Anwendung von automatisierten Bild-geführten Patch-Clamp für die Studie von Neuronen in Gehirn-Scheiben

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Durchführung von automatischen bildgeführten Patch-Clamp-Experimenten mit einem System, das kürzlich für Standard- In-vitro- Elektrophysiologie-Geräte entwickelt wurde.

Abstract

Voll-Zell-Patch-Clamp ist die Gold-Standard-Methode, um die elektrischen Eigenschaften von einzelnen Zellen zu messen. Allerdings bleibt die In-vitro- Patch-Clamp aufgrund ihrer Komplexität und ihrer hohen Abhängigkeit von Benutzerbetrieb und -steuerung eine anspruchsvolle und leistungsstarke Technik. Dieses Manuskript zeigt ein bildgeführtes automatisches Patch-Clamp-System für in-vitro- Ganzzell-Patch-Clamp-Experimente in akuten Hirnschnitten. Unser System implementiert einen computervisionsbasierten Algorithmus, um fluoreszenzmarkierte Zellen zu detektieren und sie zum vollautomatischen Patching mit einem Mikromanipulator und einer internen Pipettendruckkontrolle zu zielen. Der gesamte Prozess ist hoch automatisiert, mit minimalen Anforderungen für menschliches Eingreifen. Echtzeit-experimentelle Informationen, einschließlich elektrischer Widerstand und interner Pipettendruck, werden elektronisch für die zukünftige Analyse und für die Optimierung auf verschiedene Zelltypen dokumentiert. Obwohl unser System im Kontext der akuten brai beschrieben wirdN Slice-Aufnahmen kann es auch auf die automatisierte bildgeführte Patch-Clamp von dissoziierten Neuronen, organotypischen Slice-Kulturen und anderen nicht-neuronalen Zelltypen angewendet werden.

Introduction

Die Patch - Clamp - Technik wurde zuerst von Neher und Sakmann in den 1970er Jahren entwickelt , um die Ionenkanäle von erregbaren Membranen ¹ zu studieren. Seitdem wurde die Patch-Clamping auf die Untersuchung vieler verschiedener Subjekte auf zellulärer, synaptischer und Circuit-Ebene angewendet - sowohl in vitro als auch in vivo - in vielen verschiedenen Zelltypen, einschließlich Neuronen, Kardiomyozyten, Xenopus-Oozyten und künstlichen Liposomen ² . Dieser Prozess beinhaltet die korrekte Identifizierung und Ausrichtung einer Zelle von Interesse, komplizierte Mikromanipulator-Steuerung, um die Patch-Pipette in der Nähe der Zelle zu bewegen, die Anwendung von positiven und negativen Druck auf die Pipette zur richtigen Zeit, um eine enge Gigaseal Patch, Und ein Einbruch, um eine Ganzzell-Patch-Konfiguration zu etablieren. Patch-Clamping wird in der Regel manuell durchgeführt und erfordert umfangreiche Schulungen zu meistern. Auch für einen Forscher, der mit dem Patch erlebt wurdeKlemme, die Erfolgsquote ist relativ gering. In jüngster Zeit wurden mehrere Versuche unternommen, Patch-Clamp-Experimente zu automatisieren. Zwei Hauptstrategien haben sich entwickelt, um die Automatisierung zu erreichen: die Erweiterung der Standard-Patch-Clamp-Ausrüstung, um die automatische Steuerung des Patching-Prozesses und die Gestaltung neuer Geräte und Techniken von Grund auf zu ermöglichen. Die frühere Strategie ist an vorhandene Hardware anpassbar und kann in einer Vielzahl von Patch-Clamp-Anwendungen verwendet werden, einschließlich in vivo Blind Patch Clamp ^{3 , 4 , 5} , in vitro Patch Clamp von akuten Hirnschnitten, organotypischen Slice Kulturen und kultivierten dissoziierten Neuronen ⁶ . Es ermöglicht die Abfrage von komplexen lokalen Schaltungen durch die Verwendung mehrerer Mikromanipulatoren gleichzeitig ⁷ . Die Planar-Patch-Methode ist ein Beispiel für die neue Entwicklungsstrategie, die gleichzeitig den Hochdurchsatz erreichen kannAtch Klemme von Zellen in Suspension für Drogen-Screening-Zwecke ⁸ . Allerdings ist das Planar-Patch-Verfahren nicht für alle Zelltypen, insbesondere für Neuronen mit langen Prozessen oder intakten Schaltungen, die umfangreiche Verbindungen enthalten, anwendbar. Dies beschränkt seine Anwendung auf die Abbildung der komplizierten Schaltungen des Nervensystems, was ein wichtiger Vorteil der traditionellen Patch-Clamp-Technologie ist.

Wir haben ein System entwickelt, das den manuellen Patch-Clamp-Prozess in vitro automatisiert, indem er Standard-Patch-Clamp-Hardware erweitert. Unser System, Autopatcher IG, bietet automatische Pipettenkalibrierung, Fluoreszenzzelle Zielidentifikation, automatische Steuerung der Pipettenbewegung, automatisches Ganzzellpatching und Datenlogging. Das System kann automatisch mehrere Bilder von Gehirnscheiben in verschiedenen Tiefen erwerben; Analysiere sie mit Computer Vision; Und extrahieren Informationen, einschließlich der Koordinaten von fluoreszenzmarkierten Zellen. Diese Information kann dann seinVerwendet, um zu zielen und automatisch patch Zellen von Interesse. Die Software ist in Python geschrieben - eine freie, Open-Source-Programmiersprache - mit mehreren Open-Source-Bibliotheken. Dies sorgt für die Zugänglichkeit für andere Forscher und verbessert die Reproduzierbarkeit und Strenge der elektrophysiologischen Experimente. Das System ist modular aufgebaut, so dass zusätzliche Hardware problemlos mit dem hier dargestellten System verbunden werden kann.

Protocol

1. Systemeinrichtung

1. Konstruktionsdruckgerät ausbauen.
   1. Montieren Sie das Druckregelgerät gemäß Schaltplan ( Abbildung 1 ). Löten Sie die notwendigen Teile auf die Leiterplatte (Leiterplatte), die nach den Schaltplänen der elektrischen Schaltungen hergestellt wurde ( Abbildung 1b ). Verwenden Sie Standardwiderstände, LEDs, Metall-Oxide Semiconductor Feld-Eeffect Transistoren (MOSFETs), Kondensatoren und Steckverbinder (siehe Tabelle der Materialien ). Lötmagnetventile auf die Leiterplatte auftragen. Verbinden Sie die Luftpumpe und den Luftdrucksensor mit der elektrischen Leiterplatte mit der Leiterplatte.
      HINWEIS: Es dauert ca. 2 h, um die Druckregelung mit allen notwendigen Teilen zu fertigen.
2. Verbinden Sie die Sekundärdatenerfassung (DAQ).
   1. Verbinden Sie die Datenausgänge von der Leiterplatte mit der DAQ-Platine nach Tabelle 1 .
      HINWEIS: Der DAQ-Vorstand wilIch laufe in "Single-Ended-Modus". Die Port-Karte finden Sie im Benutzerhandbuch (siehe Tabelle der Materialien ).
   2. Verbinden Sie "AIn Pr S" mit einem der analogen Eingangs- (AI-) Kanäle und "R-Gr" zu einem der analogen Gründe auf der sekundären DAQ-Platine.
   3. Verbinden Sie den Primärausgang vom Verstärker mit einem der AI-Kanäle und der Masse auf die analoge Masse der sekundären DAQ-Platine.
      HINWEIS: Ein Standard-BNC-Kabel kann verwendet werden, um den primären Ausgang des Verstärkers anzuschließen.
   4. Streifen Sie das andere Ende und verbinden Sie das positive Signal ( dh Kupferkern) mit dem AI-Kanal und dem Boden ( dh dem dünnen Draht um den Kern) mit dem analogen Boden. Wiederholen Sie diesen Schritt für einen zweiten Kanal, wenn mehr als ein Patchkanal verwendet wird.
      HINWEIS: Der analoge Eingang der DAQ-Karte wird in späteren Schritten konfiguriert.
   5. Schließen Sie die Stromversorgung der sekundären DAQ-Platine an. Verwenden Sie eine separate 12 V Leistung soDringend für die Pumpe.
3. Verbinden Sie den Schlauch.
   1. Die Luftpumpe und die beiden Ventile gemäß Tabelle 2 anschließen . Verwenden Sie einen 3-Wege-Steckverbinder, um den Weichschlauch vom Ventil 2 oben, dem Drucksensor und dem Pipettenhalter im letzten Schritt zu verbinden.
   2. Fügen Sie einen weiteren 3-Wege-Stecker zu dem Schlauch hinzu, der mit dem Pipettenhalter verbunden ist, wenn zwei Pipetten verwendet werden. Manuelles Umschalten zwischen den Ventilen und den Pipetten im Einsatz beim Patching.
4. Installiere Autopatcher IG.
   HINWEIS: Systemvoraussetzung: Autopatcher IG wurde nur auf einem PC mit Windows 7 getestet. Es wurde nicht für andere Betriebssysteme validiert. Das beschriebene Verfahren gilt speziell für die in der Werkstoffliste aufgeführten Hardware.
   1. Laden Sie Autopatcher-IG von GitHub herunter (https://github.com/chubykin/AutoPatcher_IG).
   2. Installieren Sie Python (siehe Tabelle der Materialien für die Version und Download-Adresse).
   3. Deinstallieren Sie das PyQt4Bibliothek, indem Sie "pip deinstallieren" PyQt4 "in einem Kommandozeilen-Terminal.
      HINWEIS: Das System verwendet eine ältere Version der PyQt4-Bibliothek, um die Kompatibilität mit den Qwt- und Opencv-Bibliotheken zu erreichen.
   4. Installieren Sie Python-Bibliotheken aus historischen Rad-Dateien (http://www.lfd.uci.edu/~gohlke/pythonlibs/). Finden Sie die folgenden Dateien: Numpy (pymc-2.3.6-cp27-cp27m-win32.whl), Opencv (opencv_python-2.4.13.2-cp27-cp27m-win32.whl), Pyqt (PyQt4-4.11.4-cp27-none -win32.whl) und Qwt (PyQwt-5.2.1-cp27-none-win32.whl).
      1. Um die Rad-Dateien zu installieren, geh in das Verzeichnis, in dem die Dateien gespeichert sind und tipp "pip install *** wheelfilename ***. Whl." Ersetzen Sie "*** wheelfilename ***" mit dem tatsächlichen Namen der Datei.
         HINWEIS: "cp27" im Rad Dateinamen zeigt Python 2.7 und "win32" angegeben Windows 32-Bit. Wenn "win32" nicht funktioniert, versuchen Sie "win64".
   5. Um die CCD-Kamera zu steuern, laden und installieren Sie das InstallationsprogrammFür 64-bit (https://www.qimaging.com/support/software/). Dann laden Sie MicroManager für 64-Bit (https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release) herunter, um die Kamera in Python zu steuern.
   6. Um die Manipulatoren und die Mikroskopstufe zu steuern, installieren Sie die vom Hersteller bereitgestellte Steuerungssoftware.
      HINWEIS: Auf diese Weise ist der Treiber erforderlich, um die Manipulatoren zu kontrollieren. Das Installationspaket wird üblicherweise auf einer CD-ROM bereitgestellt.
   7. Um die sekundäre DAQ-Platine zu steuern, installiere die Universal Library von CD-ROM, die mit dem Kauf des DAQ-Boards ausgestattet ist.
5. Konfiguriere die Hardware für Autopatcher IG.
   1. Verbinden Sie die Mikroskopstufe und die Manipulatorsteuerungen über USB-Ports mit dem Computer.
   2. Zuweisen von COM-Portnummern zu Einheit 0: Mikroskopstufe, Einheit 1: linker Manipulator und Einheit 2: rechter Manipulator, in dieser Reihenfolge, in der Konfigurationsdatei "ports.csv" im Ordner "Konfiguration". LEave die anderen Parameter in der Datei ports.csv ( dh "SCI" ​​und "1") unverändert.
      HINWEIS: Die Informationen zur COM-Portnummer können durch Ausführen der Manipulator-Konfigurations-Software des Herstellers gefunden werden. Gehen Sie auf die Registerkarte "Einstellungen", wählen Sie "Einstellungen" und die "Motion" -Seite und lesen Sie die Etiketten für jede Registerkarte oben. Alternativ finden Sie diese Informationen im PC Device Manager.
   3. Zuordnen von analogen Eingangskanalnummern auf der DAQ-Platine für einen Drucksensor und Patchkanal 1 und 2 (entsprechend Einheit 1 und 2). Geben Sie die Kanalnummer in der Datei "DAQchannels.csv" im Ordner "Konfiguration" ein.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, die .csv-Dateien mit der Notepad-Anwendung anstelle einer Tabellenkalkulation zu öffnen, da sie die Informationen beim Speichern von Änderungen ändern kann.
6. Führen Sie Autopatcher IG aus.
   1. Schalten Sie den Verstärker, den Mikroskop Controller und den Manipulator Controller ein. EnsuRe, dass die Verstärker-Software läuft.
   2. Führen Sie Autopatcher IG mit Python von einem Befehlszeilen-Terminal wie folgt aus: Ändern Sie zuerst das Verzeichnis (Befehl "cd" für die meisten gängigen Terminals), wo Autopatcher IG installiert ist, geben Sie "python Autopatcher_IG.pyw" in der Befehlszeile Terminal ein und drücken Sie die "Enter-Taste.
      HINWEIS: Führen Sie die Manipulator-Steuerungssoftware nicht aus, bevor Sie Autopatcher IG ausführen, da es das Mikroskopstadium und den Manipulator einnimmt, wodurch Autopatcher IG die Hardware nicht finden kann. Manipulator-Steuerungssoftware kann ausgeführt werden, nachdem der Autopatcher IG vollständig eingeleitet wurde, wenn zusätzliche Module gesteuert werden sollen ( z. B. die Inline-Heizung).
7. Kalibrieren Sie die Primärpipette.
   1. Ziehen Sie Patchpipetten wie zuvor beschrieben ⁹ . Füllen Sie eine gezogene Glaspipette mit interner Lösung und legen Sie sie auf die Kopfstufe.
      HINWEIS: Leere Glaspipetten haben unterschiedliche Kontraste unterDas Mikroskop und kann zu einer ungenauen Kalibrierung führen.
   2. Bewegen Sie die Pipettenspitze auf das Mikroskop-Gesichtsfeld und bringen Sie sie in den Fokus. Wenn das Wähltasten verwendet wird, um die Manipulatoren und / oder das Mikroskopstadium zu bewegen, aktualisieren Sie die Koordinaten durch Drücken von "z" auf der Tastatur.
      HINWEIS: Diese Aktion ist nicht erforderlich, wenn die Tastatur (Mikroskopstufe: A / D - x-Achse, W / S - y-Achse, R / F - z-Achse; Manipulatoren: H / K - x-Achse, U / J-y-Achse, O / L-z-Achse, 1/2 - Einheitsnummer) wird zur Steuerung der Bewegung verwendet, da die Koordinaten in Echtzeit aktualisiert werden.
   3. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Kalibrierung starten" auf der grafischen Benutzeroberfläche (GUI) für die entsprechende Einheit, auf der die Pipette geladen ist ( Abbildung 2 ).
      HINWEIS: Nach Abschluss der Kalibrierung erscheint ein Popup-Fenster.
      HINWEIS: Die Kalibrierung erfolgt automatisch, was ca. 3,5 min dauert. Klicken Sie auf die gleiche Taste (umgeschaltet auf "Kalibrierung abbrechen" afDie Kalibrierung auslösen) wird den Kalibrierungsversuch abbrechen.
   4. Speichern Sie die Kalibrierung, indem Sie auf "Kalibrierung speichern" am unteren Rand der Haupt-GUI (es speichert die aktuelle Kalibrierung für beide Manipulatoren und kann in der Zukunft geladen werden).
      HINWEIS: Das Sichtfeld unter niedriger (4 oder 10X) und hoher (40facher) Vergrößerung muss für die sekundäre Kalibrierung ausgerichtet sein, um ordnungsgemäß zu funktionieren. Bitte beachten Sie die Bedienungsanleitung des verwendeten optischen Systems für die Ausrichtungsverfahren.

2. Automatische Patch-Clamp-Prozedur

1. Bereiten Sie akute Hirnscheiben vor, wie zuvor beschrieben ¹⁰ .
2. Glaspipetten für die Patchklemme vorbereiten.
3. Lege eine Hirnscheibe in die Mitte der Aufnahmekammer. Stabilisieren Sie die Scheibe mit einer Scheibe Niederlage oder "Harfe".
4. Erfassen Sie die fluoreszierende Zelle.
   1. Finden Sie den Bereich des Interesses unter dem 4X Objektiv. Bewegen Sie die Mikroskopstufe, indem Sie Cli einschaltenCk-to-move ("CTM") Modus und klicken Sie auf die Mitte des Bereichs von Interesse. Alternativ können Sie die Mikroskopstufe (A / D - x - Achse, W / S - y - Achse, R / F - z - Achse) bewegen.
   2. Wechseln Sie auf das Objektiv mit hoher Vergrößerung und stellen Sie den Fokus ein, indem Sie das Mikroskop in die z-Achse bewegen, indem Sie R / F auf dem Tastenfeld verwenden.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, den Wasserbadstand so einzustellen, dass die Brennebene unter den Objektiven mit niedriger und hoher Vergrößerung in der z-Achse gleich oder ähnlich ist.
   3. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Ermitteln der Zelle" in der Haupt-GUI-Spalte "Einheit 0". Wenn die LED oder Laserlichtquelle des Setups nicht durch das TTL-Signal gesteuert werden kann, schalten Sie die LED / Laser manuell ein. Erscheint ein Popup-Fenster, wenn die Zellenerkennung beendet ist.
      1. Schalten Sie bei Bedarf die LED / Laser aus. Eine Liste der Zellenkoordinaten erscheint in der GUI "Speicherpositionen". Entfernen Sie unerwünschte Zellen aus der Liste, indem Sie neben den Koordinaten auf die Schaltfläche "X" klicken.
      2. Alternativ, wenn Zielzellen nicht fluoreszenzbeschriftet sind, klicken Sie auf der Haupt-GUI auf "Mausmodus". Klicken Sie auf die Zelle von Interesse; Ein gelber Punkt mit einer Nummer erscheint auf der Zelle, und die Koordinaten der Zelle erscheinen in der GUI "Speicherpositionen".
5. Kalibrieren Sie die Sekundärpipette.
   1. Füllen Sie 1/3 einer Glaspipette mit interner Lösung. Legen Sie die Pipette auf den Pipettenhalter, der an der Kopfstufe befestigt ist.
   2. Verwenden Sie das Objektiv mit geringer Vergrößerung. Bringen Sie die Pipette in das Gesichtsfeld und stellen Sie den Fokus über die Tastatur (H / K - x-Achse, U / J-y-Achse, O / L-z-Achse) ein. Verwenden Sie "1" und "2", um zwischen Gerät 1 und Gerät 2 umzuschalten.
   3. Laden Sie die primäre Kalibrierung, indem Sie auf "Kalibrierung laden" klicken. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Sekundäre Kalibrierung" auf der Haupt-GUI unter dem Gerät, das verwendet wird. Wenn zum Beispiel die Einheit 2 verwendet wird, klicken Sie auf die Schaltfläche "Sekundäre Kalibrierung" in der "Einheit 2" coSäule Folgen Sie den Anweisungen des Popup-Fensters, um zum Objektiv mit hoher Vergrößerung zu wechseln.
6. Patch eine Zielzelle.
   1. Stellen Sie sicher, dass die Software "MultiClamp" ( dh Verstärker) läuft. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Patch Control", um die "Patch Control" GUI zu öffnen. Es kann bis zu ein paar Minuten dauern, um diese GUI zu öffnen.
   2. Verwenden Sie das 40fache Vergrößerungsobjektiv, indem Sie "40X" auf der Haupt-GUI "Einheit 0" Spalte überprüfen. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Gehe zu" neben der Zelle von Interesse auf der Koordinatenliste in der "Speicherposition" GUI; Das Mikroskop bewegt sich in die Zelle.
   3. Klicken Sie auf die CTM-Taste des Gerätes, das in der Haupt-GUI verwendet wird, um die Bewegung nach einem Mausklick zu aktivieren. Klicken Sie auf die Zelle von Interesse; Die Pipettenspitze bewegt sich in die Zelle.
   4. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Patch" auf der GUI "Patch Control".
      HINWEIS: Das automatische Patching beginnt, und der Druck und der Widerstand können überwacht werdenDie "Patch Control" GUI.
      1. Verwenden Sie die Taste "Gerät 1 ausgewählt", um das Eingangssignal zwischen den beiden Geräten umzuschalten.
         HINWEIS: Das System nähert sich der Zielzelle an, übt einen negativen Druck an, passt sich dem Zellmembranpotential an und erkennt die Gigasealbildung auf der Grundlage einer Reihe von Druck- und Widerstandsschwellen und Logik.
      2. Manipulieren Sie den automatischen Prozess an einem beliebigen Punkt, indem Sie auf die entsprechenden Schaltflächen auf der "Patch Control" GUI klicken. Zum Beispiel klicken Sie erneut auf die Schaltfläche "Patch", um die Patch-Testversion abzubrechen und auf "Next stage" zu klicken, um den Patching-Prozess auf den nächsten Schritt zu bringen, unabhängig von der Schwelle.
         HINWEIS: Ein Pop-up-Fenster benachrichtigt den Benutzer, wenn ein Gigaseal gebildet hat, und die Option, zap zusammen mit großem Unterdruck anzuwenden, wird präsentiert.
   5. Wählen Sie "Ja", um mit kombinierten Zap und Saugen zu brechen. Alternativ wählen Sie "Nein", um nur mit Absaugung zu brechen.
      
   6. Speichern Sie das Experiment-Patch-Protokoll.
      HINWEIS: Wenn ein Patch-Test nicht erfolgreich ist, wird ein Popup-Fenster den Benutzer benachrichtigen und der Patch-Prozess wird zurückgesetzt.
   7. Gehen Sie zurück zu Schritt 2.4 und wiederholen Sie die Schritte mit einer anderen Zelle.
7. Verfeinern Sie die Patching-Schwellen (optional).
   HINWEIS: Schwellenwerte für den anfänglichen Pipettenwiderstandsbereich, positiver und negativer Druck, gigasealer Widerstand usw. Kann aus einer Konfigurationsdatei geändert werden.
   1. Öffnen Sie die Datei "PatchControlConfiguration.csv" im Ordner "Konfiguration" am Zielort, an dem das System installiert ist. Ändern Sie die Zahlen, die jedem Schwellenwert entsprechen. Ändern Sie nicht die Namen der Werte. Dies führt zu nicht erkennbaren Einträgen im System.
   2. Die neuen Schwellenwerte sofort durch Drücken von "CtRl + L "ohne Neustart des Programms, Neustart des Programms wird den neuesten Schwellenwert aus der Datei implementieren.

3. Aufnahmen machen

HINWEIS: Der Modus im computergesteuerten Mikroelektrodenverstärker wird von der Autopatcher-Software automatisch auf Current Clamp ("IC") gesetzt, sobald ein erfolgreicher Patch erreicht ist. Vollständige Patch-Clamp-Aufnahmen können mit der Aufnahmesoftware der Wahl durchgeführt werden (dieses System enthält keine Aufzeichnungsfunktion). Wenn mehrere Zielzellen identifiziert wurden, nach Abschluss einer Aufnahme, gehen Sie zurück zu Schritt 2.4 und versuchen Sie eine andere Zelle.

1. Führen Sie automatische lokale Drogen-Anwendung Experimente mit einem picospritzer (optional).
   HINWEIS: Hier wird ein lokales Arzneimittelanwendungsexperiment als Beispiel verwendet, um zu beschreiben, wie man die zusätzliche "Befehlsfolge" -Funktion verwendet, um externe Hardware durch TTL-Signale zu steuern.
   1. Port anschließen A chaNnel 0 und die Masse auf der sekundären DAQ-Platine zum Start-Trigger-Eingang am Digitalisierer unter Verwendung eines abgestreiften BNC-Kabels (wie in Schritt 1.2.3 beschrieben). Verbinden Sie einen digitalen Ausgangskanal auf dem Digitalisierer mit dem externen Trigger auf dem picospritzer.
   2. Bereiten Sie den Picospritzer entsprechend der Bedienungsanleitung vor. Verbinden Sie den picospritzer Luftausgang mit dem an einem Mikromanipulator angebrachten Arzneimittel-Puff-Pipettenhalter.
   3. Legen Sie eine Pipette mit einem Medikament der Wahl gefüllt. Bringen Sie es an den Pipettenhalter an. Kalibrieren Sie die Pipette, wie in Schritt 1.7 beschrieben.
   4. Nach dem Patching einer Zelle, wie in Schritt 2.6 beschrieben, wählen Sie einen gewünschten Ort für die Medikamentenabgabe durch Mausklick in die Kamera-Ansicht GUI unter "Maus-Modus" (von der Haupt-GUI umgeschaltet). Alternativ verwenden Sie die "Grid" GUI, um ein Raster zu entwerfen, wobei jedes Pixel im Raster als einer der Zielorte ist.
      HINWEIS: Das Raster kann in der Kamera-Ansicht GUI manipuliert werden, indem man mit der Maus zieht.
   5. Im "Command SequEnce "GUI, wählen Sie die Manipulatoreinheit, auf der die Medikamentenpipette montiert ist. Klicken Sie auf" Mauszeilen laden "oder" Gitterpunkte laden ", um alle Koordinaten für die Medikamentenabgabe zu importieren.
      1. Klicken Sie auf jeden Koordinateneintrag, um den spezifischen Befehl TTL-Signal in der rechten Spalte zu bearbeiten. Klicken Sie im ersten Befehlseingang auf die rechte Ziffer, um sie von "0" auf "1" zu schalten, um ein + 5-V TTL-Signal zu senden. Stellen Sie die Zeit (T) auf die gewünschte TTL-Signaldauer ein, in ms.
      2. In der zweiten Befehlseingabe alle Ziffern auf "0" setzen und T auf die Dauer der Aufzeichnungslänge des Versuches einstellen. Bearbeiten von Befehlen für alle Koordinateneinträge. Fügen Sie Befehlseinträge hinzu, indem Sie auf "+" klicken, wenn mehrere TTL-Signale erforderlich sind.
         HINWEIS: Die 8-stelligen Bits stellen den Port dar A-Kanäle 0-7 auf dem sekundären DAQ (Anschlüsse 1 - 3 sind von der Pumpe und zwei Ventilen belegt) können bei Bedarf umgeschaltet werden.
   6. Erstellen Sie ein Aufzeichnungsprotokoll im Datenerfassungsmodul soDass der Start eines Sweep durch den externen Startauslöser ausgelöst wird. Bearbeiten Sie das Protokoll, um das Medikament zur gewünschten Zeit zu liefern.
   7. Klicken Sie in der GUI "Command Sequence" auf "Run" auf der linken Seite, um alle Koordinaten auszuführen. Alternativ klicken Sie auf "Ausführen" auf der rechten Seite, um nur die ausgewählte Sequenz auszuführen.
      HINWEIS: Die Pipette bewegt sich zu jeder Koordinate und führt das TTL-Signal aus, wie es zum Starten des Aufzeichnungs-Sweep definiert ist.

Representative Results

Unser System wurde auf seine Fähigkeit getestet, Zellen in akuten Hirnschnitten, Maus induzierten Pluripotenten Stammzellen (iPSCs) differenziert in Neuronen, und HEK 293 Zellen künstlich ausdrücken Kanäle von Interesse. Abbildung 3 zeigt ein Experiment mit Thy1-ChR2-YFP-transgenen Mäusen (B6.Cg-Tg (Thy1-COP4 / EYFP) 18Gfng / J), die auf fluoreszenzmarkierte Schicht-5-Pyramiden-Neuronen im visuellen Kortex zielen. Die Zielzelle war eine der automatisch identifizierten grün fluoreszenz-positiven Zellen ( Abbildung 3b ). Fig. 3a ist das Differential Interference Contrast (DIC) -Bild des gepatchten Neurons. Die Ganzzellkonfiguration wurde durch das automatische Patching-Protokoll in den Schritten 2.5 - 2.6 erreicht und wurde durch stufenstrominduzierungsinduzierte Aktionspotentiale validiert ( Abbildung 3c )

1 "> Um die zusätzliche" Command Sequence "-Funktion zu demonstrieren, haben wir 500 mM KCl für 200 ms an drei Stellen auf einer Hirnscheibe geliefert, während wir eine Zelle patchten ( Abbildung 4 ). Zuerst haben wir 3 Standorte auf der Gehirnscheibe ausgewählt: eine enge Die Koordinaten wurden in die "Command Sequence" GUI unter "Unit1" geladen, was der Manipulator war, dass die KCl- Es wurden die Befehle in die linke Spalte gesetzt, um ein + 5-V-TTL-Signal für 500 ms zu senden, gefolgt von 0 V für 10 s ( Abbildung 4a ) von Port A-Kanal 0 auf der sekundären DAQ-Platine, Die mit dem Digitizer "start trigger" -Eingang verbunden war, Abbildung 4c zeigt, dass die gepatchte Zelle ein regelmäßiges Spiking-Neuron war. Die Drogenanwendungspipette (Einheit 1) durchquerte die drei ausgewählten Orte aUtomatisch ( Abbildung 4b ), und wir haben 10 s für jede Anwendung unter Spannungsklemme aufgezeichnet ( Abbildung 4d ). Die Farbe der Spuren in Fig. 4d entspricht der Randfarbe in Fig. 4b . Als KCl an der Zelle paffte, wurde ein großer nach innen gerichteter Strom beobachtet, der langsam abnahm, als KCl diffundierte. Roter Fluoreszenzfarbstoff wurde der KCl-Lösung zugesetzt, um die räumliche Verteilung der Arzneimittelabgabe anzuzeigen, und wurde unter Verwendung von kombinierter DIC und epifluoreszierender Bildgebung abgebildet. Dieses Experiment verdeutlichte die Leichtigkeit und Flexibilität unseres Systems, um Manipulator / Mikroskop-Bewegung und externe Hardware durch TTL-Signale zu steuern.

Abbildung 1. Druckregelgerät. A: Leiterplatte (Leiterplatte) zum Anschluss der Ventile, DruckSensor und Luftpumpe. Die linke zeigt Details auf der Leiterplatte, Etikettierung von Ausgängen, die im Protokoll erwähnt werden. Das Recht zeigt die Verbindung zwischen der Platine und der Luftpumpe, dem USB-Port und dem Schlauch. B: Schaltplan für die Leiterplatte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. Autopatcher-GUI. Die im Protokoll erwähnten Tasten sind in roten Quadraten dargestellt und nummeriert. 1: Kalibrierung starten, 2: Kalibrierung speichern, 3: Kalibrierung laden, 4: Sekundäre Kalibrierung, 5: Erkennung der Zelle, 6: Patch-Steuerung, 7: Gehen Sie zu (Zielzellenkoordinate) und 8: Patch. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. Ein Beispiel für die gepatchte ChR2-YFP-positive Zelle. A: 40fache Vergrößerung unter DIC-Optik. B: Epifluoreszenzbild der gleichen Zelle im Panel A (LED-Beleuchtung bei 488 nm). C: Strom-Clamp-Aufnahmen aus der gepatchten Zelle während einer Reihe von hyperpolarisierenden und depolarisierenden Stufenstrom-Injektionen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4. Durchführung eines automatisierten Drug Delivery Experiments. A: Ausgewählte Orte, die in die GUI "Command Sequence" geladen wurden. Die linke Spalte zeigtDie Liste der Koordinaten und die rechte Spalte zeigt die Liste der Befehle in Form von TTL-Signalen für jeden Standort an. B: Screenshots während des Medikamentenanwendungsexperiments entsprechend den drei ausgewählten Orten. Einheit 1 war die KCl-haltige Pipette und Einheit 2 war die Patchpipette. KCl-Lösung wurde zum Zwecke der Visualisierung mit rotem Fluoreszenzfarbstoff gemischt. Bilder wurden durch Kombination von DIC und Fluoreszenzbildgebung erhalten. C: Schrittstrom-Injektionen, die ein regelmäßiges Spiking-Neuron zeigen. D: Spannungsklemmenaufzeichnungsspuren aus der lokalen Applikation von 500 mM KCl-Lösung an drei Standorten. Die rote Spur mit nach innen gerichtetem Strom wurde aus dem Versuch aufgezeichnet, als die KCl-Anwendung nahe der gepatchten Zelle war. Der rote Pfeil zeigt den Zeitpunkt der KCl-Anwendung an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Steckdose auf der Leiterplatte	Portname auf dem DAQ-Board	Port # auf DAQ-Board	Anmerkung
DOUT V1	Port A Kanal 1	22	Steuerventil 1
DOUT V2	Port A Kanal 2	23	Steuerventil 2
DOUT P	Port A Kanal 3	24	Luftpumpe einstellen
GR	Boden	29	Boden

Tabelle 1. Leiterplatte (Leiterplatte) zur sekundären Datenerfassung (DAQ) -Konfiguration. Verwenden Sie diese Tabelle, um PCB-Ausgänge (erste Spalte von links) mit Ports auf der DAQ-Platine zu verbinden (zweite Spalte von links). Der Portname und die Nummer des sekundären DAQ beziehen sich auf den Single-Ended-Modus.

Tabelle 2. Schlauchverbindungen vom Druckregelgerät zum Pipettenhalter (n). Für jede Verbindung verbinden Sie die entsprechenden Ports, die mit einem grauen Kasten markiert sind, mit weichen Schläuchen (siehe Tabelle der Materialien ).

Discussion

Hier beschreiben wir eine Methode für automatische bildgeführte Patch-Clamp-Aufnahmen in vitro . Die wichtigsten Schritte in diesem Prozess sind wie folgt zusammengefasst. Zuerst wird Computer Vision verwendet, um die Pipettenspitze automatisch mit einer Reihe von Bildern zu erkennen, die über ein Mikroskop aufgenommen wurden. Diese Information wird dann verwendet, um die Koordinatentransformationsfunktion zwischen dem Mikroskop und den Manipulator-Koordinatensystemen zu berechnen. Computer Vision wird verwendet, um automatisch fluoreszenzmarkierte Zellen zu erkennen und ihre Koordinaten zu identifizieren. Diese Schritte sind mit Pipetten-Targeting und dem automatischen Patching-Algorithmus unter Verwendung der Open-Source-Python-Programmiersprache, PyQT und OpenCV-Bibliotheken integriert.

Im Vergleich zu bestehenden In-vitro- Patch-Clamp-Methoden macht dieses System in den verschiedenen Bereichen deutliche Verbesserungen. Es minimiert menschliches Eingreifen. Dieses System automatisiert die meisten Schritte im Patch-Clamp-Experiment, minimiert die AnforderungFür menschliches Eingreifen. Einige der verbleibenden manuellen Schritte, einschließlich der Umschaltung zwischen den Low- / High-Magnification-Mikroskop-Objektiven, können mit zusätzlichen motorisierten Hardware automatisiert werden.

Die Patch-Clamp-Methode verbessert den Durchsatz. Patch-Clamp-Experimente mit diesem System erzielten höhere Erfolgsraten und kürzere Zeiten für jede Studie, was zu einer deutlichen Steigerung des Gesamtdurchsatzes beiträgt. Der Computer-Vision-Algorithmus für die Fluoreszenzzellenerfassung und die Pipettenspitzenerkennung ist sehr robust und die Fehlerrate war sehr gering. Der durchschnittliche Fehler für die Pipettenspitzenerfassung betrug 1,6 μm, und die falsch-positive Rate für die Fluoreszenzzelldetektion betrug 4,9% ± 2,25%. Ein detaillierter Vergleich zwischen traditionellen manuellen Patching und automatischen Patching wurde gemacht ⁶ .

Detaillierte Dokumentation von Experimenten ist möglich. Patch-Protokolle jeder Studie können gespeichert und analysiert werden post-hoc . So ausführlichDie Dokumentation war bisher nicht für das manuelle Patching verfügbar. Dies ermöglicht die systematische Analyse von Patching-Experimenten in einzigartigen experimentellen Bedingungen, Zelltypen, Spezies und Slice-Präparaten.

Diese Methode zeigt die Kompatibilität mit Standard- In-vitro- Patch-Clamp-Ausrüstung. Unser System, wie in diesem Manuskript gezeigt, wurde entwickelt, um bestehende in vitro Patch-Clamp-Rigs zu erweitern, so dass sie die Fähigkeit, automatische Patching zu führen. Im Gegensatz zum Planar-Patch-Ansatz eignet sich dieses System auch für Laboratorien, die bereits eine manuelle Patch-Clamping durchführen, um ihre Geräte zu minimalen Kosten umzuwandeln. Gleichzeitig gibt es noch die Möglichkeit, manuell oder halbautomatisch mit demselben System zu patch.

Wegen der Anpassungsfähigkeit des oben erwähnten Systems ist die Verbindung der Hardware und die Konfiguration der Software vom Experimentator erforderlich, wenn das System zum ersten Mal eingerichtet wird. Probleme können auftretenVon falscher Portzuweisung und unzureichenden Treiberbibliotheken für die Steuerung bestimmter Hardware. Bitte beachten Sie die Schritte 1.2 - 1.4 bei der Fehlersuche.

Im Vergleich zur Teilautomatisierung bestehender Anlagen erreicht dieses System bei der konventionellen In-vitro- Patch-Clamping von akuten Hirnschnitten (und anderen in vitro- Präparaten) den maximalen Automatisierungsgrad. Dies gilt für alle Schritte, von der Zellenerkennung bis zur Pipettenkalibrierung bis zum Patching ^{7 , 11} . Der einzige Engpass ist der manuelle Prozess des Füllens und Änderns der Patchpipetten zwischen den Trails. Die jüngsten Entwicklungen bei der Wiederverwendung von Patchpipetten können dieses Problem potenziell lösen ¹² . Neben der Qualität der Scheibenvorbereitung entsteht der häufigste Grund für erfolglose Versuche von manipulatorischen mechanischen Fehlern und der Bewegung der Scheibe in der Kammer. Diese Einschränkungen sind außerhalb unserer Kontrolleaktuelles System. Es werden Anstrengungen unternommen, um eine enge, Echtzeit-Erkennung und Steuerung der Pipettenbewegung zu implementieren, um dieses Problem zu berücksichtigen.

Für die zukünftige Entwicklung sind wir daran interessiert, die derzeitigen Fluoreszenzzellen-Erkennungsfunktionen auf die allgemeine Zelldetektion unter DIC-Optik zu erweitern.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CCD Camera	QImaging	Rolera Bolt
Electrophysiology rig	Scientifica	SliceScope Pro 2000	Include microscope and manipulators. The manufacturer provided manipulator control software demonstrated in this manuscript is “Linlab2”.
Amplifier	Molecular Devices	MultiClamp 700B	computer-controlled microelectrode amplifier
Digitizer	Molecular Devices	Axon Digidata 1550
LED light source	Cool LED	pE-100	488 nm wavelength
Data acquisition board	Measurement Computing	USB1208-FS	Secondary DAQ. See manual at : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf
Solenoid valves	The Lee Co.	LHDA0531115H
Air pump	Virtual industry	VMP1625MX-12-90-CH
Air pressure sensor	Freescale semiconductor	MPXV7025G
Slice hold-down	Warner instruments	64-1415 (SHD-40/2)	Slice Anchor Kit, Flat for RC-40 Chamber, 2.0 mm, 19.7 mm
Python	Anaconda	version 2.7 (32-bit for windows)	https://www.continuum.io/downloads
Screw Terminals	Sparkfun	PRT - 08084	Screw Terminals 3.5 mm Pitch (2-Pin)
(2-Pin)
N-Channel MOSFET 60 V 30 A	Sparkfun	COM - 10213
DIP Sockets Solder Tail - 8-Pin	Sparkfun	PRT-07937
LED - Basic Red 5 mm	Sparkfun	COM-09590
LED - Basic Green 5mm	Sparkfun	COM-09592
DC Barrel Power Jack/Connector (SMD)	Sparkfun	PRT-12748
Wall Adapter Power Supply - 12 V DC 600 mA	Sparkfun	TOL-09442
Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG)	Sparkfun	PRT-11367
Locking Male x Female x Female Stopcock	ARK-PLAS	RCX10-GP0
Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Flexible Tubings	Fisher scientific	14-171-129	Outer Diameter: 1/8 in. Inner Diameter: 1/16 in.
BNC male to BNC male coaxial cable	Belkin Components	F3K101-06-E
560 Ohm Resistor (5% tolerance)	Radioshack	2711116
Picospritzer	General Valve	Picospritzer II