Summary
Vi præsenterer en filtreringsbaseret protokol til isolering af kerne af høj kvalitet fra tværbundet museskeletmuskulatur, hvor vi fjernede behovet for ultracentrifugering, hvilket gør det let anvendeligt. Vi viser, at kromatin fremstillet ud fra kernerne er egnet til chromatinimmunpræcipitation og sandsynligvis chromatinimmunpræcipitationssekventeringsundersøgelser.
Abstract
Kromatinimmunudfældning (ChIP) er en kraftfuld metode til bestemmelse af proteinbinding til chromatin-DNA. Fiber-rige skeletmuskler har imidlertid været en udfordring for ChIP på grund af tekniske vanskeligheder i isolation af højkvalitetskerner med minimal forurening af myofibriller. Tidligere protokoller har forsøgt at rense kerner inden krydsbinding, hvilket medfører risikoen for ændret DNA-proteininteraktion under den forlængede kerneforberedelsesproces. I den nuværende protokol tværbindede vi først skeletmuskelvævet opsamlet fra mus, og vævene blev hakket og sonikeret. Da vi fandt ud af, at ultracentrifugering ikke var i stand til at adskille kerner fra myofibriller ved anvendelse af tværbundet muskelvæv, udtænkte vi en sekventiel filtreringsprocedure for at opnå højkvalitets kerner uden væsentlig myofibrilforurening. Vi fremstillede efterfølgende chromatin ved anvendelse af en ultralydator, og ChIP-assays med anti-BMAL1-antistof afslørede robust cirkadisk bindingMønster af BMAL1 for at målrette genpromotorer. Denne filtreringsprotokol udgør en let anvendelig metode til isolering af kerne af høj kvalitet fra tværbundet skeletmuskulaturvæv, hvilket muliggør konsekvent prøvebehandling til cirkadian og andre tidsfølsomme undersøgelser. I kombination med næste generations sekventering (NGS) kan vores metode implementeres til forskellige mekaniske og genomiske undersøgelser med fokus på skeletmuskelfunktion.
Introduction
Skeletmuskel spiller vigtige roller i fysiologi og adfærd. Den multikernerede muskelfiber består af myofibriller, hvor actin og myosin danner funktionelle enheder kaldet sarcomerer for at danne kontraktilkraft. Skeletmuskler er også det største stofskifteorgan i kroppen, der tegner sig for> 80% postprandial glukoseindtagelse og regulerer insulinrespons og metabolisk homeostase 1 , 2 . Muskelfysiologi og stofskifte er tæt reguleret af det cirkadiske ur, en iboende biologisk timer 3 , 4 , 5 , 6 . For eksempel resulterede den skeletmuskelspecifikke deletion af Bmal1 , en af de kernekredittiske urkomponenter , insulinresistens og nedsat glukoseoptagelse i skeletmuskel, og dyrene viste sig at udvikle type 2-diabetes 7 . jegN-tillæg bliver skeletmuskel også i stigende grad værdsat som et hormon 8 , der udskiller myokiner for at regulere systemisk metabolisme og fysiologi. Mekanistiske undersøgelser er nødvendige for fuldt ud at forstå disse regulatoriske funktioner i skeletmuskel.
ChIP er en kraftfuld tilgang til afgrænsning af promotor rekruttering af DNA-bindende proteiner. ChIP blev oprindeligt udviklet til at identificere nukleosomorganisering på chromatin DNA 9 , 10 . En række fremgangsmåder er siden blevet rapporteret til tværbindingsproteiner og chromatin-DNA ved anvendelse af formaldehyd, dimethylsulfat eller ultraviolet bestråling (UV) 11 , 12 . Formaldehyd-tværbinding er den mest almindeligt anvendte, konserverende kromatinstruktur og DNA-proteininteraktioner 9 , 13 , 14 . Tværbundet kromatografiIn er shredded ved sonication og immunpræcipiteret med antistof mod det specifikke DNA-bindende protein af interesse 15 , 16 . I de senere år er ChIP-sekventering (ChIP-seq), en metode, der kombinerer ChIP med NGS, udviklet for at forhøre genomfattende transkriptionsfaktorbinding 17 og i nogle tilfælde at overvåge dynamiske ændringer over et tidsforløb 18 , 19 , 20 . For eksempel har circadian-ChIP-seq-studier afsløret en stærkt orkestreret sekvens af genomisk binding af kredsløbskomponenter og histonmarkører, som dirigerer temporært præcis genekspression gennem hele den 24-timers cirkadiske cyklus 18 .
De fleste tilgængelige ChIP-protokoller er designet til blødt væv ( fx lever, hjerne osv. ), Og meget få er blevet offentliggjort til hårdt væv inklusive skeleTal muskler. Det er teknisk udfordrende at homogenisere fiberrig skeletmuskel og isolere højkvalitets kerne 21 , især til ChIP-eksperimenter, som kræver tværbinding. I en nylig muskel-ChIP-undersøgelse 22 blev satellitceller adskilt fra myofibere, og kerner blev fremstillet ud fra begge celletyper gennem en forlænget procedure, der involverer vævsfordøjelse. Hele processen tog cirka tre timer at afslutte før formaldehyd-tværbinding blev udført på isolerede kerner. Selvom denne procedure undgik krydsbinding af muskelfibre, hvilket gør muskelvæv endnu mere ildfast til effektiv homogenisering og var i stand til at producere kerne af høj kvalitet, medfører den betydelige tidsforsinkelse fra vævsopsamling til kerneforbindelser risikoen for ændret DNA -proteininteraktion. I modsætning hertil udførte de fleste undersøgelser tværbinding umiddelbart efter forsøgsbehandling eller vævsopsamling for at bevare real-time DNA-proteiN bindende 12 . En anden ulempe ved kerneisolation før tværbinding er, at den udelukker tidsfølsomme anvendelser såsom cirkadisk prøveopsamling, som typisk forekommer med intervaller på 3 - 4 timer. Uden krydsbinding af kernerne skal isolationen fortsætte umiddelbart efter dissektion, mens tværbundne prøver kan behandles sammen, efter at hele tidskursus er afsluttet, hvilket sikrer større eksperimentel konsistens.
Andre protokoller for kerneisolation fra ikke-tværbundet skeletmuskel er også blevet rapporteret. To undersøgelser beskrev brugen af gradient ultracentrifugering til adskillelse af kerner fra resterende myofibriller og celleaffald 23 , 24 . Selvom sukrose eller kolloidal gradient ultracentrifugering er effektiv med ikke-tværbundne muskelvæv, viste vores eksperimenter, at efter krydsbinding mislykkedes gradient-ultracentrifugering til at adskille kerner fra celle dEbris på graden.
Vi udviklede derfor en procedure til isolering af kerne af høj kvalitet ved anvendelse af tværbundne muskelvæv i muskelskelet. I stedet for gradient ultracentrifugering udtænkte vi en seriefiltreringsmetode til effektivt at adskille kerner fra affald. Efter ultralydning blev chromatinprøverne succesfuldt anvendt til ChIP-undersøgelser, der viste et cirkadisk mønster af BMAL1-proteinbinding til målpromotorer. Vores metode kan bredt anvendes til forskellige mekaniske studier af muskelvæv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrpleje blev udført under retningslinierne for Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), og procedurerne blev udført i henhold til en animalsk protokol godkendt af University of Texas Health Science Center i Houston.
1. Nuclei-isolation fra tværbundet skeletmuskel
- Skeletmuskulatur af vægt og bagvæg, isoleret fra ca. 20 ugers gamle C57BL / 6 hanmus, i iskold fosfatbuffet saltvand (PBS) som beskrevet detaljeret tidligere 22 .
BEMÆRK: Vi opnår normalt 1,0 - 1,5 g skelettmuskel fra en mus.- Anbring hakket skeletmuskelvæv i et 50 ml konisk rør indeholdende 10 ml PBS på is.
- Centrifuge ved 300 xg ved 4 ° C i 5 minutter.
- Fjern forsigtigt PBS-supernatanten ved aspiration.
- Anslå pelletvolumen i hvert 50 ml rør ved brug af referencerør med 1, 2, 3 og 4 ml vand.
- Tilføj 7 volumener afIskold 1% formaldehyd i PBS og homogenisere prøverne på is ved anvendelse af en sondevævshomogenisator (se tabel over materialer ).
BEMÆRK: Valgfrit: Homogeniseringsproceduren kan udføres i et koldt rum. - Tværbind prøven ved inkubering ved stuetemperatur i 10 minutter.
- Sænk tværbindingsreaktionen ved tilsætning af 1 M glycin til en slutkoncentration på 0,125 M og inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Centrifuger prøverne ved 3.000 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Fjern supernatanten via aspiration.
- Skyl med 10 ml iskold basebuffer (10 mM HEPES-KOH ved pH 7,3, 10 mM EDTA, 10 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT) indeholdende frisk tilsatte proteasehæmmere (0,2 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) , Og 10 μg / ml leupeptin). Centrifuger ved 3.000 g i 5 minutter ved 4 ° C, og fjern forsigtigt supernatanten ved aspiration.
- Resuspender pelleten i 6 ml lysisbuffer (10 mM HEPES-KOH på sH 7,3, 10 mM EDTA, 10 mM KCI, 5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT, 1% Triton X-100) indeholdende frisk tilsatte proteaseinhibitorer (0,2 mM PMSF og 10 μg / ml leupeptin).
- Overfør prøven til en forkølet 15 ml Dounce-homogenisator og inkuber i 10 minutter på is. Afprøv homogeniser hver prøve på is med 15 langsomt slagtilfælde ved hjælp af løs pestle efterfulgt af 15 slag med tæt pestle for at frigive kernerne.
- Filtrer homogenatet (6 ml) gennem cellefilter (porestørrelse: 100 μm) og skyll med 4 ml lysisbuffer. Centrifuger prøverne ved 1000 xg i 10 minutter ved 4 ° C. Resuspenderes i 5 ml iskold basebuffer og dråber 10 gange med tæt pestle for at frigive kerner.
- Fjern en alikvot på 20 μl til DNA-koncentrationsmåling med et spektrofotometer (OD260 / OD280) og mikroskopisk observation med trypanblå, hvis nødvendigt (se nedenfor) ( Figur 1A ).
- Filtrer suspensionen igennemEn cellefilter (porestørrelse: 70 μm), skylle røret og filtrere igen med 2 ml basebuffer som ovenfor.
- Gentag filtreringen som i trin 1.13 med cellefjernere med gradvist reduceret porestørrelse (40 μm, 30 μm, 20 μm og 10 μm).
BEMÆRK: I alt blev der anvendt strenge med 6 porestørrelser i trin 1.12-1.14. - Centrifuger ved 1000 g ved 4 ° C i 10 minutter. Fjern supernatanten og resuspender pelleten i 500 μl base buffer.
- Mål DNA-koncentration som ovenfor.
BEMÆRK: Ca. 200 μg nukleins DNA blev opnået ved at kombinere begge bagleder fra et dyr. Gem eventuelt 20 μL til mikroskopisk observation med trypanblåt farvning (bestandskoncentration 0,4%, 1: 5 fortynding); Kerner vil pletter blå ( figur 1 B ). - Centrifuger ved 1000 g ved 4 ° C i 10 minutter og kasserer supernatanten. Opbevar pellet ved -80 ° C.
2. Sonikering
<ol>BEMÆRK: Et eksempel til evaluering af sonikationseffektivitet er vist i figur 2 .
3. Evaluering af Sonication og Quantitation
- Tilføj 1,0ΜL RNase A (500 U / ml RNase A: 20.000 U / ml RNase T1) til de gemte 50 μl sonikerede prøver og inkuber i 30 minutter ved 37 ° C.
- Tilsæt 8 μl protease K (10 mg / ml) og inkuber 30 minutter ved 55 ° C.
- Høst DNA'et ved hjælp af et DNA-ekstraktionskit.
- Tilsæt 5 volumener bindingsbuffer, påfør den til spindingskolonne og centrifuger ved 4.000 xg, 10 min.
- Påfør gennemgangen på den samme kolonne og centrifuger igen.
- Vask med vaskebuffer to gange ved 13.000 xg, 1 min.
- Centrifuger igen ved 13.000 xg, 1 min for at tørre søjlen.
- Tilsæt 50 μl H20 og centrifuge ved 13.000 xg, 1 min for at eluere DNA.
- Påfør gennemgangen på den samme kolonne og centrifuger igen.
- Kvantificer mængden af DNA med et spektrofotometer (OD260 / OD280). Kør prøver på 0,8% geler for at vurdere størrelsen og mængden (1 μg) af de sonikerede produkter ( figur 2 ).
BEMÆRK: Det gennemsnitlige chromatinudbytte er ca. ~ 20%.
4. ChIP
- Optø det tidligere gemte kromatin ved -80 ° C og alikvot kromatinet til ~ 100 - 120 μg pr. Rør. Fortynd 1:10 med radioimmunoprecipitationsassay (RIPA) buffer (20 mM Tris-HCI (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 1 mM PMSF, 1x proteaseinhibitor cocktail (PIC), 0,1% Na-deoxycholat Vægt / volumen), 1% Triton X-100).
- Hvis der er flere prøver i hver gruppe, kombineres lige store mængder kromatin-DNA til den endelige mængde på ~ 100 - 120 μg / prøve. Gem 10% som input.
- Tilsæt 40 μL (50% v / v opslæmning i RIPA-buffer) af BSA-præblokeret (~ 2 h, 4 ° C) Protein A / G agarose (ikke-kyllingantistof) eller IgY-perler (kyllingantistof) og inkuber på En rotator i 3 timer ved 4 ° C.
- Centrifuge ved 1000 xg, 10 min og overfør forsigtigt supernatanten til nye rør.
- Tilsæt antistoffer ved 1 μg antistof pr25 - 100 ug chromatin-DNA.
- Roter forsigtigt ved 4 ° C natten over ved ca. 15 omdr./min.
- Tilsæt 10 μl BSA-præblokeret (~ 2 timer, 4 ° C) Protein A / G agarose (ikke-kyllingantistof) eller IgY-perler (Kyllingantistof) blandes og roteres i det kolde rum i 2 timer.
- Vask perler som følger. Vask med 1 ml RIPA-buffer i 3 minutter to gange, vask med 1 ml højt saltbuffer (20 mM Tris-HCI (pH 7,4), 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1% Triton X-100) i 3 minutter to gange Vaskes med 1 ml LiCl-buffer (20 mM Tris-HCI (pH 7,4), 250 mM LiCl, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1% Na-deoxycholat, 0,5% NP40) i 3 minutter to gange.
- Vask med 1 ml Tris-EDTA (TE) puffer (10 mM Tris-HCI (pH 7,4), 1 mM EDTA) i 3 minutter en gang. Derefter elueres DNA med elueringsbuffer (20 mM Tris-HCI, 5 mM EDTA og 0,5% SDS).
- Centrifuger ved 1000 g, 1 minut og fjern supernatanten omhyggeligt.
- Resuspender perlen med 50 μl elueringsbuffer.
- Inkubere for 10Min ved 65 ° C.
- Centrifuge ved 12.000 g i 5 minutter.
- Overfør supernatanten til et nyt rør, tilsæt yderligere 50 μL og centrifuger igen ved 12.000 g i 5 minutter. Det endelige elueringsvolumen vil være 100 μl.
- Omvendt tværbinding og DNA-eluering.
- Inkuber det eluerede chromatin natten over ved 65 ° C.
- Tilsæt 1,0 μl RNase A og inkuber i 30 minutter ved 37 ° C.
- Tilsæt 8 μl protease K (10 mg / ml) og inkuber 30 minutter ved 55 ° C.
- Høst DNA'et ved at anvende et PCR-oprydningssæt med elueringsvolumen ved 50 μl ifølge producentens protokol.
- Analyser profilerne ved hjælp af realtids qPCR som tidligere beskrevet 25 , 26 .
BEMÆRK: Primersekvenserne er angivet i figur 3 Legend . Data præsenteres som middel ± SEM ( Figur 3 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her gennemførte vi formaldehyd-tværbinding umiddelbart efter vævsopsamling for at bevare real-time DNA-protein interaktion. Vi fandt imidlertid, at saccharose eller kolloidal gradient, der almindeligvis anvendes til nuclei-isolering 23 , 24 , ikke var effektiv til at adskille kerner fra myofibriller (data ikke vist). Årsagen kan være, at tværbinding gav samme tyngdekraft for kerner og myofibriller. Derfor udviklede vi en seriel filtreringsproces for effektivt at fjerne store myofibriller og andre affald fra kernefraktionen. Efter 100 μm filtrering var der stadig store vævsrester og myofibriller ( Figur 1 A ). Til sammenligning blev flertallet af store vævsrester, intakte celler og store myofibriller ved fjernelsen af den sekventielle filtrering fjernet ( Figur 1 B ).
27 eller mus embryonal fibroblast (MEF) 28 , efter vores erfaring det interfererede med sonikering af skeletmuskelkerner og resulterede i bred udtværing, hvilket indikerer Ineffektiv lydbehandling. Ved anvendelse af den nuværende protokol med øjeblikkelig sonikering efter suspension i SDS lysisbuffer observerede vi effektiv sonikering med chromatin gradvist strimlet på en cyklusafhængig måde og producerede til sidst ~ 500 bp DNA-fragmenter ( figur 2 ). Forinkubation i lysisbufferen påvirkede sandsynligvis sonikationseffektiviteten.
Til conFastslår kvaliteten af chromatinpræparatet for ChIP, undersøgte vi DNA-binding af den cirkadiske transkriptionsfaktor BMAL1, som viste bindestop og trug ved Zeitgeber-tid (ZT) 6 og ZT18 henholdsvis 18 , 29 . Skelettmuskelprøver fra C57B / 6J mus blev opsamlet ved ZT6 og ZT18, og kromatinprøver blev fremstillet som ovenfor. Kort efter, efter sonikering blev forkletede kromatinprøver forklaret med IgY-perler, der er blevet blokeret med BSA efterfulgt af inkubation med anti-BMAL1-antistof ved 4 ° C natten over. Efter eluering og rensning af chromatin udførte vi RT-qPCR for at detektere BMAL1-binding på E-Box-elementer af to målgener, Nr1d1 og Dbp 30 . Vi registrerede robust binding af BMAL1 til E-box-elementerne ved ZT6 og minimal binding ved ZT18 ( Nr1d1 : 0,462 ± 0,022 vs 0,039 ± 0,002, Dbp -0,4: 0,627 ± 0,013 vs 0,062 ± 0,009, Dbp+0,8: 0,176 ± 0,013 vs 0,008 ± 0,001, Dbp + 2,4 : 0,466 ± 0,010 vs 0,122 ± 0,014; Alle værdier er gennemsnitlige ± SEM) ( Figur 3 ), validering af protokollen for tidsfølsom transkriptionsfaktor bindingsanalyse i skeletmuskel.
Figur 1 : Sekventiel filtrering effektivt fjernet vævsladelse. (A) Repræsentative billeder, der viser prøver efter 100 μm filtrering. Store vævs- og fiberrester observeres. (B) Repræsentative billeder, der viser prøver efter seriel filtrering. Store fiberaffald blev ryddet. Kun isolerede kerner og små myofibrilfragmenter observeres. Billeder blev taget ved hjælp af et lysmikroskop ved 10X, 20X og 40X forstørrelser. Skalestænger vises på højre sidepaneler.Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2 : Progressiv kromatin-formaling gennem 10 cykler af sonikering. Ti cykler af sonikering med fordøjet chromatin-DNA til ~ 500 bp, som afsløret i en 0,8% agarosegel, kører ved 150 V i 60 minutter. Det højre panel indikerer en lavere lydstyrkeffektivitet efter forinkubation i iskold SDS lysisbuffer i 1 time. Klik her for at se en større version af denne figur.
FiGure 3 : Repræsentative qPCR-resultater for BMAL1 ChIP med museskelettet muskelprøver indsamlet ved ZT6 og ZT18. Data præsenteres som gennemsnit ± SEM. Dbp -0,4, +0,8 og +2,4 angiver placeringer af E-Box-elementerne på Dbp- genet. NC: negativ kontrol med IgY. Det tidsmæssige mønster for BMAL1-binding er i overensstemmelse med tidligere resultater, der viser BMAL1-bindingsspids ved omkring ZT6 18 . Frem- og reverse-primere er som følger. Rev-erba: 5'-GTAGACTACAAATCCCAACAATCCTG og 5'-TGGAGCAGGTACCATGTGATTC; Dbp -0,4: 5'-ACACCCGCATCCGATAGC og 5'-CCACTTCGGGCCAATGAG; Dbp +0,8: 5'- ATGCTCACACGGTGCAGACA og 5'-CTGCTCAGGCACATTCCTCAT; Dbp +2,4: 5'-TGGGACGCCTGGGTACAC og 5'-GGGAATGTGCAGCACTGGTT. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en robust metode, hvor tværbundet skeletmuskelvæv blev brugt til at isolere kerne af høj kvalitet. Sekventiel filtrering blev udført for effektivt at adskille kerner fra affald, og ultralydsakustisk energi fra skålformet transducer skåret kromatinet til ChIP-analyse. Resultaterne viste cirkadisk tidsspecifik binding af BMAL1 til målpromotorer.
ChIP kan anvendes til at indfange realtidsproteinbelægning på genomisk DNA, når tværbindingen finder sted. For at udnytte dette potentiale har vi til formål at udvikle en metode til at muliggøre tværbinding af skeletmuskulaturen på tidspunktet for vævsdissektion og strømline kerneisolationen uden gradient ultracentrifugering. På grund af vanskeligheden ved at homogenisere fiber-rige skeletmuskler sammenlignet med blødt væv som lever, hakede vi muskelvæv i iskold PBS og homogeniserede derefter prøven i en formaldehydbuffer. Efter quenching, vævs suspensionen waS centrifugeres og skylles med iskold basebuffer til skylning af eventuelt resterende formaldehyd. Nuclei blev frigivet ved Dounce-homogenisering, og homogenaterne blev sekventielt filtreret for gradvist at fjerne celleaffald og myofibriller. Vi udtænkte filtreringsserien for at minimere filterstopning, som kunne påvirke udbyttet negativt. Kun meget korte myofibriler forblev, da den sekventielle filtrering blev gennemført.
Sonication- og ChIP-procedurerne blev tilpasset fra en tidligere rapport 12 med modifikationer omfattende lydbehandlingstidspunkt og SDS-buffer-mængde. Den skålformede sonicator muliggør udsættelse for centraliseret ultralydbølge til prøver i glasflasker i et koldtvandsbad. Sammenlignet med sonde lydgivere kontrollerer denne sonikator prøvetemperaturen for at undgå overophedning og forhindrer også stikprøvekontaminering. Hvis probesignalatorer anvendes, skal optimale sonikationsbetingelser bestemmes empirisk. Vi har også reduceret amounT af SDS-buffer, da udbyttet af muskelkromatin er lavere end i lever 12 . Adskillige protokoller 28 , 31 , 32 indbefatter inkubation på is eller ved stuetemperatur forud for sonikering. I vores erfaring forbedrede præ-inkubation på is imidlertid ikke sonication-effektiviteten. Faktisk var lyden i nogle tilfælde kompromitteret. Det er muligt, at resterende myofibriller viklet kromatin-DNA'et under inkubation og svækket sonikationseffektivitet. Med øjeblikkelig sonikering efter nucleinsuspension i SDS lysisbuffer lykkedes det at opnå progressiv chromatinfragmentering med stigende sonikationscykluser ( Figur 2 ).
Vi validerede kromatins kvalitet med ChIP qPCR. Som vist i figur 3 var BMAL1-promotorbelægningen robust ved ZT6 og minimal ved ZT18, i overensstemmelse med tidligere vist BMAL1 circaDian promotor binding 18 . Dette funktionelle assay bekræftede kvaliteten af kerner og chromatin. I de seneste år har den hurtige udvikling i NGS åbnet en ny horisont for ChIP-applikationen, hvor ChIP-seq kvantitativt kan forhøre genomisk binding med høj følsomhed 17 . Specielt for ChIP-seq kræves højkvalitetskerner og chromatin konsekvent at opfange protein-DNA-interaktion. Fremgangsmåden beskrevet heri kan udgøre en værdifuld ressource for ChIP-seq-studier ved anvendelse af skeletmuskel. Bemærk, at ChIP-seq-bibliotekets forberedelse kræver yderligere foranstaltninger til forbedring af signalopløsningen, såsom PAGE-baseret størrelsesvalg 18 .
Til sidst udviklede vi en filtreringsbaseret protokol til fremstilling af kerne af høj kvalitet fra tværbundet skeletmuskel. Vi fjerner behovet for ultracentrifugering, hvilket gør den let anvendelig. Foruden ChIP for gener af interesse, er kernerne og chromatin prEpared som beskrevet kan være bredt anvendelig for ChIP-seq undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Karyn Esser, Nobuya Koike og Noheon Park for nyttige råd. Dette arbejde blev delvist støttet af NIH / NIGMS (R01GM114424) til S.-HY, og Robert A. Welch Foundation (AU-1731) og NIH / NIA (R01AG045828) til ZC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Fisher Scientific | 15250061 | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| Protease K | Sigma Aldrich | 3115887001 | |
| Chicken Anti-BMAL1 antibody | Generated in chicken (Cocalico Biologicals) against antigen aa 318 - 579, and IgY was affinity purified using the same antigen. | ||
| Chicken IgY Precipitating Resin | GenScript | L00405 | |
| Equipment | |||
| KINEMATICA Polytron PT2100 Benchtop Homogenizer | Fisher Scientific | 08-451-178 | |
| 15 mL Dounce tissue grinder | Whearton | 357544 | |
| Falcon Cell Strainers 100 µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| Falcon Cell Strainers 70 µm | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Falcon Cell Strainers 40 µm | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| pluriStrainer 30 µm | PluriSelect | 43-50030-03 | |
| pluriStrainer 20 µm | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| pluriStrainer 10 µm | PluriSelect | 43-50010-03 | |
| Covaris S2 Focused-ultrasonicator | Covaris | Model S2 | |
| Labquake | Thermo Scientific | C415110 | |
| CCD Microscope Camera | Leica Microsystems | DFC3000 G | |
| Reagent Kit | |||
| DNA extraction kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| Buffers | |||
| All buffer components are discribed in the protocol. Each component was purchased from Sigma Aldrich |
References
- Bouzakri, K., et al. siRNA-based gene silencing reveals specialized roles of IRS-1/Akt2 and IRS-2/Akt1 in glucose and lipid metabolism in human skeletal muscle. Cell Metab. 4 (1), 89-96 (2006).
- Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (1), (2014).
- Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J.
- Liu, A. C., Lewis, W. G., Kay, S. A. Mammalian circadian signaling networks and therapeutic targets. Nat Chem Biol. 3 (10), 630-639 (2007).
- Harfmann, B. D., Schroder, E. A., Esser, K. A. Circadian rhythms, the molecular clock, and skeletal muscle. J Biol Rhythms. 30 (2), 84-94 (2015).
- Nohara, K., Yoo, S. H., Chen, Z. J. Manipulating the circadian and sleep cycles to protect against metabolic disease. Front Endocrinol (Lausanne). 6, 35 (2015).
- Harfmann, B. D., et al. Muscle-specific loss of Bmal1 leads to disrupted tissue glucose metabolism and systemic glucose homeostasis. Skelet Muscle. 6, 12 (2016).
- Pedersen, B. K., Febbraio, M. A. Muscles, exercise and obesity: skeletal muscle as a secretory organ. Nat Rev Endocrinol. 8 (8), 457-465 (2012).
- Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (19), 6470-6474 (1985).
- Jackson, V. Studies on histone organization in the nucleosome using formaldehyde as a reversible cross-linking agent. Cell. 15 (3), 945-954 (1978).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Takahashi, J. S., et al. ChIP-seq and RNA-seq methods to study circadian control of transcription in mammals. Methods Enzymol. 551, 285-321 (2015).
- Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19 (3), 425-433 (1999).
- Chen, Z., Manley, J. L. Core promoter elements and TAFs contribute to the diversity of transcriptional activation in vertebrates. Mol Cell Biol. 23 (20), 7350-7362 (2003).
- Menet, J. S., Abruzzi, K. C., Desrochers, J., Rodriguez, J., Rosbash, M. Dynamic PER repression mechanisms in the Drosophila circadian clock: from on-DNA to off-DNA. Genes Dev. 24 (4), 358-367 (2010).
- Miki, T., Matsumoto, T., Zhao, Z., Lee, C. C. p53 regulates Period2 expression and the circadian clock. Nat Commun. 4, 2444 (2013).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Koike, N., et al. Transcriptional architecture and chromatin landscape of the core circadian clock in mammals. Science. 338 (6105), 349-354 (2012).
- Zhou, J., Yu, W., Hardin, P. E. ChIPping away at the Drosophila clock. Methods Enzymol. 551, 323-347 (2015).
- Takahashi, J. S. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nat Rev Genet. , (2016).
- Edelman, J. C., Edelman, P. M., Kniggee, K. M., Schwartz, I. L.
- Ohkawa, Y., Mallappa, C., Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. Isolation of nuclei from skeletal muscle satellite cells and myofibers for use in chromatin immunoprecipitation assays. Methods Mol Biol. 798, 517-530 (2012).
- Wilkie, G. S., Schirmer, E. C. Purification of nuclei and preparation of nuclear envelopes from skeletal muscle. Methods Mol Biol. 463, 23-41 (2008).
- Hahn, C. G., Covault, J. Isolation of transcriptionally active nuclei from striated muscle using Percoll density gradients. Anal Biochem. 190 (2), 193-197 (1990).
- Jeong, K., et al. Dual attenuation of proteasomal and autophagic BMAL1 degradation in Clock Delta19/+ mice contributes to improved glucose homeostasis. Scientific reports. 5, 12801 (2015).
- Nohara, K., et al. Ammonia-lowering activities and carbamoyl phosphate synthetase 1 (Cps1) induction mechanism of a natural flavonoid. Nutrition & metabolism. 12, 23 (2015).
- Zhang, L., Rubins, N. E., Ahima, R. S., Greenbaum, L. E., Kaestner, K. H. Foxa2 integrates the transcriptional response of the hepatocyte to fasting. Cell Metab. 2 (2), 141-148 (2005).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).
- Kondratov, R. V., et al. BMAL1-dependent circadian oscillation of nuclear CLOCK: posttranslational events induced by dimerization of transcriptional activators of the mammalian clock system. Genes Dev. 17 (15), 1921-1932 (2003).
- Ripperger, J. A., Schibler, U. Rhythmic CLOCK-BMAL1 binding to multiple E-box motifs drives circadian Dbp transcription and chromatin transitions. Nat Genet. 38 (3), 369-374 (2006).
- Laplante, M., et al. DEPTOR cell-autonomously promotes adipogenesis, and its expression is associated with obesity. Cell Metab. 16 (2), 202-212 (2012).
- Blechman, J., Amir-Zilberstein, L., Gutnick, A., Ben-Dor, S., Levkowitz, G. The metabolic regulator PGC-1alpha directly controls the expression of the hypothalamic neuropeptide oxytocin. J Neurosci. 31 (42), 14835-14840 (2011).
