Medicine

جيل طراز انسداد الشعب الهوائية المزمن في الفئران بالتعرض للأوزون المتكررة

Published: August 25, 2017 doi: 10.3791/56095

Zhongwei Sun^1,2, Feng Li³, Xin Zhou³, Wen Wang^1,2

¹Cellular Biomedicine Group, Shanghai, ²Cellular Biomedicine Group, Cupertino, ³Department of Respiratory Medicine, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiaotong University

Summary

تصف هذه الدراسة نجاح توليد نموذج جديد للحيوان مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD) وذلك بتعريض الفئران لتركيزات عالية من الأوزون مرارا وتكرارا.

Abstract

مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD) يتسم باستمرار تدفق الهواء الرئة والحد من تدمير متني. أنها نسبة عالية جداً في شيخوخة السكان. العلاجات التقليدية الحالية لهذا المرض تركز أساسا على تعديل أعراض المخدرات؛ وبالتالي، ثمة حاجة ملحة في تطوير علاجات جديدة. نماذج حيوانية المؤهلين لهذا المرض يمكن أن تساعد على وصف الآليات الكامنة، ويمكن أن تستخدم لفحص المخدرات الجديدة. النماذج الحالية من هذا المرض، مثل ليبوبوليساكتشاريدي (LPS) أو elastase البنكرياس الخنزير (معدات الوقاية الشخصية)-نموذج انتفاخ المستحث، تولد آفات شبيهة بهذا المرض في الرئتين والخطوط الجوية ولكن لا تشبه إلا الآلية المرضية لهذا المرض البشري. دخان سجائر (CS)-نموذج المتعمد لا تزال واحدة من الأكثر شعبية نظراً لأنه ليس فقط يحاكي آفات شبيهة بهذا المرض في الجهاز التنفسي، بل أنها تقوم أيضا على واحد من المواد الخطرة الرئيسية التي تسبب هذا المرض في البشر. بيد أن جوانب تستغرق وقتاً طويلاً وتتطلب عمالة مكثفة من طراز المستحثة CS تحد كبير تطبيقه في فحص المخدرات الجديدة. في هذه الدراسة، بنجاح إنشاء نموذج جديد لهذا المرض وذلك بتعريض الفئران إلى مستويات عالية من الأوزون. أظهر هذا النموذج ما يلي: 1) انخفض حجم الزفير القسري 25 و 50 و 75/القسري القدرات الحيوية (FEV₂₅/FVC، FEV₅₀/FVC، و FEV₇₅/FVC)، التي تشير إلى تدهور وظائف الرئة؛ 2) الحويصلات الهوائية في الرئة الموسع، مع تدمير متني الرئة؛ 3) تخفيض وقت التعب والمسافة؛ و 4) زاد الالتهاب. أخذت معا، تبين هذه البيانات أن نموذج التعرض (عمر الفاروق) الأوزون هو نموذج حيوان موثوقة أنه مماثل للبشر المفرط الأوزون أحد العوامل المسببة لهذا المرض. بالإضافة إلى ذلك، استغرق الأمر سوى 6-8 أسابيع، على أساس عملنا السابق، لإنشاء نموذج عمر الفاروق، في حين أنه يتطلب 3-12 شهرا للحث على الطراز دخان السجائر، مشيراً إلى أن النموذج عمر الفاروق الذي قد يكون خياراً جيدا للبحوث هذا المرض.

Introduction

ويقدر أن هذا المرض، بما في ذلك انتفاخ الرئة والتهاب القصبات المزمن، قد يكون السبب الرئيسي الثالث للوفاة في العالم بحلول عام 2020¹^،². يحتمل حدوث هذا المرض في عدد سكان ما يزيد على 40 عاماً يقدر أن 12.7 في المائة عند الذكور و 8.3% في الإناث خلال ال 40 عاماً القادمة³. لا توجد أدوية متوفرة حاليا لعكس التدهور التدريجي لمرضى هذا المرض⁴. موثوق بها من نماذج حيوانية لهذا المرض ليس فقط الطلب التقليد عملية باثولوجية المرض ولكن أيضا تحتاج إلى فترة قصيرة من جيل. النماذج الحالية من هذا المرض، بما في ذلك لبس أو نموذج المستحثة بمعدات الوقاية الشخصية، يمكن أن تحدث أعراض مثل انتفاخ الرئة⁵^،⁶. إدارة واحدة أو تحديا أسبوعا من لبس أو معدات الوقاية الشخصية لنتائج الفئران أو الجرذان في neutrophilia ملحوظ في سائل الغسل للفيسيولوجيا (بالف)، الزيادات الوسطاء المحترفين التحريضية (مثلاً، تنف-α وايل-1β) في بالف أو في مصل الدم، وتنتج الرئة المسافات الجوية تدمير الموسع متني وحدود تدفق الهواء⁵^،^،من⁶⁷^،⁹^،^،من⁸¹⁰. ومع ذلك، لبس أو معدات الوقاية الشخصية ليست الأسباب لهذا المرض البشري وبالتالي لا تحاكي عملية المرضية¹¹. نموذج المستحثة CS المنتجة الحد من استمرار تدفق الهواء، وتدمير متني الرئة، وانخفاض القدرة على ممارسة الرياضة الوظيفية. ومع ذلك، يتطلب بروتوكول CS تقليدية لتوليد هذا المرض نموذج¹²^،¹³^،^،من¹⁴¹⁵3 أشهر على الأقل. وبالتالي، من المهم إنشاء نموذج حيوانية جديدة، أكثر كفاءة تفي بالمتطلبات اثنين.

في الآونة الأخيرة، بالإضافة إلى تدخين السجائر، تلوث الهواء، والتعرض المهني أصبحت الأسباب الأكثر شيوعاً لهذا المرض¹⁶^،^،من¹⁷¹⁸. الأوزون، كأحد الملوثات الرئيسية (على الرغم من عدم العنصر الرئيسي لتلوث الهواء) ومباشرة يمكن أن تتفاعل مع الجهاز التنفسي وتلف أنسجة الرئة للأطفال والشباب البالغين¹⁹^،²⁰^،²¹ ^،^،من²²²³^،^،من²⁴²⁵. الأوزون، فضلا عن المنبهات الأخرى بما في ذلك لبس، ومعدات الوقاية الشخصية، وخدمات العملاء، ويشاركون في خطيرة من المسارات البيوكيميائية الرئوية الأكسدة وتلف الحمض النووي وترتبط باستهلال وتعزيز هذا المرض²⁶^،²⁷. وثمة عامل آخر أن تتدهور أعراض بعض المرضى من هذا المرض بعد التعرض للأوزون، مما يشير إلى أن الأوزون يمكن أن تعطل الرئة الدالة¹⁸^،^،من²⁸²⁹. لذلك، نحن إنشاء نموذج جديد لهذا المرض وذلك بتعريض الفئران لتركيزات عالية من الأوزون مرارا وتكرارا لمدة 7 أسابيع؛ وادي ذلك إلى تدفق الهواء العيوب والأضرار متني الرئة مماثلة لتلك التي للتحقيقات السابقة³⁰^،^،من³¹³². تمديد البروتوكول عمر الفاروق للفئران الإناث في هذه الدراسة، واستنسخت بنجاح انتفاخ الرئة في الفئران الذكور في أعمالنا السابقة الدراسات³¹^،^،من³⁰³². لأن انخفض معدل وفيات هذا المرض لدى الرجال ولكن زادت في النساء في العديد من البلدان³³، نموذج هذا المرض في الإناث يلزم دراسة الآليات وتطوير الأساليب العلاجية للمرضى الإناث في هذا المرض. إمكانية تطبيق نموذج عمر الفاروق للجنسين جميع يضفي مزيدا من الدعم لاستخدامه كنموذج هذا المرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: تم إنشاء نموذج "عمر الفاروق" والمستخدمة في البحث عنها سابقا ³⁰ ^، ^، من ³¹ ³². وقد أقر جميع التجارب على الحيوانات "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة جياوتونغ بشانغهاى.

1-الفئران

مرفق

البيت خالية من مسببات الأمراض، 7-9 أسبوع من الفئران بالب/ج الإناث في أقفاص التهوية الفردية في حيوان تحت التحكم درجة الحرارة (20 درجة مئوية) ورطوبة (40-60 في المائة). توفير 12 ح الضوء ودورة الظلام ح 12 في المرفق. توفير الغذاء والمياه libitum الإعلانية.

2. الأوزون أو التعرض للهواء

توليد الأوزون مع مولد كهربائي في مربع اكريليك (مثل بيرسبيكس) ختم. ضربة جوية الخروج من مربع باستخدام منفاخ هواء صغيرة من خلال أنبوب تنفيس هواء متصل داخل وخارج منطقة الجزاء. رصد تركيز الأوزون في المربع باستخدام مسبار الأوزون. انتظر حتى يصل تركيز الأوزون في المربع إلى أجزاء 2.5 لكل مليون (ppm).
ملاحظة: مسبار الأوزون يمكن تبديل مولد الأوزون تلقائياً أو إيقاف تشغيله، ويمكن المحافظة على مستوى الأوزون في المربع في 2.5 جزء في المليون-
وضع الفئران في المربع عند مستوى الأوزون تصل إلى 2.5 جزء في المليون. تبقى الفئران في مربع ح 3 في كل مرة تعرضها للأوزون-
ملاحظة: المربع يمكن الاحتفاظ بمستوى الأوزون من 2.5 جزء في المليون خلال ح 3 عن طريق التحول مولد الأوزون تلقائياً أو إيقاف تشغيله، وتهب CO ₂ التي ينتجها الفئران من خارج منطقة الجزاء.
إعطاء اثنين من التعرض الأوزون (كل التعرض الدائم ح 3) أسبوعيا (مرة كل 3 أيام) لمدة 7 أسابيع؛ وفضح الفئران السيطرة الهواء في نفس الوقت وفي نفس الفترة-

3. الصغير-المقطعي

في نهاية الأسبوع 7، تخدير الفئران بحقن داخل ناتريكوم بيلتوباربيتالوم (1%، 0.6-0.8 مل/100 غرام) تعديل الجرعة وفقا للحالات الفردية لمعرفة أن الماوس لا الاستجابة إلى رشة تو. مراقبة والاحتفاظ الماوس في وتيرة التنفس مطرد؛ وتأكد من وجود لا التماسات طوعية أثناء الإجراءات.
مكان الفئران أنيسثيتيزيد في الدائرة حسابها الصغرى التصوير المقطعي (µCT)-
µCT استخدام البروتوكول القياسي والشركة المصنعة ' تعليمات s. تعيين أنبوب الأشعة السينية في 50 كيلو فولت والتيار في 450 µA.
ملاحظة: كل الأشعة السينية وكاشف الدوران حول الفئران.
إجراء تحليل µCT بالحصول على إسقاطات 515 مع حجم بكسل فعالة 0.092 ملم، ووقت تعرض من 300 مرض التصلب العصبي المتعدد لشريحة واحدة، وسمك شريحة ملم 0.093.
في الرئة مع الصور المكتسبة باستخدام برمجيات. ضبط سطوع الصورة الرمادية بتعيين الحد الأدنى والحد الأقصى للدرجات الرمادية في وحدات هاونسفيلد-550 و-750، على التوالي.
ملاحظة: البرنامج تلقائياً حساب حجم حمة الرئة وال ³⁴ ^، منطقة منخفضة التوهين (LAA) ³⁵-
لحساب النسبة مئوية LAA (LAA %) بقسمة حجم LAA بحجم إجمالي الرئة.

4. "اختبار حلقة مفرغة"

إعطاء اختبار الفئران التكيف بسرعة 10 م/دقيقة لمدة 10 دقيقة على آلة المطحنة قيد التشغيل. ملاحظة: الكهرباء دائماً قبالة عندما يجري الإجراء.
إدارة اختبار التعب للفئران.
1. الاحماء الفئران بسرعة 10 م/دقيقة للحد الأدنى 5
2. زيادة السرعة إلى 15 متر/دقيقة لدقيقة 10
3. زيادة كثافة ممارسة: زيادة السرعة من 5 م/دقيقة، بدءاً من 20 مترا في الدقيقة، كل 30 دقيقة حتى الفئران لا يمكن الاستمرار في تشغيل ³⁶-
تسجيل إجمالي قيد التشغيل عن بعد وإدارة الوقت كالتعب المسافة والوقت التعب، على التوالي.

5. "قياسات وظيفة الرئة"

تخدير الفئران بحقن داخل ناتريكوم بيلتوباربيتالوم (1%، 0.6-0.8 مل/100 غرام) تعديل الجرعة وفقا للحالات الفردية لمعرفة أن الماوس لا لا تستجيب لقرصة أخمص القدمين والانتظار حتى الفئران حافظت على التنفس العفوي. مراقبة والاحتفاظ الماوس في وتيرة التنفس مطرد؛ وتأكد من وجود لا التماسات طوعية أثناء الإجراءات.
تراتشيوستوميزي الفئران بعناية ووضعها في بليثيسموجراف جسم متصل بجهاز التنفس الصناعي تسيطر عليها الكمبيوتر.
ملاحظة: يتم التحكم في التهوية عبر صمام الموقع بروكسيمالي إلى أنبوب داخل الرغامى. يوفر الإعداد مختلف المناورات شبه التلقائي، بما في ذلك مناورة حجم الضغط شبه ثابتة والمناورة لحجم التدفق السريع-
فرض معدل التنفس تواتر 150 نفسا بالدقيقة للماوس أنيسثيتيزيد عن طريق التهوية تسيطر عليها الضغط حتى نمط التنفس عادية ويتم الحصول على الصلاحية الكاملة في كل دورة من دورات التنفس.
إجراء المناورة حجم الضغط شبه ثابت مع الجهاز باستخدام الضغوط السلبية التي ولدت في بليثيسموجراف-
إجراء المناورة حجم التدفق السريع داخل الحلقات حجم الضغط شبه ثابت لتسجيل في تطعيما و FEV. انتفاخ الرئة إلى + 30 سم ح ₂ س، وفورا بعد ذلك بتوصيله إلى ضغط سلبي للغاية فرض انتهاء الصلاحية حتى تصبح وحدة التخزين المتبقية في سجل سين-30 سم ح ₂ FEV في 25 الأولى و 50 و 75 مللي من زفير (FEV ₂₅ ، FEV ₅₀، و ₇₅ من FEV، على التوالي). رفض هذه المناورات دون الحد الأمثل. لكل اختبار مع كل واحدة بالماوس، القيام بالحد أدنى من ثلاث مناورات مقبولة للحصول على وسيلة موثوقة لجميع المعلمات العددية.

6. جمع بالف

عقب التخدير الطرفي مع ناتريكوم بيلتوباربيتالوم ((1%، 1.8-2.4 مل/100 غرام) تعديل الجرعة وفقا للحالات الفردية لمعرفة أن الماوس عدم الاستجابة إلى رشة أخمص القدمين وتفقد التنفس)، الغسل الفئران مع 2 مل من برنامج تلفزيوني عن طريق أنبوب داخل الرغامى مم 1 واسترداد ثم بالف ¹⁰-
تجمع مختبرين الغسل المستردة والطرد المركزي لهم في 4 درجات مئوية و 250 g x للحد الأدنى 10
جمع المادة طافية للاستخدام الفوري، وتخزين ما تبقى في-80 درجة مئوية أو سائل النيتروجين.
حساب إجمالي عدد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير.
ريسوسبيند بيليه الخلية في برنامج تلفزيوني وثم زيادة ونقصان (1,400 س ز، 6 دقيقة) 250 ميليلتر الخلايا حراكه على الشرائح باستخدام أجهزة الطرد مركزي في الزيادة ونقصان شريحة.
"رأيت تطبيق" التلوين للخلايا على الشرائح وفقا للشركة المصنعة ' بروتوكول s-
عد الخلايا 200 كل الماوس؛ وتحديد الخلايا الضامة أو العَدلات، وفقا مورفولوجية القياسية، تحت 400 X التكبير؛ وحساب هذه الأرقام-

7. أخذ عينات الدم القلب

جمع الدم عن طريق ثقب القلب وتحميله إلى 1.5 مل أنابيب، وإبقائه على الجليد للحد الأدنى 30
الطرد المركزي عينات الدم لمدة 5 دقائق في 000 2 × ز و 4 درجة مئوية.
نقل المادة طافية (المصل) إلى أنبوب جديد وتخزينها في-80 درجة مئوية أو سائل النيتروجين.
إعداد المصل لايل-1β، إيل-10، واختبارات الكشف عن تنف-α باستخدام مجموعات أليسا كل منهما.

8. تحليل شكلي الرئة

تشريح الرئتين وتراتشياس من الفئران.
1. بوضع كل الماوس يوثانيزيد على لوحة العمليات جراحية مباشرة بعد تضحية.
2. تشريح بعيداً في بلاتيسما وعضلات القصبة الهوائية الأمامية لتصور والوصول إلى حلقات الرغامى.
3. مفتوحة حتى الصدر. تشريح الرئتين والقصبة الهوائية، ولكن لا تفصل القلب من الرئتين.
توصيل القسطرة داخل الرغامى بحقنه تحتوي على بارافورمالدهيد 4% عن طريق أنبوب البولي إيثيلين PE90-
تنبيه: بارافورمالدهيد السامة. ارتداء قفازات ونظارات السلامة واستخدام الحل داخل غطاء دخان.
انتفاخ الرئة تماما استخدام بارافورمالدهيد 4% (10 قطرات، ~ 200 ميليلتر) عن طريق القسطرة داخل الرغامى. إزالة القلب بعد انتهاء التضخم.
المحافظة على الرئة في أنبوب 15 مل تحتوي على 10 مل بارافورمالدهيد 4% على الأقل 4 حاء
في الرئة في البارافين. الحصول على الأقسام 5-ميكرومتر بكتلة البارافين تمزيقها مع مبضع دوارة. خلال تمزيقها، يعرض الحد الأقصى للمساحة السطحية لانسجة الرئة داخل منطقة الشعب الهوائية شجرة-
لتحليل شكلي، أداء الهيماتوكسيلين وويوزين (ح & ه) تلطيخ في المقاطع.
صورة الأقسام مع مجهر تستقيم مشرق الميدان (الهدف العدسة، 20 X؛ وقت التعرض، 1.667 ms).
اثنين من المحققين أعمى لبروتوكول العلاج عد المقاطع النسيجي بشكل مستقل. استخدام التقاطع الخطي يعني (ل _م) كمعلمة لقياس مسافة الجدار الحاجز بين السنخية. تحديد ل _م باستخدام الخطوات التالية:
1. فتح صور المقاطع في Photoshop، ورسم شبكة شبيكة الشعر على الصورة مع مكم 550 خمس خطوط طويلة.
2. عدد من الحويصلات الهوائية عبر خط الشبكة.
3. ل _م بتقسيم طول خط الشبكة على عدد من الحويصلات الهوائية. للتحديد الكمي، صورة خمسة أقسام للماوس. الحصول على صور عشرة من كل قسم (صورة واحدة في كل حقل) وتقييم عشوائياً. أثناء تحديد الحقل، تجنب حقول الخطوط الجوية والسفن بنقل حقل واحد المقبلة أو في اتجاه آخر-
  ملاحظة: يتم عرض البيانات ك ± يعني S.E.M. اختبار t المزدوجة الأمم المتحدة أجريت للمقارنة بين الفئران المعرضة للهواء والفئران المعرضة للأوزون. واستخدمت الحيوانات ثلاثة من كل مجموعة لحساب الفرق كبير. فقيمه < 0.05 اعتبرت هامة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتم عرض أمثلة للصور µCT ثلاثية الأبعاد لكل مجموعة في الشكل 1. الفئران المعرضة للأوزون كانت وحدة تخزين إجمالي الرئة أكبر بشكل ملحوظ (الشكل 1وب) و LAA % (الشكل 1ج) عما الفئران المعرضة للهواء عنصر التحكم. وظل حجم الرئة و LAA % مرتفعة بعد ستة أسابيع من التعرض للأوزون³¹^،³². وتمثل النمط الظاهري انتفاخ الرئة زيادة حجم و LAA %. وتوضح الأمثلة لتوسيع التهاب الرئة في الشكل 2 تشكيل انتفاخ الرئة. ولوحظ زيادة في اعتراض خطي يعني (Lm) في الفئران المعرضة للأوزون (الشكل 2ب)، الذي أكد أن تدمير الرئة متني حدث بعد التعرض للأوزون.

وتم قياس وظيفة الرئة بالمعلمات معدل تدفق الهواء، كما هو موضح FEV₂₅/FVC، FEV₅₀/FVC، و FEV₇₅/FVC. وأظهرت النتائج أن جميع المعلمات التي انخفضت في الفئران المعرضة للأوزون (الشكل 3أ-ج) تتفق مع العيوب الفنية الرئة النموذجية في هذا المرض المرضى⁴^،³⁷. لمواصلة تقييم نموذج عمر الفاروق، قمنا ممارسة التسامح اختبار مستبدل للمشي 6-مين اختبار (6MWT)³⁸^،³⁹، الذي يستخدم عادة لتقييم التغيرات في القدرة على ممارسة الرياضة الوظيفية في المرضى الذين يعانون من هذا المرض. تعرض الأوزون انخفضت إلى حد كبير المسافة الزمنية والتعب التعب (الشكل 4وب).

ولمعالجة الآلية المرضية لهذا المرض في نموذج عمر الفاروق، أحصى الضامة والعدلات من بالفس الفئران؛ تم الكشف عن المحترفين التحريضية السيتوكينات (إيل-1β وتنف-α) والالتهابات السيتوكينات (إيل-10) في الأمصال الماوس. وأظهرت الفئران المعرضة للأوزون زيادة كبيرة في الخلايا التحريضية، بما في ذلك الضامة والعدلات (الشكل 5أ-ج)، فضلا عن انخفاض كبير في إيل-10 وزيادة في إيل-1β وتنف-α (الشكل 6أ-ج ). كافة البيانات أظهرت أن عمر الفاروق نموذج لخص أعراض هذا المرض تشبه الإنسان.

الشكل 1. التعرض للأوزون إلى زيادة حجم الرئة و LAA % الكشف عنها بواسطة µCT. (أ) ممثل 3D صور عرض الرئتين من الهواء أو الأوزون يتعرض الفئران في 7 أسابيع بعد التعرض الخاصة بكل منها. (ب) وحدات التخزين الرئة المجموع كل من الفريقين استخرجت من الصور الثلاثية الأبعاد للإحصاءات. وأظهرت الفئران المعرضة للأوزون زيادة كبيرة في حجم مجموع الرئة. (ج) الفردية ويعني LAA % بين الفريقين. وأظهرت الفئران المعرضة للأوزون زيادة كبيرة في LAA %. ويشير اللون الأحمر إلى LAA (فوكسيلس مع كثافة وحدات هاونسفيلد 2,550-2,700). وأزيلت في القصبة الهوائية والقصبات الهوائية التي تظهر باللون الأحمر في هذا الرقم لحساب الرئة LAA. وترد البيانات ± يعني S.E.M. * * ف < 0.01، * * * ف < 0.001. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الرقم 2. زيادة التعرض للأوزون لم. (أ) ممثل ميكروجرافس الرئة المسافات السنخية في أقسام الملطخة بأنه من الفئران المعرضة للهواء أو المعرضة للأوزون. (ب) تم قياس كمية القيم الفردية من Lm من أقسام الرئة بين الفريقين للإحصاءات. ولوحظ زيادة Lm في الفئران المعرضة للأوزون. وترد البيانات ± يعني S.E.M. * * ف < 0.01. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3 . التعرض للأوزون انخفضت وظائف الرئة. (أ-ج) المعرضة للهواء والفئران المعرضة للأوزون، FEV الفردية في 25 الأولى، سريع 50 و 75 مللي ثانية من انتهاء الصلاحية (FEV₂₅و FEV₅₀و₇₅من FEV، على التوالي)، فضلا عن تطعيما، كل سجل. تم حساب النسب المئوية ل FEV₂₅و FEV₅₀و FEV₇₅ إلى تطعيما بشكل منفصل. FEV₂₅/FVC، FEV₅₀/FVC، و FEV₇₅/FVC جميع انخفض بشكل ملحوظ المعرضة للأوزون الفئران. وترد البيانات ± يعني S.E.M. * ف < 0.05، * * ف < 0.01. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4 . التعرض للأوزون انخفض وقت التعب والإرهاق المسافة. (أ) تشغيل كل الأوقات للهواء أو الأوزون-تعرضت الفئران وسجلت. وأظهرت الفئران المعرضة للأوزون انخفاضا كبيرا في وقت التعب. (ب) وسجلت المسافات قيد التشغيل كل من الفريقين. الفئران المعرضة للأوزون أظهرت انخفاضا كبيرا في المسافة التعب. وترد البيانات ± يعني S.E.M. * ف < 0.05. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 5 . عد الخلايا الملتهبة من بالف- (أ) الفردية ومتوسط أرقام مجموع الخلايا (مجموع) في الهواء أو الأوزون يتعرض الفئران. (ب) الفردية ومتوسط عدد الضامة (ماك) في هاتين المجموعتين. (ج) الفردية ومتوسط عدد العَدلات (نوى) في هاتين المجموعتين. وترد البيانات ± يعني S.E.M. * ف < 0.05، * * ف < 0.01. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

صفحة الاستعدادات = "1" >

الرقم 6 . كشف سيتوكين التهابات والالتهابات في المصل. (أ) الفردية ويعني قيم كمية إيل-10 في الهواء أو الأوزون يتعرض الفئران. (ب) الفردية ويعني قيم كمية إيل-1β في المجموعتين. (ج) الفردية ومتوسط قيم كمية تنف-α في هاتين المجموعتين. وترد البيانات ± يعني S.E.M. * ف < 0.05. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه الدراسة، نقدم وسيلة موثوق بها لتوليد نموذج جديد لهذا المرض. مقارنة بنماذج أخرى (أي لبس أو نماذج معدات الوقاية الشخصية)، وهذا نموذج عمر الفاروق يجمل العملية المرضية لمرضى هذا المرض. نظراً لأن دخان السجائر المواد الخطرة الرئيسية التي تسبب هذا المرض في البشر المرضى⁴⁰، يظل النموذج CS⁴¹^،من طراز هذا المرض الأكثر شعبية⁴². ومع ذلك، يتطلب النموذج CS ص 3 إلى 12 شهرا & مد الفترة للعقاقير الجديدة. بالمقارنة مع طراز CS، نموذج عمر الفاروق الحالي يقلل من فترة جيل إلى 6-8 أسابيع. وقد لاحظنا انتفاخ الرئة في الفئران الذكور بعد 6 أسابيع تعرض للأوزون في أعمالنا السابقة الدراسات³¹^،^،من³⁰³². في هذه الدراسة، ونحن تطبيق البروتوكول عمر الفاروق على الفئران الإناث لمدة 7 أسابيع وإنشاؤها بنجاح نموذج عمر الفاروق الإناث. لأنه قد أفيد أن وفيات هذا المرض قد انخفض في الرجال، لكنه زاد في النساء في بعض البلدان³³، من الضروري دراسة الآليات المسببة للأمراض وتطوير نهج العلاج للمرضى الإناث في هذا المرض باستخدام نموذج هذا المرض الإناث. ونحن نعلم أن نماذج هذا المرض المذكور أعلاه (أي لبس، ومعدات الوقاية الشخصية، وخدمات العملاء) يمكن أن تعمل في كلا الحيوانات الذكور والإناث⁴³. وكان الهدف من هذا العمل اقتراح نموذج إضافية لهذا المرض سواء يلخص عملية المرضية لمرضى هذا المرض ويتطلب فترة زمنية قصيرة جداً من جيل.

أن الخطوة الرئيسية لتوليد هذا النموذج تم تعريض الفئران للأوزون (عند مستوى 2.5 جزء في المليون) مرتين في الأسبوع (مرة واحدة كل 3 أيام) لمدة 6-8 أسابيع (في هذه الدراسة، كنا 7 أسابيع، على الرغم من أننا لم تحاول تصعيد الجرعة). عن طريق التحكم المعلمات حرجة وتواتر التعرض وتركيز الأوزون، نحن استنسخت بنجاح انتفاخ الرئة في الفئران C57BL/6 الذكور³¹^،³²والذكور بالب/ج الفئران³⁰الإناث بالب/ج الفئران (الحالية الدراسة). النمط الظاهري انتفاخ الرئة نتيجة للتعرض للأوزون، مع الحد من تدفق الهواء وتدمير متني الرئة مماثلة للتغييرات التي ينظر إليها في هذا المرض المرضى⁴⁴^،⁴⁵.

لا تزال هناك قيود على هذه الدراسة. على سبيل المثال، لأن الآلية المرضية لهذا المرض البشري يرتبط بتشريح للرئتين، يجب إنشاء نموذج مثالي لهذا المرض في الحيوانات التي لها بنية تشريحية رئوية شبيه بالبشر. بالمقارنة مع الحيوانات الكبيرة، تمتلك الحيوانات الصغيرة حتى أقل كثافة الخطوط الجوية المتفرعة من البشر⁴⁶. يجب أن نعترف بأنه سيكون أكثر جدوى لإنشاء نموذج هذا المرض في الحيوانات الكبيرة. ومع ذلك، من الصعب جداً وضع النماذج على نطاق واسع في الحيوانات. قيد آخر لهذا النموذج هو أهميتها السريرية. على الرغم من أنه من المؤكد أن الأوزون يمكن أن تتفاعل مع الجهاز التنفسي وتلف أنسجة الرئة¹⁹^،²²، وعلى الرغم من أن هناك أدلة على أن تدهور أعراض بعض المرضى من هذا المرض بعد التعرض للأوزون²⁸، الأوزون ليس السبب الرئيسي لهذا المرض في المرضى. ومع ذلك، نحن لا يزال اقتراح واستخدام هذا النموذج عمر الفاروق للأوزون وخدمات العملاء يسبب أضرارا للجهاز التنفسي بتحريض التهاب ويؤدي إلى الأكسدة²⁶^،²⁷. وهكذا، دواء جديد يمكن علاج هذا المرض في عمر الفاروق النموذجي يمكن أنها أيضا العمل في نموذج CS وذلك يحتمل أن تكون المتقدمة لمرضى هذا المرض.

تطبيقات نموذج عمر الفاروق لا تقتصر على فك رموز الآليات الجزيئية والخلوية لهذا المرض. لدينا ورقتي الأخيرة حققت أيضا فعالية ن-أسيتيل (NAC)³¹ وناهس³² (جهة مانحة خارجية من H₂S) في علاج هذا المرض عن طريق إدارة خارجية من الأدوية هما نموذج عمر الفاروق. في الدراسة الأولى، ووجدنا عكس مجرى الهواء فرط-الاستجابة والحد من كتلة العضلات الملساء مجرى الهواء بعد إقامة ائتلاف البرنامج الجديد. قد تدل هذه الآثار أساس الفوائد السريرية المحتملة للائتلاف في هذا المرض المرضى³¹. في الدراسة الثانية من طراز عمر الفاروق، وجدنا أن إدارة خارجية ناهس عكس التهاب الرئة وجزئياً عكست الملامح من انتفاخ الرئة. وهكذا، مع هذا النموذج عمر الفاروق، أثبتنا في دراسة أولية أن أن ناهس يمكن تطويرها كمرشح محتمل من المخدرات لهذا المرض المرضى³². لذلك، يحتوي طراز عمر الفاروق التطبيقات المحتملة للبحوث الآلية على حد سواء، وفحص المخدرات لهذا المرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Z.W.S. وقد بالموظفين الحاليين وأصحاب الأسهم الخيار مجموعة الطب الحيوي الخلوية (ناسداك: كبمج). تعلن مؤلفين آخرين أن لديهم لا تضارب في المصالح.

Acknowledgments

المؤلفون يود أن يعرب عن امتنانه للسيد تشين بويين (مركز السريرية الصحة العامة شانغهاي) للمساعدة التقنية بشأن تقييم µCT في هذا البروتوكول.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/c mice	Slac Laboratory Animal,Shanghai, China	N/A	7-to-9-week-old female BALB/c mice were used in this study.
Individual ventilated cages	Suhang, Shanghai, China	Model Number: MU64S7	The cages were used for housing mice in the animal facility.
Sealing perspex-box	Suhang, Shanghai, China	N/A	The box was used to contain the ozone generator. Mice were exposed to ozone within the box.
Electric generator	Sander Ozoniser, Uetze-Eltze, Germany	Model 500	The device was used for generating ozone.
Ozone probe	ATi Technologies, Ashton-U-Lyne, Greater Manchester, UK	Ozone 300	The device was used for monitoring and controlling the generation of ozone.
Pelltobarbitalum natricum	Sigma, St. Louis, MO, USA	P3761	Mice were anesthetized by intraperitoneal injection of pelltobarbitalum natricum.
Micro-Computed Tomography	GE Healthcare, London, ON, Canada	RS0800639-0075	This device was used for acquiring images of the lung.
Micro-view 2.01 ABA software	GE Healthcare, London, ON, Canada	Micro-view 2.01	This device was used for reconstruct the lung and analyze volume, LAA of the lung.
Treadmill machine	Duanshi, Hangzhou, Zhejiang, China	DSPT-208	This machine was usd for fatigue test.
Body plethysmograph	eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK	Forced Manoeuvres System	This device was used to test spirometry pulmonary function.
Ventilator	eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK	Forced Manoeuvres System	This device was used to test spirometry pulmonary function.
Slide spinner centrifuge	Denville Scientific, Holliston, MA, USA	C1183	It was used to spin BALF cells onto slides.
Wright Staining	Hanhong, Shanghai, China	RE04000054	It was used to staining macrophages, neutrophils in the suspended BALF.
Hemocytometer	Hausser Scientific, Horsham, PA, USA	4000	It was used to count cells.
IL-1β	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab100704	They were used to test the respective factors in serum.
IL-10	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab46103	They were used to test the respective factors in serum.
TNF-α	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab100747	They were used to test the respective factors in serum.
Paraformaldehyde	Sigma, St. Louis, MO, USA	P6148	The lung was inflated by 4% paraformaldehyde.
Paraffin	Hualing, Shanghai, China	56#	It was used to embed the lung.
Rotary Microtome	Leica, Wetzlar, Hesse, Germany	RM2255	It was used for sectioning the lung.
Hgaematoxylin and Eosin (H&E) staining solution	Solarbio, Beijing, China	G1120	H&E staining was done for morphometric analysis.
Upright bright field microscope	Olympus, Center Valley, PA, USA	CX41	It was used to image the H&E staining slides.
Adobe Photoshop 12	Adobe, San Jose, CA, USA	Adobe Photoshop 12	It was used to count the number of alveoli on the H&E stained images.
GraphPad prism 5	Graphpad Software Inc., San Diego, CA	GraphPad prism 5	It was used for data analysis and production of figures.