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Medicine

Generación de un modelo de enfermedad pulmonar obstructiva crónica en ratones por la exposición repetida del ozono

Published: August 25, 2017 doi: 10.3791/56095
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1,2
1Cellular Biomedicine Group, Shanghai, 2Cellular Biomedicine Group, Cupertino, 3Department of Respiratory Medicine, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiaotong University

Summary

Este estudio describe la generación exitosa de un nuevo modelo animal de enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) exponiendo repetidamente a ratones con altas concentraciones de ozono.

Abstract

La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) se caracteriza por flujo de aire persistente limitación y pulmón parenquimatosa la destrucción. Tiene una incidencia muy elevada en las poblaciones que envejecen. Las actuales terapias convencionales para EPOC foco principalmente en síntomas medicamentos; por lo tanto, es urgente el desarrollo de nuevas terapias. Modelos animales calificados de EPOC podrían contribuir a caracterizar los mecanismos subyacentes y pueden ser utilizados para detección de drogas nuevas. Modelos actuales de la EPOC, como el lipopolisacárido (LPS) o la elastasa pancreática porcina (PPE)-modelo de enfisema inducido, generar EPOC-como lesiones en los pulmones y vías respiratorias pero no de lo contrario se asemejan a la patogenia de la EPOC humana. Un humo de cigarrillo (CS)-modelo inducido sigue siendo uno de los más populares ya que no sólo simula EPOC-como lesiones en el sistema respiratorio, pero también se basa en uno de los principales materiales peligrosos que causa EPOC en los seres humanos. Sin embargo, los aspectos desperdiciador de tiempo y mano de obra intensiva del modelo CS-inducida dramáticamente limitan su aplicación en la detección de drogas de nuevo. En este estudio, hemos generado con éxito un nuevo modelo de EPOC mediante la exposición de ratones con altos niveles de ozono. Este modelo demostró lo siguiente: 1) disminuido volumen expiratorio forzado 25, 50 y 75/forzado capacidad vital (FEV25/FVC, FEV50/FVC y VEF75/FVC), indicando el deterioro de la función pulmonar; 2) alvéolos del pulmón ampliada, con destrucción parenquimatosa pulmonar; 3) reduce el tiempo de fatiga y la distancia; y 4) aumenta la inflamación. Tomados en conjunto, estos datos demuestran que el modelo de exposición (OE) de ozono es un modelo confiable que es similar a los seres humanos debido a la sobreexposición de ozono es uno de los factores etiológicos de la EPOC. Además, sólo tomó 6-8 semanas, basados en nuestro trabajo anterior, para crear un modelo de OE, mientras que se requiere de 3 a 12 meses para inducir el modelo de humo de cigarrillo, lo que indica que el modelo de OE puede ser una buena opción para la investigación de la EPOC.

Introduction

Se ha estimado que la EPOC, incluyendo bronquitis crónica y enfisema podría ser la tercera causa de muerte en el mundo en el 20201,2. Se estima la potencial incidencia de EPOC en una población de más de 40 años 12.7% en los hombres y 8,3% en las mujeres dentro de los próximos 40 años3. No hay medicamentos están disponibles para revertir el deterioro progresivo en la EPOC pacientes4. Modelos animales confiables de la EPOC no sólo demandan la imitación del proceso patológico de la enfermedad pero también requieren un período de generación corto. Modelos actuales de la EPOC, incluyendo los LPS o un modelo de EPI-inducida, pueden inducir síntomas de enfisema5,6. Una sola administración o un reto de la semana de LPS o PPE resultados ratones o ratas en marcada neutrofilia en el lavado broncoalveolar (BALF), aumentos de mediadores proinflamatorios (p. ej., TNF-α y IL-1β) en suero, o BALF produce pulmón espacios de aire agrandado de destrucción parenquimatosas y límites aire5,6,7,8,9,10. Sin embargo, LPS o EPI no son causas de EPOC humana y así no imitan el proceso patológico11. Un modelo CS-inducida produce una limitación del flujo de aire persistente, destrucción de parénquima pulmonar y redujo la capacidad de ejercicio funcional. Sin embargo, un protocolo tradicional de CS requiere al menos 3 meses para generar un EPOC modelo12,13,14,15. Por lo tanto, es importante generar un nuevo modelo de animal más eficiente que cumpla los dos requisitos.

Recientemente, además del consumo de cigarrillo, contaminación del aire y la exposición ocupacional se han convertido en causas más comunes de EPOC16,17,18. El ozono, como uno de los principales contaminantes (aunque no es el componente principal de la contaminación atmosférica), directamente puede reaccionar con el tracto respiratorio y dañar el tejido pulmonar de los niños y jóvenes adultos19,20,21 ,22,23,24,25. Ozono, así como otros estimulantes, incluyendo LPS, PPE y CS, participan en un serio de vías bioquímicas de estrés oxidativo pulmonar y daños en el ADN y están vinculadas a la iniciación y la promoción de EPOC26,27. Otro factor es que los síntomas de algunos pacientes con EPOC se deterioran después de estar expuesto al ozono, lo que indica que el ozono puede interrumpir pulmón función18,28,29. Por lo tanto, nos genera un nuevo modelo de EPOC al exponer repetidamente ratones a altas concentraciones de ozono durante 7 semanas; Esto dio lugar a defectos de flujo de aire y daños parenquimatosos pulmonares similares a los de anteriores investigaciones30,31,32. Extendió el protocolo de OE a ratones hembra en este estudio y reproducir con éxito el enfisema en ratones machos en nuestros anteriores estudios30,31,32. Porque ha disminuido la mortalidad de la EPOC en los hombres aumentó en las mujeres en muchos países33, un modelo de EPOC en las mujeres es necesario para estudiar los mecanismos y desarrollar métodos terapéuticos para pacientes EPOC. La aplicabilidad del modelo OE para todos los géneros presta ayuda adicional a su uso como un modelo de EPOC.

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Protocol

Nota: OE el modelo ha sido generado y utilizado en la investigación previamente divulgados 30 , 31 , 32. Todos los experimentos en animales fueron aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Jiaotong de Shanghai.

1. ratones

centro
  1. casa libre de patógeno, de 7 a 9 semanas de edad hembra ratones BALB/c en jaulas individuales ventiladas en un animal bajo control temperatura (20 ° C) y humedad (40-60%). Proporcionar un ciclo oscuro 12 h en el centro y 12 h de luz. Proporcionar alimento y agua ad libitum.

2. Ozono o exposición al aire

  1. generar ozono con un generador eléctrico en una caja de acrílico (e.g. plexiglás) sellado. Soplar el aire fuera de la caja con un ventilador pequeño a través de un tubo de ventilación de aire que se conecta en el interior y fuera de la caja. Monitorear la concentración de ozono en la caja usando una sonda de ozono. Espere hasta que la concentración de ozono en el cuadro de alcance 2,5 partes por millón (ppm).
    Nota: La sonda de ozono puede cambiar automáticamente el generador de ozono o apagar y puede mantener el nivel de ozono en la caja de 2,5 ppm.
  2. Colocar los ratones en la caja cuando el nivel del ozono llegue a 2,5 ppm. Mantener los ratones en el cuadro de 3 h cada vez para exponer al ozono.
    Nota: El cuadro puede mantener un nivel de 2,5 ppm de ozono durante 3 h desconectando automáticamente el generador de ozono o desactivar y soplar el CO 2 que es producido por los ratones fuera de la caja.
  3. Dar dos exposiciones de ozono (cada exposición duración 3 h) por semana (una vez cada 3 días) por 7 semanas, exponer los ratones de control al aire al mismo tiempo y en el mismo periodo.

3. La tomografía computada micro

  1. al final de la semana 7, anestesiar los ratones con una inyección intraperitoneal de pelltobarbitalum natricum (1%, 0.6 - 0.8 ml/100 g) ajustar la dosis según situaciones individuales para ver que el ratón no responder a un pellizco del dedo del pie. Monitor y mantenga el ratón a una frecuencia constante de la respiración; y asegúrese de que no hay movimientos voluntarios existen durante los procedimientos de.
  2. Colocar los ratones anestesiados en la cámara de una tomografía micro computada (µCT).
  3. Calibrar el µCT usando el protocolo estándar y el fabricante ' instrucciones. Fijar el tubo de rayos x a 50 kV y la corriente en 450 μA.
    Nota: Tanto los rayos x y el detector giran alrededor de los ratones.
  4. Realizar el análisis µCT mediante la adquisición de 515 proyecciones con un tamaño de píxeles efectivos de 0,092 mm, un tiempo de exposición de 300 ms para una rebanada y una rebanada de 0,093 mm.
  5. Reconstruir el pulmón con las imágenes adquiridas mediante un software. Ajustar brillo de la imagen en escala de grises fijando el mínimo y máximo de la escala de grises en unidades Hounsfield-750 y-550, respectivamente.
    Nota: El software automáticamente calcula los volúmenes de la parenquimia de pulmón y el área de baja atenuación (LAA) 34 , 35.
  6. Calcular el porcentaje de LAA (LAA %) dividiendo el volumen LAA por el volumen pulmonar total.

4. prueba de la cinta de correr

  1. dan los ratones una adaptación de prueba a una velocidad de 10 m/min durante 10 min en una corriente cinta de la máquina. Nota: la electricidad siempre está apagado cuando el procedimiento se lleva a cabo.
  2. administrar un prueba de fatiga a los ratones.
    1. Calentar los ratones a una velocidad de 10 m/min por 5 min
    2. Aumentar la velocidad a 15 m/min durante 10 minutos
    3. Aumentar la intensidad del ejercicio: aumenta la velocidad de 5 m/min, a partir de 20 m/min, cada 30 min hasta ratones no puede continuar funcionando 36.
  3. Registrar el total de distancia corriente y tiempo de funcionamiento como distancia de fatiga y cansancio tiempo, respectivamente.

5. medidas de función pulmonar

  1. anestesiar los ratones con una inyección intraperitoneal de pelltobarbitalum natricum (1%, 0.6 - 0.8 ml/100 g) ajustar la dosis según situaciones individuales para ver que el ratón no no responder a un pellizco del dedo del pie y espere hasta que los ratones han mantenido espontáneo respiración. Monitor y mantienen el ratón a una frecuencia constante de la respiración; y asegúrese de que no hay movimientos voluntarios existen durante los procedimientos de.
  2. Tracheostomize los ratones cuidadosamente y colocarlos en un pletismógrafo de cuerpo conectado a un ventilador controlado por ordenador.
    Nota: La ventilación es controlada mediante una válvula situada proximalmente al tubo endotraqueal. La configuración proporciona diferentes maniobras semiautomáticas, incluyendo la maniobra de la cuasi-estática presión volumen y la maniobra de flujo rápido del volumen de la.
  3. Imponer un promedio de frecuencia de 150 respiraciones/min hasta el ratón anestesiado mediante ventilación controlada por presión hasta un patrón de respiración regular la respiración y expiración completa en cada ciclo de respiración se obtiene.
  4. Realizar la maniobra de presión-volumen cuasi-estático con el dispositivo mediante la presión negativa generada en el pletismógrafo.
  5. Realizar la maniobra de volumen de flujo dentro de los lazos de la cuasi-estática de presión-volumen a grabar la FVC y el FEV. Inflar el pulmón + 30 cm H 2 O e inmediatamente después conectarlo a una presión altamente negativa para hacer valer la caducidad hasta el volumen residual es el VEF en el primer 25, 50 y 75 ms de la exhalación (FEV 25-30 cm H 2 O. expediente FEV 50 y 75 de la FEV, respectivamente). Rechazar las maniobras subóptimas. Para cada prueba con cada ratón, realizar un mínimo de tres maniobras aceptables para obtener una media fiable para todos los parámetros numéricos.

6. Colección de BALF

  1. tras anestesia terminal con pelltobarbitalum natricum ((1%, 1.8-2.4 ml/100 g) ajustar la dosis según situaciones individuales al ver que el ratón no responde a un pellizco del dedo del pie y perder el aliento), lavado del ratones con 2 mL de PBS a través de un tubo endotraqueal de 1 mm de diámetro y luego recuperar el BALF 10.
  2. Piscina las alícuotas obtenido el lavado y centrifugar a 4 ° C y 250 x g durante 10 minutos
  3. Recoger el sobrenadante para su uso inmediato y almacenar el resto a-80 ° C o líquido nitrógeno.
  4. Cuenta el número total de células usando un hemocitómetro.
  5. Resuspender el precipitado de células en PBS y luego giro (1.400 x g, 6 min) 250 μl de células resuspendidas en diapositivas utilizando una centrífuga de spinner diapositiva.
  6. Tinción de Wright se aplican a las células en el portaobjetos según el fabricante ' Protocolo s.
  7. 200 células por ratón; identificar las células como los macrófagos o neutrófilos, según morfología estándar, bajo 400 aumentos; y sus números de la cuenta.

7. Muestreo de sangre cardiaca

  1. recoger la sangre mediante punción cardiaca, carga en tubos de 1,5 mL y mantenerlo en hielo durante 30 minutos
  2. Centrifugar las muestras de sangre durante 5 min a 2.000 x g y 4 ° C.
  3. Transferir el sobrenadante (suero) a un tubo nuevo y conservarlo a-80 ° C o líquido nitrógeno.
  4. Preparar el suero de IL-1β, IL-10 y pruebas de detección de TNF-α utilizando los respectivos kits ELISA.

8. Análisis morfométrico de pulmón

  1. diseccionar los pulmones y el traquear de los ratones.
    1. Posición cada eutanasia ratón sobre un tablero quirúrgico inmediatamente después del sacrificio.
    2. a diseccionar el platisma y los músculos traqueales anteriores para visualizar y acceder a los anillos traqueales.
    3. Abierta a la torácica de la cavidad. Diseccionar los pulmones y la tráquea, pero no separar el corazón de los pulmones.
  2. Conectar el catéter endotraqueal a una jeringa con paraformaldehído al 4% a través de un tubo de polietileno PE90.
    PRECAUCIÓN: Paraformaldehido es tóxico. Use guantes y gafas de seguridad y utilizar la solución dentro de una campana de humos.
  3. Inflar el pulmón completamente con paraformaldehído al 4% (10 gotas, ~ 200 μL) a través del catéter endotraqueal. Quitar el corazón después de la terminación de la inflación.
  4. Mantener el pulmón en un tubo de 15 mL que contiene 10 mL de paraformaldehído al 4% para al menos 4 h.
  5. Incrustar el pulmón en parafina. Obtener secciones de 5 μm por el bloque de parafina de seccionamiento con un micrótomo rotatorio. Durante el seccionamiento, exponer la máxima superficie de tejido pulmonar dentro del área del árbol bronquial.
  6. Para el análisis morfométrico, realizar hematoxilina y eosina (H & E) manchas en las secciones de.
  7. Las secciones de la imagen con un microscopio de campo brillante vertical (objetivo, 20 X, tiempo de exposición, ms 1,667).
  8. Tienen dos investigadores cegados en el protocolo de tratamiento independientemente contar las secciones histológicas. Utilizar la intercepción lineal media (L m) como un parámetro para medir la distancia de la pared septal alveolar entre. Determinar el L m siguiendo estos pasos:
    1. Abra las imágenes de las secciones en Photoshop y dibujar una cuadrícula de la retícula en la imagen con líneas largas de cinco 550 μm.
    2. Contar el número de alvéolos a través de la línea de la red.
    3. Calcular el L m dividiendo la longitud de la línea de la cuadrícula el número de alvéolos. Para la cuantificación, imagen de cinco secciones por ratón. Adquirir diez imágenes de cada sección (una imagen por campo) y evaluar al azar. Durante la selección del terreno, evitar los campos de las vías respiratorias y los vasos moviendo un campo adelante o en otra dirección.
      Nota: Los datos se presentan como la media ± SEM Se realizó una prueba de t no pareada para comparación entre ratones expuestos al aire y los ratones expuestos al ozono. Tres animales de cada grupo se utilizaron para calcular la diferencia significativa. Un valor de p < 0.05 se consideró significativo.

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Representative Results

Ejemplos de imágenes 3D µCT de cada grupo se muestran en la figura 1un. Los ratones expuestos al ozono tenían un volumen pulmonar total significativamente mayor (figura 1a y b) y LAA % (figura 1c) de los ratones de control expuestos al aire. La capacidad pulmonar y LAA % seguían elevadas después de seis semanas de la exposición de ozono31,32. Volumen pulmonar mayor y LAA % representan el fenotipo de enfisema. Ejemplos de ampliación alveolar del pulmón en figura 2un ilustran la formación de enfisema. Se observó un aumento en la intercepción lineal media (Lm) en los ratones expuestos al ozono (figura 2b), que confirmaron que la destrucción parenquimatosa pulmonar ocurrió después de la exposición de ozono.

Función pulmonar fue medida por los parámetros de tasa de flujo de aire, se muestra como FEV25/FVC, FEV50/FVC y VEF75/FVC. Los resultados mostraron que todos los parámetros que disminuyeron en ratones expuestos al ozono (figura 3-c) fueron consistentes con los defectos funcionales pulmonares típicos en EPOC pacientes4,37. Para evaluar el modelo de OE, llevamos a cabo una prueba de tolerancia de ejercicio que sustituyó por la caminata de 6 min prueba (6MWT)38,39, que comúnmente se utiliza para evaluar los cambios en la capacidad para el ejercicio funcional en pacientes con EPOC. La exposición de ozono disminuyó significativamente la distancia de tiempo y fatiga fatiga (figura 4a y b).

Para abordar la patogénesis de la EPOC en el modelo de OE, los macrófagos y neutrófilos fueron contadas de las BALFs de los ratones; citoquinas proinflamatorias (IL-1β y TNF-α) y citocinas antiinflamatorias (IL-10) fueron detectados en el suero de ratón. Los ratones expuestos al ozono mostraron un aumento significativo en las células inflamatorias, incluyendo macrófagos y neutrófilos (figura 5-c), así como una disminución significativa de la IL-10 y un aumento de IL-1β y TNF-α (figura 6-c ). Todos los datos demostraron que el OE Modelo recapitulados humano EPOC-como síntomas.

Figure 1
Figura 1. Exposición al ozono aumenta la capacidad pulmonar y LAA % detectado por µCT. (a) imágenes en 3D representantes mostrando los pulmones de los ratones expuestos al aire u ozono a las 7 semanas después de la exposición respectiva. (b) volumen pulmonar total individuales de los dos grupos se obtuvieron de las imágenes 3D para las estadísticas. Ratones expuestos al ozono mostraron un aumento significativo en el volumen pulmonar total. (c) individual y medio % LAA de los dos grupos. Ratones expuestos al ozono mostraron un aumento significativo en LAA %. El color rojo indica que LAA (voxels con densidades de 2.550-2.700 unidades de Hounsfield). La tráquea y los bronquios que se muestra en rojo en esta figura se quitaron para calcular el pulmón LAA. Los datos se presentan como la media ± SEM ** P < 0.01, *** P < 0.001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Exposición al ozono aumenta el Lm. (a) representantes micrografías de espacios alveolares del pulmón en las secciones manchadas de ratones expuestos al aire o expuestos al ozono. (b) los valores de Lm fueron cuantificados de las secciones del pulmón de los dos grupos para las estadísticas. Se observó un aumento en Lm en ratones expuestos al ozono. Los datos se presentan como la media ± SEM ** P < 0.01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 . Exposición al ozono una función pulmonar disminuida. (-c) Para los expuestos al aire y los ratones expuestos al ozono, la FEV individual en los primeros 25, 50 y 75 ms de rápido vencimiento (FEV25y FEV50VEF75, respectivamente), así como de la CVF, fueron todos registrados. Se calcularon los porcentajes de VEF75 a FVC, FEV25y FEV50por separado. FEV25/FVC, FEV50/FVC y VEF75/FVC todos disminuyeron significativamente en expuestos al ozono ratones. Los datos se presentan como la media ± SEM * P < 0.05, ** P < 0.01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 . Exposición al ozono había disminuido tiempo de fatiga y cansancio distancia. tiempos en (a) marcha Individual para aire u ozono-expuestos ratones fueron registrados. Ratones expuestos al ozono mostraron una disminución significativa en el tiempo de fatiga. (b) se registraron distancias corrientes individuales de los dos grupos. Ratones expuestos al ozono exhibieron una disminución significativa en la distancia de la fatiga. Los datos se presentan como la media ± SEM * P < 0.05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 . Las células inflamatorias contaron a partir de BALF. (a) individual y promedio número de células totales (TOTAL) en los ratones expuestos al aire u ozono. (b) media y los números de macrófagos (MAC) en los dos grupos. (c) individual y promedio número de neutrófilos (NEU) en los dos grupos. Los datos se presentan como la media ± SEM * P < 0.05, ** P < 0.01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Página de dentro = "1" >Figure 6
Figura 6 . Detección de citoquinas inflamatorias y antiinflamatorias en suero. (a) valores de individuales y promedios de la cantidad de IL-10 en ratones expuestos al aire u ozono. (b) media y los valores de la cantidad de IL-1β en los dos grupos. (c) valores individuales y media de la cantidad de TNF-α en los dos grupos. Los datos se presentan como la media ± SEM * P < 0.05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

En este estudio, presentamos un método confiable para la generación de un nuevo modelo de EPOC. En comparación con otros modelos (es decir, LPS o modelos de EPI), este modelo de OE recapitula el proceso patológico de pacientes con EPOC. Porque el humo del cigarrillo es el principal material peligroso que causa EPOC en pacientes humanos con40, el modelo CS sigue siendo el más popular EPOC modelo41,42. Sin embargo, el modelo CS requiere una R de 3 a 12 meses & período D de nuevos medicamentos. En comparación con el modelo de CS, el actual modelo de OE reduce el período de generación a 6-8 semanas. Hemos observado enfisema en ratones machos después de 6 semanas de la exposición a ozono en nuestros anteriores estudios30,31,32. En este estudio, había aplicado el protocolo de OE a ratones hembra de 7 semanas y había generado con éxito un modelo femenino de OE. Porque se ha reportado mortalidad de EPOC ha disminuido en los hombres que aumentó en las mujeres en algunos países33, es necesario estudiar los mecanismos patogénicos y desarrollar enfoques de curación para pacientes de EPOC femeninos utilizando un modelo femenino de la EPOC. Sabemos que los modelos de EPOC antes mencionadas (es decir, LPS, PPE y CS) pueden trabajar en ambos animales macho y hembra de43. El objetivo de este trabajo fue proponer un modelo adicional de EPOC que recapitula el proceso patológico de pacientes con EPOC y requiere un período de generación muy corto.

El paso clave para la generación de este modelo fue exponer los ratones al ozono (a un nivel de 2,5 ppm) dos veces por semana (una vez cada 3 días) por 6-8 semanas (en este estudio, hemos utilizado 7 semanas, aunque no tratamos de escalamiento de dosis). Mediante el control de los parámetros críticos de la frecuencia de exposición y concentración de ozono, se con éxito reproducido enfisema en hombre de31,de ratones C57BL/632, hombre de ratones BALB/c30y ratones BALB/c femenino (la corriente estudio). El fenotipo de enfisema resultó de la exposición al ozono, con la limitación de flujo de aire y la destrucción parenquimal pulmonar similar a los cambios considerados en EPOC pacientes44,45.

Todavía hay limitaciones para este estudio. Por ejemplo, debido a la patogenia de la EPOC humana está relacionada con la anatomía de los pulmones, un modelo ideal de la EPOC debe generarse en los animales que tienen una estructura anatómica pulmonar similar a la de los seres humanos. Comparado con grandes animales, pequeños animales poseen vías respiratorias incluso menos amplia ramificación que los seres humanos46. Debemos admitir que sería más significativo para generar un modelo de EPOC en grandes animales. Sin embargo, es muy difícil establecer modelos a gran escala en los animales. Otra limitación de este modelo es su relevancia clínica. Si bien es cierto que ozono puede reaccionar con el tracto respiratorio y daño pulmonar tejido19,22, y aunque hay evidencia de que los síntomas de algunos pacientes con EPOC se deterioran después de la exposición a ozono28, el ozono no es la causa principal de la EPOC en los pacientes. Sin embargo, todavía estamos proponiendo y utilizando este modelo de OE porque ozono y CS causan daños al sistema respiratorio induciendo inflamación y conducen a estrés oxidativo26,27. Así, un nuevo medicamento que puede curar la EPOC en la poder del modelo OE assumably también trabajar en el modelo de CS y por lo tanto potencialmente desarrollados para pacientes con EPOC.

Aplicaciones del modelo OE no están restringidos a descifrar los mecanismos moleculares y celulares de la EPOC. Nuestros dos trabajos recientes también investigaron la eficacia de N-acetilcisteína (NAC)31 y NaHS32 (donante exógeno de H2S) en el tratamiento de la EPOC mediante la administración exógena de los dos fármacos en el modelo de OE. En el primer estudio, se encontraron una revocación de hiperreactividad de las vías respiratorias y una reducción de la masa de músculo liso de las vías respiratorias después de la administración de NAC. Estos efectos podrían indicar la base para posibles beneficios clínicos de la NAC en pacientes de EPOC31. En el segundo estudio del modelo de OE, se encontró que la administración de exógenos NaHS había invertida inflamación del pulmón y revocó parcialmente las características del enfisema. Así, con este modelo de OE, demostró en un estudio preliminar que NaHS podría desarrollarse como un potencial candidato a fármaco para EPOC pacientes32. Por lo tanto, el OE tiene aplicaciones potenciales para la investigación del mecanismo tanto investigación de fármacos para EPOC.

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Disclosures

Z.W.S. y W.W. son empleados actuales y los titulares de opciones sobre acciones del grupo de Biomedicina celular (NASDAQ: CBMG). Otros autores declaran que no tienen intereses que compiten.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer al Sr. Boyin Qin (Shanghai pública Health Clinical Center) para la asistencia técnica para la evaluación µCT en el presente Protocolo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BALB/c mice Slac Laboratory Animal,Shanghai, China N/A 7-to-9-week-old female BALB/c mice were used in this study.
Individual ventilated cages Suhang, Shanghai, China Model Number: MU64S7 The cages were used for housing mice in the animal facility.
Sealing perspex-box Suhang, Shanghai, China N/A The box was used  to contain the ozone generator. Mice were exposed to ozone within the box.
Electric generator Sander Ozoniser, Uetze-Eltze, Germany Model 500  The device was used for generating ozone.
Ozone probe ATi Technologies, Ashton-U-Lyne, Greater Manchester, UK Ozone 300 The device was used for monitoring and controlling the generation of ozone.
Pelltobarbitalum natricum Sigma, St. Louis, MO, USA P3761 Mice were anesthetized by intraperitoneal injection of pelltobarbitalum natricum.
Micro-Computed Tomography GE Healthcare, London, ON, Canada RS0800639-0075 This device was used for acquiring images of the lung.
Micro-view 2.01 ABA software GE Healthcare, London, ON, Canada Micro-view 2.01  This device was used for reconstruct the lung and analyze volume, LAA of the lung.
Treadmill machine  Duanshi, Hangzhou, Zhejiang, China DSPT-208 This machine was usd for fatigue test.
Body plethysmograph eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK Forced Manoeuvres System This device was used to test spirometry pulmonary function.
Ventilator eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK Forced Manoeuvres System This device was used to test spirometry pulmonary function.
Slide spinner centrifuge Denville Scientific, Holliston, MA, USA C1183  It was used to spin BALF cells onto slides.
Wright Staining Hanhong, Shanghai, China RE04000054  It was used to staining macrophages, neutrophils in the suspended BALF.
Hemocytometer Hausser Scientific, Horsham, PA, USA 4000 It was used to count cells.
IL-1β Abcam, Cambridge, MA, USA ab100704 They were used to test the respective factors in serum.
IL-10 Abcam, Cambridge, MA, USA ab46103 They were used to test the respective factors in serum.
TNF-α Abcam, Cambridge, MA, USA ab100747 They were used to test the respective factors in serum.
Paraformaldehyde  Sigma, St. Louis, MO, USA P6148 The lung was inflated by 4% paraformaldehyde.
Paraffin Hualing, Shanghai, China 56# It was used to embed the lung.
Rotary Microtome Leica, Wetzlar,  Hesse, Germany RM2255 It was used for sectioning the lung.
Hgaematoxylin and Eosin (H&E) staining solution Solarbio, Beijing, China G1120 H&E staining was done for morphometric analysis.
Upright bright field microscope Olympus, Center Valley, PA, USA CX41 It was used to image the H&E staining slides.
Adobe Photoshop 12 Adobe, San Jose, CA, USA Adobe Photoshop 12 It was used to count the number of alveoli on the H&E stained images.
GraphPad prism 5 Graphpad Software Inc., San Diego, CA GraphPad prism 5 It was used for data analysis and production of figures.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380, 2095-2128 (2012).
  2. Chapman, K. R., et al. Epidemiology and costs of chronic obstructive pulmonary disease. Eur Respir J. 27, 188-207 (2006).
  3. Afonso, A. S., Verhamme, K. M., Sturkenboom, M. C., Brusselle, G. G. COPD in the general population: prevalence, incidence and survival. Respir Med. 105, 1872-1884 (2011).
  4. Rabe, K. F., et al. Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease: GOLD executive summary. Am J Respir Crit Care Med. 176, 532-555 (2007).
  5. Ogata-Suetsugu, S., et al. Amphiregulin suppresses epithelial cell apoptosis in lipopolysaccharide-induced lung injury in mice. Biochem Biophys Res Communi. 484, 422-428 (2017).
  6. Oliveira, M. V., et al. Characterization of a Mouse Model of Emphysema Induced by Multiple Instillations of Low-Dose Elastase. Front Physiol. 7, 457 (2016).
  7. Vernooy, J. H., Dentener, M. A., van Suylen, R. J., Buurman, W. A., Wouters, E. F. Long-term intratracheal lipopolysaccharide exposure in mice results in chronic lung inflammation and persistent pathology. Am J Respir Cell Mol Biol. 26, 152-159 (2002).
  8. Birrell, M. A., et al. Role of matrix metalloproteinases in the inflammatory response in human airway cell-based assays and in rodent models of airway disease. J Pharm Exp Ther. 318, 741-750 (2006).
  9. Gamze, K., et al. Effect of bosentan on the production of proinflammatory cytokines in a rat model of emphysema. Exp Mol Med. 39, 614-620 (2007).
  10. Vanoirbeek, J. A., et al. Noninvasive and invasive pulmonary function in mouse models of obstructive and restrictive respiratory diseases. Am J Respir Cell Mol Biol. 42, 96-104 (2010).
  11. Wright, J. L., Cosio, M., Churg, A. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, 1-15 (2008).
  12. Huh, J. W., et al. Bone marrow cells repair cigarette smoke-induced emphysema in rats. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301, 255-266 (2011).
  13. Schweitzer, K. S., et al. Adipose stem cell treatment in mice attenuates lung and systemic injury induced by cigarette smoking. Am J Respir Crit Care Med. 183, 215-225 (2011).
  14. Guan, X. J., et al. Mesenchymal stem cells protect cigarette smoke-damaged lung and pulmonary function partly via VEGF-VEGF receptors. J Cell Biochem. 114, 323-335 (2013).
  15. Gu, W., et al. Mesenchymal stem cells alleviate airway inflammation and emphysema in COPD through down-regulation of cyclooxygenase-2 via p38 and ERK MAPK pathways. Sci Rep. 5, 8733 (2015).
  16. Cordasco, E. M., VanOrdstrand, H. S. Air pollution and COPD. Postgrad Med. 62, 124-127 (1977).
  17. Berend, N. Contribution of air pollution to COPD and small airway dysfunction. Respirology. 21, 237-244 (2016).
  18. DeVries, R., Kriebel, D., Sama, S. Outdoor Air Pollution and COPD-Related Emergency Department Visits, Hospital Admissions, and Mortality: A Meta-Analysis. COPD. 14 (1), 113-121 (2016).
  19. Penha, P. D., Amaral, L., Werthamer, S. Ozone air pollutants and lung damage. IMS Ind Med Surg. 41, 17-20 (1972).
  20. Stern, B. R., et al. Air pollution and childhood respiratory health: exposure to sulfate and ozone in 10 Canadian rural communities. Environ Res. 66, 125-142 (1994).
  21. Tager, I. B., et al. Chronic exposure to ambient ozone and lung function in young adults. Epidemiology. 16, 751-759 (2005).
  22. Romieu, I., Castro-Giner, F., Kunzli, N., Sunyer, J. Air pollution, oxidative stress and dietary supplementation: a review. Eur Respir J. 31, 179-197 (2008).
  23. Hemming, J. M., et al. Environmental Pollutant Ozone Causes Damage to Lung Surfactant Protein B (SP-B). Biochemistry. 54, 5185-5197 (2015).
  24. Chu, H., et al. Comparison of lung damage in mice exposed to black carbon particles and ozone-oxidized black carbon particles. Sci Total Environ. 573, 303-312 (2016).
  25. Jin, M., et al. MAP4K4 deficiency in CD4(+) T cells aggravates lung damage induced by ozone-oxidized black carbon particles. Environ Toxicol Pharmacol. 46, 246-254 (2016).
  26. Brusselle, G. G., Joos, G. F., Bracke, K. R. New insights into the immunology of chronic obstructive pulmonary disease. Lancet. 378, 1015-1026 (2011).
  27. Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, K., Loridas, S. Pulmonary oxidative stress, inflammation and cancer: respirable particulate matter, fibrous dusts and ozone as major causes of lung carcinogenesis through reactive oxygen species mechanisms. Int J Environ Res Public Health. 10, 3886-3907 (2013).
  28. Medina-Ramon, M., Zanobetti, A., Schwartz, J. The effect of ozone and PM10 on hospital admissions for pneumonia and chronic obstructive pulmonary disease: a national multicity study. Am J Epidemiol. 163, 579-588 (2006).
  29. Lee, I. M., Tsai, S. S., Chang, C. C., Ho, C. K., Yang, C. Y. Air pollution and hospital admissions for chronic obstructive pulmonary disease in a tropical city: Kaohsiung, Taiwan. Inha Toxicol. 19, 393-398 (2007).
  30. Triantaphyllopoulos, K., et al. A model of chronic inflammation and pulmonary emphysema after multiple ozone exposures in mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 300, 691-700 (2011).
  31. Li, F., et al. Effects of N-acetylcysteine in ozone-induced chronic obstructive pulmonary disease model. PLoS ONE. 8, e80782 (2013).
  32. Li, F., et al. Hydrogen Sulfide Prevents and Partially Reverses Ozone-Induced Features of Lung Inflammation and Emphysema in Mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 55, 72-81 (2016).
  33. Rycroft, C. E., Heyes, A., Lanza, L., Becker, K. Epidemiology of chronic obstructive pulmonary disease: a literature review. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 7, 457-494 (2012).
  34. Washko, G. R., et al. Airway wall attenuation: a biomarker of airway disease in subjects with COPD. J Appl Physiol. 107, 185-191 (2009).
  35. Yamashiro, T., et al. Quantitative assessment of bronchial wall attenuation with thin-section CT: An indicator of airflow limitation in chronic obstructive pulmonary disease. AJR Am J Roentgenol. 195, 363-369 (2010).
  36. Tang, X., et al. Arctigenin efficiently enhanced sedentary mice treadmill endurance. PLoS ONE. 6, e24224 (2011).
  37. Schmidt, G. A., et al. Official Executive Summary of an American Thoracic Society/American College of Chest Physicians Clinical Practice Guideline: Liberation from Mechanical Ventilation in Critically Ill Adults. Am J Respir Crit Care Med. 195, 115-119 (2017).
  38. ATS Committee on Proficiency Standards for Clinical Pulmonary Function Laboratories. ATS statement: guidelines for the six-minute walk test. Am J Respir Crit Care Med. 166, 111-117 (2002).
  39. Shigemura, N., et al. Autologous transplantation of adipose tissue-derived stromal cells ameliorates pulmonary emphysema. Am J Transplant. 6, 2592-2600 (2006).
  40. Bchir, S., et al. Concomitant elevations of MMP-9, NGAL, proMMP-9/NGAL and neutrophil elastase in serum of smokers with chronic obstructive pulmonary disease. J Cell Mol Med. , 1-12 (2016).
  41. Fricker, M., Deane, A., Hansbro, P. M. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. Expert Opin Drug Discov. 9, 629-645 (2014).
  42. Perez-Rial, S., Giron-Martinez, A., Peces-Barba, G. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. Arch Bronconeumol. 51, 121-127 (2015).
  43. Antunes, M. A., et al. Effects of different mesenchymal stromal cell sources and delivery routes in experimental emphysema. Respir Res. 15, 118 (2014).
  44. Celli, B. R., MacNee, W., Force, A. E. T. Standards for the diagnosis and treatment of patients with COPD: a summary of the ATS/ERS position paper. Eur Respir J. 23, 932-946 (2004).
  45. U.S. Preventive Services Task Force. Screening for chronic obstructive pulmonary disease using spirometry: U.S. Preventive Services Task Force recommendation statement. Ann Intern Med. 148, 529-534 (2008).
  46. Ward, R. E., et al. Design considerations of CareWindows, a Windows 3.0-based graphical front end to a Medical Information Management System using a pass-through-requester architecture. Proc Annu Symp Comput Appl Med Care. , 564-568 (1991).

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Medicina número 126 enfermedad pulmonar obstructiva crónica bronquitis crónica enfisema limitación de flujo de aire destrucción de parénquima pulmonar exposición al ozono
Generación de un modelo de enfermedad pulmonar obstructiva crónica en ratones por la exposición repetida del ozono
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Sun, Z., Li, F., Zhou, X., Wang, W.… More

Sun, Z., Li, F., Zhou, X., Wang, W. Generation of a Chronic Obstructive Pulmonary Disease Model in Mice by Repeated Ozone Exposure. J. Vis. Exp. (126), e56095, doi:10.3791/56095 (2017).

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