Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

A طريقة الترشيح القائم على إعداد نوى عالية الجودة من عبر ربط العضلات والهيكل العظمي للكروماتين مناعي

Published: July 6, 2017 doi: 10.3791/56013
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Texas Health Science Center at Houston

Summary

نقدم بروتوكول القائمة على الترشيح لعزل نوى ذات جودة عالية من عبر ربط الماوس العضلات والهيكل العظمي حيث أزلنا الحاجة لتنبيذ فائق، مما يجعلها قابلة للتطبيق بسهولة. وتبين لنا أن الكروماتين أعدت من نوى مناسبة للكروماتين مناعي ودراسات تسلسل مناعي لونين المرجح.

Abstract

الكروماتين مناعي (رقاقة) هو وسيلة قوية لتحديد البروتين ملزم الحمض النووي الكروماتين. ومع ذلك، فقد كانت العضلات الهيكلية الغنية بالألياف تحديا ل تشيب بسبب صعوبة تقنية في عزل نوى ذات جودة عالية مع الحد الأدنى من التلوث من ميوفيبريلز. وقد حاولت البروتوكولات السابقة لتنقية النوى قبل عبر ربط، مما يتكبد خطر تغير التفاعل الحمض النووي البروتين خلال عملية إعداد النوى لفترات طويلة. في البروتوكول الحالي، ونحن أولا عبر ربط الأنسجة العضلية والهيكل العظمي التي تم جمعها من الفئران، وكانت مفروم الأنسجة و سونيكاتد. منذ وجدنا أن تنبيذ فائق لم يكن قادرا على فصل نوى من ميوفيبريلز باستخدام الأنسجة العضلية عبر ربط، وضعنا إجراء الترشيح متتابعة للحصول على نوى عالية الجودة خالية من التلوث ميوفيبريل كبير. أعدنا في وقت لاحق لونين باستخدام أولتراسونيكاتور، ومقايسات رقاقة مع مكافحة الأجسام المضادة BMAL1 كشف قوية الإيقاعية ملزمةنمط BMAL1 لاستهداف المروجين الجينات. ويشكل بروتوكول الترشيح هذا طريقة قابلة للتطبيق بسهولة لعزل نوى عالية الجودة من الأنسجة العضلية الهيكلية عبر ربط، مما يسمح معالجة عينة متسقة للدراسات الساعة البيولوجية الحساسة وغيرها من الوقت. في تركيبة مع الجيل المقبل من التسلسل (نغس)، ويمكن نشر طريقتنا لمختلف الدراسات الميكانيكية والجينومية مع التركيز على وظيفة العضلات والهيكل العظمي.

Introduction

العضلات الهيكلية تلعب أدوارا مهمة في علم وظائف الأعضاء والسلوك. تتكون الألياف العضلية متعددة الأنوية من الليفي العضلي حيث وحدات أكتين وميوسين وظيفية تسمى ساركوميريز لتوليد قوة مقلص. العضلات والهيكل العظمي هو أيضا أكبر جهاز التمثيل الغذائي في الجسم، وهو ما يمثل> 80٪ تناول الجلوكوز بعد الأكل وتنظيم استجابة الأنسولين والتمثيل الغذائي التمثيل الغذائي 1 ، 2 . وينظم علم وظائف الأعضاء العضلات والتمثيل الغذائي عن كثب من قبل الساعة البيولوجية، وهو توقيت البيولوجي الجوهري 3 ، 4 ، 5 ، 6 . على سبيل المثال، أدى الحذف الخاص بالهيكل العظمي الخاص بالعضلات Bmal1 ، أحد مكونات الساعة اليومية الأساسية، إلى مقاومة الإنسولين وانخفاض امتصاص الجلوكوز في العضلات الهيكلية، وتم العثور على الحيوانات لتطوير داء السكري من النوع الثاني 7 . أنان بالإضافة إلى ذلك، يتم أيضا على نحو متزايد يجري تقدير العضلات والهيكل العظمي باعتباره جهاز الغدد الصماء 8 ، إفراز ميوكينس لتنظيم الأيض النظامية وعلم وظائف الأعضاء. مطلوب دراسات آلية لفهم كامل هذه الوظائف التنظيمية في العضلات والهيكل العظمي.

رقاقة هو نهج قوي لتحديد مروج توظيف الحمض النووي ملزم البروتينات. تم تطوير رقاقة في البداية لتحديد منظمة نوكليوسوم على الحمض النووي الكروماتين 9 ، 10 . وقد تم الإبلاغ عن مجموعة متنوعة من الأساليب لربط عبر البروتينات والحمض النووي الكروماتين باستخدام الفورمالديهايد، كبريتات ثنائي ميثيل أو الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) 11 ، 12 . الفورمالديهايد عبر ربط هو الأكثر استخداما، والحفاظ على بنية الكروماتين والتفاعلات الحمض النووي البروتين 9 ، 13 ، 14 . كرومات متصالبةفي تمزيقه بواسطة سونيكاتيون و إمونوبريسيبيتاتد مع الأجسام المضادة ضد بروتين ملزمة الحمض النووي محددة من الفائدة 15 ، 16 . في السنوات الأخيرة، تم تطوير رقاقة رقاقة (تشيب-سيق)، وهي طريقة تجمع بين رقاقة مع نغس، لاستجواب عامل النسخ على نطاق الجينوم ملزمة 17 ، وفي بعض الحالات لمراقبة التغيرات الديناميكية على مدى دورة بالطبع 18 ، 19 ، 20 . على سبيل المثال، وقد كشفت الدراسات التي أجريت على رقاقة تشيق سيقان جدا تسلسل مدبرة للغاية من ملزمة الجينومية لمكونات الساعة البيولوجية الساعة هيستون علامات، والذي يدفع مؤقتا التعبير الجيني دقيقة طوال دورة 24 ساعة ~ ساعة البيولوجية 18 .

تم تصميم معظم بروتوكولات رقاقة المتاحة للأنسجة الرخوة ( مثل الكبد والدماغ، وما إلى ذلك )، وعدد قليل جدا تم نشرها للأنسجة الصلبة بما في ذلك سكيلالعضلات. فمن الناحية الفنية تحدي تجانس الألياف الغنية بالهيكل العظمي العضلات وعزل نوى عالية الجودة 21 ، وخاصة بالنسبة للتجارب رقاقة التي تتطلب عبر ربط. في دراسة رقاقة العضلات الأخيرة 22 ، تم فصل الخلايا الأقمار الصناعية من ميوفيبرز، وأعدت نويات من كل من أنواع الخلايا من خلال إجراء لفترات طويلة تنطوي على هضم الأنسجة. استغرقت العملية برمتها حوالي ثلاث ساعات لإكمال قبل الفورمالديهايد عبر ربط تم تنفيذها على نوى معزولة. في حين تجنب هذا الإجراء عبر ربط الألياف العضلية، مما يجعل الأنسجة العضلية أكثر صهر إلى التجانس كفاءة، وكان قادرا على إنتاج نوى ذات جودة عالية، والتخلف الوقت كبير من جمع الأنسجة إلى نوى عبر ربط يتكبد خطر الحمض النووي المتغير -البروتين التفاعل. في المقابل، أجرى معظم الدراسات عبر ربط مباشرة بعد العلاج التجريبي أو جمع الأنسجة من أجل الحفاظ على الوقت الحقيقي الحمض النووي بروتين ملزمة 12 . والعيب الثاني لعزل النوى قبل الربط المتبادل هو أنه يحول دون تطبيقات حساسة للوقت مثل جمع العينات البيولوجية التي تحدث عادة على فترات تتراوح بين 3 و 4 ساعات. دون ربط عبر النوى، والعزلة يحتاج إلى الشروع فورا بعد تشريح، في حين يمكن معالجة عينات عبر ربط معا بعد اكتمال بالطبع كامل الوقت، وبالتالي ضمان الاتساق التجريبي أكبر.

كما تم الإبلاغ عن بروتوكولات أخرى للعزل النوى من العضلات والهيكل العظمي أونكروسلينكد. وقد وصفت دراستان استخدام تنظير فائق التدرج لفصل نوى من الخلايا الليفية المتبقية والحطام الخلية 23 ، 24 . في حين أن السكروز أو الغروية التدرج النابض للضوء فعالة مع أنسجة العضلات أونكروسلينكد، كشفت تجاربنا أنه بعد التشابك، فشلت الطرد المركزي التدرج التدريجي لفصل نوى من الخلية دإبريس، عن، ال التعريف، التدرج.

ولذلك وضعنا إجراء لعزل نوى ذات جودة عالية باستخدام عبر ربط الماوس العضلات والهيكل العظمي الأنسجة. بدلا من التدرج الطرد المركزي، وضعنا طريقة الترشيح التسلسلي لفصل فعال نوى من الحطام. بعد أولتراسونيكاتيون، تم تطبيق عينات لونين بنجاح لدراسات رقاقة التي أظهرت نمط الساعة البيولوجية من البروتين BMAL1 ملزمة لمروجي الهدف. طريقة لدينا يمكن تطبيقها على نطاق واسع لمختلف الدراسات الميكانيكية من أنسجة العضلات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم تنفيذ رعاية الحيوان بموجب المبادئ التوجيهية المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام اللجنة (إاكوك)، وأجريت الإجراءات وفقا لبروتوكول الحيوان التي وافق عليها مركز العلوم الصحية جامعة تكساس في هيوستن.

1. عزل النوى من الصليب-- مرتبطة العضلات والهيكل العظمي

  1. تزن واللحم المفروم أطرافهم الخلفية العضلات والهيكل العظمي، معزولة عن ما يقرب من 20 أسبوعا من العمر C57BL / 6 الفئران الذكور، في الجليد الفوسفات الفوسفات مخزنة المالحة (بس) كما هو موضح بالتفصيل سابقا 22 .
    ملاحظة: نحن عادة الحصول على 1.0 - 1.5 غرام من العضلات والهيكل العظمي من الماوس واحد.
    1. مكان المفروم الأنسجة العضلية الهيكل العظمي في أنبوب مخروطي 50 مل يحتوي على 10 مل بس على الجليد.
  2. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج في 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
  3. إزالة بعناية بس طاف عن طريق الشفط.
  4. تقدير حجم بيليه في كل أنبوب 50 مل باستخدام أنابيب مرجعية مع 1 و 2 و 3 و 4 مل من الماء.
  5. أضف 7 مجلدات منالجليد البارد 1٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني وتجانس العينات على الجليد باستخدام الخالط الأنسجة التحقيق (انظر جدول المواد ).
    ملاحظة: اختياري: يمكن إجراء إجراء التجانس في غرفة باردة.
  6. عبر ربط العينة عن طريق احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
  7. إخماد التفاعل عبر ربط بإضافة 1 M الجلايسين إلى تركيز النهائي من 0.125 M واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  8. الطرد المركزي العينات في 3000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة طاف عن طريق الشفط.
  9. شطف مع 10 مل من العازلة قاعدة الجليد الباردة (10 ملي هيبيس كوه في درجة الحموضة 7.3، 10 ملي إدتا، 10 ملي بوكل، 5 ملي مغكل 2 ، 0.5 ملي دت) تحتوي على مثبطات البروتينات المضافة الطازجة (0.2 ملي فينيلميثيلسولفونيل فلوريد (بمسف) ، و 10 ميكروغرام / مل ليوبيبتين). أجهزة الطرد المركزي في 3000 غرام لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وإزالة بعناية طاف عن طريق الشفط.
  10. ريسوسبيند بيليه في 6 مل من العازلة تحلل (10 ملي هيبيس-كوه في صH 7.3، 10 ملي إدتا، 10 ملي بوكل، 5 ملي مغكل 2 ، 0.5 ملي دت، 1٪ تريتون X-100) تحتوي على مثبطات بروتياز جديدة المضافة (0.2 ملي بمسف، و 10 ميكروغرام / مل ليوبيبتين).
  11. نقل العينة إلى بريشيلد 15 مل دونس الخالط واحتضان لمدة 10 دقيقة على الجليد.الانسجام تجانس كل عينة على الجليد مع 15 السكتات الدماغية بطيئة باستخدام مدقة فضفاضة تليها 15 السكتات الدماغية مع مدقة ضيقة للافراج عن نوى.
  12. تصفية جناسة (6 مل) من خلال مصفاة الخلية (حجم المسام: 100 ميكرون) وشطف مع 4 مل من العازلة تحلل. الطرد المركزي العينات في 1000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. ريسوسبيند إلى 5 مل من العازلة قاعدة الجليد الباردة و دونس 10 مرات مع مدقة ضيق لإطلاق نوى.
    1. إزالة قسامة من 20 ميكرولتر لقياس تركيز الحمض النووي مع مطياف (OD260 / OD280) والمراقبة المجهرية مع الأزرق التريبان إذا لزم الأمر (انظر أدناه) ( الشكل 1 A ).
  13. تصفية التعليق من خلالمصفاة الخلية (حجم المسام: 70 ميكرون)، وشطف الأنبوب وتصفية مرة أخرى مع 2 مل قاعدة عازلة كما هو مبين أعلاه.
  14. كرر الترشيح كما هو الحال في الخطوة 1.13 مع مصافي الخلية من انخفاض تدريجيا حجم المسام (40 ميكرون، 30 ميكرون، 20 ميكرون و 10 ميكرون).
    ملاحظة: في المجموع، تم استخدام مصافي من 6 أحجام المسام في الخطوات 1.12-1.14.
  15. أجهزة الطرد المركزي في 1000 غرام في 4 درجات مئوية لمدة 10 دقيقة. إزالة طاف و ريسوسبيند بيليه في 500 ميكرولتر قاعدة عازلة.
  16. قياس تركيز الحمض النووي على النحو الوارد أعلاه.
    ملاحظة: تم الحصول على ما يقرب من 200 ميكروغرام من الحمض النووي النووي من الجمع بين كل من أطرافه الخلفية من حيوان واحد. اختياريا، حفظ 20 ميكرولتر للمراقبة المجهرية مع تريبان الأزرق تلطيخ (الأسهم تركيز 0.4٪، التخفيف 1: 5). سوف نوى وصمة عار الأزرق ( الشكل 1 B ).
  17. أجهزة الطرد المركزي في 1000 غرام في 4 درجات مئوية لمدة 10 دقيقة، وتجاهل طاف. تخزين بيليه في -80 درجة مئوية.

2. سونيكيشن

<رأ>
  • ذوبان الجليد العينات في 500 ميكرولتر من سدز تحلل العازلة و ريسوسبيند مع بيبتينغ لطيف.
  • نقل تعليق الحمض النووي نوى إلى قارورة زجاجية على الجليد.
  • تشغيل سونيكاتيون مع رشقات نارية مركزة من الطاقة الصوتية بالموجات فوق الصوتية من محول على شكل طبق. راجع جدول المواد الخاصة بتفاصيل المعدات. استخدم الإعداد التالي: دورات لكل رشقة: 200؛ شدة: 5؛ ديوتي سيكل: 20؛ درجة الحرارة 4 - 6 درجة مئوية؛ 30 ثانية على / قبالة.
    ملاحظة: ويرد مثال لتقييم فعالية سونيكيشن في الشكل 2 .
  • نقل لونين سونيكاتد إلى أنبوب 1.5 مل. أجهزة الطرد المركزي في 12000 x ج لمدة 15 دقيقة ونقل طاف إلى أنبوب جديد. نقل 50 ميكرولتر من عينات سونيكاتد (~ 7-10 ميكروغرام / عينة العضلات) إلى أنبوب 1.5 مل جديد لعكس يشابك بين عشية وضحاها في 65 درجة مئوية. تجميد العينات المتبقية في -80 درجة مئوية.

    • 3. تقييم سونيكاتيون والكميات

    1. إضافة 1.0ميكرولتر من ريبونوكلياز A (500 U / مل ريبونوكلياز ريبونوكلياز: 20000 U / مل رنيس T1) إلى 50 عينات ميكرولتر سونيكاتد واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    2. إضافة 8 ميكرولتر من البروتيني K (10 ملغ / مل) واحتضان 30 دقيقة عند 55 درجة مئوية.
    3. حصاد الحمض النووي باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي.
      1. إضافة 5 مجلدات من العازلة ملزمة، وتطبيقه على عمود الدوران، وأجهزة الطرد المركزي في 4000 x ج، 10 دقيقة.
      2. تطبيق مرور من خلال نفس العمود وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى.
      3. يغسل مع غسل العازلة مرتين في 13000 x ج، 1 دقيقة.
      4. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 13،000 x ج، 1 دقيقة لتجفيف العمود.
      5. إضافة 50 ميكرولتر من H 2 O وأجهزة الطرد المركزي في 13000 x ج، 1 دقيقة إلى أزل الحمض النووي.
      6. تطبيق مرور من خلال نفس العمود وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى.
    4. تحديد كمية الحمض النووي مع مطياف (OD260 / OD280). تشغيل العينات على المواد الهلامية 0.8٪ لتقييم حجم وكمية (1 ميكروغرام) من المنتجات سونيكاتد ( الشكل 2 ).
      ملاحظة: متوسط ​​العائد لونين حوالي ~ 20٪.

    4. رقاقة

    1. ذوبان الجليد والكروماتين المحفوظة سابقا في -80 درجة مئوية وقسامة لونين إلى ~ 100 - 120 ميكروغرام لكل أنبوب. تمييع 1:10 مع فحص مقايسة راديوية (ريبا) العازلة (20mM تريس-حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 7.4)، 150mM كلوريد الصوديوم، 1mM إدتا، 1mM ناف، 1mM Na3VO4، 1mM بمسف، 1X الكوكتيل مثبط البروتياز، بيكاي، 0.1٪ نا-ديوكسيكولات w / v)، 1٪ تريتون X-100).
      1. إذا كان هناك عينات متعددة في كل مجموعة، والجمع بين كميات متساوية من الحمض النووي الكروماتين إلى المبلغ النهائي من ~ 100 - 120 ميكروغرام / عينة. حفظ 10٪ كمدخلات.
    2. إضافة 40 ميكرولتر (50٪ الخامس / الخامس الطين في ريبا العازلة) من بسا قبل حظر (~ 2 ح، 4 درجات مئوية) البروتين A / G الاغاروز (غير الدجاج الأجسام المضادة) أو الخرز إيغي (الدجاج الأجسام المضادة) واحتضان على مدورة لمدة 3 ساعات عند 4 درجات مئوية.
    3. أجهزة الطرد المركزي في 1،000 x ج، 10 دقيقة ونقل بعناية طاف لأنابيب جديدة.
    4. إضافة الأجسام المضادة في 1 ميكروغرام الأجسام المضادة في ~25 - 100 ميكروغرام من الحمض النووي الكروماتين.
    5. تدوير برفق في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها في حوالي 15 دورة في الدقيقة.
    6. إضافة 10 ميكرولتر من بسا قبل حظر (~ 2 ح، 4 درجات مئوية) البروتين A / G أغاروس (غير الدجاج الأجسام المضادة) أو الخرز إيغي (الدجاج الأجسام المضادة) مزيج وتدوير في الغرفة الباردة لمدة 2 ساعة.
    7. غسل الخرز على النحو التالي. يغسل مع 1 مل من العازلة ريبا لمدة 3 دقائق مرتين، يغسل مع 1 مل من العازلة عالية الملح (20mM تريس هكل (الرقم الهيدروجيني 7.4)، 500mM كلوريد الصوديوم، 2MM إدتا، 1mM بمسف، 1٪ تريتون X-100) لمدة 3 دقائق مرتين ، يغسل مع 1 مل من العازلة ليكل (20mM تريس-حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.4)، 250mM ليكل، 2mM إدتا، 1mM بمسف، 1٪ نا-ديوكسيكولات، 0.5٪ NP40) لمدة 3 دقائق مرتين.
      1. يغسل مع 1 مل من تريس-إدتا (تي) العازلة (10mM تريس-حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.4)، 1MM إدتا) لمدة 3 دقائق مرة واحدة. ثم الحمض النووي أزل مع العازلة شطف (20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 5 ملي إدتا و 0.5٪ سدز).
    8. أجهزة الطرد المركزي في 1،000 غرام، 1 دقيقة وإزالة بعناية طاف.
    9. ريسوسبيند حبة مع 50 ميكرولتر من شطف العازلة.
    10. احتضان لمدة 10دقيقة عند 65 درجة مئوية.
    11. أجهزة الطرد المركزي في 12،000 ز لمدة 5 دقائق.
    12. نقل طاف إلى أنبوب جديد، إضافة آخر 50 ميكرولتر وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 12،000 ز لمدة 5 دقائق. سيكون حجم شطف النهائي 100 ميكرولتر.
    13. عكس تشابك والحمض النووي شطف.
      1. احتضان لونين إلوتد بين عشية وضحاها في 65 درجة مئوية.
      2. إضافة 1.0 ميكرولتر من ريبونوكلياز واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
      3. إضافة 8 ميكرولتر من البروتيني K (10 ملغ / مل) واحتضان 30 دقيقة عند 55 درجة مئوية.
      4. حصاد الحمض النووي باستخدام عدة تنظيف ير مع حجم شطف في 50 ميكرولتر وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
    14. تحليل لمحات عن طريق قر في الوقت الحقيقي كما هو موضح سابقا 25 ، 26 .
      ملاحظة: يتم سرد متواليات التمهيدي في الشكل 3 أسطورة . يتم عرض البيانات كمتوسط ​​± سيم ( الشكل 3 ).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    هنا أجرينا الفورمالديهايد عبر ربط مباشرة بعد جمع الأنسجة للحفاظ على الوقت الحقيقي التفاعل الحمض النووي البروتين. ومع ذلك، وجدنا أن السكروز أو الغروية التدرج، وتستخدم عادة لعزل النوى 23 ، 24 ، لم يكن فعالا في فصل نوى من الليفي العضلي (لا تظهر البيانات). قد يكون السبب هو أن ربط عبر منح الثقل مماثلة للنوى والميوفيبريل. لذلك، قمنا بتطوير عملية الترشيح التسلسلي لإزالة فعال ميوفيبريلز كبيرة وغيرها من الحطام من جزء نوى. بعد الترشيح 100 ميكرون، كانت لا تزال الحطام الأنسجة الكبيرة والميوفريلات ( الشكل 1 A ). في المقارنة، في نهاية الترشيح متتابعة، تم إزالة غالبية الحطام الأنسجة الكبيرة، وخلايا سليمة والميوفيبريات كبيرة بنجاح ( الشكل 1 B ).

    أس = "jove_content" فو: كيب-together.within-بادج = "1"> تم استخدام تلك النوى في شكل أولتراسونيكاتيون على شكل طبق. تم تعليق النوى المخزنة في -80 درجة مئوية في سدز تحلل العازلة وخضعت فورا إلى سونيكاتيون. على الرغم من أن حضانة نوى في سدز تحلل العازلة على الجليد أو درجة حرارة الغرفة قد يحسن سونيكاتيون لبعض الأنسجة مثل الكبد 27 أو الفأر الخلايا الليفية الجنينية (ميف) 28 ، في تجربتنا أنها تدخلت سونيكاتيون من نوى العضلات والهيكل العظمي وأسفرت عن تلطيخ واسع، مما يدل على صوتنة غير فعالة. باستخدام البروتوكول الحالي مع سونيكاتيون فورية بعد تعليق في سدز العازلة تحلل لاحظنا سونيكاتيون فعالة مع لونين تمزيقه تدريجيا بطريقة تعتمد على الدورة، وفي نهاية المطاف إنتاج ~ 500 بب شظايا الحمض النووي ( الشكل 2 ). قبل الحضانة في المخزن تحلل كشفت بكفاءة سونيكاتيون.

    أن يخدعشركة نوعية إعداد الكروماتين ل رقاقة، فحصنا الحمض النووي ملزمة لعامل النسخ البيولوجية اليومية BMAL1، والتي أظهرت ذروة ملزمة والحوض الصغير في زمن زيتجيبر (زت) 6 و ZT18، على التوالي 18 ، 29 . تم جمع عينات العضلات والهيكل العظمي من الفئران C57B / 6J في ZT6 و ZT18، وتم إعداد عينات من الكروماتين على النحو الوارد أعلاه. لفترة وجيزة، بعد صوتنة، تم تمزيق عينات الكروماتين تم تمهيدها مسبقا مع الخرز إيغي التي تم حظرها مسبقا مع جيش صرب البوسنة تليها الحضانة مع الأجسام المضادة لمكافحة BMAL1 في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. بعد شطف وتنقية الكروماتين، أجرينا رت-قر للكشف عن BMAL1 ملزمة على عناصر مربع E من الجينات المستهدفة اثنين، Nr1d1 و دبب 30 . اكتشفنا ارتباطا قويا من BMAL1 بالعناصر E-بوكس عند ZT6 والحد الأدنى من الارتباط عند ZT18 ( Nr1d1 : 0.452 ± 0.022 مقابل 0.039 ± 0.002، دب -0.4: 0.627 ± 0.013 مقابل 0.062 ± 0.009، دب+0.8: 0.176 ± 0.013 مقابل 0.008 ± 0.001، دب +2.4 : 0.466 ± 0.010 مقابل 0.122 ± 0.014؛ جميع القيم هي يعني ± سيم) ( الشكل 3 )، التحقق من صحة بروتوكول لعامل النسخ الحساسة للوقت تحليل ملزم في العضلات والهيكل العظمي.

    شكل 1
    الشكل 1 : الترشيح المتسلسل إزالة الأنسجة بشكل فعال الحطام. (A) صور ممثل تظهر عينات بعد الترشيح 100 ميكرون. لوحظت الأنسجة الكبيرة والألياف الحطام. (B) ممثل صور تظهر عينات بعد الترشيح التسلسلي. تم تطهير حطام الألياف الكبيرة. ويلاحظ فقط نوى معزولة وشظايا ميوفبريل الصغيرة. أخذت الصور باستخدام المجهر الضوئي في 10X، 20X و 40 X التكبير. يتم عرض أشرطة مقياس على لوحات الجانب الأيمن.الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الشكل 2
    الشكل 2 : تمزيق الكروماتين التقدمي من خلال 10 دورات سونيكيشن. عشر دورات سونيكيشن مع هضم الحمض النووي الكروماتين إلى ~ 500 نقطة أساس، كما كشفت في هلام الاغاروز 0.8٪، تشغيل في 150 V لمدة 60 دقيقة. اللوحة اليمنى يشير إلى كفاءة صوتنة أقل بعد مرحلة ما قبل الحضانة في سدز الباردة الباردة تحلل العازلة لمدة 1 ساعة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الشكل 3
    فايغور 3 : ممثل قر النتائج ل BMAL1 رقاقة مع الماوس العضلات والهيكل العظمي العينات التي تم جمعها في ZT6 و ZT18. يتم عرض البيانات كما يعني ± سيم. دب -0.4، +0.8 و +2.4 تشير إلى مواقع عناصر مربع E على الجين دب . نك: السيطرة السلبية مع إيغي. النمط الزمني لل BMAL1 ملزمة يتسق مع النتائج السابقة تظهر BMAL1 الذروة ملزمة في جميع أنحاء ZT6 18 . الاشعال إلى الأمام والعكس هي على النحو التالي. ريف-إربا: 5'-غاغاكتاكاتاكاكاتكتغ، و 5'-تغغاغتاغاتغاتك؛ دب -0.4: 5'-أكاككاتغاتاغك، و 5'-كاكتكغكاتاغ؛ دب +0.8: 5'- أتغتكاكاكغكاغا، و 5'- كتغتكاغكاتكاتات؛ دب +2.4: 5'- تغغكتغاكاك، و 5'- غغاتغكاغاكتغت. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    نحن هنا وصف طريقة قوية حيث تم ربط الأنسجة العضلية الهيكلية عبر ربط لعزل نوى عالية الجودة. وقد أجريت الترشيح متسلسل من لفصل نواة فعالة من الحطام، والطاقة الصوتية بالموجات فوق الصوتية من محول على شكل طبق قص الكروماتين لتحليل رقاقة. وأظهرت النتائج ملاحق زمنية محددة في الوقت المحدد من BMAL1 لاستهداف المروجين.

    يمكن استخدام رقاقة لالتقاط الوقت الحقيقي إشغال البروتين على الحمض النووي الجيني عندما يحدث عبر ربط مكان. للاستفادة من هذه الإمكانات، ونحن تهدف إلى تطوير طريقة للسماح عبر ربط العضلات والهيكل العظمي في وقت تشريح الأنسجة وتبسيط العزلة نوى دون التدرج النابض. نظرا لصعوبة التجانس الألياف الغنية بالهيكل العظمي العضلات مقارنة مع الأنسجة الرخوة مثل الكبد، ونحن المفروم الأنسجة العضلية في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة ومن ثم تجانس العينة في العازلة الفورمالديهايد. بعد التبريد، وتعليق الأنسجة واثانية الطرد المركزي وشطف مع العازلة قاعدة الجليد الباردة لشطف أي الفورمالديهايد المتبقية. تم الافراج عن النوى من قبل التجانس دونس، وتم ترشيحها المتجانسة بالتتابع لإزالة تدريجيا الحطام الخلية والميوفيبريلز. وضعنا سلسلة من الترشيح للحد من انسداد مرشح التي يمكن أن تؤثر سلبا الغلة. بقيت اللفائف العضلية قصيرة جدا عندما تم الانتهاء من الترشيح متتابعة.

    تم تكييف إجراءات سونيكيشن و تشيب من تقرير سابق 12 مع التعديلات بما في ذلك توقيت سونيكيشن و سدز العازلة المبلغ. و سونيكاتور على شكل طبق يسمح التعرض لموجة الموجات فوق الصوتية المركزية للعينات في قارورة زجاجية في حمام الماء البارد. مقارنة مع سونيكاتورس التحقيق، وهذا سونيكاتور يتحكم في درجة حرارة العينة لتجنب ارتفاع درجة الحرارة، وأيضا يمنع عينة عبر التلوث. إذا تم استخدام سونيكاتورس التحقيق، تحتاج ظروف صوتنة الأمثل ليتم تحديدها تجريبيا. كما خفضنا أمونر من سدز العازلة منذ العائد من لونين العضلات هو أقل من ذلك في الكبد 12 . العديد من البروتوكولات 28 ، 31 ، 32 تشمل الحضانة على الجليد أو في درجة حرارة الغرفة قبل سونيكاتيون. ومع ذلك، في تجربتنا، ما قبل الحضانة على الجليد لم يحسن كفاءة سونيكيشن. في الواقع، في بعض الحالات تم اختراق سونيكاتيون. فمن الممكن أن الأوعية الليفية المتبقية متشابكة الحمض النووي الكروماتين أثناء الحضانة وفعالية صوتنة الموهن. مع سونيكاتيون فورية بعد تعليق نوى في سدز العازلة تحلل، نجحنا في الحصول على تجزئة لونين التدريجي مع زيادة دورات سونيكيشن ( الشكل 2 ).

    نحن التحقق من صحة لونين مع قر قر. كما هو مبين في الشكل 3 ، كان شغل المروج BMAL1 قوية في ZT6 والحد الأدنى في ZT18، بما يتفق مع سابقا أظهرت BMAL1 حواليديان المروج ملزمة 18 . وأكد هذا الفحص وظيفية نوعية نوى والكروماتين. في السنوات الأخيرة، فتحت التطور السريع في نغس أفقا جديدا لتطبيق رقاقة حيث تشيب-سيق يمكن استجواب كمية الجينومية ملزمة مع حساسية عالية 17 . خاصة ل تشيب سيق، نوى عالية الجودة والكروماتين مطلوبة لالتقاط باستمرار البروتين الحمض النووي التفاعل. الإجراء الموصوف هنا قد تشكل مصدرا قيما لدراسات تشيب-سيق باستخدام العضلات والهيكل العظمي. وتجدر الإشارة إلى أن إعداد مكتبة تشيب-سيق يتطلب اتخاذ تدابير إضافية لتحسين دقة الإشارة، مثل اختيار حجم الصفحة على أساس بادج 18 .

    في الختام، وضعنا بروتوكول القائم على الترشيح لإعداد نوى ذات جودة عالية من عبر ربط العضلات والهيكل العظمي. نحن إزالة الحاجة لتنبيذ فائق، مما يجعلها قابلة للتطبيق بسهولة. بالإضافة إلى رقاقة للجينات ذات الاهتمام، نوى والكروماتين بيأرإيبارد كما هو موضح يمكن أن تنطبق بشكل عام على الدراسات تشيب-سيق.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

    Acknowledgments

    نشكر كارين إسر، نوبويا كويكي و نوهيون بارك للحصول على المشورة المفيدة. تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة / نيغمس (R01GM114424) ل S.-هي، ومؤسسة روبرت A. ويلش (أو-1731) و نيه / نيا (R01AG045828) إلى زك

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Materials
    Formaldehyde solution Sigma Aldrich F8775 
    Glycine Fisher Scientific BP381-5
    Trypan Blue solution (0.4%) Fisher Scientific 15250061
    RNase A Sigma Aldrich 10109142001
    Protease K Sigma Aldrich 3115887001
    Chicken Anti-BMAL1 antibody Generated in chicken (Cocalico Biologicals) against antigen aa 318 - 579, and IgY was affinity purified using the same antigen. 
    Chicken IgY Precipitating Resin GenScript L00405
    Equipment
    KINEMATICA Polytron PT2100 Benchtop Homogenizer Fisher Scientific 08-451-178
    15 mL Dounce tissue grinder Whearton 357544
    Falcon Cell Strainers 100 µm Fisher Scientific 08-771-19
    Falcon Cell Strainers 70 µm Fisher Scientific 08-771-1
    Falcon Cell Strainers 40 µm Fisher Scientific 08-771-2
    pluriStrainer 30 µm PluriSelect 43-50030-03
    pluriStrainer 20 µm PluriSelect 43-50020-03
    pluriStrainer 10 µm PluriSelect 43-50010-03
    Covaris S2 Focused-ultrasonicator Covaris Model S2
    Labquake  Thermo Scientific C415110
    CCD Microscope Camera  Leica Microsystems DFC3000 G
    Reagent Kit
    DNA extraction kit Thermo Scientific K0691
    Buffers
    All buffer components are discribed in the protocol. Each component was purchased from Sigma Aldrich

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Bouzakri, K., et al. siRNA-based gene silencing reveals specialized roles of IRS-1/Akt2 and IRS-2/Akt1 in glucose and lipid metabolism in human skeletal muscle. Cell Metab. 4 (1), 89-96 (2006).
    2. Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (1), (2014).
    3. Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. The meter of metabolism. Cell. 134 (5), 728-742 (2008).
    4. Liu, A. C., Lewis, W. G., Kay, S. A. Mammalian circadian signaling networks and therapeutic targets. Nat Chem Biol. 3 (10), 630-639 (2007).
    5. Harfmann, B. D., Schroder, E. A., Esser, K. A. Circadian rhythms, the molecular clock, and skeletal muscle. J Biol Rhythms. 30 (2), 84-94 (2015).
    6. Nohara, K., Yoo, S. H., Chen, Z. J. Manipulating the circadian and sleep cycles to protect against metabolic disease. Front Endocrinol (Lausanne). 6, 35 (2015).
    7. Harfmann, B. D., et al. Muscle-specific loss of Bmal1 leads to disrupted tissue glucose metabolism and systemic glucose homeostasis. Skelet Muscle. 6, 12 (2016).
    8. Pedersen, B. K., Febbraio, M. A. Muscles, exercise and obesity: skeletal muscle as a secretory organ. Nat Rev Endocrinol. 8 (8), 457-465 (2012).
    9. Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (19), 6470-6474 (1985).
    10. Jackson, V. Studies on histone organization in the nucleosome using formaldehyde as a reversible cross-linking agent. Cell. 15 (3), 945-954 (1978).
    11. Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (14), 4275-4279 (1984).
    12. Takahashi, J. S., et al. ChIP-seq and RNA-seq methods to study circadian control of transcription in mammals. Methods Enzymol. 551, 285-321 (2015).
    13. Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19 (3), 425-433 (1999).
    14. Chen, Z., Manley, J. L. Core promoter elements and TAFs contribute to the diversity of transcriptional activation in vertebrates. Mol Cell Biol. 23 (20), 7350-7362 (2003).
    15. Menet, J. S., Abruzzi, K. C., Desrochers, J., Rodriguez, J., Rosbash, M. Dynamic PER repression mechanisms in the Drosophila circadian clock: from on-DNA to off-DNA. Genes Dev. 24 (4), 358-367 (2010).
    16. Miki, T., Matsumoto, T., Zhao, Z., Lee, C. C. p53 regulates Period2 expression and the circadian clock. Nat Commun. 4, 2444 (2013).
    17. Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
    18. Koike, N., et al. Transcriptional architecture and chromatin landscape of the core circadian clock in mammals. Science. 338 (6105), 349-354 (2012).
    19. Zhou, J., Yu, W., Hardin, P. E. ChIPping away at the Drosophila clock. Methods Enzymol. 551, 323-347 (2015).
    20. Takahashi, J. S. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nat Rev Genet. , (2016).
    21. Edelman, J. C., Edelman, P. M., Kniggee, K. M., Schwartz, I. L. Isolation of skeletal muscle nuclei. J Cell Biol. 27 (2), 365-377 (1965).
    22. Ohkawa, Y., Mallappa, C., Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. Isolation of nuclei from skeletal muscle satellite cells and myofibers for use in chromatin immunoprecipitation assays. Methods Mol Biol. 798, 517-530 (2012).
    23. Wilkie, G. S., Schirmer, E. C. Purification of nuclei and preparation of nuclear envelopes from skeletal muscle. Methods Mol Biol. 463, 23-41 (2008).
    24. Hahn, C. G., Covault, J. Isolation of transcriptionally active nuclei from striated muscle using Percoll density gradients. Anal Biochem. 190 (2), 193-197 (1990).
    25. Jeong, K., et al. Dual attenuation of proteasomal and autophagic BMAL1 degradation in Clock Delta19/+ mice contributes to improved glucose homeostasis. Scientific reports. 5, 12801 (2015).
    26. Nohara, K., et al. Ammonia-lowering activities and carbamoyl phosphate synthetase 1 (Cps1) induction mechanism of a natural flavonoid. Nutrition & metabolism. 12, 23 (2015).
    27. Zhang, L., Rubins, N. E., Ahima, R. S., Greenbaum, L. E., Kaestner, K. H. Foxa2 integrates the transcriptional response of the hepatocyte to fasting. Cell Metab. 2 (2), 141-148 (2005).
    28. Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).
    29. Kondratov, R. V., et al. BMAL1-dependent circadian oscillation of nuclear CLOCK: posttranslational events induced by dimerization of transcriptional activators of the mammalian clock system. Genes Dev. 17 (15), 1921-1932 (2003).
    30. Ripperger, J. A., Schibler, U. Rhythmic CLOCK-BMAL1 binding to multiple E-box motifs drives circadian Dbp transcription and chromatin transitions. Nat Genet. 38 (3), 369-374 (2006).
    31. Laplante, M., et al. DEPTOR cell-autonomously promotes adipogenesis, and its expression is associated with obesity. Cell Metab. 16 (2), 202-212 (2012).
    32. Blechman, J., Amir-Zilberstein, L., Gutnick, A., Ben-Dor, S., Levkowitz, G. The metabolic regulator PGC-1alpha directly controls the expression of the hypothalamic neuropeptide oxytocin. J Neurosci. 31 (42), 14835-14840 (2011).

    Tags

    الكيمياء الحيوية، العدد 125، العضلات والهيكل العظمي، عبر ربط، وعزل النوى، المناعية الكروماتين، والترشيح متتابعة، والوقت الساعة البيولوجية
    A طريقة الترشيح القائم على إعداد نوى عالية الجودة من عبر ربط العضلات والهيكل العظمي للكروماتين مناعي
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Nohara, K., Chen, Z., Yoo, S. H. A… More

    Nohara, K., Chen, Z., Yoo, S. H. A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation. J. Vis. Exp. (125), e56013, doi:10.3791/56013 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter