Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kvantitative lokalisering af Golgi Protein af Imaging dens centrum af fluorescens masse

Published: August 10, 2017 doi: 10.3791/55996
Automatic Translation
1, 1, 1, 2,3, 1
1School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, 2Bioinformatics Institute, 3School of Computing, National University of Singapore

Summary

Den præcise lokalisering af Golgi beboere er afgørende for forståelsen af Golgi cellulære funktioner. Men konventionelle Optisk mikroskopi er afskåret fra løse sub-Golgi strukturen. Her beskriver vi protokol for en konventionel mikroskopi baseret super-resolution metode til at bestemme kvantitativt sub-Golgi lokalisering af et protein.

Abstract

Golgi kompleks består af seriefremstillede stablet membran cisternae, som kan yderligere inddeles i sub-Golgi regioner, herunder SNG-Golgi, medial-Golgi, trans-Golgi og trans-Golgi netværk. Cellulære funktioner af Golgi bestemmes af den karakteristiske distribution af sin bopæl proteiner. Konventionelle lysmikroskopi rumlige opløsning er for lav til at løse sub-Golgi struktur eller cisternae. Immuno-guld elektronmikroskopi er således en metode til at lokalisere et protein på sub-Golgi plan. Teknik og instrument er dog ud over evne af de fleste celle biologi labs. Her beskriver vi vores nyligt udviklede super-resolution metode kaldet Golgi protein lokalisering af imaging Centre of mass (lys) til systematisk og kvantitativt lokalisere en Golgi protein. LYS er baseret på standard fluorescens mærkning protokoller og konventionelle wide-felt eller Konfokal mikroskoper. Det drejer sig om kalibrering af kromatisk-Skift aberration af mikroskopiske systemet, image erhvervelse og efter købet analyse. Sub-Golgi lokaliseringen af en test protein udtrykkes kvantitativt lokalisering kvotienten. Der er fire vigtigste fordele ved lys; Det er hurtig, baseret på konventionelle metoder og værktøjer, lokalisering resultatet er kvantitative, og det frembyder ~ 30 nm praktiske opløsningen langs Golgi-aksen. Her beskriver vi de detaljerede protokollen af lys til at lokalisere en test Golgi protein.

Introduction

Golgi kompleks spiller væsentlige roller i sekretoriske/endocytic handel med proteiner og lipider (herefter laster) i pattedyrceller1,2,3. I Golgi, er laster ikke kun sorteret til forskellige subcellulære rum men også ændret ved forskellige typer af glykosylering. Den pattedyr Golgi kompleks omfatter talrige sideværts tilsluttede Golgi stakke, som typisk består af 4-11 stramt tilstødende og flad membran sække kaldet cisternae. De seriefremstillede stablet Golgi cisternae yderligere kategoriseres, fra den ene ende til den anden, som cis, mediale og trans-cisternae. På trans-side af en Golgi stak, trans-de fleste membran sac udvikler sig til en rørformet og reticulum membran netværk kaldet trans-Golgi netværk (TGN)4. I den sekretoriske pathway, laster stammer fra det endoplasmatiske reticulum (ER) Angiv en Golgi stak på sin cis-side og derefter sekventielt passere gennem mediale og trans-cisternae. Laster til sidst afslutte Golgi på trans-Golgi eller TGN destining plasma membran, endosomes eller sekretorisk granulat.

De molekylære og cellulære mekanismer af hvordan laster transit en Golgi stak og hvordan Golgi fastholder sin cisternal organisation forblive mystiske og er i øjeblikket stadig under en ophedet debat1. En af vanskelighederne på dette område er at Golgi cisternae kun kan løses under elektronmikroskopi (EM) siden opløsningen af et optisk mikroskop (~ 200 nm) er utilstrækkelige til at løse individuelle Golgi cisternae (< 100 nm i begge cisternal tykkelse og afstand). Sub-Golgi lokaliseringen af hjemmehørende proteiner og transit laster bestemmes derfor konventionelt immuno-guld EM. Men immuno-guld EM meget teknisk krævende og det er ud over evne af de fleste celle biologi labs. Selv om løsningen af EM kan være sub nanometer, opløsningen af den immuno-guld EM er stærkt hæmmet af antistof kompleks størrelse (primære plus den sekundær antistof) og guld partiklen, og det kan være værre end 20 nm. Derudover fås EM billeder fra 2D tynd-sektioner i stedet for en 3D globale visning af Golgi, hvilket kan føre til fejlagtige konklusioner alt efter den relative placering og orientering af 2D sektion5. For eksempel kan at studere en EM single-sektion ikke pålideligt differentiere en vesikel ud fra de retvinklede en tubulus, da begge kan vise identiske runde membran profiler. De nylige fremkomsten af super-resolution mikroskopi-teknikker, såsom 3D-strukturerede belysning mikroskopi (3D-SIM), stimuleret emission udtynding (STED), photoactivated lokalisering mikroskopi (PALM) og stokastiske optisk genopbygning mikroskopi ( STORM), gør det muligt at løse sub-Golgi strukturer under lys mikroskoper6. Men der er mindst fire ulemper, der kan i betydelig grad begrænse deres anvendelser i celle biologisk undersøgelse af Golgi. 1) aktuelle super-resolution teknikker kræver dyre og særlige hardwarekonfiguration, som er ud over de fleste celle biologi labs. 2) særlig fluorescens mærkning protokoller er behov for nogle super-opløsning teknikker. 3) selv om den bedste betingelse, hævder disse teknikker 20-110 nm i rumlige opløsning, kan den praktiske opløsning fremstillet i ægte prøver være meget værre. 4) i forhold til konventionelle mikroskopi, disse super-resolution teknikker stadig har vanskeligheder med at gennemføre multicolor, 3D eller live celle imaging, enten enkeltvis eller i kombination. Nok vigtigst, giver både immuno-guld EM og super-resolution mikroskopi-teknikker kvalitative i stedet for kvantitative lokalisering data.

Forsøger at delvist løse ovennævnte problemer, har vi for nylig udviklet en konventionel lysmikroskopi baseret metode, som er opkaldt Golgi protein lokalisering af imaging Centre of mass (lys), til systematisk og kvantitativt lokalisere en Golgi protein med en opløsning svarende til immuno-guld EM7. I denne metode, er Golgi i kulturperler pattedyrceller spredt som Golgi mini-stakke af behandling af nocodazole, en mikrotubulus depolymerizing stof. Omfattende undersøgelser har vist, at nocodazole-induceret Golgi mini-stakke (herefter Golgi mini-stakke) ligner indfødte Golgi stakke i både organisation og cellulære funktioner8,9,10, 11. Lokalisering kvotienten (LQ) af en test protein kan erhverves gennem lys og det betegner den kvantitative sub-Golgi lokalisering. Numeriske værdier for LQs kan sammenlignes og en LQ database med mere end 25 Golgi markører har været til rådighed.

Golgi mini-stakke er i lys, triple-mærket af endogene eller eksogent udtrykt GM130, GalT-mCherry og test protein (x). GM130 og GalT-mCherry, cis- og trans-Golgi markører henholdsvis12,13, levere referencepunkter. Den tredobbelte fluorescens, rød (R), grøn (G) og far-red (B), kunstigt vises som røde, grønne og blå, henholdsvis. Midten af fluorescens masse (herefter center) er vedtaget for at opnå sub-pixel opløsning. Golgi akse defineres som vektor fra center GM130 som GalT-mCherry. Golgi mini stack er modelleret som en cylindrisk struktur med uendelig rotational symmetri omkring Golgi akse. Derfor kan en Golgi mini stack yderligere modelleret som en endimensional struktur langs Golgi akse. LQ test protein x defineres som dxd1, hvor dx er afstanden fra midten af x som GM130, mens d1 er afstanden fra centrum af GalT-mCherry end GM130. Hvis midten af x er off-axis, bruges sin fremskrivning aksial afstand til beregning. Variabler, herunder Golgi akse, aksial vinkel, dx, d1, vinklen α og β, vinkel, for lys er skematisk illustreret i figur 1. LQ er uafhængig af Golgi aksial vinkel, selvom Golgi mini-stakke orientere tilfældigt i en celle.

Golgi mini-stakke vises inhomogene i billeder. Vi udviklet tre kriterier for at vælge analyzable Golgi mini-stakke for lys. 1) den signal-støj-forholdet kriterium, hvor forholdet mellem den samlede intensiteten af en Golgi mini stack til standardafvigelse (SD) i baggrunden er ≥ 30 i hver kanal. Dette kriterium er at sikre den positionering nøjagtighed af center of mass, som afhænger af signal-støj-forhold af Golgi mini-stakke. 2) den aksiale vinkel eller afstand kriterium, som kræver d1≥ 70 nm. d1 aftager med forhøjelsen af Golgi aksial vinkel. Når den aksiale vinkel nærmer sig 90° eller lodret, mini stakken bliver ikke-opløselige d1 nærmer sig 0. d1≥ 70 nm kan effektivt udelukke nær lodret Golgi mini-stakke. 3) co-linearitet kriteriet, hvor enten | tan α | eller | tan β | er ≤ 0,3. Dette kriterium sikrer, at de tre centre for en mini stack er tilstrækkeligt co-lineær for vores endimensional model af Golgi mini stack. Alle lys mikroskoper lider af kromatisk aberration, der kan alvorligt fordreje de relative position af rød, grøn og far-red fluorescens Centre. Kromatisk aberration af mikroskop systemer er eksperimentelt kalibreret af imaging 110 nm perler, som triple-mærket af rød, grøn og far-red fluorescens. For hver perle billede, midten af rød er defineret som den sande holdning af perle og kromatisk-skift af grønne og far-red Centre er monteret af første-ordens polynomiel funktioner. Centre af Golgi mini-stakke er udsat for de polynomiel funktioner til at korrigere de kromatiske forskydninger i grønne og far-red kanaler.

Gennem lys kan vi opnå en opløsning af ~ 30 nm langs Golgi akse under standardbetingelser. Vigtigere, giver det en systematisk metode til kvantitativt kort enhver Golgi protein. LYS kan udføres af konventionelle mikroskoper, såsom wide-felt eller Konfokal mikroskoper, ved hjælp af fælles fluorescens mærkning protokoller. Billedbehandling og databehandling kan tage så kort som en time. Gennem lys, har vi direkte demonstreret den progressive overgang af sekretoriske lasten fra cis- til trans-side af Golgi7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: Nedenfor er en trin for trin protokol af lys til bestemmelse af LQ af EGFP-mærket tyrosylprotein sulfotransferase 1 (TPST1), en Golgi bosiddende enzym, i HeLa celler.

1. forberedelse af fluorescens-mærket Golgi Mini-stakke

  1. Forbered glas coverslips
    1. Alikvot 0,3 mL sterilt Dulbecco ændret Eagle's Medium (DMEM) til et godt af en 24-godt plade i vævskultur hætte.
    2. Tørre et stykke af Φ 12 mm No.1.5 glas coverslip ved hjælp af bløde silkepapir dabbed med 70% ethanol til at fjerne snavs på overfladen af glas coverslip. Bruge et par skarpe pincet til kort lægges i blød i coverslip i 70% ethanol, overføre det ind i den 24-godt plade og synker det til bunden af den godt indeholdende sterile DMEM.
      Bemærk: Glas coverslips er konventionelt steriliseret ved flambering. Dog knække coverslips under sådan behandling nemt under efterfølgende håndtering. 70% ethanol iblødsætning er effektiv til sterilisation glas coverslips uden at beskadige dem.
    3. Med låg er omfattet, forlade den 24-godt plade i 37 ° C CO2 inkubator indtil brug.
  2. Frø celler
    1. Kultur HeLa celler (herefter celler) i en T-25 kolben i DMEM suppleret med 10% føtal bovin Serum (FBS) (herefter komplet medium) i et 37 ° C CO2 inkubator leveres med 5% CO2. Antibiotika er ikke nødvendige her.
    2. Når cellerne kommer ~ 80% confluency, Aspirér næringssubstratet. Der tilsættes 1 mL 0,25% Trypsin-EDTA i kolben og der inkuberes celler i et 37 ° C CO2 inkubator for 2 min. Tilføj 1 mL komplet medium i kolben og forsigtigt flush celler ud af kolben væggen når der afpipetteres.
    3. Overføre fritliggende celler til en steril centrifugering rør og spin på 500 x g i 2 min. at sammenpresse cellerne. Opsug supernatanten og suspendere celle pellet i 1 mL komplet medium.
    4. Opsug medium i godt af 24-godt plade der indeholder steriliseret glas coverslip og frø ~ 1 x 105 celler i brønden. Top op af brønden med komplet medium til 0,5 mL. Inkuber i et 37 ° C CO2 inkubator leveres med 5% CO2. Kultur celler til ~ 80% confluency.
  3. Transfect celler
    Bemærk: Well-spread celler er fordelagtige for imaging spredte Golgi mini-stakke.
    1. Transfect ~ 80% sammenflydende celler med 80 ng GalT-mCherry7 og 320 ng TPST1-EGFP (Se Tabel af materialer) DNA plasmider ved hjælp af en Transfektion reagens ifølge protokollen fra producenten. Inkuber i et 37 ° C CO2 inkubator. Ændre medium efter 4-6 h inkubation. Cellerne er klar ~ 12 timer senere.
  4. Nocodazole behandling til at generere Golgi mini-stakke
    1. Forberede en nocodazole stamopløsning (33 mM) ved at opløse 10 mg nocodazole pulver i 1 mL dimethylsulfoxid. Alikvot stamopløsningen og opbevares ved-20 ° C til langtidsopbevaring.
    2. Fortyndes 1 µL af nocodazole stamopløsning (33 mM) i 1 mL 37 ° C komplet medium (slutkoncentration 33 µM). Der centrifugeres ved topfart at fjerne partikler.
    3. Aspirér medium i brønden, og der tilsættes 0,5 mL af 33 µM nocodazole indeholdende komplet medium. Inkuber celler i et 37 ° C CO2 inkubator for 3 h. Fortsæt til immunofluorescens mærkning (afsnit 1.5).
  5. Immunfluorescens mærkning
    Bemærk: Hold celler i mørke til at undgå photobleaching GalT-mCherry og TPST1-EGFP.
    1. Forberede reagenser til immunofluorescens mærkning
      1. For at forberede 4% PARAFORMALDEHYD opløsning, opløse 4% (w/v) PARAFORMALDEHYD pulver i hot 1 X fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og opløsningen filtreres gennem 0,45 µm filter. Opløsningen kan opbevares ved-20 ° C.
        Forsigtig: PARAFORMALDEHYD er giftige og kræftfremkaldende, og det kan forårsage hudirritation. Bære en passende personlige værnemidler (PPE).
      2. For at forberede fluorescens fortynding buffer (FDB), mix 5% (v/v) FBS, og 2% (w/v) bovint serumalbumin (BSA) i 1 x PBS. Opløsningen filtreres gennem 0,45 µm filter og gemme løsningen på-20 ° C.
      3. Opløse 5,35 g NH4Cl pulver i 1 L vand til at forberede 100 mM NH4Cl og gemme løsning ved stuetemperatur.
      4. Opløse 10% (w/v) saponin pulver i vand for at forberede 10% saponin, alikvot og gemme løsningen på-20 ° C.
    2. Fiksering
      1. Skyl den godt en gang med 0,5 mL 1 x PBS løsning og tilsæt 0,5 mL 4% PARAFORMALDEHYD løsning. Ruger i 20 min. ved stuetemperatur. Skyl godt to gange med 0,5 mL 1 x PBS og to gange med 0,5 mL 100 mM NH4Cl. Skyl godt to gange med 0,5 mL 1 x PBS. Celler kan holdes i 1 x PBS ved 4 ° C natten over i mørke.
    3. Fluorescens mærkning
      1. Fortyndes 1 µL musen anti-GM130 primære antistof i 500 µL FDB indeholdende 0,1% saponin. Vende låget af 24-godt plade og Anvend 10 µL primære antistof blandingen på låget.
      2. Brug et par skarpe pincet til at udpakke og overføre glas coverslip på dråbe antistof blanding sikring, celle side er i kontakt med blandingen. Inkuber celler med primær antistof blandingen i 1 time ved stuetemperatur.
        Bemærk: Låg med coverslip kan placeres i en fugtig plasticpose i mørke.
      3. Brug et par skarpe pincet til at udpakke og overføre coverslip at nå med den celle side op og skyl det i 0,5 mL 1 x PBS for tre gange i ≥ 30 min. ryster er unødvendige.
      4. Fortyndes 1 µL far-red fluorophore konjugeret gede anti-mus IgG (sekundær antistof) i 500 µL FDB indeholdende 0,1% saponin.
      5. Vask og rengør omvendt overfladen af låg af 24-godt plade. Anvend 10 µL far-red sekundær antistof blandingen på låget. Gentag trin 1.5.3.2 - 1.5.3.3.
    4. Montering
      1. Forberede montering medium ved at blande 1 g glycerol, 2,2 g poly(vinylalkohol) (MW ~ 31.000 Da), 1,2 mL 1 M Tris (pH 8) og 8.8 mL H2O. opløses blandingen i en 60 ° C vandbad med lejlighedsvis vortexing. Gemme løsningen på-20 ° C.
      2. Tø montering medium og overføre 10 µL til et glas dias. Overlejre coverslip (celle side ned) på dråbe af montering medium. Inkuber glas dias ved 37 ° C i 30 min eller stuetemperatur i 1 time til at hærde montering medium. Forsegl coverslip med farveløs-neglelak og gemme glas dias ved-20 ° C.

2. forberedelse af fluorescerende perler for kromatisk-Skift korrektion

  1. Coverslip rengøring
    1. Omhyggeligt placere et stykke af 25 mm No.1.5 glas coverslip på en plastik rack.
    2. Overførsel rack med coverslip til et 400 mL bægerglas fyldt med 300 mL 1 M NaOH og Læg instrumenterne i ultralydsbad i et badekar sonikator (35 watt) i 15 min. kort skyl rack i et 400 mL bægerglas fyldt med 300 mL deioniseret vand. Overføre rack til et 400 mL bægerglas fyldt med 300 mL 99% ethanol og Læg instrumenterne i ultralydsbad i Bad sonikator i 15 min. kort skyl rack i et 400 mL bægerglas fyldt med 300 mL deioniseret vand.
    3. Gentag trin 2.1.2 to gange mere.
    4. Skyl rack med coverslip i 300 mL deioniseret vand i et 400 mL bægerglas for 10 min. Gentag trinnet to gange mere. Overføre rack til en 60 ° C-ovn og tørre coverslip for 1 h. butik den tørrede coverslip i et støvfrit petriskål.
  2. Immobilisering af fluorescerende perler på glas coverslip
    1. Fortyndet 110 nm flerfarvet fluorescerende perler 80-fold i 1 x PBS indeholdende 0,1 µg/µL BSA. Kort vortex tube at sprede perle aggregater. Sprede 60 µL fortyndet perler på renset Φ 25 mm No.1.5 glas coverslip (Se afsnit 2.1) ved hjælp af en pipette tip. Tørre coverslip i en ekssikkator tilsluttet en vakuumpumpe i mørke og montere coverslip til et glas dias i 50 µL montering medium (Se trin 1.5.4.2).

3. billede erhvervelse

Bemærk: Lys kræver billeder af højt signal / støj-forhold (SNR) for høj præcision center of mass beregning. Billedet kan erhverves af konventionelle mikroskoper såsom laser scanning Konfokal, spinning disk wide-feltet eller Konfokal mikroskop. En wide-felt mikroskop udstyret med plan-apokromatiske mål objektiver og en lav støj billedsensor, såsom en afgift - sammen enhed (CCD) og videnskabelige komplementær metal-oxide semiconductor (sCMOS) kan bruges. Parametre for billedsensoren er justeret for at sikre en lav læse-støj og højt dynamikområde. Mikroskopet skal være udstyret med den optimale konfiguration af fluorescens filtre til grøn, mCherry og far-red fluorophore, og det skal have ubetydelig fluorescens cross-talk. Ideelt, den billedbehandlingssystem opnår en Nyquist samplingfrekvens i x, y og z-aksen, som typisk kræver x, y og z størrelse af en voxel til at være mindre end 100, 100 og 200 nm, henholdsvis. X og y størrelsen af voxel er altid lig og betegnes som pixel_size. Pixel_size kan beregnes ved at dividere kamera sensor størrelsen af systemet forstørrelse.

  1. Billede multi-farver perler
    1. Billede multi-farver perler i grøn, rød og far-red kanaler i begyndelsen og slutningen af hver tænkelig session.
      Bemærk: Her, billeder blev erhvervet gennem en konventionel wide-felt epi-fluorescens mikroskop (inverteret) udstyret med 100 X NA 1.4 plan-apokromatiske mål, motoriserede stadium, 200 Watt metal-Halogenid lyskilde og 16-bit sCMOS kamera. Bølgelængder for excitation filter (band pass), dichroic spejl (lang pass) og emission filter (band pass) af den grønne kanal filter kube er 465-495, 505 og 515-555 nm; for den røde kanal filter kube er 528-553, 565 og 578-633 nm; og for far-red kanal filter kuben er 590-650, 660 og 663-738 nm. I løbet af erhvervelse, størrelsen af en voxel langs x, er y og z akse 64, 64 og 200 nm, henholdsvis.
    2. Find en synsfelt med god perle tæthed.
    3. Erhverve 3D billedstakke i grøn, rød og far-red kanaler (kanalG, kanalRasmussen, channelB, henholdsvis). Tage 3 sektioner over og under de bedste brændplanet (7 dele pr. stak). Gemme de tre stakke som tre TIFF-filer.
      Bemærk: Eksponeringstid for hver kanal bestemmes empirisk at maksimere den dynamikområde, undgå pixel mætning og minimere photobleaching. Andre parametre, såsom filtre og x, y og z størrelse af voxel, er valgt som beskrevet ovenfor.
  2. Billedstakke Golgi mini-
    1. Brug TPST1-EGFP og GalT-mCherry transfekteret og fluorescently mærket (punkt 1.5) dias at finde celler, der udtrykkelig TPST1-EGFP og et lavt eller mellemstort GalT-mCherry. Erhverve 3D billedstakke, som beskrevet i trin 3.1.3.

4. billedanalyse

  1. Erhverve Centre af fluorescerende perler
    1. ImageJ, Åbn et sæt perle billeder bestående af tre TIFF-filer (File > Billede > Åbn).
    2. Gennemsnitlig 3 på hinanden følgende sektioner omkring den bedste fokuseret sektion i kanalRasmussen af billede > stakke > Z projekt. Input sektionsnummer "Start skive" og "Stop skive", og blandt indstillingerne af "projektion type", Vælg "Gennemsnitlige intensitet".
    3. Tegne regioner af interesse (ROIs), der indeholder ingen perler i den billed benytter "Polygon valg". I "Analyze > sæt målinger", tjek kun "Grå middelværdien" og "Standardafvigelse". Derefter køre "Analyze > foranstaltning" at få middelværdi og SD af ROI.
    4. Beregne baggrund intensiteten som "mean + 6 × SD". Subtraher billedet med de tilsvarende baggrund intensitetsværdierne af "processen > Matematik > Subtraher", inddata den baggrund intensitet værdi svarende til denne kanal.
    5. Gentag trin 4.1.2 og 4.1.4 for kanalG og kanalB billedstakke ved hjælp af den samme start og stop skive og den samme baggrund ROI. Bemærk, at Investeringsafkastet bruges i trin 4.1.3 kan kopieres til kanalG og kanalB billeder.
    6. Flette de tre baggrund-trukket billeder (billede > farve > Sammenflet kanaler) ved at vælge kanalRasmussen som rød, kanalG som grøn og kanalB som blå. En enkelt sammensat billede bestående af tre kanaler vil være opnået.
    7. Lancere ROI manager (analyser > værktøjer > ROI Manager). Tegne et kvadrat ROI omkring enkelt perler sikrer, at der er kun én perle inden for hver ROI. Tilføje ROI Investeringsafkast Manager ved at trykke på "t" på tastaturet. Gentag denne proces, og Tilføj så mange ROIs som muligt.
    8. I "Analyze > sæt målinger", tjek kun "Center of mass".
    9. Vælg kanalRasmussen, i ROI Manager, skal du klikke på "Måle" for at få Centre; to kolonner, svarende til x- og y-koordinaten af centre for ROIs vises i vinduet "Resultat". Kopier og indsæt de to kolonner i et regneark.
    10. Gentag trin 4.1.9 for kanalG ogB-kanal.
    11. Arrangere koordinater af centre i et enkelt regneark i følgende rækkefølge: xR, yR, xG, yG, xB, og yB. Gemme regnearket i ".csv" format som "beads.csv". Efterlad ingen mellemrum i filnavnet.
  2. Vælg og måle Golgi mini-stakke
    1. Installere to makroer (vedlagt i Supplerende materialer) i ImageJ, "Makro-Golgi ROI inspektion" og "Makro-Output 3 kanaler data" af Plugins > installeret ". Klart ROI manager og resultatet vindue.
    2. Åbne et sæt af Golgi mini stak billeder bestående af tre TIFF-filer (fil > Billede > Åbn).
    3. Gentag trin 4.1.2 - 4.1.5 og gemme de tre baggrund-trukket billeder til senere brug. Post baggrund SDs for kanalRasmussen, kanalG og kanalB som SDR, SDG og SDB, henholdsvis til senere brug.
    4. Kopiere de tre baggrund-trukket billeder genereret fra trin 4.2.3 (Ctrl + Shift + D).
    5. I "processen > billede regnemaskine", først tilføje baggrund-trækkes kanalG at kanaliseref billeder. Tilføje det resulterende billede til baggrunden-trækkes kanalB -billede. At det resulterende billede, i "Image > Adjust > tærskel", skal du vælge "Indstil" indtaste "1" som "Laveste grænse". Efter tryk på "Anvend", er en sort og hvid binært billede ført.
    6. I "Analyze > analysere partikler", input størrelsesområde for "størrelse (pixel ^ 2)". Input "50-infinity". Check "Omfatter ikke på kanterne" og "Tilføj til Manager". ROIs indeholdende Golgi mini-stakke er nu tilføjet til ROI manager.
      Bemærk: Størrelsesområde skal bestemmes empirisk at udelukke lyde, som generelt er små.
    7. Flette de tre baggrund-trukket billeder (billede > farve > Sammenflet kanaler) fra trin 4.2.3 ved at vælge kanalRasmussen som rød, kanalG som grøn og kanalB som blå. En enkelt sammensat billede bestående af tre kanaler er genereret.
    8. Kør makroen "Makro-Golgi ROI inspektion" ved at vælge "Plugins > makro-Golgi ROI inspektion". I dialogboksen interaktiv Inspicér visuelt hver ROI for at holde eller afvise den. Vælg ROIs, der indeholder et enkelt objekt i alle tre kanaler.
      Bemærk: Når du har kørt dette værktøj, afviste ROIs fjernes fra ROI manager.
    9. Kontroller kun "Område", "Grå middelværdien" og "Center of mass" "Analyze > sæt målinger". Erhverve data ved at lancere makro værktøj "Makro-Output 3 kanaler data" (Plugins > makro-Output 3 kanaler data).
      Bemærk: Områder, betyde Støtteintensiteter og Centre (x og y) af ROIs i kanalRasmussen, kanalG og kanalB vises i vinduet "Resultat".
    10. Kopi x og y koordinater centre i et regneark og arrangere dem i følgende rækkefølge: xR, yR, xG, yG, xB, og yB. Gemme regnearket som en ".csv" (ministacks.csv). Efterlad ingen mellemrum i filnavnet. Fortsæt til kromatisk-Skift korrektion af Centre (afsnit 4.3) og LQ beregning (afsnit 4.4).
  3. Kromatisk-Skift korrektion af Centre
    1. Installere Matlab Compiler Runtime (MCR).
    2. Installere følgende filer i en dedikeret arbejdsmappe: my_train.exe og my_test.exe. Kopier og Indsæt "beads.csv" og"ministacks.csv" filer i samme mappe.
    3. Lancere "Command Prompt" af Windows og gå til i orden omslag ved at taste den næste befale " cd path_of_working_folder".
    4. Generere en fil, kromatisk-Skift kalibrering ved hjælp af centre for perler. Skrive den næste befale "my_train.exe perler.csv kalibrering.mat 1". En fil med navnet"kalibrering.mat" er skabt i i orden omslag. Ignorere andre filer, der er genereret.
    5. Rette den kromatiske-skift af centre for Golgi mini-stakke ved at skrive følgende kommando "my_test.exe ministacks.csv corrected_ministacks.csv kalibrering.mat 1".
      Bemærk: En fil med navnet"corrected_ministacks.csv" er skabt i i orden omslag. Det indeholder kromatisk-Skift korrigeret koordinaterne for centre, som er arrangeret i rækkefølgen af xG, yG, xB og yB. Ignorere andre filer, der er oprettet. Notere, at den røde kanal er defineret som fri for kromatisk aberration og derfor xR og yR er de samme som rå data.
  4. Beregning af LQs
    1. Lancere data analyse software og kopiere og indsætte, i den nedenstående rækkefølge, mener grå værdier, områder, baggrund SDs fremstillet af trin 4.2.3 (placere dem på række 1) og kromatisk-Skift korrigeret x og y koordinater af Golgi mini-stakke i kanalRasmussen i en regneark som kolonnerne A til E. Ligeledes overføre tilsvarende data for kanalG og kanalB til kolonnerne F til J og K til O, henholdsvis.
    2. Tilføje otte nye kolonner P til W, opkaldt "integreret intensiteten af kanal Rasmussen", "integreret intensiteten af kanal G", "integreret intensiteten af kanal B", d1, dx, ABS(tan a), ABS (tan b) og LQ.
      1. Højreklik på toppen af den respektive kolonne og vælg "Sæt kolonneværdier" til at beregne værdier for hver kolonne. For kolonne P, input "Col(A)Col(B)"; for kolonne Q, input "Col(F)Col(G)"; for kolonne F, input "Col(K)Col(L)"; kolonne S, input "pixel_size*Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))" hvor "pixel_size" er størrelsen af pixel i nm; kolonne T, input "pixel_size*((Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2)/(2Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O)))"; kolonne U, input "Abs(Tan(Acos((Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2) / (2 Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))Distance(Col(D) , Col(E), Col(N), Col(O))) "; kolonne V, input "Abs(Tan(Acos((Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2) / (2 Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))Distance(Col(D) , Col(E), Col(N), Col(O))) "; kolonne W, input "Col (T) / Col (S)".
    3. Filtrer Golgi mini-stakke af de tre kriterier, der er beskrevet i Introduktion.
      1. I data analyse software, gå til "regneark > regneark forespørgsel" og vælg kolonne variabler for "If"-testen. Tildel følgende aliaser I1, I2, I3, d1, A og B for kolonner "integreret intensiteten af kanal Rasmussen", "integreret intensiteten af kanal G", "integreret intensiteten af kanal B", d1, ABS(tan a) og ABS (tan b), henholdsvis. I den "hvis betingelsen" boks, indtaste "I1 > =30*cell(1,3) og I2 > =30*cell(1,8) og I3 > =30*cell(1,13) og d1 > = 70 og (A < = 0,3 eller B < = 0,3)".
      2. Vælg "Udpak til nyt regneark", klik på "Anvend". Kolonner A-W af analyzable Golgi mini-stakke er udtrukket til et nyt regneark.
    4. I det nye regneark, Højreklik på toppen af kolonne W, Vælg "statistikker på kolonne > åben Dialog". Check "N alt", "Mener", "SE betyder", "Histogrammer". Den statistiske analyse af LQs vises derefter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den moderne forskning grade lysmikroskop udstyret med en plan apokromatiske linse, som den, der anvendes i vores laboratorium, viser minimal kromatisk aberration (fig. 2A). Men en omhyggelig undersøgelse af multi-farve fluorescerende perle billede kan afsløre skift af anden farvebilleder af den samme perle (figur 2B). Vi definerer at den røde kanal er fri for kromatisk aberration og derfor Centre af røde Fluorescens er de sande positioner af perler. De relative kromatisk forskydninger af grønne og far-red fluorescens kan være repræsenteret af grønne og blå vektorer med oprindelse fra midten af røde fluorescens (figur 2C). Den kromatiske Skift inden for billedbehandling-flyet er empirisk illustreret ved den grønne og blå vektor for hver perle (figur 2D). For vores mikroskop, kromatisk-Skift er ikke ensartet som både størrelser og retninger af forskydninger ændring ifølge x og y positioner. Den kromatiske-Skift kan betydeligt påvirke nøjagtigheden af lys, som skift af far-red Centre kan være så meget som 50 nm. Derfor skal kromatisk-Skift korrigeres. Når centre for perler er erhvervet, ansætter vi første-ordens polynomium montering til at kalibrere og efterfølgende rette kromatisk forskydninger af Centre. Kromatisk-Skift aberration er væsentligt forbedret med denne tilgang (figur 2 D-G).

I pattedyrceller er Golgi kompleks samlet på det perinuclear område, som normalt ikke er opløselige i en konventionel optisk mikroskop (fig. 3A). Efter nocodazole behandling for 3 timer, perinuclear Golgi kompleks forsvinder og snesevis af Golgi mini-stakke samle på endoplasmatiske reticulum exit steder over hele cytoplasma (fig. 3B). Store bidder af Golgi membran og aggregerede Golgi mini-stakke er til stede, og de er ikke udvalgt til analyse. Et eksempel billede illustrerer udvælgelse af Golgi mini-stakke er vist i figur 3C. Ved hjælp af værktøjet "Makro-Golgi ROI inspektion", 40 udvalgte Golgi mini-stakke er angivet i figur 3D. Efter anvendelse af de tre kriterier, 21 Golgi mini-stakke var analyzable og valgt for beregningen af LQs af TPST1-EGFP (figur 3D; mærket som "L"), med deres statistikker, vist i figur 3E. I alt 111 analyzable Golgi mini-stakke blev udvalgt fra 12 celler og LQ TPST1-EGFP blev målt til at være 0,76 0,04 (gennemsnit ± SEM; n = 111) (figur 3F). LQ TPST1-EGFP placerer det mellem giantin (LQ = 0,59) og EGFP-Rab6 (LQ = 1,04)7. Det er i nærheden af GS15 (LQ = 0,83) og ST6GalT1-AcGFP1 (LQ = 0,82). Vi har defineret sub-Golgi regionerne på grundlag af LQs ved at overveje kvalitative lokalisering data fra litteraturen: ERES/ERGIC, <-0.25; cis, 0,00 ± 0,25; mediale, 0,50 ± 0,25; Trans-Golgi, 1,00 ± 0,25 og TGN, 1,25-2,00. LQ TPST1-EGFP tyder derfor sin trans-Golgi lokalisering, som er i overensstemmelse med en tidligere undersøgelse14.

Figure 1
Figur 1 . Skematiske illustrationer viser variabler, som bruges i beregningen af lys. (A) xz visning af en Golgi mini stak, som har co-axial centers GM130, GalT-mCherry og protein x fluorescens viser Golgi akse, aksial vinkel, dx og d1. Billedet af Golgi mini stack er dens projektion på billedet flyet. (B) xy-visning af en Golgi mini stack med off-axis center af protein x viser vinklen α, vinklen β og projektion aksial afstand dx. A og B er tilpasset fra figur 1E og figur 1F i vores tidligere publikation7, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 . Korrektion af den kromatiske-shift. (A) den trefarvet flettede billede af 110 nm multi-farver perler erhvervet af en wide-felt mikroskop. Hver perle udsender grønne, røde, og far-red (kunstigt farvet blåt) fluorescens. Skala bar, 10 µm. (B) forstørret visning af en flettede single-perle billede med en mærkbar kromatisk-shift. Skalere bar, 200 nm. (C) en skematisk diagram viser, at forskydninger af grønne og far-red perle billeder kan være repræsenteret af vektorer fra midten af det røde perle billede (0,0) til Centre green (grøn vektor) og far-red (blå) perle vektorbilleder, henholdsvis. (D, E) Effekten af den kromatiske-Skift korrektion. Inden for det samme billede, grøn og blå vektorer afbildes før og efter skift korrektion. For at visualisere den lille Skift, er omfanget af hver vektor-forstærkede 200-fold. (F, G) Scatter observationsområder viser Centre green (grønne prikker) og far-red (blå prikker) perler før og efter skift korrektion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 . Et typisk eksempel på lys, her erhverve LQ af TPST1-EGFP. En HeLa celler udtrykker TPST1-EGFP (grøn) og GalT-mCherry (rød) blev farvet for endogene GM130 (blå). (A) A typiske celle. (B, C, D, E) En celle, der er behandlet med nocodazole var afbildet (B). Fra billedet, blev analyzable Golgi mini-stakke valgt som vist i C. Valgte Golgi mini-stakke er mærket af identifikationsnumre. Billeder af disse maskerede Golgi mini-stakke vises nedenfor i D med deres identifikationsnumre. "L" angiver, at Golgi mini stack er gyldig for beregningen af LQ (analyzable Golgi mini stakke). Histogram af LQs af 21 mini-stakke fra cellen er vist i E. (F) Histogram af LQs af 111 mini-stakke fra 12 celler. Værdien vises i histogrammet er gennemsnit ± SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende materialer: Makro-Golgi ROI inspection.ijm, makro-Output 3 kanaler data.ijm, Matlab koder, My_train.exe, My_test.exe og regneark template.opj.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tidligere, lokalisering af Golgi protein under den lysmikroskopi var hovedsagelig kvantificeres ved graden af korrelation eller overlapning af billedet af proteinet med billedet af en Golgi markør af kendte lokalisering15,16, 17. Den resulterende korrelation eller overlappende koefficient afspejler hvor tæt test proteinet til Golgi markør rumligt. Der er mindst tre forbehold for denne tilgang. Først korrelation eller overlappende koefficient er ikke-lineært, og det betyder ikke direkte fysisk afstand. Andet, graden af korrelation er kritisk afhængige af mikroskopiske-Systems opløsning. Derfor er koefficient mellem to Golgi proteiner ikke en system-uafhængig konstant. Tredje, to Golgi proteiner med samme aksiale lokalisering, men forskellige laterale distribution langs cisternae kan have særskilte koefficienter. Dermed angiver korrelation eller overlappende koefficienten ikke den aksiale lokalisering af en Golgi protein. I en alternativ metode foreslået af Dejgaard mfl., cis, trans-Golgi markører og protein af interesse er triple-mærket i nocodazole behandlet Golgi mini-stakke, svarende til lys. Inden for hver Golgi mini stack, holdninger i de tre maksimale intensitet pixel er erhvervet og den relative placering af test protein beregnes som en afstand forhold18. Deres metode er dog ude af stand til at opnå sub-pixel opløsning, som stærkt begrænser dets anvendelse. I forhold til tidligere kvantitative metoder, lys, der blev selvstændigt udviklet men bærer et lignende koncept som Dejgaard mfl., er i stand til at kvantificere den aksiale lokalisering af en Golgi protein med hidtil uset nøjagtighed og konsistens.

Vi præsenterede protokollen af lys til at erhverve LQ eksogent udtrykt normal god landbrugspraksis-mærkede protein - TPST1-EGFP. LQ endogene protein kan bestemmes, hvis dens antistof er tilgængelige. Afhængigt af arten af det primære antistof, mus eller kanin, så en kanin eller musen anti-GM130 antistof, henholdsvis, kan bruges i triple-mærkning-protokollen. Både kanin og musen anti-GM130 antistoffer for immunofluorescens mærkning er kommercielt tilgængelige. Vi har tidligere vist, at kanin og musen anti-GM130 antistoffer give de samme resultater i lys7. Hvis testen protein er uløseligt rød i fluorescens emission, såsom mCherry fusion, en normal god landbrugspraksis-tagged Golgi markør protein med kendte LQ i kombination med GM130 antistof mærkning kan bruges til triple-label celler og indirekte udlede LQ test protein. Antager markør protein LQ er LQm og afstanden fra centrum af markør protein til, af GM130 dm, LQ test protein x kan beregnes som (dxdm) × LQm. En af de største fordele ved lys i forhold til Super-resolution mikroskopi er, at det let kan anvendes til den levende celle imaging i konventionelle mikroskopiske opsætninger. Vi har prøvet en kombination af tre fluorescens proteiner, normal god landbrugspraksis-Golgin84, mCherry-GM130 og GalT-iRFP670, til dynamisk overvågning LQ af normal god landbrugspraksis-Golgin84 i enkelt Golgi mini-stakke7.

I lys er den mest tidskrævende trin efter købet analyse, især om udvælgelse af analyzable Golgi mini-stakke. Som Golgi mini-stakke er heterogene i størrelse og molekylære sammensætning19, det er uklart, om fordelingen af LQs (figur 3F) repræsenterer den heterogene arkitektur af Golgi mini-stakke eller usikkerhed for vores beregning af den LQ. Uanset årsagerne fandt vi, at det er vigtigt at have et stort antal analyzable Golgi mini-stakke (n) til at sikre nøjagtigheden af LQ, der er kompromitteret når n er små. Typisk giver data med n ≥ 100 fra flere celler pålidelige LQs. LYS giver derfor, ensemble-gennemsnit lokalisering data, tilsløre individualitet af Golgi mini-stakke. En anden begrænsning af lys er, at det forudsætter, at alle Golgi proteiner har en smal distribution omkring et enkelt center. Nogle Golgi proteiner, såsom COPI underenheder, ARF1 og opløselige N-ethylmaleimide-følsomme faktor vedhæftet fil protein receptor (snarer)20,21, er blevet rapporteret til at distribuere bredt fra cis til trans- Golgi og TGN. Det er formentlig upassende at studere deres Golgi lokalisering af LQ. Som lys i øjeblikket indebærer manuel udvælgelse af Golgi mini-stakke, der er både besværlig og subjektive, vil den fremtidige udvikling af lys være at gennemføre et software-værktøj for at vælge automatisk Golgi mini-stakke med minimal menneskelig indblanding.

Hvad er den rumlige opløsning af lys? Da LQ er et forhold, som er unitless, betyder det ikke en rumlig afstand. Her, forsøger vi at give et meget groft skøn. Den rumlige opløsning af lys kan defineres som den mindste aksial afstand mellem to opløselige Golgi proteiner. Undersøge LQs af forskellige Golgi proteiner7, fandt vi, at SEMs af datasæt med n ≥ 100 vifte omkring 0,03. Forudsat to Golgi proteiner har den samme n = 100 og SEM = 0,03, de to Golgi proteiner har signifikant forskellige lokalisering af t-test (p < 0,05), dvs, opløselige, hvis forskellen mellem deres LQs er ≥ 3 × SEM = 0,09. Fra EM-data, kan vi anslår, at den aksial længde af Golgi mini stack, som også er afstanden fra GM130 til GalT-mCherry i lys, er ~ 300 nm8. Dermed opløsning af lys er anslået til 0,09 × 300 = 30 nm langs Golgi akse. I lys giver en større n generelt mindre SEM, hvilket igen resulterer i højere opløsning.

Det er formentlig upassende at direkte sammenligne opløsning af lys til at af den immuno-guld EM, da de sidstnævnte teknik ikke direkte giver kvantitative lokalisering data. Svarende til lys, opløsningen af den immuno-guld EM langs Golgi-aksen kan defineres som den mindste afstand mellem to opløselige Golgi markører. For at måle dens opløsning kræver undersøgelse af dual-immuno-guld mærkning af to Golgi proteiner, der er tæt støder op til hinanden langs Golgi akse. Sådan systemisk undersøgelse er sandsynligvis ikke tilgængelig efter vores overbevisning. Som omtalt i indledningen er en af de begrænsende faktorer i den rumlige opløsning af den immuno-guld EM er den store størrelse af antistof kompleks, hvilket gør beslutningen om at være værre end ~ 20 nm. En anden vigtig begrænsende faktor af billedopløsningen er mærkning massefylden af antigen molekyler. Ifølge Nyquist prøveudtagning teori, skal der være mindst to guld partikler pr. opløsning enhed. I de fleste immuno-guld EM undersøgelser, afstande mellem nabo guld partikler ikke < 15 nm på grund af den meget lave mærkning effektivitet; Dette gør det vanskeligt for denne teknik til at opnå en opløsning er mindre end 30 nm. Fra dette synspunkt anslår vi, at løsningen af lys er mindst sammenligneligt med immuno-guld EM.

LYS er en robust metode, der giver særdeles ensartede resultater. Det er uafhængige af typen af mikroskop bruges. Vi har testet de hele-felt og spinning disk Konfokal mikroskoper gav de samme resultater. LQs af de samme Golgi proteiner erhvervet på forskellige batches af eksperimenter blev også i god aftale med hinanden. En LQ database består af en varieret vifte af Golgi bosiddende proteiner der er genereret for sammenligning og fortolkning. Vi forventer, at mere brug af lys i Fællesskabets forskning vil udvide databasen. Derfor, en mere komplet database kvantitativt beskriver lokaliseringen af et stort antal af Golgi proteiner høj grad vil hjælpe med at forstå organisation og funktion af Golgi kompleks.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke D. Stephens (University of Bristol, Bristol, Storbritannien) for TPST1-EGFP DNA plasmid, samt Lakshmi Gitte Steen for at hjælpe med softwareoptimering. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Medical Research Council (NMRC-CBRG-007/2012), Undervisningsministeriet (AcRF Tier1 RG 18/11, RG 48/13 og 15/RG132 og AcRF Tier2 MOE2015-T2-2-073) til ll

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fluorescence beads. Commercial name: TetraSpeck beads Invitrogen T7279 As multi-color beads to calibrate chromatic-shift of the microscope
Glass coverslip Φ 12 mm (No. 1.5) Menzel CB00120RAC
Glass coverslip Φ 25 mm (No. 1.5) Menzel
DMEM Capricon DMEM-HPA-P50
Trypsin-EDTA
FBS GE Hyclone SV30160.03
Nocodazole Merck 487928
transfection reagent. Commercial name: Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019
transfection medium. Commercial name: OptiMEM Invitrogen 31985070
TPST1-EGFP Addgene 66617 A gift from D. Stephens (University of Bristol, Bristol, United Kingdom)
GalT-mCherry Made in our lab
paraformaldehyde Merck 1.04005.1000
saponin Sigma-Aldrich 47036
poly(vinyl alcohol) (Mw ~31,000). Commercial name: Mowiol-488 CALBIOCHEM 475904
BSA Sigma-Aldrich A9647
Mouse anti-GM130 BD Biosciences 610823 Primary antibody for human GM130
far-red fluorescence conjugated goat anti-mouse IgG. Commercial name: Alexa Fluor 647 conjugated goat anti-mouse IgG Invitrogen A-21235 Far red fluorescence conjugated secondary antibody

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Glick, B. S., Luini, A. Models for Golgi traffic: a critical assessment. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), 005215 (2011).
  2. Klumperman, J. Architecture of the mammalian Golgi. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (7), (2011).
  3. Lu, L., Hong, W. From endosomes to the trans-Golgi network. Semin Cell Dev Biol. , (2014).
  4. De Matteis, M. A., Luini, A. Exiting the Golgi complex. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 273-284 (2008).
  5. Lu, L., Ladinsky, M. S., Kirchhausen, T. Cisternal organization of the endoplasmic reticulum during mitosis. Mol Biol Cell. 20 (15), 3471-3480 (2009).
  6. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J Cell Biol. 190 (2), 165-175 (2010).
  7. Tie, H. C., et al. A novel imaging method for quantitative Golgi localization reveals differential intra-Golgi trafficking of secretory cargoes. Mol Biol Cell. 27 (5), 848-861 (2016).
  8. Trucco, A., et al. Secretory traffic triggers the formation of tubular continuities across Golgi sub-compartments. Nat Cell Biol. 6 (11), 1071-1081 (2004).
  9. Cole, N. B., Sciaky, N., Marotta, A., Song, J., Lippincott-Schwartz, J. Golgi dispersal during microtubule disruption: regeneration of Golgi stacks at peripheral endoplasmic reticulum exit sites. Mol Biol Cell. 7 (4), 631-650 (1996).
  10. Rogalski, A. A., Bergmann, J. E., Singer, S. J. Effect of microtubule assembly status on the intracellular processing and surface expression of an integral protein of the plasma membrane. J Cell Biol. 99 (3), 1101-1109 (1984).
  11. Van De Moortele, S., Picart, R., Tixier-Vidal, A., Tougard, C. Nocodazole and taxol affect subcellular compartments but not secretory activity of GH3B6 prolactin cells. Eur J Cell Biol. 60 (2), 217-227 (1993).
  12. Nakamura, N., et al. Characterization of a cis-Golgi matrix protein, GM130. J Cell Biol. 131, 6 Pt 2 1715-1726 (1995).
  13. Roth, J., Berger, E. G. Immunocytochemical localization of galactosyltransferase in HeLa cells: codistribution with thiamine pyrophosphatase in trans-Golgi cisternae. J Cell Biol. 93 (1), 223-229 (1982).
  14. Baeuerle, P. A., Huttner, W. B. Tyrosine sulfation is a trans-Golgi-specific protein modification. J Cell Biol. 105 (6), Pt 1 2655-2664 (1987).
  15. Honda, A., Al-Awar, O. S., Hay, J. C., Donaldson, J. G. Targeting of Arf-1 to the early Golgi by membrin, an ER-Golgi SNARE. J Cell Biol. 168 (7), 1039-1051 (2005).
  16. Lavieu, G., Zheng, H., Rothman, J. E. Stapled Golgi cisternae remain in place as cargo passes through the stack. Elife. 2, 00558 (2013).
  17. Zhao, X., Lasell, T. K., Melancon, P. Localization of large ADP-ribosylation factor-guanine nucleotide exchange factors to different Golgi compartments: evidence for distinct functions in protein traffic. Mol Biol Cell. 13 (1), 119-133 (2002).
  18. Dejgaard, S. Y., Murshid, A., Dee, K. M., Presley, J. F. Confocal microscopy-based linescan methodologies for intra-Golgi localization of proteins. J Histochem Cytochem. 55 (7), 709-719 (2007).
  19. Fourriere, L., Divoux, S., Roceri, M., Perez, F., Boncompain, G. Microtubule-independent secretion requires functional maturation of Golgi elements. J Cell Sci. 129 (17), 3238-3250 (2016).
  20. Volchuk, A., et al. Countercurrent distribution of two distinct SNARE complexes mediating transport within the Golgi stack. Mol Biol Cell. 15 (4), 1506-1518 (2004).
  21. Popoff, V., Adolf, F., Brugger, B., Wieland, F. COPI budding within the Golgi stack. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), 005231 (2011).

Tags

Cellulær biologi sag 126 Golgi Golgi mini stack protein lokalisering kvantitative lokalisering Fluorescens mikroskopi super-resolution billeddannelse.
Kvantitative lokalisering af Golgi Protein af Imaging dens centrum af fluorescens masse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tie, H. C., Chen, B., Sun, X.,… More

Tie, H. C., Chen, B., Sun, X., Cheng, L., Lu, L. Quantitative Localization of a Golgi Protein by Imaging Its Center of Fluorescence Mass. J. Vis. Exp. (126), e55996, doi:10.3791/55996 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter