new member of the antifungal drug arsenal against candida albicans. Antimicrob. Agents Chemother. 57 (8), 3667-3675 (2013).
    20. Muñoz, A., Marcos, J. F., Read, N. D. Concentration-dependent mechanisms of cell penetration and killing by the de novo designed antifungal hexapeptide PAF26. Mol. Microbiol. 85 (1), 89-106 (2012).
    21. Eaton, C. J., et al. The guanine nucleotide exchange factor RIC8 regulates conidial germination through Gα proteins in Neurospora crassa. PLoS One. 7 (10), e48026 (2012).
    22. Leslie, J. F., Summerell, B. A. The Fusarium. laboratory manual. , Blackwell Professional. Ames, IA, USA. (2006).
    23. Broekaert, W. F., Terras, F. R. G., Cammue, B. P. A., Vanderleyden, J. An automated quantitative assay for fungal growth inhibition. FEMS Microbiol.Lett. 69 (1-2), 55-59 (1990).
    24. Sagaram, U. S., et al. Structural and functional studies of a phosphatidic acid-binding antifungal plant defensin MtDef4: Identification of an RGFRRR motif governing fungal cell entry. PLoS One. 8 (12), 1-22 (2013).
    25. Uchida, M., et al. Soft X-ray tomography of phenotypic switching and the cellular response to antifungal peptoids in Candida albicans. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (46), 19375-19380 (2009).
    26. Nair, R., et al. Better prediction of sub-cellular localization by combining evolutionary and structural information. Proteins Struct. Funct. Bioinform. 53 (4), 917-930 (2003).
    27. Scott, M. S., Calafell, S. J., Thomas, D. Y., Hallett, M. T. Refining protein subcellular localization. PLoS Comput. Biol. 1 (6), e66 (2005).
    28. Shagaghi, N., Bhave, M., Palombo, E., Clayton, A. Revealing the sequence of interactions of PuroA peptide with Candida albicans cells by live-cell imaging. Sci. Rep. 7, 43542 (2017).

    Tags

    सेलुलर जीवविज्ञान अंक १३० लाइव सेल इमेजिंग रोधी संयंत्र defensin कार्रवाई के तंत्र (मुआ) internalization उपसेलुलर स्थानीयकरण Neurospora crassa फ़्यूज़ेरियम graminearum
    लाइव-कवक कोशिकाओं के सेल इमेजिंग प्रवेश के साधनों की जांच करने के लिए और रोधी संयंत्र Defensins के उपसेलुलर स्थानीयकरण
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Islam, K. T., Shah, D. M.,… More

    Islam, K. T., Shah, D. M., El-Mounadi, K. Live-cell Imaging of Fungal Cells to Investigate Modes of Entry and Subcellular Localization of Antifungal Plant Defensins. J. Vis. Exp. (130), e55995, doi:10.3791/55995 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter