Summary
Anlegget defensins spille en viktig rolle i anlegget forsvar mot patogener. For effektiv bruk av disse antifungal peptider som soppdrepende midler, forstå deres moduser handling (MOA) er kritisk. Her er en live-celle bildebehandling metode beskrevet for å studere viktige sider ved MOA av disse peptider.
Abstract
Liten cystein-rik defensins er en av de største gruppene av vert forsvar peptider i alle planter. Mange anlegg defensins exhibit potente i vitro soppdrepende aktivitet mot et bredt spekter av sopp patogener og derfor har potensial til å bli brukt som soppdrepende midler i paradoks. For å utnytte det fulle potensialet av anlegget defensins for sykdommer kontroll, er det avgjørende å belyse deres virkningsmekanismer (MOA). Med bruk av avansert mikroskopi teknikker, har live-celle bildebehandling blitt et kraftig verktøy for å forstå dynamikken i soppdrepende MOA av anlegget defensins. Her beskrives en AC confocal mikroskopi basert live-celle bildebehandling metode med to fluorescently merket anlegget defensins (MtDef4 og MtDef5) i kombinasjon med viktig fluorescerende fargestoffer. Denne teknikken gir sanntids visualisering og analyse av dynamisk hendelsene i MtDef4 og MtDef5 internalisering i fungal cellene. Viktigere, genererer denne analysen et vell av informasjon, inkludert internalisering kinetikk, modus av oppføringen og subcellular lokalisering av disse peptider. Andre cellen biologiske verktøy, har disse metodene gitt kritisk innsikt i dynamikken og kompleksiteten av MOA av disse peptider. Disse verktøyene kan også brukes til å sammenligne MOA av disse peptider mot ulike sopp.
Introduction
Planter har utviklet et sofistikert medfødte immunsystem forsvar mot microbial plante patogener1. De uttrykke mange gen-kodet vert forsvar peptider med antatte antimikrobielle aktivitet2. Faktisk, mange av disse peptider vise antimikrobielle aktivitet i vitro3. Defensins utgjør en av de største gruppene av vert forsvar peptider i anlegget rike4. Disse cystein-rik, kationisk peptider utstillingen potente vekst hemmende aktivitet mot sopp og oomycete patogener micromolar konsentrasjoner og representerer en av de første linjene av forsvar mot disse patogener5,6. På grunn av sin potente soppdrepende aktivitet, kan defensins utnyttes i agribiotechnological programmer for å generere sykdom avlinger. Grunnleggende overuttrykte flere anlegg defensins har vist seg å forbedre sykdomsresistens i drivhus og feltet testene paradoks6. Det er viktig å løse virkningsmekanismer (MOA) av disse antifungal peptider å fullt utnytte sitt potensial som effektive verktøy for avlingsvern. Imidlertid er MOA av disse plante defensins dårlig forstått. Gjeldende bevis antyder at de viser ulike MOA5,6,7,8. Noen defensins handle extracellularly på sopp og målrette bestemte cellen vegg/plasma membran bosatt sphingolipider, forstyrre membran integritet og aktivere cellulære toksisitet trasé9,10,11. Nylig imidlertid har soppdrepende defensins som translocate i fungal cellene vært oppdaget12,13,14. Noen av disse defensins binde til membran-resident bioaktive fosfolipider, danne oligomeric komplekser og permeabilize plasma membraner15,16,17. Dermed har noen aspekter av MOA av anlegget defensins utredet. Men innebære MOA av anlegget defensins sannsynlig et komplekst sett av hendelser som ennå ikke er identifisert og integrert i en omfattende modell. Spesielt er det fortsatt et stort gap i vår forståelse av mobilnettet målene av disse peptider.
Med nylige fremskritt i mikroskopi teknologi og utvikling av nye fluorescerende sonder brukes live-celle Bildeteknikker nå ofte til å studere MOA av antimikrobielle peptider (ampere). Disse teknikkene utfylle brukte metoder som immunolocalization, elektronmikroskop, atomic force mikroskopi eller X-ray tomografi18, som har vært ansatt hovedsakelig for å analysere effekten av soppdrepende peptider på morfologi og veksten av fungal cellene inkludert studiet av cellevegg integritet, endringer i celle vekst/forgrening mønstre, samt plasma membran permeabilization og drepe. Likevel, disse studiene har vært begrenset til imaging celler på et bestemt tidspunkt etter behandling med peptider i stedet for å utføre time-lapse imaging i de samme cellene til å overvåke deres dynamiske endringer i respons til defensin utfordring. De siste årene, har bruken av fluorescently merket peptider i forbindelse med levende celle imaging bruker AC confocal mikroskopi aktivert sanntids visualisering av dynamikken i AMP-mikrobe interaksjoner. Både naturlig renset og kjemisk syntetisert soppdrepende peptider kan være merket med fluorescerende (f.eks, DyLight, rhodamine, BODIPY eller Alexa Fluor basert fargestoffer) og direkte observert under deres samhandling med celler av time-lapse Live-celle bildebehandling. Bruk av dette merket peptider har betydelig økt vår forståelse av de ulike aspektene ved deres MOA inkludert oppføring, subcellular lokalisering, intracellulær smugling og nettsteder av soppdrepende handling i levende fungal cellene 18.
Flere studier har nylig vist at ulike soppdrepende peptider inkludert anlegget defensins er internalisert bor fungal cellene12,14,19,20. MOA av disse defensins sannsynlig innebære interaksjon med intracellulære mål. Vi har nylig rapportert soppdrepende handlingen av en plante defensin MtDef4 i to ascomycete sopp, Neurospora crassa og Fusarium graminearum. MtDef4 ble vist å bruke ulike veier for sopp celleoppføring og subcellular lokalisering i disse sopp14. Denne studien brukte kjemisk syntetisert tetramethyl rhodamine (TAMRA)-merket MtDef4 i kombinasjon med viktig fluorescerende fargestoffer (membran selektiv fargestoff, FM4-64, membran-permeant fargestoff, SYTOX Green, celle død reporter fargestoff, propidium iodide) og Metabolsk hemmere. Disse analysene viste the kinetics av internalisering MtDef4, dens mekanismer for intracellulær transport og dens subcellular mål14.
Her, er en protokoll live-celle bildevisning AC confocal mikroskopi presentert. Protokollen utnytter fluorescently merket peptider i kombinasjon med viktig fluorescerende fargestoffer å studere anlegget defensin-fungal samspill, spesielt, veier av translokasjon og intracellulær mål for defensins i fungal cellene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. merking av Defensins med Fluorophores
- Velg en fluorophore som har minimal effekt på antimikrobielle egenskapene som opptak og lokalisering av defensin i levende cellen.
Merk: Å velge optimal fluorophore avhenger av spesifikke eksperimentelle mål. Spectral og kjemiske egenskaper, photostability, størrelse og kostnad på fluorophore bør også vurderes. - Etiketten defensin med den valgte fluorophore ved hjelp av en passende peptid merking kit tilgjengelig fra kommersielle leverandører. Alternativt, kjemisk syntetisere fluorophore-merket defensins. I denne studien etiketten MtDef5 defensin med DyLight550 ved hjelp av en kommersiell merking utstyr i henhold til produsentens protokollen og tetramethyl rhodamine (TAMRA)-merket MtDef4 defensin var kjemisk syntetisert kommersielt.
Merk: Det anbefales at kjemisk syntetisk fluorophore merket peptider (spesielt for kort peptider 50 aminosyrer eller mindre) brukes siden til fluorophore kan knyttes til N - eller C-terminalen rester av peptid å sikre minimum effekt på sine Antimikrobiell aktivitet. Syntese av lang peptider med mer enn tre disulfide obligasjoner er utfordrende. I dette tilfellet anbefaler at peptid merkes med en optimal fluorophore bruke et egnet kommersielt tilgjengelig peptid merking kit. - Test i vitro antimikrobielle aktiviteten til den angitte defensin og finne ut den minimale inhibitoriske konsentrasjonen (MIC) mot sopp undersøkes.
Merk: I denne studien MIC av DyLight550-MtDef5 og TMR-MtDef4 var bestemt mot Neurospora crassa og Fusarium graminearum.
2. sopp kulturer og oppblomstringen Medium
- Overføre conidia fra en N. crassa lager kultur skråstilling rør som inneholder Vogel's agar middels21 og ruge ved romtemperatur under lys i 5 dager.
- Kultur F. graminearum PH-1 belastning på plater som inneholder fullstendig middels (CM)22 på 28 º c i 5 dager. For produksjon av conidia, vaksinere 4 (10 mm diameter) pluggene 5 dagers gammel kultur av F. graminearum PH-1 til 50 mL av carboxymethyl cellulose (CMC) medium (15 g carboxymethyl cellulose, 1 g gjærekstrakt, 0,5 g MgSO4.7 H2O, 1 g NH 4 INGEN3og 1 g KH2PO4) og kultur for 4-7 dager på 28 º c i en roterende shaker på 180 rpm.
3. forberedelse av Conidial suspensjon
- F. graminearum conidial suspensjon
- Vortex F. graminearum flytende kulturen og samle conidia ved filtrering 1,5 mL fungal kultur gjennom to lag av filtrering materiale (for eksempel Miracloth) i en 2 mL microcentrifuge tube. Sentrifuge conidial suspensjon på 13,226 x g-hastighet i et microcentrifuge i 2 minutter.
- Forkaste nedbryting, og legge 1 mL steril vann å vaske pellet.
- Sentrifuge conidial suspensjon på 13,226 x g-hastighet i et microcentrifuge for 2 min. Forkast nedbryting og resuspend pellet i 1 mL av 2 X SFM (syntetisk Fungal Media)23.
- Telle conidia med en hemocytometer under en lys mikroskop.
- Justere conidial suspensjon til 105 conidia/mL med 2 X SFM.
- N. crassa conidial suspensjon
- Overføre en liten mengde voksende kultur (5 dagers gammel) N. crassa bruker en inoculation løkke slik microcentrifuge som inneholder 2 mL Vogels flytende medium.
- Vortex conidial suspensjon og filtrere gjennom filtrering materiale i en ny microcentrifuge tube.
- Sentrifuge conidial suspensjon med maksimal hastighet i en microcentrifuge for 2 min. Forkast nedbryting og resuspend det conidial pellet i 1 mL av Vogels flytende medium.
- Telle conidia med en hemocytometer under en lys mikroskop.
- Justere conidial suspensjon til 105 conidia/mL med Vogels flytende medium.
4. Prøv forberedelse og AC Confocal mikroskopi
- Subcellular lokalisering av MtDef4 defensin i fungal cellene
- Pipetter 50 µL av hver conidial suspensjon (105 conidia/mL) i 10 mm microwell 35 mm glass bunn microwell retter. For observasjon av conidia, direkte fortsette til neste trinn eller germlings forberedelse, pipette 50 µL av N. crassa og F. graminearum conidia i 35 mm kultur retter og la spire 3-6 h ved romtemperatur.
- Legg til 50 µL av fluorescently merket defensin på MIC til hver microwell rett og ruge 2,5 h. MIC av den fluorophore-merket defensins her (trinn 1.3) er 3 µM både N. crassa og F. graminearum MIC av TMR-MtDef4 N. crassa og F. graminearum var 1 µM og 12 µM, henholdsvis.
- Legge til 2 µL av membran-selektiv farge FM4-64 (siste konsentrasjon: 5 µM) i kultur parabol og ruge i 30 min og montere umiddelbart på AC confocal mikroskop for bildebehandling.
- Velg hvitt lys laser (WLL). Bruk to laser kilder 488 nm og 550 nm å opphisse TMR-MtDef4 og FM4-64 fargestoff, henholdsvis. Oppdage fluorescens av TMR-MtDef4 på 580-700 nm og oppdage FM4-64 fargestoff på 690-800 nm.
Merk: Utføre AC confocal mikroskopi i mørke rom.
- Tid forfalle avbilding av internalization av MtDef5 defensin
- Pipetter 50 µL av N. crassa og F. graminearum conidial suspensjon (105 conidia/mL) i 10 mm microwell 35 mm glass bunn microwell retter. 10 mm microwell er ubestrøket og har et nei 1.5 cover glass nederst. For observasjon av conidia, går du direkte til neste trinn. For observasjon av germlings, ruge conidia 3-6 h ved romtemperatur før du fortsetter med mikroskopi.
- Slå på WLL. Velg laser linjen på 550 nm å opphisse fluorophore-merket defensins her (trinn 1.3) og FM4-64 med 1,00% intensitet og aktivere de tilsvarende detektorer. Den fluorophore-merket defensins her (trinn 1.3) ble oppdaget på 560-600 nm og FM4-64dye ble oppdaget på 690-800 nm.
Merk: Bruk lavt laser intensitet for levende celle tenkelig som høy laser intensitet kan skade live fungal cellene. - Montere microwell fatet på mikroskopet. Finne celler med 10 x mål først, deretter bytte til 100 x / 1,44 oljeobjektiv for høyere forstørrelse.
Merk: Satt til skannemodus til xyzt (kombinasjon av Z-stack og time-lapse moduser), Z posisjon, Zoom, hyppigheten av bildeoppløsning, etc.
Merk: Legge til defensin og fluorophore etter montering microwell parabolen i mikroskopet kan defokus regionen rundt. Etter å legge til defensin og fluorophore microwell, må regionen rundt derfor være refocused som kan føre til forsinkelser i bildeopptak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Live celle imaging ble utført å spore og sammenligne internalisering og subcellular lokalisering av to defensins, MtDef4 og MtDef5, fra Medicago truncatula; i fungal cellene. TMR-MtDef4 var kjemisk syntetisert mens MtDef5 var merket med Dylight550 (Dylight550-MtDef5). Conidia ble inkubert med enten defensin i kombinasjon med membran selektiv fargestoff FM4-64. Figur 1 viser at TMR-MtDef4 har ulike menneskehandel veier i N. crassa forhold til F. graminearum. N. crassa, FM4-64 co Lokaliser ikke med den defensin men heller flekker membraner av vacuoles som den defensin er sequestered. I F. graminearum, derimot, TMR-MtDef4 er ikke lokalisert innen en bestemt membran-bundet organeller men er diffust i cytoplasma (figur 1).
Time lapse bilder av N. crassa celler merket med både fluorophore-merket defensins her (trinn 1.3) og FM4-64 viser at den defensin er kjøpedyktig gå inn fungal cellene innen 30 til 40 min behandling (figur 2). Ved inngåelse cellene, den fluorophore-merket defensins her (trinn 1.3) Lokaliser ikke i noen bestemt organelle men diffunderer lett i cytoplasma. Dette er TMR-MtDef4 som går inn N. crassa celler og er fanget innenfor vesicula likene selv etter 3hrs behandling (figur 1).
Figur 1: MtDef4 har ulike menneskehandel veier i N. crassa og F. graminearum. TMR-MtDef4 regionaliserer i vesicula organer i N. crassa (A) men er diffust i cytoplasma av F. graminearum (B). Conidia N. crassa og F. graminearum var co merket med 1 µM og 12 µM TMR-MtDef4 (rød), henholdsvis, og med FM4-64 (grønn). Bildene ble tatt etter 3 h behandling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: MtDef5 er internalisert N. crassa og diffunderer i cellene. DyLight550-MtDef5 er internalisert i N. crassa celler og diffunderer i cytoplasma. N. crassa celler var co merket med 3 µM DyLight550-MtDef5 (rød) og FM4-64 (grønn). Videoen ble spilt inn i 2 h og 30 min. Forsinkelsen mellom tillegg av MtDef5 og starter bildeopptak var 5 min. skala bar = 4 µm. Vennligst klikk her for å vise denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien var en pålitelig live-celle bildebehandling metode med bruk av fluorescently merket soppdrepende defensins beskrevet å studere the kinetics av internalisering av disse peptider i fungal cellene og å finne sine subcellular mål. Denne metoden er et kraftig verktøy for å visualisere dynamikken i samspillet mellom defensins og fungal cellene timelig og romlig.
Ulike metoder har blitt brukt til å studere internalisering og intracellulær lokalisering av anlegg defensins i fungal cellene. I disse metodene, defensin-behandlet cellene vanligvis fast og deretter behandlet for immunolocalization, elektronmikroskop eller X-ray tomografi15,24,25. Dessuten, har de fleste av disse teknikkene vært begrenset til imaging celler på et bestemt tidspunkt og ikke i sanntid ved hjelp av tidsinnstilt bildebehandling av samme levende celler for å overvåke de dynamiske endringene foregår svar på defensin utfordring. Muligheten til å visualisere, analysere og sammenligne dynamisk hendelser som skjer i fungal cellene i sanntid under soppdrepende handlingen av defensins gjør denne teknikken effektivt og spennende. I tillegg gir det bedre forståelse av hvordan den dynamiske intracellulære lokaliseringen av peptid påvirker morphogenesis av sopp enkeltceller med tid.
En av de viktige aspektene ved denne metoden er å avgjøre subcellular mål med fluorescently merket peptider sammen med viktige fluorescerende fargestoffer (f.eks FM4-64; SG). Subcellular lokalisering bestemmer miljøet som et peptid opererer, og representerer et viktig skritt mot Klargjørende sin interaksjon partnere, funksjon og potensielle roller i mobilnettet maskineri26,27.
En mindre begrensninger av denne teknikken er at den fluorescerende peptid ofte viser redusert soppdrepende aktivitet sammenlignet med den umerkede peptid. Hvis peptid er merket ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig peptid merking kit og viser fullstendig tap av soppdrepende aktivitet, anbefales en kjemisk syntetisert peptid merket med en liten fluorophore på sin N - eller C-terminus.
I sammendraget, live celle er avbilding av fungal cellene utfordret med en fluorophore-merket defensin et effektivt verktøy som kan gi direkte, spatio-temporale høyoppløselig av MOA av en soppdrepende defensin. For mer presise MOA studien, kan denne teknikken kombineres med fluorescens levetid imaging mikroskopi (FLIM)28 som lar måle samhandling kinetics av et peptid andre peptider, eller andre merket molekyler eller cellular bestanddeler i sanntid. Dette vil berike vår forståelse av hvordan antimikrobielle peptider arbeide dermed påskynde utviklingsprosessen som soppdrepende midler for bruk innen landbruk og medisin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. R. Howard Berg, direktør for integrerte mikroskopi anlegget ved Donald Danforth Plant Science Center, for hans veiledning og hjelp med AC confocal mikroskopi. Forfatterne har noen interessekonflikt å erklære.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FM4-64 Dye | Life Technologies | T13320 | |
| DyLight 550 Antibody Labeling Kit | Thermo Scientific | 84530 | |
| Glass Bottom Microwell Dishes | Mat TeK | P35G-1.5-10-C | |
| Mira cloth | EMD Millipore Corp | 475855-1R | |
| SP8-X confocal microscope | Leica | ||
| ImageJ software | FiJi | For Image analysis | |
| Imaris software | Bitplane | For Image analysis |
References
- Jones, J. D. G., Dangl, J. L. The plant immune system. Nature. 444 (7117), 323-329 (2006).
- Tavormina, P., De Coninck, B., Nikonorova, N., De Smet, I., Cammue, B. P. A. The Plant Peptidome: An expanding repertoire of structural features and biological functions. Plant cell. 27 (8), 2095-2118 (2015).
- Van Der Weerden, N. L., Bleackley, M. R., Anderson, M. A. Properties and mechanisms of action of naturally occurring antifungal peptides. Cell. and Mol. Life Sci. 70 (19), 3545-3570 (2013).
- Van der Weerden, N. L., Anderson, M. A. Plant defensins: Common fold, multiple functions. Fungal Biol Rev. 26 (4), 121-131 (2013).
- De Coninck, B., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. Modes of antifungal action and in planta functions of plant defensins and defensin-like peptides. Fungal Biol Rev. 26 (4), 109-120 (2013).
- Kaur, J., Sagaram, U. S., Shah, D. Can plant defensins be used to engineer durable commercially useful fungal resistance in crop plants? Fungal Biol. Rev. 25 (3), 128-135 (2011).
- Vriens, K., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. Antifungal plant defensins: Mechanisms of action and production. Molecules. 19 (8), 12280-12303 (2014).
- Sagaram, U. S., Kaur, J., Shah, D. Antifungal plant defensins: Structure-activity relationships, modes of action, and biotech applications. ACS Symp. Ser. 1095, 317-336 (2012).
- Thevissen, K., Francois, I. E. J. A., Aerts, A. M., Cammue, B. P. A. Fungal sphingolipids as targets for the development of selective antifungal therapeutics. Curr. Drug Targets. 6 (8), 923-928 (2005).
- Thevissen, K., Kristensen, H. H., Thomma, B. P. H. J., Cammue, B. P. A., Francois, I. E. J. A. Therapeutic potential of antifungal plant and insect defensins. Drug Discov. Today. 12 (21-22), 966-971 (2007).
- Aerts, A. M., François, I. E. J. A., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. The mode of antifungal action of plant, insect and human defensins. Cell. Mol. Life Sci. 65 (13), 2069-2079 (2008).
- Van Der Weerden, N. L., Lay, F. T., Anderson, M. A. The plant defensin, NaD1, enters the cytoplasm of Fusarium oxysporum hyphae. J. Biol. Chem. 283 (21), 14445-14452 (2008).
- Lobo, D. S., Pereira, I. B., et al. Antifungal Pisum sativum Defensin 1 Interacts with Neurospora crassa Cyclin F Related to the Cell Cycle. Biochemistry. 46 (4), 987-996 (2007).
- El-Mounadi, K., Islam, K. T., Hernandez-Ortiz, P., Read, N. D., Shah, D. M. Antifungal mechanisms of a plant defensin MtDef4 are not conserved between the ascomycete fungi Neurospora crassa and Fusarium graminearum. Mol. Microbiol. 100 (3), 542-559 (2016).
- Baxter, A. A., et al. The Tomato Defensin TPP3 Binds Phosphatidylinositol (4,5)-Bisphosphate via a Conserved Dimeric Cationic Grip Conformation To Mediate Cell Lysis. Mol. and Cell. Biol. 35 (11), 1964-1978 (2015).
- Kvansakul, M., et al. Binding of phosphatidic acid by NsD7 mediates the formation of helical defensin-lipid oligomeric assemblies and membrane permeabilization. Proc. Natl. Acad. Sci. 113, 11202-11207 (2016).
- Poon, I. K. H., et al. Phosphoinositide-mediated oligomerization of a defensin induces cell lysis. eLife. 3, e01808 (2014).
- Muñoz, A., Read, N. D. Live-cell imaging and analysis shed light on the complexity and dynamics of antimicrobial Peptide action. Front. Immunol. 3, 248 (2012).
- Hayes, B. M. E., et al. Identification and mechanism of action of the plant defensin NaD1 as a new member of the antifungal drug arsenal against candida albicans. Antimicrob. Agents Chemother. 57 (8), 3667-3675 (2013).
- Muñoz, A., Marcos, J. F., Read, N. D. Concentration-dependent mechanisms of cell penetration and killing by the de novo designed antifungal hexapeptide PAF26. Mol. Microbiol. 85 (1), 89-106 (2012).
- Eaton, C. J., et al. The guanine nucleotide exchange factor RIC8 regulates conidial germination through Gα proteins in Neurospora crassa. PLoS One. 7 (10), e48026 (2012).
- Leslie, J. F., Summerell, B. A. The Fusarium. laboratory manual. , Blackwell Professional. Ames, IA, USA. (2006).
- Broekaert, W. F., Terras, F. R. G., Cammue, B. P. A., Vanderleyden, J. An automated quantitative assay for fungal growth inhibition. FEMS Microbiol.Lett. 69 (1-2), 55-59 (1990).
- Sagaram, U. S., et al. Structural and functional studies of a phosphatidic acid-binding antifungal plant defensin MtDef4: Identification of an RGFRRR motif governing fungal cell entry. PLoS One. 8 (12), 1-22 (2013).
- Uchida, M., et al. Soft X-ray tomography of phenotypic switching and the cellular response to antifungal peptoids in Candida albicans. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (46), 19375-19380 (2009).
- Nair, R., et al. Better prediction of sub-cellular localization by combining evolutionary and structural information. Proteins Struct. Funct. Bioinform. 53 (4), 917-930 (2003).
- Scott, M. S., Calafell, S. J., Thomas, D. Y., Hallett, M. T. Refining protein subcellular localization. PLoS Comput. Biol. 1 (6), e66 (2005).
- Shagaghi, N., Bhave, M., Palombo, E., Clayton, A. Revealing the sequence of interactions of PuroA peptide with Candida albicans cells by live-cell imaging. Sci. Rep. 7, 43542 (2017).
