Biology

Kvantitativ lokalisering av et Golgi Protein av Imaging sin sentrum av fluorescens masse

Published: August 10, 2017 doi: 10.3791/55996

Hieng Chiong Tie¹, Bing Chen¹, Xiuping Sun¹, Li Cheng^2,3, Lei Lu¹

¹School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, ²Bioinformatics Institute, ³School of Computing, National University of Singapore

Summary

Den nøyaktige lokaliseringen av Golgi beboere er avgjørende for å forstå Golgi cellulære funksjoner. Konvensjonelle optisk mikroskopi er imidlertid ikke klarer å løse sub-Golgi strukturen. Her beskriver vi protokollen for konvensjonelle mikroskopi basert super-oppløsning metode å avgjøre kvantitativt sub-Golgi lokalisering av et protein.

Abstract

Golgi komplekset består av serielt stablet membran cisternae som kan kategoriseres ytterligere i sub-Golgi regioner, inkludert cis-Golgi, mediale-Golgi, trans-Golgi og trans-Golgi nettverk. Cellulære funksjoner av Golgi bestemmes av karakteristiske fordelingen av sin bosatt proteiner. Den romlig oppløsningen på konvensjonelle * lys er for lavt løse sub-Golgi struktur eller cisternae. Dermed er elektronmikroskop immuno-gull en metode for valg å lokalisere et protein på sub-Golgi nivå. Teknikk og apparatet er imidlertid utover funksjonaliteten til de fleste celle biologi labs. Her beskriver vi vår nylig utviklede super-oppløsning metode kalt Golgi protein lokalisering av imaging senterne av masse (KYNDIG) å systematisk og kvantitativt lokalisere en Golgi protein. KYNDIG er basert på standard fluorescens merking protokoller og konvensjonelle wide-feltet eller AC confocal mikroskop. Det innebærer kalibrering av kromatisk-Skift avvik av mikroskopiske systemet, bilde oppkjøpet og etter oppkjøp analyse. Den sub-Golgi lokaliseringen av en test protein uttrykkes kvantitativt lokalisering kvotienten. Det er fire viktigste fordelene av KYNDIG; Det er rask, basert på konvensjonelle metoder og verktøy, lokalisering resultatet er kvantitative og den gir ~ 30 nm praktisk oppløsningen langs Golgi akse. Her beskriver vi detaljerte protokollen av KYNDIG å lokalisere en test Golgi protein.

Introduction

Golgi komplekset spiller viktige roller i sekretoriske/endocytic smugling av proteiner og lipider (heretter Last) i pattedyrceller¹^,²^,³. På Golgi, er Last ikke bare sortert til ulike sub mobilnettet rom men også endret av ulike typer glykosylering. Pattedyr Golgi komplekset består av mange lateralt tilkoblede Golgi stabler, som vanligvis består av 4-11 tett tilstøtende og flat membran sacs kalt cisternae. Serielt stablet Golgi cisternae kategoriseres ytterligere, fra den ene enden til den andre, som cis, mediale og trans-cisternae. På trans-side av en Golgi stabel, trans-de fleste membran sac utvikler seg til en rørformet og retikulum membran nettverk kalt trans-Golgi nettverk (TGN)⁴. I sekretoriske veien, Last avledet fra det endoplasmatiske retikulum (ER) Angi en Golgi stabel på sin cis-side og deretter sekvensielt passere gjennom mediale og trans-cisternae. Last til slutt avslutte Golgi på trans-Golgi eller TGN destining plasma membran, endosomes eller sekretoriske granulat.

Molekylære og cellulære mekanismer for hvordan cargos transitt en Golgi stabel og hvordan Golgi opprettholder sin cisternal organisasjon fortsatt mystisk og er fortsatt under en opphetet debatt¹. En av vanskelighetene i dette feltet er at Golgi cisternae kan bare løses under elektronmikroskop (EM) siden oppløsningen av en optisk mikroskopet (~ 200 nm) er tilstrekkelig for å løse enkelte Golgi cisternae (< 100 nm i begge cisternal tykkelse og avstand). Derfor den sub-Golgi lokaliseringen av bosatt proteiner og transiting cargos konvensjonelt bestemmes av immuno-gull EM. Men immuno-gull EM er svært teknisk krevende og det er utenfor evnen til de fleste celle biologi labs. Selv om oppløsningen av EM kan være sub nanometer, oppløsningen by av immuno-gull EM er sterkt hemmet av størrelsen på antistoffer komplekse (primær og sekundær antistoffer) og gull partikkelen, og det kan være verre enn 20 nm. Videre er EM bilder Hentet fra 2D tynn-deler i stedet for en 3D global oversikt over Golgi, som kan medføre feilaktige konklusjoner avhengig av relative posisjonen og orientering av 2D seksjon⁵. For eksempel, er studere en EM single-delen ikke pålitelig skille en vesicle fra ortogonale visning av en tubule siden begge kan vise identiske runde membran profiler. Det nylige advent super-oppløsning mikroskopi teknikker, for eksempel 3D-strukturert belysning mikroskopi (3D-SIM), stimulert utslipp nedbryting (STED), photoactivated lokalisering mikroskopi (PALM) og Stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi ( STORM), gjør det mulig å løse sub-Golgi strukturer under lys mikroskop⁶. Det er imidlertid minst fire ulemper som kan betydelig begrense bruksområdene i cellen biologiske studiet av Golgi. 1) gjeldende super-oppløsning teknikker krever dyre og spesielle maskinvarekonfigurasjon som er utenfor de fleste celle biologi labs. 2) spesielle fluorescens merking protokoller er nødvendig for noen super-oppløsning teknikker. 3) selv, under den beste tilstanden, disse teknikkene 20-110 nm i romlig oppløsning, kan praktisk oppløsningen innhentet i virkelige eksempler være mye verre. 4) i forhold til konvensjonelle mikroskopi, disse super-oppløsning teknikker fortsatt har problemer i å gjennomføre multicolor, 3D eller live celle imaging, enten enkeltvis eller kombinert. Sannsynligvis viktigst, gi både immuno-gull EM og super-oppløsning mikroskopi teknikker kvalitative stedet for kvantitative lokalisering data.

Prøver å delvis løse problemene nevnt ovenfor, har vi nylig utviklet en konvensjonell * lys basert metode, kalt Golgi protein lokalisering av imaging senterne av masse (KYNDIG), å systematisk og kvantitativt lokalisere en Golgi protein oppløsning som av immuno-gull EM⁷. I denne metoden er Golgi i kulturperler pattedyrceller spredt som Golgi mini-stabler ved behandling av nocodazole, en microtubule depolymerizing narkotika. Omfattende studier har vist at nocodazole-indusert Golgi mini-stakker (heretter Golgi mini-stabler) ligner innfødt Golgi stabler både organisasjonen og cellular funksjonene⁸^,⁹^,¹⁰^, ¹¹. Lokalisering kvotienten (LQ) en test protein kan skaffes gjennom KYNDIG og betyr den kvantitative sub-Golgi lokaliseringen. De numeriske verdiene i LQs kan sammenlignes, og en LQ database med mer enn 25 Golgi markører er tilgjengelig.

I KYNDIG er Golgi mini-stabler trippel-merket av endogene eller exogenously uttrykt GM130, GalT-mCherry og test protein (x). GM130 og GalT-mCherry, cis- og trans-Golgi markører henholdsvis¹²^,¹³, gi referansepunkt. Den tredoble fluorescensen, rød (R), grønn (G) og langt rødt (B), kunstig vises som rød, grønn og blå, henholdsvis. Midten av fluorescens masse (heretter senter) er vedtatt for å oppnå sub pikslers oppløsning. Golgi aksen er definert som vektor fra midten av GM130 for GalT-mCherry. Golgi mini stakken er modellert som en sylindrisk struktur med uendelig rotational symmetri rundt Golgi aksen. Derfor kan en Golgi mini stabel videre modelleres som en endimensjonal langs Golgi aksen. LQ av testen protein x er definert som d_x/d₁, der d_x er avstanden fra sentrum av x som for GM130, mens d₁ er avstanden fra sentrum av GalT-mCherry for GM130. Hvis midten av x er off-aksen, brukes projeksjon aksial avstanden for beregning. Variablene, inkludert Golgi aksen, aksial vinkel, d_x, d₁, vinkel α og vinkel β, for KYNDIG illustrert skjematisk i figur 1. LQ er uavhengig av Golgi aksial vinkelen om Golgi mini-stabler orientere tilfeldig i en celle.

Golgi mini-stabler vises ikke-homogen i bilder. Vi utviklet tre kriterier for å velge analyzable Golgi mini-stabler for KYNDIG. 1) signal-til-støy forholdet kriteriet, der totalt intensiteten av en Golgi mini stabel til standardavviket (SD) for bakgrunnen er ≥ 30 i hver enkelt kanal. Dette kriteriet er å sikre at plassering av senteret av massen, som avhenger av signal-til-støy-forhold av Golgi mini-stabler. 2) aksial vinkelen eller avstanden kriteriet, som krever d₁≥ 70 nm. d₁ reduseres med økningen av Golgi aksial vinkelen. Når aksial vinkelen nærmer seg 90° eller vertikal, mini stakken blir ikke løses som d₁ nærmer seg 0. d₁≥ 70 nm kan effektivt ekskludere nær vertikale Golgi mini-stabler. 3) Ko-linearitet kriteriet, der enten | tan α | eller | tan β | er ≤ 0,3. Dette kriteriet sikrer at tre sentrene for en mini stabel er tilstrekkelig co-lineær for våre endimensjonal modellen av Golgi mini stabelen. Alle lys mikroskop lider kromatisk aberrasjon som kan alvorlig forvrenge de relative plasseringene til røde, grønne og langt rødt fluorescens sentre. Kromatisk aberrasjon mikroskop systemer er eksperimentelt kalibrert av imaging 110 nm perler, som trippel-merket av rød, grønn, langt rødt fluorescens. For hver perle bilde, sentrum av rødt er definert som den sanne plasseringen av perle og kromatisk-Skift av grønne og langt rødt sentrene utstyrt av første orden polynom funksjoner. Av Golgi mini-stabler er utsatt til polynom funksjoner å rette kromatisk-skift i grønt og langt rødt kanaler.

Gjennom KYNDIG vi kan oppnå en oppløsning på ~ 30 nm langs Golgi aksen under standard betingelser. Viktigere, gir det en systematical metode for å tilordne kvantitativt noen Golgi protein. KYNDIG kan utføres av konvensjonell mikroskop, som wide-feltet eller AC confocal mikroskoper, bruker vanlige fluorescens merking protokoller. Bildebehandling og databehandling kan ta idet kort idet for en time. Gjennom KYNDIG, vi har direkte viste progressiv overgangen av sekretoriske lasten fra cis- trans-side av Golgi⁷.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: Nedenfor er KYNDIG trinnvise protokollen for å bestemme LQ av EGFP-merket tyrosylprotein sulfotransferase 1 (TPST1), en Golgi bosatt enzym, i jakten celler.

1. utarbeidelse av fluorescens-merket Golgi Mini-stabler

Forberede glass coverslips
1. Aliquot 0,3 mL steril Dulbecco endret Eagle's Medium (DMEM) til et godt av en 24-vel plate i vev kultur hette.
2. Slette et stykke Φ 12 mm No.1.5 glass dekkglassvæske med mykt papir dytter med 70% etanol for å fjerne rusk på overflaten av glass dekkglassvæske. Bruk et par skarpe pinsett kort suge dekkglassvæske i 70% etanol, overføre det til 24-vel platen og vask det til bunnen av den også inneholder sterilt DMEM.
  Merk: Glass coverslips er konvensjonelt sterilisert av flammende. Men knekke coverslips under slik behandling lett under senere håndtering. 70% etanol soaking er effektiv på sterilisering glass coverslips uten å skade dem.
3. Med lokket dekket, la 24-vel platen i 37 ° C CO₂ inkubator før bruk.
Frø celler
1. Kultur HeLa celler (heretter celler) i en T-25 bolle i DMEM med 10% fosterets Bovine Serum (FBS) (heretter komplett medium) i en 37 ° C CO₂ inkubator leveres med 5% CO₂. Antibiotika er ikke nødvendig her.
2. Når celler nå ~ 80% confluency, Sug opp kultur medium. Legge 1 mL av 0,25% Trypsin-EDTA i flasken og ruge cellene i en 37 ° C CO₂ inkubator for 2 min. legge 1 mL komplett middels i flasken og forsiktig flush cellene av flasken veggen av pipettering.
3. Overføre frittstående cellene til en steril sentrifugering rør og spinn på 500 x g i 2 minutter til pellets cellene. Sug opp nedbryting og suspendere celle pellet i 1 mL komplett medium.
4. Sug opp mediet i av 24-vel plate som inneholder steriliserte glass dekkglassvæske og frø ~ 1 x 10⁵ celler i brønnen. Topp opp volumet av brønnen med komplett medium til 0,5 mL. Inkuber i en 37 ° C CO₂ inkubator leveres med 5% CO₂. Kultur cellene til ~ 80% confluency.
Transfect celler
Merk: Spredning celler er fordelaktig for imaging spredt Golgi mini-stabler.
1. Transfect ~ 80% confluent celler med 80 ng GalT-mCherry⁷ og 320 ng TPST1-EGFP (se Tabell for materiale) DNA plasmider bruker en transfection reagens i henhold til protokollen fra produsenten. Inkuber i en 37 ° C CO₂ inkubator. Endre mediet etter 4-6 h inkubasjon. Cellene er klar ~ 12 h senere.
Nocodazole behandling for å generere Golgi mini-stabler
1. Klargjør en nocodazole lager løsning (33 mM) ved oppløsning 10 mg nocodazole pulver i 1 mL dimethyl sulfoxide. Aliquot lager løsningen og butikk på 20 ° C for langtidslagring.
2. Fortynne 1 µL nocodazole lager løsning (33 mM) i 1 mL 37 ° C komplett medium (siste konsentrasjon 33 µM). Virvel i full fart å fjerne partikler.
3. Sug opp mediet i brønnen, og Legg til 0,5 mL 33 µM nocodazole inneholder fullstendig medium. Inkuber cellene i en 37 ° C CO₂ inkubator for 3 h. Fortsett til immunofluorescence merking (inndelingen 1.5).
Immunofluorescence merking
Merk: Holde celler i mørket for å unngå photobleaching GalT-mCherry og TPST1-EGFP.
1. Forberede reagenser immunofluorescence merking
  1. For å forberede 4% paraformaldehyde løsning, oppløse 4% (w/v) paraformaldehyde pulver i varmt 1 X fosfat bufret saltvann (PBS) og filtrere løsningen gjennom 0,45 µm. Løsningen kan lagres på 20 ° C.
    FORSIKTIG: Paraformaldehyde er giftige og kreftfremkallende og det kan forårsake hudirritasjon. Bruke riktig personlig beskyttende utstyr (PPE).
  2. For å forberede fluorescens fortynning buffer (FDB), bland 5% (v/v) FBS, og 2% (w/v) bovin serum albumin (BSA) i 1 x PBS. Filtrere løsningen gjennom 0,45 µm og lagre løsningen på 20 ° C.
  3. Oppløse 5.35 g NH₄Cl pulver i 1 L vann for å forberede 100 mM NH₄Cl og lagre løsningen ved romtemperatur.
  4. Oppløse 10% (w/v) saponin pulver i vannet for å forberede 10% saponin, aliquot og lagre løsningen på 20 ° C.
2. Fiksering
  1. Skyll den godt gang med 0,5 mL 1 x PBS løsning og legge til 0,5 mL 4% paraformaldehyde løsning. Inkuber for 20 min ved romtemperatur. Skyll godt to ganger med 0,5 mL 1 x PBS og to ganger med 0,5 mL 100 mM NH₄klasse skyll brønnen to ganger med 0,5 mL 1 x PBS. Cellene kan holdes i 1 x PBS på 4 ° C over natten i mørket.
3. Fluorescens merking
  1. Fortynne 1 µL musen anti-GM130 primære antistoff 500 µL FDB med 0,1% saponin. Reversere lokket på 24-vel platen og bruke 10 µL primære antistoff blanding på lokket.
  2. Bruk et par skarpe pinsetter trekke og overføre glass dekkglassvæske på slipp av antistoff blanding sikrer at siden cellen er i kontakt med blandingen. Inkuber cellene med primære antistoff blandingen 1t ved romtemperatur.
    Merk: Lokket med dekkglassvæske kan plasseres i en fuktet plastpose i mørket.
  3. Bruk et par skarpe pinsett å ekstra og overføre dekkglassvæske til brønnen med cellen side opp og skyll den i 0,5 mL 1 x PBS for tre ganger i ≥ 30 min. risting er unødvendig.
  4. Fortynne 1 µL langt rødt fluorophore konjugert geit anti-musen IgG (sekundær antistoff) i 500 µL FDB med 0,1% saponin.
  5. Vask og rengjøre omvendt lokket av 24-vel plate. Bruke 10 µL langt rødt sekundære antistoff blanding på lokket. Gjenta trinn 1.5.3.2 - 1.5.3.3.
4. Montering
  1. Forberede montering medium ved å blande 1 g glyserol, 2.2 g poly(vinyl alcohol) (MW ~ 31 000 Da), 1,2 mL 1 M Tris (pH 8) og 8,8 mL H₂O. oppløses blandingen i en 60 ° C vannbad med noen ganger vortexing. Lagre løsningen på 20 ° C.
  2. Tine montering mediet og overføre 10 µL på et glass lysbilde. Legge dekkglassvæske (celle side ned) på slipp av montering medium. Inkuber av objektglass på 37 ° C i 30 min eller romtemperatur 1t å stivne montering medium. Forsegle dekkglassvæske med fargeløs-neglelakk og lagre av objektglass på 20 ° C.

2. forberedelse av fluorescerende perler til kromatisk-Skift rettelsen

Dekkglassvæske rengjøring
1. Forsiktig plassere et stykke 25 mm No.1.5 glass dekkglassvæske på en plast reol.
2. Overføring brettet med dekkglassvæske til en 400 mL kanne fylt med 300 mL 1 M NaOH og sonicate i et bad sonicator (35 watt) for 15 min. kort skyll racket på en 400 mL kanne fylt med 300 mL vaskebuffer vann. Overføre stativet til en 400 mL kanne fylt med 300 mL 99% etanol og sonicate i Bad sonicator i 15 min. kort skyll racket på en 400 mL kanne fylt med 300 mL vaskebuffer vann.
3. Gjenta trinn 2.1.2 to ganger.
4. Skyll brettet med dekkglassvæske i 300 mL vaskebuffer vann i en 400 mL kanne for 10 min. Gjenta trinnet to ganger. Overføre stativet til en 60 ° C ovn og tørr dekkglassvæske for 1 h. Store tørket dekkglassvæske i et støvfritt Petriskål.
Immobilisering av fluorescerende perler på glass dekkglassvæske
1. Fortynne 110 nm multi-farge fluorescerende perler 80-fold i 1 x PBS med 0,1 µg/µL BSA. Kort vortex røret for å spre perle aggregat. Spre 60 µL utvannet perler på renset Φ 25 mm No.1.5 glass dekkglassvæske (se § 2.1) bruker en pipette tips. Tørr dekkglassvæske i en desiccator koblet til en vakuumpumpe i mørket og montere dekkglassvæske på et glass lysbilde i 50 µL montering medium (se trinn 1.5.4.2).

3. image vinningen

Merk: KYNDIG krever bilder av høy signal-til-støy-forhold (SNR) for høy presisjon senteret av massen beregning. Bildet kan bli kjøpt opp av konvensjonell mikroskop som laser skanning AC confocal, spinner disken AC confocal eller wide-field mikroskop. Wide-field mikroskop utstyrt med planen-apochromatic målet objektiver og en lav støy image sensor, slik som en kostnad - sammen enhet (CCD) og vitenskapelige complementary metal oxide semiconductor (sCMOS) kan brukes. Parametere for bildesensoren justeres for å sikre et lavt lese-støy og høy dynamisk område. Mikroskopet må være utstyrt med optimale konfigurasjonen av fluorescens filtre for grønn, mCherry og langt rødt fluorophore, og det må ha ubetydelig fluorescens cross-talk. Ideelt sett tenkelig systemet oppnår en Nyquist samplingsfrekvens i x, y og z-aksen, som vanligvis krever x, y og z størrelsen på en voxel som mindre enn 100, 100 og 200 nm, henholdsvis. X- og y størrelsen på voxel er alltid like og kalles pixel_size. Pixel_size kan beregnes ved å dele kameraet sensorstørrelse systemet forstørrelsen.

Bildet multi-farge perler
1. Bildet multi-farge perler i grønn, rød og langt rødt kanaler i begynnelsen og på slutten av hver tenkelig økt.
  Merk: Her, bildene ble anskaffet gjennom konvensjonelle wide-field epi-fluorescens mikroskop (invertert) 100 X NA 1.4 plan-apochromatic mål, motorisert scenen, 200 Watt metall-metallhalid lyskilde og 16-biters sCMOS kameraet. Bølgelengder for eksitasjon (band pass), dichroic speil (long pass) og utslipp filter (band pass) av grønne kanalen filter kuben er 465-495, 505 og 515-555 nm; de røde kanalen filter kuben er 528-553, 565 og 578-633 nm; for langt rødt kanal filter kuben er 590-650, 660 og 663-738 nm. Under oppkjøpet, størrelsen på en voxel langs x, er y og z aksen 64, 64 og 200 nm, henholdsvis.
2. Finne en synsfelt med god perle tetthet.
3. Få 3D bildestakker grønn, rød og langt rødt kanaler (kanal_G, kanal_R, kanal_B, henholdsvis). Ta 3 deler over og under beste fokalplanet (7 deler per stabel). Lagre de tre stablene som tre TIFF-filer.
  Merk: Eksponeringstid for hver kanal bestemmes empirisk å maksimere dynamikkområdet, unngå pixel metning og minimere photobleaching. Andre parametere, for eksempel filtre og x, y og z størrelsen på voxel, velges som beskrevet ovenfor.
Bildestakker Golgi mini-
1. Bruk TPST1-EGFP og GalT-mCherry transfekterte og fluorescently merket (inndelingen 1.5) lysbilder finne celler som uttrykker TPST1-EGFP og en lav eller middels nivå av GalT-mCherry. Få 3D bildestakker som beskrevet i trinn 3.1.3.

4. bildeanalyser

Skaffe av fluorescerende perler
1. ImageJ, åpne et sett med perle bilder som består av tre TIFF-filer (Fil > bilde > Åpne).
2. Gjennomsnittlig 3 sammenhengende deler rundt beste fokusert delen i kanalen_R av Image > Stakker > Z prosjektet. Input inndelingsnummeret "Start skive" og "Stop del", og blant alternativer for "projeksjon type", velg "Gjennomsnittlig intensitet".
3. Tegne regioner av interesse (ROIs) som inneholder ingen perler i bildet ved hjelp av "Polygon valg". I "analyser > angi mål", bare "Grå middelverdien" og "Standardavvik". Deretter kjøre "analyser > mål" betyr og SD av Avkastningen.
4. Beregne bakgrunn intensiteten som «betyr + 6 × SD»_. Trekke bildet med tilsvarende bakgrunn intensitetsverdiene av "prosessen > matematikk > trekk fra", input bakgrunn intensitetsverdien som tilsvarer denne kanalen.
5. Gjenta trinn 4.1.2 og 4.1.4 for_G-kanalen og kanalen_B bildestakker ved å bruke de samme start og stopp skive og den samme bakgrunnen avkastning. Merk at Avkastningen brukte i trinn 4.1.3 kan kopieres til_G-kanalen og kanalen_Bbilder_.
6. Flette de tre bakgrunn-trukket bildene (bilde > farge > slå sammen kanaler) ved å velge kanal_R rødt, kanal_G Green og kanal_B blå. Et enkelt sammensatt bilde som består av tre kanaler oppnås.
7. Innlede ROI Bestyrer (analyser > Verktøy > avkastning Manager). Tegne en firkant avkastning rundt enkelt perler å sikre at det er kun en perle innen hver avkastning. Legge til Avkastningen Avkastningen manager ved å trykke "t" på tastaturet. Gjenta denne prosessen og legge til så mange ROIs som mulig.
8. I "analyser > angi mål", sjekk bare "sentrum av masse".
9. Velg kanal_R, i Avkastningen Manager, klikk "Måle" for å få sentre; to kolonner svarer til x- og y-koordinaten av ROIs vises i vinduet "Resultat". Kopiere og lime inn i to kolonner i et regneark.
10. Gjenta trinn 4.1.9 for kanal_Gog_B-kanal.
11. Ordne koordinatene til sentre i et enkelt regneark i følgende rekkefølge: x_R, y_R, x_G, y_G, x_Bog y_B. Lagre regnearket i "CSV" format som "beads.csv". La ikke plass i filnavnet.
Velg og måle Golgi mini-stabler
1. Installere to makroer (vedlagt i Supplerende materiale) i ImageJ, "Makro-Golgi ROI inspeksjon" og "Makro-Output 3 kanaler data" av Plugins > installert ". Klart ROI manager og resultatvinduet.
2. Åpne et sett med Golgi mini stakk bilder som består av tre TIFF-filer (Fil > bilde > Åpne).
3. Gjenta 4.1.2 - 4.1.5 og lagre de tre bakgrunn-trukket bildene for senere bruk. Post bakgrunnen SDs for_R-kanal, kanal_G og_B -kanalen som SD_R, SD_G og SD_B, henholdsvis for senere bruk.
4. Kopiere de tre bakgrunn-trukket bildene fra trinn 4.2.3 (Ctrl + Shift + D).
5. I "prosessen > Image Kalkulator", først legge bakgrunn-trukket stasjon_Gtil kanal_R bilder. Legge til bildets bakgrunn-trukket kanal_B bildet. Den resulterende bildet, i "Image > Juster > terskelen", velge "Angi" Angi "1" som "Laveste terskelnivå". Etter trykker "Apply", er en svart og hvit binære bilder resulterte.
6. I "analyser > analysere partikler", inndataområde størrelse for "størrelsen (piksler ^ 2)". Skriv "50-infinity". Sjekk "Ekskluderer på kantene" og "Legge til Manager". ROIs inneholder Golgi mini-stabler er nå lagt til Avkastningen manager.
  Merk: Størrelse området må være empirisk fastsatt utelate lyder som er generelt liten.
7. Flette de tre bakgrunn-trukket bildene (bilde > farge > slå sammen kanaler) fra trinn 4.2.3 ved å velge kanal_R rødt, kanal_G Green og kanal_B blå. Et enkelt sammensatt bilde som består av tre kanaler genereres.
8. Kjøre makroen "Makro-Golgi ROI inspeksjon" ved å velge "Plugins > makro-Golgi ROI inspeksjon". I dialogboksen interaktive visuelt inspisere hver avkastning for å beholde eller forkaste den. Velg ROIs som inneholder ett enkelt objekt i alle tre kanaler.
  Merk: Etter å ha kjørt dette verktøyet, avviste ROIs er eliminert fra avkastning manager.
9. Kontroller bare "Område", "Mener grå verdi" og "Senteret av massen" "analyser > angi mål". Hente data ved å lansere makroen verktøyet "Makro-Output 3 kanaler data" (Plugins > makro-Output 3 kanaler data).
  Merk: Områdene og mener intensiteter sentre (x og y) av ROIs i kanalen_R,_G -kanalen og kanalen_B vises i vinduet "Resultat".
10. Kopier x og y koordinatene til sentre i et regneark og ordne dem i følgende rekkefølge: x_R, y_R, x_G, y_G, x_Bog y_B. Lagre regnearket som en "CSV" fil (ministacksCSV). La ikke plass i filnavnet. Fortsett til kromatisk-Skift rettelsen av sentre (inndelingen 4.3) og LQ beregning (punkt 4.4).
Kromatisk-Skift rettelsen av sentre
1. Installere Matlab kompilatoren Runtime (MCR).
2. Installere følgende filer i en dedikert arbeidsmappe: my_train.exe og my_test.exe. Kopier og lim "beads.csv" og"ministacksCSV" filer i samme mappe.
3. Starte "Kommandere spørsmål" Windows og gå til arbeidsmappen ved å skrive følgende kommando " cd path_of_working_folder".
4. Generere en kromatisk-Skift kalibrering fil ved hjelp av perler. Skriv inn kommandoen nedenfor "my_train.exe perlerCSV kalibrering.mat 1". Det opprettes en fil kalt"kalibrering.mat" inne det arbeider brosjyre. Ignorere andre filer som genereres.
5. Rette kromatisk-skiftet av Golgi mini-stabler ved å skrive følgende kommando "my_test.exe ministacksCSV corrected_ministacksCSV kalibrering.mat 1".
  Merk: En fil som heter"corrected_ministacksCSV" opprettes i arbeidsmappen. Det inneholder kromatisk-Skift korrigert koordinatene til sentre, som er ordnet i rekkefølge x_G, y_G, x_B og y_B. Ignorere andre filer som er opprettet. Ta note det den røde kanalen er definert som kromatisk aberrasjon og derfor x_R og y_R er det samme som rådata.
Beregning av LQs
1. Lansere dataanalyse programvare og kopiere og lime, i den under rekkefølge, mener gråverdier, områder, bakgrunn SDs hentet i trinn 4.2.3 (plassere dem i rad 1) og kromatiske-Skift korrigert x og y koordinatene til Golgi mini-stabler i_R -kanal til en regneark som kolonnene A til E. Tilsvarende overføre tilsvarende data for kanal_G og_B -kanal til kolonnene F til J og K o, henholdsvis.
2. Legge til åtte nye kolonner P W, kalt "integrert intensitet av R", "integrert intensitet av G", "integrert intensitet av B-kanal", d1, dx, ABS(tan a), ABS (tan b) og LQ.
  1. Høyreklikk øverst på respektive kolonnen og velg "Angi kolonneverdier" å beregne verdier for hver kolonne. For kolonnen P input "Col(A)Col(B)"; for kolonnen Q, input "Col(F)Col(G)"; for kolonnen R, input "Col(K)Col(L)"; for kolonnen S, input "pixel_size*Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))" hvor "pixel_size" er størrelsen på pikselen nm; for T-kolonnen input "pixel_size*((Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2)/(2Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O)))"; for U-kolonnen input "Abs(Tan(Acos((Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2) / (2 Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))Distance(Col(D) , Col(E), Col(N), Col(O))) "; for kolonne V, input "Abs(Tan(Acos((Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2) / (2 Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))Distance(Col(D) , Col(E), Col(N), Col(O))) "; for kolonnen W, input "Col (T) / Col (S)".
3. Filtrere Golgi mini-stabler av tre kriteriene beskrevet i introduksjonen.
  1. Data analyseprogramvare, gå til "regneark > regnearket spørringen" og velg kolonnen variabler for "Hvis" test. Tilordne følgende aliaser I1, I2, I3, d1, A og B for kolonner "integrert intensitet av R", "integrert intensitet av G", "integrert intensitet av B-kanal", d1, ABS(tan a) og ABS (tan b), henholdsvis. I den "Hvis tilstand" boksen inngang "I1 > =30*cell(1,3) og I2 > =30*cell(1,8) og I3 > =30*cell(1,13) og d1 > = 70 og (A < = 0,3 eller B < = 0,3)".
  2. Velg "Pakk ut til nye regneark", klikk "Apply". Kolonnene A-W i analyzable Golgi mini-stabler pakkes et nytt regneark.
4. I det nye regnearket, høyreklikk øverst i kolonnen W, velg "statistikk på kolonnen > Åpne dialogboksen". Sjekk "N total", "Betyr", "SE betyr", "Histogrammer". Statistisk analyse av LQs vises deretter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Moderne forskning klasse lys mikroskopet utstyrt med en plan apochromatic linse, som den som brukes i vår lab, viser minimal kromatisk aberrasjon (figur 2A). Men kan en nøye undersøkelse av multi-farge fluorescerende perle bildet avsløre skifte av annen fargebilder av samme perle (figur 2B). Vi definerer at den røde kanalen er kromatisk aberrasjon og derfor av røde fluorescens er sanne plasseringen av perler. Den relative kromatisk-Skift av grønn og langt rødt fluorescens kan representeres av grønne og blå vektorer fra midten av røde fluorescens (figur 2C). Kromatisk-skiftet i imaging-fly er empirisk illustrert av den grønne og blå vektoren for hver perle (figur 2D). For vår mikroskop, kromatisk-Skift er ikke ensartet både størrelsen og retninger av Skift endringen i henhold til x og y posisjoner. Kromatisk-skiftet kan påvirke nøyaktigheten av KYNDIG som skifte av langt rødt sentre kan være så mye som 50 nm. Derfor må kromatisk-Skift korrigeres. Når av perler er ervervet, bruker vi første orden Polynomisk passende å kalibrere og deretter rette kromatisk-Skift av sentre. Kromatisk-Skift avvik blir betydelig forbedret ved denne tilnærmingen (figur 2 D-G).

I pattedyrceller, er Golgi komplekset akkumuleres på perinuclear området som vanligvis ikke løses under et mikroskop med konvensjonelle optisk (Figur 3A). Etter nocodazole behandling for 3 timer, perinuclear Golgi komplekset forsvinner og dusinvis av Golgi mini-stabler montere på endoplasmatiske retikulum Avslutt nettsteder i cytoplasma (Figur 3B). Store biter av Golgi membran og aggregert Golgi mini-stabler finnes og de er valgt ikke for analyse. Et eksempel bilde som illustrerer valg av Golgi mini-stabler er vist i Figur 3C. Bruke verktøyet "Makro-Golgi ROI inspeksjon", 40 valgte Golgi mini-stabler vises i Figur 3D. Etter anvender de tre kriteriene, 21 Golgi mini-stabler var analyzable og valgt for beregning av LQs av TPST1-EGFP (Figur 3D; merket som "L"), med sine statistikken som vises i Figur 3E. Totalt 111 analyzable Golgi mini-stabler ble valgt fra 12 celler og LQ av TPST1-EGFP ble målt skal 0,76 0,04 (gjennomsnittlig ± SEM, n = 111) (Figur 3F). LQ TPST1-EGFP posisjoner det mellom giantin (LQ = 0,59) og EGFP-Rab6 (LQ = 1.04)⁷. Det er nær GS15 (LQ = 0,83) og ST6GalT1-AcGFP1 (LQ = 0,82). Vi har definert regionene sub-Golgi ifølge LQs ved å vurdere kvalitative lokalisering data fra litteratur: ERES/ERGIC, <-0.25; cis, 0,00 ± 0,25; mediale, 0,50 ± 0,25; trans-Golgi, 1.00 ± 0,25 og TGN, 1.25-2,00. LQ TPST1-EGFP angir derfor den trans-Golgi lokalisering, som er i samsvar med en tidligere studie¹⁴.

Figur 1 . Skjematisk illustrasjoner viser variablene brukes i beregningen av KYNDIG. (A) xz-visningen av en Golgi mini stabel med co-aksial sentre for GM130, GalT-mCherry og protein x fluorescens viser Golgi aksen, aksial vinkel, d_x og d₁. Bildet av Golgi mini stakken er dens anslaget på bildet flyet. (B) xy visning av en Golgi mini stabel med off-aksen center protein x viser vinkel α, vinkel β og projeksjon aksial avstand d_x. A og B er tilpasset fra figur 1E og figur 1F av vår forrige publikasjonen⁷, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2 . Korrigering av kromatisk-shift. (A) det tre farger sammenslåtte bildet av 110 nm multi-farge perler av wide-field mikroskop. Hver perle avgir grønn, rød og langt rødt (kunstig farget blå) fluorescens. Skala bar, 10 µm. (B) forstørret visning av en sammenslåtte single-perle bildet med en merkbar kromatisk-SKIFT. Skalere bar, 200 nm. (C) en skjematisk diagram viser at Skift grønn og langt rødt perle bilder kan representeres av vektorer fra midten av røde perlen bildet (0,0) til sentre for green (grønn vektor) og langt rødt (blå) perle vektorbilder, henholdsvis. (D, E) Effekten av kromatisk-Skift rettelsen. Innen samme bilde, grønne og blå vektorer tegnes før og etter skifte korreksjon. For å visualisere små skiftet, forsterkes omfanget av hver vektor 200-fold. (F, G) Punktdiagram tomter viser av grønn (grønne prikker) og langt rødt (blå prikker) perler før og etter Skift rettelsen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3 . Et typisk eksempel av KYNDIG, her å skaffe LQ av TPST1-EGFP. En HeLa celle uttrykke TPST1-EGFP (grønn) og GalT-mCherry (rød) var farget for endogene GM130 (blå). (A) A typisk celle. (B, C, D, E) En celle behandlet med nocodazole ble avbildet (B). Fra bildet ble analyzable Golgi mini-stabler valgt som vist i C. Valgte Golgi mini-stabler er merket av ID-numre. Bilder av disse maskert Golgi mini-stakker vises nedenfor i D med deres identifikasjonsnumre. "L" betyr at Golgi mini stakken er gyldig for beregning av LQ (analyzable Golgi mini stabler). Histogram av LQs av 21 mini-stabler fra cellen vises i E. (F) Histogram av LQs av 111 mini-stabler fra 12 celler. Verdien som vises i histogrammet er gjennomsnittlig ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

TILLEGGSRESULTATER materialer: Makro-Golgi avkastning inspection.ijm, makro-Output 3 kanaler data.ijm, Matlab koder, My_train.exe, My_test.exe og regneark template.opj.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tidligere var lokalisering av et Golgi protein under * lys hovedsakelig kvantifisert ved sammenheng eller overlappende av bildet av protein med bildet av merketråd Golgi kjent lokalisering¹⁵^,¹⁶^, ¹⁷. Den resulterende sammenheng eller overlappende koeffisienten gjenspeiler hvor nær testing protein er til Golgi merket romlig. Det er minst tre begrensninger for denne tilnærmingen. Først den sammenheng eller overlappende koeffisient er lineære og det indikerer ikke direkte romlige avstand. Andre er graden av sammenheng kritisk avhengig av oppløsningen av mikroskopiske systemet. Derfor er koeffisient mellom to Golgi proteiner ikke en uavhengig konstant. Tredje, to Golgi proteiner med samme aksial lokalisering, men forskjellige lateral utbredelsesområde langs cisternae kan ha forskjellige koeffisienter. Derfor indikerer sammenheng eller overlappende koeffisienten ikke den aksiale lokaliseringen av et Golgi protein. I en alternativ metoden foreslått av Dejgaard et al., cis, trans-Golgi markører og protein av interesse er trippel-merket i nocodazole behandlet Golgi mini-stabler, ligner på KYNDIG. Innenfor hver Golgi mini stabel, posisjoner tre maksimale intensitet pikslene er ervervet og den relative plasseringen av testen protein beregnes som en avstand forhold¹⁸. Deres metode er imidlertid ikke å oppnå underpiksel oppløsning, som sterkt begrenser anvendelsen. Sammenlignet med tidligere kvantitative metoder, KYNDIG, som var uavhengig utviklet, men bærer et lignende konsept som Dejgaard et al., stand til å kvantifisere den aksiale lokaliseringen av et Golgi protein med uovertruffen nøyaktighet og konsistens.

Vi presentert protokollen av KYNDIG å anskaffe LQ exogenously uttrykt GFP-merket protein - TPST1-EGFP. LQ av endogene protein kan bestemmes hvis dens antistoff tilgjengelig. Avhengig av arten av det primære antistoffet, mus eller kanin, så en kanin eller musen anti-GM130 antistoff, henholdsvis kan brukes i trippel-merking protokollen. Både kanin og mus anti-GM130 antistoffer for immunofluorescence merking er kommersielt tilgjengelig. Vi har tidligere vist at kanin og mus anti-GM130 antistoffer gir samme resultat i KYNDIG⁷. Hvis testen protein er egentlig rødt fluorescens utslipp, som mCherry fusion, en GFP-merket Golgi markør protein med kjente LQ i kombinasjon med GM130 antistoffer merking kan brukes til trippel-label celler og indirekte utlede LQ av testen protein. Antar markør protein's LQ er LQ_m , avstanden fra midten av markøren protein som i GM130 d_m, LQ testen protein x kan beregnes (d_x/d_m) × LQ_m. En av de største fordelene av KYNDIG i forhold til super-oppløsning mikroskopi er at det kan lett brukes på levende celle bildebehandling i konvensjonelle mikroskopiske oppsett. Vi har forsøkt en kombinasjon av tre fluorescens proteiner, GFP-Golgin84, mCherry-GM130 og GalT-iRFP670, for dynamisk overvåking av LQ av GFP-Golgin84 i enkel Golgi mini-stabler⁷.

KYNDIG er det mest tidkrevende trinnet etter oppkjøp analyse, spesielt på valg av analyzable Golgi mini-stabler. Golgi mini-stabler er heterogene i både størrelse og molekylære komposisjon¹⁹, det er uklart om fordelingen av LQs (figur 3F) representerer heterogene arkitektur Golgi mini-stabler eller usikkerhet i vår beregning av den LQ. Uavhengig av årsakene fant vi at det er viktig å ha et stort antall analyzable Golgi mini-stakker (n) å sikre nøyaktigheten av LQ, som er svekket når n er liten. Vanligvis gir data med n ≥ 100 fra flere celler pålitelig LQs. Derfor gir KYNDIG ensemble-gjennomsnitt lokalisering data, skjule Individualiteten til Golgi mini-stabler. En annen begrensning av KYNDIG er at det forutsetter at alle Golgi proteiner har en smal distribusjon rundt en enkelt center. Noen Golgi proteiner, som COPI underenheter, ARF1 og løselig N-ethylmaleimide-sensitive faktor vedlegg protein reseptor (snarer)²⁰^,²¹, har blitt rapportert å distribuere bredt fra cis til trans- Golgi og TGN. Det er sannsynligvis upassende å studere deres Golgi lokalisering av LQ. Som KYNDIG foreløpig innebærer manuelt valg av Golgi mini-stabler, som er både arbeidskrevende og subjektive, blir den fremtidige utviklingen av KYNDIG å implementere en programvareverktøy for automatisk Golgi mini-stabler med minimal menneskelig innblanding.

Hva er romlig oppløsning av KYNDIG? Siden LQ er et forhold, som er uten enhet, indikerer det ikke romlige avstand. Her prøver vi å gi grovt regnet. Romlig oppløsning av KYNDIG kan defineres som den minste akseavstand mellom to løses Golgi proteiner. Undersøke LQs av ulike Golgi proteiner⁷, fant vi at søkemotormarkedsførere av datasett med n ≥ 100 området rundt 0,03. Forutsatt at to Golgi proteiner har samme n = 100 og SEM = 0,03, de to Golgi proteiner har betydelig forskjellige lokalisering av t-test (p < 0,05), dvs, løses, hvis forskjellen mellom deres LQs ≥ 3 × SEM = 0.09. Fra EM data, kan vi anslår at aksial Golgi mini stakken, som også er avstanden fra GM130 til GalT-mCherry i KYNDIG, er ~ 300 nm⁸. Derfor oppløsningen av KYNDIG er anslått til 0.09 × 300 = 30 nm langs Golgi aksen. I KYNDIG gir en større n generelt mindre SEM, som igjen fører til høyere oppløsning.

Det er sannsynligvis upassende direkte sammenligne oppløsningen av KYNDIG som immuno-gull EM siden sistnevnte teknikken ikke gir direkte kvantitative lokalisering data. Ligner KYNDIG, oppløsningen av immuno-gull EM langs Golgi aksen, kan defineres som den minste avstanden mellom to løses Golgi markører. For å måle oppløsningen krever studiet av dual-immuno-gull merking av to Golgi proteiner som er tett ved siden av hverandre langs Golgi aksen. Slike systemisk studier er sannsynligvis utilgjengelig ifølge vår kunnskap. Som omtalt i innledningen, en av de begrensende faktorene i romlig oppløsning på immuno-gull EM er den store størrelsen på antistoffer komplekset, som gjør resolusjonen å være verre enn ~ 20 nm. En annen viktig begrensende faktor av bildeoppløsningen er merking tettheten av antigen molekyler. Ifølge Nyquist prøvetaking teori, må det være minst to gull partikler per oppløsning enhet. I de fleste immuno-gull EM studier, er avstandene mellom nabo gull partikler ikke < 15 nm på grunn av svært lav merking effektivitet; Dette gjør det vanskelig for denne teknikken å oppnå en bildeoppløsning mindre enn 30 nm. Fra dette synspunkt anslår vi at oppløsningen av KYNDIG er minst sammenlignes med immuno-gull EM.

KYNDIG er en robust metode som gir svært konsekvente resultater. Det er uavhengig av hvilken mikroskopet brukes. Vi har testet at wide-feltet og spinning disk AC confocal mikroskop gitt samme resultat. LQs av samme Golgi proteiner kjøpt til forskjellige bunker eksperimenter var også i god avtale med hverandre. En LQ database bestående av et variert utvalg av Golgi bosatt proteiner er generert for sammenligning og tolkning. Vi forventer at mer bruk av KYNDIG i forskningen fellesskapet betydelig utvide databasen. Derfor vil en mer komplett database beskriver kvantitativt lokalisering av et stort antall Golgi proteiner hjelpe forstå organisasjon og funksjonen til Golgi komplekset.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke D. Stephens (University of Bristol, Bristol, Storbritannia) for TPST1-EGFP DNA plasmider, samt Lakshmi Narasimhan Govindarajan for å hjelpe med programvare optimalisering. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Medical Research Council (NMRC/CBRG/007/2012), Ministry of Education (AcRF Tier1 RG 18/11, RG 48/13 og RG132/15 og AcRF Tier2 MOE2015-T2-2-073) til ll

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
fluorescence beads. Commercial name: TetraSpeck beads	Invitrogen	T7279	As multi-color beads to calibrate chromatic-shift of the microscope
Glass coverslip Φ 12 mm (No. 1.5)	Menzel	CB00120RAC
Glass coverslip Φ 25 mm (No. 1.5)	Menzel
DMEM	Capricon	DMEM-HPA-P50
Trypsin-EDTA
FBS	GE Hyclone	SV30160.03
Nocodazole	Merck	487928
transfection reagent. Commercial name: Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019
transfection medium. Commercial name: OptiMEM	Invitrogen	31985070
TPST1-EGFP	Addgene	66617	A gift from D. Stephens (University of Bristol, Bristol, United Kingdom)
GalT-mCherry			Made in our lab
paraformaldehyde	Merck	1.04005.1000
saponin	Sigma-Aldrich	47036
poly(vinyl alcohol) (Mw ~31,000). Commercial name: Mowiol-488	CALBIOCHEM	475904
BSA	Sigma-Aldrich	A9647
Mouse anti-GM130	BD Biosciences	610823	Primary antibody for human GM130
far-red fluorescence conjugated goat anti-mouse IgG. Commercial name: Alexa Fluor 647 conjugated goat anti-mouse IgG	Invitrogen	A-21235	Far red fluorescence conjugated secondary antibody

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Glick, B. S., Luini, A. Models for Golgi traffic: a critical assessment. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), 005215 (2011).
Klumperman, J. Architecture of the mammalian Golgi. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (7), (2011).
Lu, L., Hong, W. From endosomes to the trans-Golgi network. Semin Cell Dev Biol. , (2014).
De Matteis, M. A., Luini, A. Exiting the Golgi complex. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 273-284 (2008).
Lu, L., Ladinsky, M. S., Kirchhausen, T. Cisternal organization of the endoplasmic reticulum during mitosis. Mol Biol Cell. 20 (15), 3471-3480 (2009).
Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J Cell Biol. 190 (2), 165-175 (2010).
Tie, H. C., et al. A novel imaging method for quantitative Golgi localization reveals differential intra-Golgi trafficking of secretory cargoes. Mol Biol Cell. 27 (5), 848-861 (2016).
Trucco, A., et al. Secretory traffic triggers the formation of tubular continuities across Golgi sub-compartments. Nat Cell Biol. 6 (11), 1071-1081 (2004).
Cole, N. B., Sciaky, N., Marotta, A., Song, J., Lippincott-Schwartz, J. Golgi dispersal during microtubule disruption: regeneration of Golgi stacks at peripheral endoplasmic reticulum exit sites. Mol Biol Cell. 7 (4), 631-650 (1996).
Rogalski, A. A., Bergmann, J. E., Singer, S. J. Effect of microtubule assembly status on the intracellular processing and surface expression of an integral protein of the plasma membrane. J Cell Biol. 99 (3), 1101-1109 (1984).
Van De Moortele, S., Picart, R., Tixier-Vidal, A., Tougard, C. Nocodazole and taxol affect subcellular compartments but not secretory activity of GH3B6 prolactin cells. Eur J Cell Biol. 60 (2), 217-227 (1993).
Nakamura, N., et al. Characterization of a cis-Golgi matrix protein, GM130. J Cell Biol. 131, 6 Pt 2 1715-1726 (1995).
Roth, J., Berger, E. G. Immunocytochemical localization of galactosyltransferase in HeLa cells: codistribution with thiamine pyrophosphatase in trans-Golgi cisternae. J Cell Biol. 93 (1), 223-229 (1982).
Baeuerle, P. A., Huttner, W. B. Tyrosine sulfation is a trans-Golgi-specific protein modification. J Cell Biol. 105 (6), Pt 1 2655-2664 (1987).
Honda, A., Al-Awar, O. S., Hay, J. C., Donaldson, J. G. Targeting of Arf-1 to the early Golgi by membrin, an ER-Golgi SNARE. J Cell Biol. 168 (7), 1039-1051 (2005).
Lavieu, G., Zheng, H., Rothman, J. E. Stapled Golgi cisternae remain in place as cargo passes through the stack. Elife. 2, 00558 (2013).
Zhao, X., Lasell, T. K., Melancon, P. Localization of large ADP-ribosylation factor-guanine nucleotide exchange factors to different Golgi compartments: evidence for distinct functions in protein traffic. Mol Biol Cell. 13 (1), 119-133 (2002).
Dejgaard, S. Y., Murshid, A., Dee, K. M., Presley, J. F. Confocal microscopy-based linescan methodologies for intra-Golgi localization of proteins. J Histochem Cytochem. 55 (7), 709-719 (2007).
Fourriere, L., Divoux, S., Roceri, M., Perez, F., Boncompain, G. Microtubule-independent secretion requires functional maturation of Golgi elements. J Cell Sci. 129 (17), 3238-3250 (2016).
Volchuk, A., et al. Countercurrent distribution of two distinct SNARE complexes mediating transport within the Golgi stack. Mol Biol Cell. 15 (4), 1506-1518 (2004).
Popoff, V., Adolf, F., Brugger, B., Wieland, F. COPI budding within the Golgi stack. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), 005231 (2011).

Biology

Kvantitativ lokalisering av et Golgi Protein av Imaging sin sentrum av fluorescens masse

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.