Summary
식물 defensins 병원 균에 대 한 식물 방어에 중요 한 역할을 재생. 대 한 항진균 요원, 액션 (MOA)의 그들의 모드를 이해로 이러한 항진균 펩 티 드의 효과적인 사용이 중요 합니다. 여기, 라이브 세포 이미징 방법 공부 이러한 펩 티이 드의 MOA의 중요 한 측면을 설명 합니다.
Abstract
작은 시스테인-부자 defensins 모든 식물에 호스트 방어 펩 티 드의 가장 큰 그룹 중 하나입니다. 많은 식물 defensins 곰 팡이 병원 균의 넓 스펙트럼에 대 한 강력한 생체 외에서 항진균 성 활동을 전시 하 고 따라서 유전자 변형 작물에 항진균 성 대리인으로 사용 될 가능성이 있다. 질병 제어를 위한 식물 defensins의 잠재력을 활용 하기 위해 그들의 행동 (MOA)의 메커니즘을 명료 하 게 결정적 이다. 고급 현미경 검사 법 기술의 도래와 함께 라이브 셀 이미징 식물 defensins의 항진균 MOA의 역학을 이해 하기 위한 강력한 도구가 되고있다. 여기, confocal 현미경 검사 법 기반 라이브 세포 이미징 방법 중요 한 형광 염료와 함께에서 두 붙일 레이블된 공장 defensins (MtDef4 및 MtDef5)를 사용 하 여 설명 합니다. 이 기술은 실시간 시각화 및 곰 팡이 세포에 MtDef4 및 MtDef5 국제화의 동적 이벤트의 분석을 수 있습니다. 중요 한 것은,이 분석 결과 다양 한 국제화 활동, 항목의 모드와 이러한 펩 티이 드의 subcellular 지 방화를 포함 하 여 정보를 생성 합니다. 다른 셀 생물 학적 도구를 이러한 방법 역학과 이러한 펩 티이 드의 MOA의 복잡성에 대 한 중요 한 통찰력 제공. 이러한 도구는 또한 다른 버섯에 대 한 이러한 펩 티이 드의 MOA 비교 하 사용할 수 있습니다.
Introduction
식물 미생물 식물 병원 체1에 대 한 방어에 대 한 정교한 타고 난 면역 체계를 진화 했다. 그들은 수많은 유전자 인코딩 호스트 방어 펩 putative 항균 활동2익스프레스. 실제로, 많은 이러한 펩 티이 드의 항균 활동 생체 외에서3표시합니다. Defensins 식물 왕국4호스트 방어 펩 티 드의 가장 큰 그룹 중 구성 됩니다. 이 시스테인-부자, 양이온 펩 티 드 곰 팡이 대 한 강력한 성장 억제 활동 전시 및 micromolar 농도 및 이러한 병원 균5,6에 대 한 방어의 첫 번째 라인 중 하나에서 oomycete 병원 체. 그들의 강력한 항진균 활동 때문에 defensins agribiotechnological 저항 하는 질병 작물을 생성 하기 위해 응용 프로그램에 악용 될 수 있습니다. 여러 식물 defensins의 제정 overexpression 유전자 변형 작물6온실 및 필드 테스트에 질병 저항을 향상 시키기 위해 표시 되었습니다. 그것은 완전히 작물 보호를 위한 효과적인 도구로 서 자신의 잠재력을 활용 하기 위해서는 이러한 항진균 펩 티 드의 행동 (MOA)의 메커니즘을 해명 하는 것이 중요. 그러나, 이러한 식물 defensins MOA 제대로 이해 하 고. 현재 증거 그들이 다른 MOA5,6,,78전시 제안 합니다. 일부 defensins extracellularly 버섯에 행동 하 고 특정 세포 벽/플라즈마 막 주민 sphingolipids 대상, 막 무결성 고 세포 독성 경로9,,1011활성화 됩니다. 그러나 최근에,, 곰 팡이 세포로 이동 하는 항진균 defensins 발견된12,,1314있다. 일부 이러한 defensins 바인딩할 막 상주 생리 인지질, oligomeric 단지를 형성 하 고 플라즈마 막15,,1617permeabilize. 따라서, 식물 defensins의 MOA의 몇 가지 측면 해명 되어 있다. 그러나, 식물 defensins 가능성이의 MOA 아직 식별 및 포괄적인 모델에 통합 이벤트의 복잡 한 세트를 포함 한다. 특히, 이러한 펩 티이 드의 셀룰러 목표의 우리의 이해에 큰 간격이 남아 있습니다.
진보와 함께 최근 현미경 검사 법 기술 및 새로운 형광 프로브 개발, 라이브 세포 이미징 기술은 지금 자주 사용 된다 항균 성 펩 티 드 (암페어)의 모아 공부 하. 이러한 기술을 보완 형태에 항진균 펩타이드의 효과 분석 하는 주로 고용 immunolocalization, 전자 현미경, 원자 힘 현미경 또는 x 선 단층 촬영18등 널리 사용 되는 방법 및 세포 벽 무결성, 원형질 막 permeabilization로 셀 성장/분기 패턴 변경의 연구를 포함 하 여 고 죽이 곰 팡이 세포의 성장. 그럼에도 불구 하 고, 이러한 연구는 특정 시간 시점에서 셀 defensin 도전 하 응답 그들의 동적 변화를 모니터링 하는 같은 셀에 이미징 시간 경과 수행 하는 대신 펩 티 드와 치료 후 이미징에 국한 되었습니다. 최근 몇 년 동안, 라이브 셀 이미징 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 함께에서 붙일 레이블된 펩 티 드의 사용은 앰프-미생물 상호 작용의 역동성의 실시간 시각화를 활성화 하 고. 둘 다 자연스럽 게 정화 하 고 화학적으로 합성된 항진균 펩 티 드 형광 라벨 태그 될 수 있습니다 (예를 들어, DyLight, rhodamine, BODIPY, 또는 알 렉 사 Fluor 기반 염료) 직접 세포와의 상호 작용 하는 동안 시간 경과 의해 관찰 하 고 라이브 셀 이미지입니다. 이러한 펩 티 드를 표시의 사용은 크게 모드 항목, subcellular 지 방화, 세포내 매매, 및 살아있는 곰 팡이 세포 내 항진균 작업의 사이트를 포함 하 여 그들의 MOA의 다양 한 측면의 우리의 이해를 증가 18.
최근, 여러 연구 공장 defensins 포함 하는 다양 한 항진균 펩 티 드는 살고 곰 팡이 세포12,14,,1920내 면 나타났습니다. 이러한 defensins 가능성이의 MOA 세포내 목표와 상호 작용을 포함 한다. 우리 최근 두 ascomycete 버섯, Neurospora crassa 과 Fusarium graminearum에 MtDef4 defensin 식물의 항진균 액션을 보고 있다. MtDef4 곰 팡이 셀 항목 및이 균14subcellular 지 방화에 대 한 다른 경로 사용 하 여 표시 했다. 화학적으로 사용이 연구 합성 tetramethyl rhodamine (TAMRA)-중요 한 형광 염료 (막 선택적 염료, FM4-64; 막 permeant 염료, SYTOX 그린 셀 죽음 기자 염료, 요오드 화물 propidium)와 함께에서 MtDef4를 표시 하 고 신진 대사 억제제입니다. 이러한 분석의 MtDef4, 세포내 수송의 그것의 기계 장치 및 그것의 subcellular 대상14의 국제화 활동을 보여주었다.
여기, confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 라이브 셀 이미징에 대 한 프로토콜 제공 됩니다. 프로토콜 공장 defensin 곰 팡이 상호 작용, 특히 공부를 중요 한 형광 염료, 전 좌의 경로와 defensins 곰 팡이 세포에서의 세포내 표적 조합에 붙일 레이블된 펩 티 드를 이용 한다.
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Protocol
1. 라벨 Defensins Fluorophores와의
- 살아있는 세포 내부에 항균 성 속성으로 이해 및 지역화 defensin의 최소 효과가 fluorophore를 선택 합니다.
참고: 최적의 fluorophore 선택 특정 실험 목적에 따라 달라 집니다. 스펙트럼 및 화학 속성, photostability, 크기와는 fluorophore의 충전도 고려해 야 합니다. - 라벨 라벨 키트 상업용 공급 업체에서 제공 하는 적절 한 펩 티 드를 사용 하 여 선택한 fluorophore와 defensin. 또는, 화학적 fluorophore 표시 defensins 음성 합성. 이 연구에서는 DyLight550와 MtDef5 defensin 라벨 상업 라벨을 사용 하 여 제조 업체의 프로토콜 및 tetramethyl rhodamine (TAMRA)에 따르면 키트-화학적으로 상업적으로 합성 되었다 레이블 MtDef4 defensin.
참고: 것이 좋습니다는 fluorophore에 최소 효과 보장 하기 위해 펩 티 드의 N 또는 C 맨끝 잔류물을 연결할 수 있기 때문에 화학적 합성된 fluorophore 태그 펩 티 드 (특히에 대 한 짧은 펩 티 드 아미노산 50 이하로) 사용할 수는 항균 성 활동입니다. 3 개 이상의 이황화 채권 긴 펩 티 드의 종합 도전 이다. 이 경우에 펩 티 드 적합 한 상용 펩 티 드 라벨 키트를 사용 하 여 최적의 fluorophore와 함께 표시 하는 것이 좋습니다. - 레이블이 defensin의 생체 외에서 항균 성 활동을 테스트 하 고 조사를 곰 팡이 대 한 최소 억제 농도 (MIC)을 결정.
참고:이 연구에서 DyLight550 MtDef5 및 TMR MtDef4 마이크 Neurospora crassa Fusarium graminearum에 대 한 결정 되었다.
2. 곰 팡이 문화 및 성장 매체
- 경사 관 보 글의 한 천 매체21 를 포함 하 고 5 일 동안 빛에서 실 온에서 품 어 N. crassa 주식 문화에서 conidia를 전송 합니다.
- 5 일에 대 한 완벽 한 중간 (CM)22 28 º C에서를 포함 하는 접시에 F. graminearum PH-1 변형 문화. Conidia의 생산에 대 한 접종 F. graminearum PH 1의 5 일 오래 된 문화 4 (10 m m 직경) 플러그 carboxymethyl 셀 루 로스 (CMC) 매체 (15 g carboxymethyl 셀 루 로스, 효 모 추출 물, 0.5 g MgSO4.7 H2O, 1 g NH 1g의 50 mL에 4 아니3, 고 1 g KH2포4) 180 rpm 회전 통에 28 º C에서 4-7 일에 대 한 문화.
3. 준비의 Conidial 서 스 펜 션
- F. graminearum conidial 서 스 펜 션
- 소용돌이 F. graminearum 액체 문화 및 수집 conidia 2 mL microcentrifuge 관으로 여과 재료 (예: Miracloth)의 2 개의 층을 통해 1.5 mL 곰 팡이 문화를 필터링 하 여. 2 분 동안 microcentrifuge에 g 속도 x 13,226에서 conidial 정지 원심
- 상쾌한, 삭제 하 고 펠 릿을 세척 살 균 물의 1 mL를 추가 합니다.
- 원심 2 분 삭제에 대 한 microcentrifuge에 g 속도 x 13,226에서 conidial 정지는 상쾌한 고 2 X SFM (합성 균 미디어)23의 1 mL에 펠 릿을 resuspend.
- Conidia는 가벼운 현미경 hemocytometer를 사용 하 여 계산 합니다.
- 2 X SFM 함께 105 conidia/ml conidial 서 스 펜 션을 조정 합니다.
- N. crassa conidial 서 스 펜 션
- 적은 양의 성장 문화 (5 일 이전) N. crassa 보 글의 액체 매체의 2 개 mL를 포함 하는 microcentrifuge 관을 접종 루프를 사용 하 여 전송 합니다.
- 소용돌이 conidial 정지 하 고 새로운 microcentrifuge 관으로 여과 소재를 통해 필터.
- 원심 2 분 삭제에 대 한 microcentrifuge에서 최대 속도로 conidial 정지는 상쾌한 고 보 글의 액체 매체의 1 mL에 conidial 펠 릿 resuspend.
- Conidia는 가벼운 현미경 hemocytometer를 사용 하 여 계산 합니다.
- 보 글의 액체 매체와 105 conidia/ml conidial 서 스 펜 션을 조정 합니다.
4. 샘플 준비와 Confocal 현미경 검사 법
- MtDef4 곰 팡이 세포로 defensin의 subcellular 지 방화
- 각 conidial 서 스 펜 션 (105 conidia/mL)의 50 µ L 35 m m 유리 하단 microwell 요리 10 m m microwell에 플라스틱. Conidia의 관찰, 직접 다음 단계로 또는 germlings 준비, N. crassa F. graminearum 의 피 펫 50 µ L 35mm 문화 요리에 conidia 진행이 고 실 온에서 3-6 h에 대 한 발 아 하 게.
- 각 microwell 접시를 마이크에 붙일 레이블 defensin의 50 µ L을 추가 하 고 2.5 h에 대 한 품 어. 마이크는 fluorophore 표시 defensins 여기 사용 (1.3 단계)의 N. crassa 및 F. graminearum 3 µ M 이며 N. crassa 및 F. graminearum TMR-MtDef4의 마이크는 1 µ M 및 12 µ M, 각각.
- 막 선택의 2 µ L 염색 FM4-64를 추가 (최종 농도: 5 µ M) 문화에 요리 하 고 30 분 동안 품 어 이미징 confocal 현미경에 즉시 탑재.
- 화이트 빛 레이저 (WLL)을 선택 합니다. 두 개의 레이저 소스 488 nm을 사용 하 여 550 nm 각각 TMR MtDef4 그리고 FM4-64 염료를 흥분 시키기 위해. 580-700 nm에서 TMR MtDef4의 형광을 검출 하 고 690-800 nm FM4-64 염료 검출.
참고: 어두운 방에 있는 confocal 현미경 검사 법을 수행 합니다.
- MtDef5 defensin의 국제화의 시간 경과 영상
- N. crassa F. graminearum conidial 정지 (105 conidia/mL)의 50 µ L 35 m m 유리 하단 microwell 요리 10 m m microwell로 플라스틱. 10 m m microwell 코팅 이며 하단에 제 1.5 커버 유리를 있다. Conidia의 관찰에 대 한 직접 다음 단계로 진행 합니다. Germlings의 관찰, 현미경 검사 법으로 진행 하기 전에 실 온에서 3-6 h conidia를 품 어.
- WLL을 켭니다. 550 레이저 라인 선택 fluorophore 표시 defensins 여기 사용 (1.3 단계) 그리고 FM4-64 1.00% 강도의 자극을 활성화 하 고 해당 감지기 nm. fluorophore 표시 defensins 여기 사용 (1.3 단계) 560-600 nm에서 검색 되었습니다 그리고 FM4-64dye 690-800 nm에서 검색 되었습니다.
참고: 높은 레이저 강도 라이브 곰 팡이 세포에 손상을 일으킬 수 있습니다 라이브 셀 이미징에 대 한 낮은 레이저 강도 사용 합니다. - 현미경에 microwell 접시를 탑재 합니다. 100 x로 전환 후 처음 10 x 목표를 사용 하 여 셀 찾기 / 1.44 높은 확대에 대 한 석유 목표.
참고: 스캔 모드를 설정 합니다 xyzt (Z-스택 및 시간 경과 모드의 조합), Z 위치, 줌, 이미지 캡처, 등의 주파수.
참고: 추가 defensin 고 fluorophore 현미경에 장착 microwell 요리 관심 영역 defocus 수 있습니다 후. 따라서, 추가 defensin fluorophore는 microwell를, 후 관심 영역 필요가 refocused 수 이미지 수집 시간이 지연 될 수 있습니다.
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Representative Results
라이브 셀 이미징 추적 하 고 국제화 및 두 defensins, MtDef4 및 MtDef5, 개자리속 truncatula;에서 subcellular 지 방화 비교 실시 되었다 버섯 모양 세포. TMR MtDef4 MtDef5 Dylight550으로 표시 했습니다 동안 합성 화학적으로 되었다 (Dylight550-MtDef5). Conidia 막 선택적 염료 FM4-64와 함께에서 어느 defensin 함께 알을 품을 했다. 그림 1 TMR MtDef4가 다른 밀매 경로 N. crassa F. graminearum에 비해 보여줍니다. N. crassa, FM4-64는 defensin와 공동 지역화 하지 않습니다 하지만 오히려 얼룩는 defensin 압수 하는 그들의 세포 막. F. graminearum, 다른 한편으로, TMR-MtDef4 어떤 특정 막 바인딩된 세포 내에서 지역화 되지 하지만 (그림 1) 세포질에서 확산.
N. crassa 셀 fluorophore 표시 defensins 여기 사용 (1.3 단계) 및 FM4-64 쇼는 defensin 치료 (그림 2)의 30 ~ 40 분 이내 곰 팡이 세포를 입력할 수는 표시의 시간 경과 이미지입니다. 셀에는 항목, 시는 fluorophore 표시 defensins 여기 사용 (1.3 단계) 어떤 특정 세포 기관이 내를 지역화 하지 않습니다 하지만 쉽게 세포질으로 확산. 이것은 TMR-MtDef4 N. crassa 세포를 입력 하 고 기공을 몸 안에 갇혀 3hrs 치료 (그림 1)의 후에 남아 있는 대조적 이다.
그림 1: N. crassa 에 MtDef4는 다른 성매매 경로 및 F. graminearum. TMR-MtDef4 N. crassa (A)에 기공을 시체로 localizes 하지만 F. graminearum (B)의 세포질으로 확산. N. crassa 및 F. graminearum conidia 1 µ M와 12 µ M 공동 분류 했다 TMR-MtDef4 (빨강), 각각, 그리고 FM4-64 (녹색). 이미지 처리의 3 h 후 찍은 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: MtDef5 N. crassa 에 의해 내 면화 하 고 셀 내부 확산. DyLight550-MtDef5 N. crassa 세포로 내 면 및 세포질에 확산 한다. DyLight550-MtDef5 (빨강) 및 FM4-64 (녹색) N. crassa 셀 했다 공동 3 µ M으로 표시 됩니다. 비디오 2 h 30 분 기록 했다. MtDef5의 추가 및 이미지 수집 시작 사이 지연 했다 5 분 규모 바 = 4 µ m. 하시기 바랍니다 여기를 클릭 하십시오가이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)
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Discussion
이 연구에 붙일 레이블된 항진균 defensins 사용 하 여 신뢰할 수 있는 라이브 셀 이미징 방법론 곰 팡이 세포에 이러한 펩 티이 드의 국제화의 속도 론을 공부 하 고 그들의 subcellular 목표를 결정 하는 설명 했다. 이 방법은 일시적으로 그리고 공간 defensins와 곰 팡이 세포 사이 상호 작용의 역동성을 시각화 하는 강력한 도구입니다.
다양 한 방법은 국제화 식물 defensins 곰 팡이 세포에서의 세포내 지역화를 공부 하 고 사용 되었습니다. 이러한 방법에서 defensin 취급 세포는 일반적으로 고정 하 고 immunolocalization, 전자 현미경, 또는 x 선 단층 촬영15,,2425에 대 한 처리. 또한, 이러한 기술의 대부분 특정 시간에 보다 실시간으로 같은 살아있는 세포의 시간 경과 영상 모니터를 사용 하는 동적 변화 defensin 도전 하 응답 세포 이미징 제한 되었습니다. 시각화, 분석 및 비교 defensins의 항진균 작업 하는 동안 실시간으로 곰 팡이 세포에서 일어나는 동적 이벤트의 수는이 기술을 효과적이 고 흥미로운. 또한, 그것은 펩 티 드의 동적 세포내 지역화 시간 개별 곰 팡이 세포의 morphogenesis에 미치는 영향의 더 나은 이해를 제공 합니다.
이 방법의 중요 한 측면 중 하나는 중요 한 형광 염료 (예: FM4-64; 함께 붙일 레이블된 펩 티 드를 사용 하 여 subcellular 대상 결정 SG)입니다. Subcellular 지 방화에 있는 펩 티 드 운영, 그리고 그것의 상호 작용 협동자, 기능 및 세포 기계26,27에서 잠재적인 역할 elucidating 향해 중요 한 단계를 나타냅니다 환경을 결정 합니다.
이 기술은 작은 한계 형광 펩타이드 종종 레이블이 펩 티 드에 비해 감소 항진균 활동 전시입니다. 펩 티 드 상용 펩 티 드 라벨 키트를 사용 하 여 표시 됩니다 나타나고 항진균 성 활동의 완전 한 손실, 화학적 합성된 펩 티 드 작은 fluorophore에서 그것의 N-또는 C-말단 이라고 것이 좋습니다.
요약, 라이브 셀에서 이미징 defensin fluorophore 태그와 함께 도전 하는 곰 팡이 세포의 항진균 defensin의 MOA의 직접, 높은 spatio 시간적 해상도 제공할 수 있는 효과적인 도구입니다. 더 정확한 MOA 연구를 위해이 기술은 결합 될 수 있다 형광 일생 현미경 이미징 펩 티 드 또는 다른 레이블이 분자 나 휴대 다른 펩 티 드와의 상호 작용 활동을 측정 하는 것을 허용할 것 이다 (FLIM)28 실시간으로의 성분 이 항균 성 펩 티 드 작동 함으로써 농업과 의학에 사용 하기 위해 항진균 성 대리인으로 그들의 개발을 가속화 하는 방법에 대 한 우리의 이해를 풍부 하 게 됩니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리 박사 R. 하 워드 베 르 그, 도널드 댄 포트 식물 과학 센터, 그의 지도에 통합 현미경 시설의 감독 감사 하 고 도움이 confocal 현미경 검사 법. 저자는 선언에 충돌의 관심 있다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FM4-64 Dye | Life Technologies | T13320 | |
| DyLight 550 Antibody Labeling Kit | Thermo Scientific | 84530 | |
| Glass Bottom Microwell Dishes | Mat TeK | P35G-1.5-10-C | |
| Mira cloth | EMD Millipore Corp | 475855-1R | |
| SP8-X confocal microscope | Leica | ||
| ImageJ software | FiJi | For Image analysis | |
| Imaris software | Bitplane | For Image analysis |
References
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