Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Generasjon av kronisk obstruktiv lungesykdom modell i mus ved gjentatte ozon eksponering

Published: August 25, 2017 doi: 10.3791/56095
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1,2
1Cellular Biomedicine Group, Shanghai, 2Cellular Biomedicine Group, Cupertino, 3Department of Respiratory Medicine, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiaotong University

Summary

Denne studien beskriver vellykkede generering av en ny kroniske hindrende lunge sykdom (COPD) dyr modell av gjentatte ganger utsette mus for høye konsentrasjoner av ozon.

Abstract

Kroniske hindrende lunge sykdom (COPD) er preget av vedvarende luftstrømmen begrensning og lunge parenchymal ødeleggelse. Den har en svært høy forekomst i aldrende befolkning. De gjeldende konvensjonell terapi for COPD fokusere hovedsakelig på symptom-modifisere stoffer; Dermed er utvikling av nye behandlinger haster. Kvalifiserte dyremodeller av COPD kunne hjelpe som karakteriserer de underliggende mekanismene og kan brukes for nye narkotikarelaterte screening. Gjeldende COPD modeller, for eksempel lipopolysakkarid (LPS) eller svin bukspyttkjertelen elastase (PPE)-indusert emfysem modellen, generere KOLS-lignende lesjoner i lungene og luftveiene, men ligner ellers ikke patogenesen av menneskelig COPD. En sigarettrøyk (CS)-indusert modellen forblir en av de mest populære fordi det ikke bare simulerer KOLS-lignende lesjoner i luftveiene, men det er også basert på en av de viktigste farlige materialene som forårsaker COPD hos mennesker. Men begrense de tidkrevende og arbeidskrevende aspektene av CS-indusert modellen dramatisk anvendelsen i nye narkotikarelaterte screening. I denne studien generert vi har en ny COPD modell ved å utsette mus til høye nivåer av ozon. Denne modellen vist følgende: 1) redusert Forsert ekspirasjonsvolum 25, 50 og 75/tvunget vitalkapasitet (FEV25/FVC, Feb50/FVC og FEV75/FVC), som angir forverring av lungefunksjonen; 2) forstørret lunge alveoler, med lunge parenchymal ødeleggelse. 3) redusert tretthet tid og avstand; og 4) økt betennelse. Sammen viser disse dataene at ozon eksponering (OE) modellen er en pålitelig dyremodell som ligner på mennesker fordi ozon overeksponering er en paranoid faktorer av COPD. I tillegg, tok det bare 6-8 uker, basert på våre tidligere arbeid, lage en OE modell, mens det krever 3-12 måneder å indusere sigarettrøyk modellen, indikerer at OE modellen kan være et godt valg for COPD forskning.

Introduction

Det har blitt anslått at KOLS, inkludert emfysem, kronisk bronkitt, kan være den tredje største dødsårsaken i verden i 20201,2. Potensielle forekomsten av COPD i en befolkning over 40 år gamle er anslått til 12.7% i menn og 8,3% inne kvinner innen de neste 40 år3. Ingen medisiner er tilgjengelig å reversere den progressive svekkelse COPD pasienter4. Pålitelig dyremodeller av COPD ikke bare krever imitasjon av sykdom patologiske prosessen, men krever også en kort generasjon periode. Gjeldende KOLS-modeller, inkludert LPS eller PPE-indusert modell, kan indusere emfysem-lignende symptomer5,6. En enkelt administrasjon eller en ukelang utfordring til LPS eller PPE til mus eller rotter resultater i merkede neutrophilia i bronchoalveolar lavage væske (BALF), øker pro-inflammatoriske mediatorer (f.eks TNF-α og IL-1β) i BALF eller serum, produserer lunge parenchymal ødeleggelse-forstørret luftrom, og begrenser luftstrømmen5,6,7,8,9,10. Imidlertid LPS eller PPE er ikke årsakene til menneskelig COPD og dermed etterligne ikke patologiske prosessen11. En CS-indusert modell produsert en vedvarende luftstrømmen begrensning, lunge parenchymal ødeleggelse, og redusert funksjonell trening kapasitet. Men krever en tradisjonell CS-protokollen minst 3 måneder til å generere en COPD modell12,13,14,15. Derfor er det viktig å generere en ny og mer effektiv dyr modell som oppfyller to.

Nylig, i tillegg til røyking, luftforurensning og yrkesmessig eksponering har blitt mer vanlige årsaker til COPD16,17,18. Ozon, som en av de viktigste (om ikke det større komponenten av luftforurensning), kan direkte reagerer med luftveiene og skade lungevev av både barn og unge voksne19,20,21 ,22,23,24,25. Ozon, samt andre stimulators inkludert LPS, PPE og CS, er involvert i en alvorlig av biokjemiske lunge oksidativt stress og DNA skade og er knyttet til initiering og fremming av COPD26,27. En annen faktor er at symptomene på noen COPD pasienter svekkes etter å bli utsatt for ozon, indikerer at ozon kan forstyrre lunge funksjonen18,28,29. Derfor generert vi en ny COPD modell av gjentatte ganger utsette mus for høye konsentrasjoner av ozon i 7 uker; Dette resulterte i luftstrømmen feilene og parenchymal lungeskade ligner på tidligere undersøkelser30,31,32. Vi utvidet OE protokollen til kvinnelige mus i denne studien og gjengitt fullført emfysem observert i mannlige mus i våre tidligere studier30,31,32. Fordi COPD dødelighet har avtatt i menn, men økte i kvinner i mange land33, KOLS modell i kvinner er nødvendig å studere mekanismer og utvikle terapeutiske metoder for kvinnelige COPD pasienter. Anvendelse av OE modellen til alle kjønn gir ytterligere støtte til bruk som COPD modell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: The OE modellen er generert og brukes i tidligere rapportert forskning 30 , 31 , 32. Alle dyreforsøk ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) i Shanghai Jiaotong University.

1. mus

  1. huset patogen-fri, 7-9 uke gamle kvinnelige BALB/c mus i individuelle ventilert bur i et dyr anlegg under kontrollert temperatur (20 ° C) og fuktighet (40-60%). Angi et 12t lys og 12t mørke syklus i anlegget. Skaffe mat og vann ad libitum.

2. Ozon eller Air eksponering

  1. Generer ozon med en elektrisk generator i en forsegling akryl (f.eks Perspex). Blåse luft ut av boksen med en vakuumpumpe gjennom en air ventil rør som er koblet på innsiden og utsiden av boksen. Overvåke konsentrasjonen av ozon i boksen med en ozon sonde. Vente til konsentrasjonen av ozon i boksen når 2,5 deler per million (ppm).
    Merk: Ozon proben kan automatisk bytte ozongeneratoren på eller av og kan opprettholde ozon-nivå i boksen på 2,5 ppm.
  2. Sted musene i boksen når nivået av ozon når 2,5 ppm. Holde musene i boksen for 3t hver gang for å utsette dem for ozon.
    Merk: Boksen kan opprettholde et ozon-nivå av 2,5 ppm under 3 h ved automatisk bytte ozongeneratoren på eller av og blåser CO 2 som produseres av musene esken.
  3. Gi to ozon eksponeringer (hver eksponering varig 3 h) per uke (en gang hver 3 dager) i 7 uker, utsette kontroll mus til samtidig og i samme periode.

3. Mikro-tomografi

  1. på slutten av uken 7, bedøve mus med en intraperitoneal injeksjon av pelltobarbitalum natricum (1%, 0.6 - 0,8 ml/100 g) justere dose ifølge enkelte situasjoner å se at musen ikke svare på en tå-knipe. Monitor og hold musen på en jevn puste frekvens; og sørg for at ingen frivillig bevegelser finnes under prosedyrene.
  2. Plasserer bedøvet musene i kammeret av en mikro-beregnet tomografi (µCT).
  3. Kalibrerer µCT bruke standardprotokollen og produsenten ' s instruksjoner. Angi X-ray tube på 50 kV og gjeldende på 450 µA.
    Merk: Begge X-ray og detektoren rotere rundt musene.
  4. Analysere µCT ved å kjøpe 515 anslag med en effektiv pikselstørrelsen 0.092 mm, en eksponeringstid på 300 ms for én sektor og en skive tykkelse på 0.093 mm.
  5. Rekonstruere lungene med ervervet bilder ved hjelp av en programvare. Justere gråtone bildelysstyrke ved å angi minimum og maksimum av gråtoner på-750 og-550 Hounsfield enheter, henholdsvis.
    Merk: Programvaren automatisk beregne volumet av lunge parenchyma og lav-demping området (LAA) 34 , 35.
  6. Beregning av LAA (LAA %) ved å dele LAA volumet av totale lungevolumet.

4. tredemølle teste

  1. gi mus en tilpasning test med en hastighet på 10 m/min i 10 min på en kjørende tredemølle machine. Merk: elektrisitet er alltid av når prosedyren utføres.
  2. administrere en trøtthet test til mus.
    1. Varme opp mus med en hastighet på 10 m/min i 5 min.
    2. Øke hastigheten til 15 m/min i 10 min.
    3. Øke treningsintensiteten: øke hastigheten av 5 m/min, starter på 20 m/min, enhver 30 min før mus kan ikke fortsette å kjøre 36.
  3. Registrere totalen kjører avstand og kjøretiden som tretthet avstand og tretthet tid, henholdsvis.

5. lunge funksjonen målinger

  1. bedøve mus med en intraperitoneal injeksjon av pelltobarbitalum natricum (1%, 0.6 - 0,8 ml/100 g) justere dose ifølge enkelte situasjoner å se at musen ikke ikke svare på tå knipe og vente til mus har opprettholdt spontan pusting. Monitor og hold musen på en jevn puste frekvens; og sørg for at ingen frivillig bevegelser finnes under prosedyrene.
  2. Nøye tracheostomize mus og plassere dem i en kropp plethysmograph som er koblet til en datastyrt ventilator.
    Merk: Ventilasjon styres via en ventil ligger proximally av endotracheal tube]. Oppsettet gir forskjellige halvautomatisk manøvrer, inkludert manøver av kvasi-statiske trykket og manøver av rask flyt.
  3. Innføre gjennomsnittlig puste frekvensen av 150 åndedrag/min til bedøvet musen via press-kontrollerte ventilasjon til en vanlig pustemønster og komplett utløpsdato på hver puste syklus hentes.
  4. Utfører kvasi-statisk trykk volum manøver med enheten med negative presset generert i plethysmograph.
  5. Utføre rask flyt volum manøver i kvasi-statisk trykk volum løkkene til posten FVC og FEV. Blåse lungene til 30 cm H 2 O og umiddelbart etterpå koble den til en svært negative trykket å håndheve utløp inntil residualvolum er-30 cm H 2 O. post FEV i de første 25, 50 og 75 ms av utpust (FEV 25 FEV 50 og FEV 75, henholdsvis). Avvise suboptimal manøvrene. For hver test med hver enkelt museklikk, avholde minst tre akseptabel manøvrer å få et pålitelig gjennomsnittet for alle numeriske parametere.

6. BALF samling

  1. etter terminal anestesi med pelltobarbitalum natricum ((1%, 1.8-2,4 ml/100 g) justere dose ifølge enkelte situasjoner å se at musen ikke svarer på tå knipe og miste pusten), nasal lavage den mus med 2 mL PBS via en 1 mm diameter endotracheal tube og deretter hente BALF 10.
  2. Pool Hentet lavage dele og sentrifuge på 4 ° C og 250 x g for 10 min.
  3. Samle nedbryting for umiddelbar bruk og lagre resten på-80 ° C eller flytende nitrogen.
  4. Teller antall celler ved hjelp av en hemocytometer.
  5. Resuspend celle pellet i PBS og deretter spinn (1400 x g, 6 min) 250 µL av resuspended celler på lysbilder ved hjelp av et lysbilde spinner sentrifuge.
  6. Bruke Wright flekker til celler på lysbildene ifølge produsenten ' s protokollen.
  7. Teller 200 celler per mus; identifisere celler som makrofager eller nøytrofile, ifølge standard morfologi, under 400 X forstørrelse; og telle journalnumrene.

7. CARDIAC blod prøvetaking

  1. samle blod via cardiac punktering, laste den inn i 1,5-mL rør, og holde det på is 30 min.
  2. Sentrifuge blodprøver i 5 min på 2000 x g og 4 ° C.
  3. Overføre nedbryting (serum) til en ny tube og lagre den på-80 ° C eller flytende nitrogen.
  4. Forberede serum IL-1β, IL-10, og TNF-α oppdagelsen tester med de respektive ELISA kits.

8. Lunge Morphometric analyse

  1. dissekere lungene og tracheas fra mus.
    1. Plasser hver euthanized musen på en kirurgisk bord umiddelbart etter offer.
    2. Dissekere unna platysma og fremre tracheal muskler til å visualisere og tilgang tracheal ringene.
    3. Åpen opp den thoracic hulrom. Dissekere lungene og luftrøret, men ikke separat hjertet fra lungene.
  2. Av endotracheal kateter tilkobles en sprøyte som inneholder 4% paraformaldehyde gjennom en PE90 polyetylen rør.
    Forsiktig: Paraformaldehyde er giftige. Bruk vernehansker og vernebriller og bruke løsningen i avtrekksvifte.
  3. Blåse lungene helt med 4% paraformaldehyde (10 dråper, ~ 200 µL) gjennom endotracheal kateter. Fjern kjernen etter ferdigstillelse av inflasjon.
  4. Behold lunge i en 15 mL tube som inneholder 10 mL av 4% paraformaldehyde for minst 4 h.
  5. Bygge lunge i parafin. Få 5 µm deler av parafin snitting med en roterende mikrotom. Under snitting, avsløre maksimal arealet av lungevev innen bronkial treet.
  6. For morphometric analyse, utføre hematoxylin og eosin (H & E) flekker på delene.
  7. Image delene med lyse-feltet oppreist mikroskop (linsen, 20 X, eksponeringstid, 1.667 ms).
  8. Har to etterforskere blindet for behandlingen protokollen uavhengig telle delene histologiske. Du kan bruke mener lineær skjæringspunkt (L m) som en parameter for å måle avstanden mellom alveolar septal veggen. Bestemme L m på følgende måte:
    1. Åpne delene i Photoshop og tegne et reticule-rutenett på bildet med fem 550 µm lange linjer.
    2. Antall alveoler over rutenettlinjen.
    3. Beregner den L m ved lengden på rutenettlinje med antall alveoler. For kvantifisering, bilde fem deler per musen. Hente ti bilder av hver inndeling (ett bilde per felt) og vurdere tilfeldig. Under feltvalg, unngå airways og fartøy ved å flytte ett felt frem eller i en annen retning.
      Merk: Dataene presenteres som gjennomsnittlig ± S.E.M. En un parvis t-test ble utført for sammenligning mellom luft-eksponerte mus og ozon-eksponerte mus. Tre dyr i hver gruppe ble brukt til å beregne den betydelig forskjellen. P-verdien < 0,05 ble ansett som vesentlige.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Eksempler på 3D µCT bilder av hver gruppe vises i figur 1en. Ozon-eksponerte musene hadde et betydelig større totale lunge volum (figur 1en og b) og LAA % (figur 1c) enn luft-eksponerte kontroll mus. Lungevolumet og LAA % forble opphøyet etter seks uker med ozon eksponering31,32. Økte volumet og LAA % representerer emfysem fenotypen. Eksempler på lunge alveolar utvidelse i figur 2en illustrerer emfysem dannelsen. En økning i gjennomsnittlig lineær skjæringspunktet (Lm) ble observert i ozon-eksponerte mus (figur 2b), som bekreftet at lunge parenchymal ødeleggelse skjedde etter ozon eksponering.

Lungefunksjonen ble målt ved luftstrømmen rate parametrene vist som Feb25/FVC, Feb50/FVC og FEV75/FVC. Resultatene viste at alle parameterne i ozon-eksponerte mus (Figur 3a-c) var i samsvar med typiske lunge funksjonelle mangler i COPD pasienter4,37. For å ytterligere evaluere OE modellen, gjennomført vi en øvelse toleranse test som substituert for 6 minutters gange test (6MWT)38,39, som er vanlig å vurdere endringer i funksjonell trening kapasitet i COPD pasienter. Ozon eksponering betydelig redusert tretthet tid og tretthet avstanden (Figur 4en og b).

For å løse patogenesen av COPD i OE modellen, ble makrofager og nøytrofile regnet fra BALFs av mus; Pro-inflammatoriske cytokiner (IL-1β og TNF-α) og anti-inflammatoriske cytokiner (IL-10) ble oppdaget i musen sera. Ozon-eksponerte musene viste en betydelig økning i inflammatoriske celler, inkludert makrofager og nøytrofile (figur 5en-c), en betydelig reduksjon i IL-10 og en økning i IL-1β og TNF-α (figur 6en-c ). Alle data viste at OE modellen recapitulated menneskelige KOLS-lignende symptomer.

Figure 1
Figur 1. Ozon eksponering økt lungevolumet og LAA % oppdaget av µCT. (a) representant 3D-bilder som viser lungene til luft - eller ozon-eksponerte mus på 7 uker etter respektive eksponering. (b) personlige totale lunge volumer av de to gruppene ble Hentet fra 3D-bilder for statistikk. Ozon-eksponerte mus viste en betydelig økning i total lunge volum. (c) personlige og mener LAA % av de to gruppene. Ozon-eksponerte mus viste en betydelig økning i LAA %. Den røde fargen angir LAA (voxels med tettheter av 2,550-2700 Hounsfield enheter). Trachea og bronchi vises i rødt i dette tallet var fjernet for å beregne lungene LAA. Dataene presenteres som gjennomsnittlig ± S.E.M. ** P < 0.01, *** P < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Ozon eksponering økt Lm. (a) representant micrographs lunge alveolar områder i han-farget deler av luft-utsatt eller ozon-eksponerte mus. (b) enkeltverdiene av Lm kvantifisert fra lunge delene av de to gruppene for statistikk. En økning i Lm ble observert i ozon-eksponerte mus. Dataene presenteres som gjennomsnittlig ± S.E.M. ** P < 0,01. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 . Ozon eksponering redusert pulmonal funksjonen. (a-c) Både luft-eksponert og ozon-eksponerte musene, personlige FEV i første 25, 50 og 75 ms av rask utløp (FEV25Feb50og FEV75, henholdsvis), samt FVC, spilt inn. Prosentverdiene FEV25, FEV50og FEV75 til FVC ble beregnet separat. FEV25/FVC, Feb50/FVC og FEV75/FVC alle redusert betydelig i ozon-eksponerte mus. Dataene presenteres som gjennomsnittlig ± S.E.M. * P < 0,05, ** P < 0,01. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 . Ozon eksponering redusert tretthet tid og tretthet avstand. (a) personlige kjører ganger for luft - eller ozon-utsatt mus ble registrert. Ozon-eksponerte mus viste en signifikant nedgang i tretthet tid. (b) personlige kjører avstander på de to gruppene ble registrert. Ozon-eksponerte mus viste en signifikant nedgang i tretthet avstand. Dataene presenteres som gjennomsnittlig ± S.E.M. * P < 0,05. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 . Inflammatoriske celler regnet fra BALF. (a) personlige og gjennomsnittlig antall totale celler (TOTAL) i luften - eller ozon-eksponerte mus. (b) personlige og gjennomsnittlig antall makrofager (MAC) i de to gruppene. (c) personlige og gjennomsnittlig antall nøytrofile (NEU) i de to gruppene. Dataene presenteres som gjennomsnittlig ± S.E.M. * P < 0,05, ** P < 0,01. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

plassere side = "1" >Figure 6
Figur 6 . Inflammatorisk og anti-inflammatorisk cytokin gjenkjenning i serum. (a) personlige og mener verdier av IL-10 i luft - eller ozon-eksponerte mus. (b) personlige og mener verdier av IL-1β i de to gruppene. (c) personlige og mener verdier av TNF-α i de to gruppene. Dataene presenteres som gjennomsnittlig ± S.E.M. * P < 0,05. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne studien presenterer vi en pålitelig metode for å generere en ny COPD modell. Sammenlignet med andre modeller (dvs. LPS eller PPE modeller), viser denne OE modellen patologiske prosessen med COPD pasienter. Sigarettrøyk er det viktigste farlig materialet som forårsaker COPD i menneskelige pasienter40, fortsatt CS modellen den mest populære COPD modell41,42. Men CS modellen krever en 3 - til 12-måneders R & D periode for nye legemidler. Sammenlignet med CS modellen, reduserer gjeldende OE modell generasjon perioden til 6-8 ukens. Vi har observert emfysem i mannlige mus etter 6 uker av eksponering for ozon i våre tidligere studier30,31,32. I denne studien vi brukt OE protokollen kvinnelige mus i 7 uker og generert har en kvinnelig OE-modell. Fordi det har blitt rapportert at COPD dødelighet har redusert i menn, men økte i kvinner i noen land33, er det nødvendig å studere patogene mekanismer og utvikle kur tilnærminger for kvinnelige COPD pasienter med en kvinnelig COPD modell. Vi vet at ovennevnte COPD modellene (dvs. LPS, PPE og CS) kan arbeide i både mannlige og kvinnelige dyr43. Formålet med dette arbeidet var å foreslå en ekstra COPD modell som både viser patologiske prosessen med COPD pasienter og krever en svært kort generasjon-periode.

Det viktigste trinnet for å generere denne modellen var eksponere mus til ozon (på et nivå av 2,5 ppm) to ganger per uke (en gang hver 3 dager) for 6-8 uker (i denne studien vi brukte 7 uker, selv om vi ikke prøve dose opptrapping). Ved å kontrollere de kritiske parameterne av eksponering frekvens og ozon konsentrasjon, gjengitt vi er emfysem i mannlige C57BL/6 mus31,32, mannlige BALB/c mus30og kvinnelige BALB/c mus (gjeldende studere). Emfysem fenotypen resulterte fra ozon eksponering, med luftstrømmen begrensning og lunge parenchymal ødeleggelse ligner på endringene i COPD pasienter44,45.

Det er fortsatt begrensninger på denne studien. For eksempel fordi patogenesen av menneskelig COPD er knyttet til anatomien i lungene, skal en ideell COPD modell genereres i dyr som har en lunge anatomiske struktur ligner på mennesker. Sammenlignet med store dyr, ha liten dyrene enda mindre omfattende airway forgrening enn mennesker46. Vi må innrømme at det ville være mer meningsfylt å generere COPD modell i store dyr. Men er det svært vanskelig å etablere store modeller i dyr. En annen begrensning av denne modellen er sin kliniske relevans. Selv om det er sikkert at ozon kan reagere med luftveiene og skade lunge vev19,22, og selv om det er bevis som symptomene på noen COPD pasienter svekkes etter eksponering for ozon28, ozon er ikke den viktigste årsaken til COPD hos pasienter. Vi er imidlertid fortsatt foreslår og bruker denne OE modellen fordi både ozon og CS skade luftveiene av inducing betennelser og føre til oksidativt stress26,27. Dermed et nytt medikament som kan kurere COPD i OE modell kan assumably også fungere i CS modellen og derfor potensielt bli utviklet for COPD pasienter.

Anvendelser av OE modellen er ikke begrenset til å tyde de molekylære og cellulære mekanismene av COPD. Våre to nyere verk også undersøkt effekten av N-acetylcysteine (NAC)31 og NaHS32 (en eksogene giver H2S) til å behandle COPD via eksogene administrasjonen av de to stoffene i OE-modellen. I den første studien fant vi en reversering av luftveiene hyper-respons og en reduksjon av luftveiene glatt muskelmasse etter administrasjon av NAC. Disse effektene kan angi grunnlaget for klinisk fordeler av NAC med COPD pasienter31. I den andre studien av OE modellen fant vi at administrasjonen av eksogene NaHS reversert lungebetennelse og delvis reversert funksjonene til emfysem. Dermed, med denne OE modellen, vi viste i en innledende studie at NaHS kunne utvikles som en potensiell stoffet kandidat COPD pasienter32. Derfor har OE modellen bruksmuligheter for både mekanisme forskning og narkotikarelaterte screening for COPD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Z.W.S. og ww er gjeldende ansatte og lager for innehavere av mobilnettet biomedisin gruppen (NASDAQ: CBMG). Andre forfattere erklærer at de har ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å uttrykke takknemlighet til Mr. Boyin Qin (Shanghai offentlige helse kliniske Center) for teknisk assistanse med µCT evaluering i denne protokollen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BALB/c mice Slac Laboratory Animal,Shanghai, China N/A 7-to-9-week-old female BALB/c mice were used in this study.
Individual ventilated cages Suhang, Shanghai, China Model Number: MU64S7 The cages were used for housing mice in the animal facility.
Sealing perspex-box Suhang, Shanghai, China N/A The box was used  to contain the ozone generator. Mice were exposed to ozone within the box.
Electric generator Sander Ozoniser, Uetze-Eltze, Germany Model 500  The device was used for generating ozone.
Ozone probe ATi Technologies, Ashton-U-Lyne, Greater Manchester, UK Ozone 300 The device was used for monitoring and controlling the generation of ozone.
Pelltobarbitalum natricum Sigma, St. Louis, MO, USA P3761 Mice were anesthetized by intraperitoneal injection of pelltobarbitalum natricum.
Micro-Computed Tomography GE Healthcare, London, ON, Canada RS0800639-0075 This device was used for acquiring images of the lung.
Micro-view 2.01 ABA software GE Healthcare, London, ON, Canada Micro-view 2.01  This device was used for reconstruct the lung and analyze volume, LAA of the lung.
Treadmill machine  Duanshi, Hangzhou, Zhejiang, China DSPT-208 This machine was usd for fatigue test.
Body plethysmograph eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK Forced Manoeuvres System This device was used to test spirometry pulmonary function.
Ventilator eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK Forced Manoeuvres System This device was used to test spirometry pulmonary function.
Slide spinner centrifuge Denville Scientific, Holliston, MA, USA C1183  It was used to spin BALF cells onto slides.
Wright Staining Hanhong, Shanghai, China RE04000054  It was used to staining macrophages, neutrophils in the suspended BALF.
Hemocytometer Hausser Scientific, Horsham, PA, USA 4000 It was used to count cells.
IL-1β Abcam, Cambridge, MA, USA ab100704 They were used to test the respective factors in serum.
IL-10 Abcam, Cambridge, MA, USA ab46103 They were used to test the respective factors in serum.
TNF-α Abcam, Cambridge, MA, USA ab100747 They were used to test the respective factors in serum.
Paraformaldehyde  Sigma, St. Louis, MO, USA P6148 The lung was inflated by 4% paraformaldehyde.
Paraffin Hualing, Shanghai, China 56# It was used to embed the lung.
Rotary Microtome Leica, Wetzlar,  Hesse, Germany RM2255 It was used for sectioning the lung.
Hgaematoxylin and Eosin (H&E) staining solution Solarbio, Beijing, China G1120 H&E staining was done for morphometric analysis.
Upright bright field microscope Olympus, Center Valley, PA, USA CX41 It was used to image the H&E staining slides.
Adobe Photoshop 12 Adobe, San Jose, CA, USA Adobe Photoshop 12 It was used to count the number of alveoli on the H&E stained images.
GraphPad prism 5 Graphpad Software Inc., San Diego, CA GraphPad prism 5 It was used for data analysis and production of figures.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380, 2095-2128 (2012).
  2. Chapman, K. R., et al. Epidemiology and costs of chronic obstructive pulmonary disease. Eur Respir J. 27, 188-207 (2006).
  3. Afonso, A. S., Verhamme, K. M., Sturkenboom, M. C., Brusselle, G. G. COPD in the general population: prevalence, incidence and survival. Respir Med. 105, 1872-1884 (2011).
  4. Rabe, K. F., et al. Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease: GOLD executive summary. Am J Respir Crit Care Med. 176, 532-555 (2007).
  5. Ogata-Suetsugu, S., et al. Amphiregulin suppresses epithelial cell apoptosis in lipopolysaccharide-induced lung injury in mice. Biochem Biophys Res Communi. 484, 422-428 (2017).
  6. Oliveira, M. V., et al. Characterization of a Mouse Model of Emphysema Induced by Multiple Instillations of Low-Dose Elastase. Front Physiol. 7, 457 (2016).
  7. Vernooy, J. H., Dentener, M. A., van Suylen, R. J., Buurman, W. A., Wouters, E. F. Long-term intratracheal lipopolysaccharide exposure in mice results in chronic lung inflammation and persistent pathology. Am J Respir Cell Mol Biol. 26, 152-159 (2002).
  8. Birrell, M. A., et al. Role of matrix metalloproteinases in the inflammatory response in human airway cell-based assays and in rodent models of airway disease. J Pharm Exp Ther. 318, 741-750 (2006).
  9. Gamze, K., et al. Effect of bosentan on the production of proinflammatory cytokines in a rat model of emphysema. Exp Mol Med. 39, 614-620 (2007).
  10. Vanoirbeek, J. A., et al. Noninvasive and invasive pulmonary function in mouse models of obstructive and restrictive respiratory diseases. Am J Respir Cell Mol Biol. 42, 96-104 (2010).
  11. Wright, J. L., Cosio, M., Churg, A. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, 1-15 (2008).
  12. Huh, J. W., et al. Bone marrow cells repair cigarette smoke-induced emphysema in rats. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301, 255-266 (2011).
  13. Schweitzer, K. S., et al. Adipose stem cell treatment in mice attenuates lung and systemic injury induced by cigarette smoking. Am J Respir Crit Care Med. 183, 215-225 (2011).
  14. Guan, X. J., et al. Mesenchymal stem cells protect cigarette smoke-damaged lung and pulmonary function partly via VEGF-VEGF receptors. J Cell Biochem. 114, 323-335 (2013).
  15. Gu, W., et al. Mesenchymal stem cells alleviate airway inflammation and emphysema in COPD through down-regulation of cyclooxygenase-2 via p38 and ERK MAPK pathways. Sci Rep. 5, 8733 (2015).
  16. Cordasco, E. M., VanOrdstrand, H. S. Air pollution and COPD. Postgrad Med. 62, 124-127 (1977).
  17. Berend, N. Contribution of air pollution to COPD and small airway dysfunction. Respirology. 21, 237-244 (2016).
  18. DeVries, R., Kriebel, D., Sama, S. Outdoor Air Pollution and COPD-Related Emergency Department Visits, Hospital Admissions, and Mortality: A Meta-Analysis. COPD. 14 (1), 113-121 (2016).
  19. Penha, P. D., Amaral, L., Werthamer, S. Ozone air pollutants and lung damage. IMS Ind Med Surg. 41, 17-20 (1972).
  20. Stern, B. R., et al. Air pollution and childhood respiratory health: exposure to sulfate and ozone in 10 Canadian rural communities. Environ Res. 66, 125-142 (1994).
  21. Tager, I. B., et al. Chronic exposure to ambient ozone and lung function in young adults. Epidemiology. 16, 751-759 (2005).
  22. Romieu, I., Castro-Giner, F., Kunzli, N., Sunyer, J. Air pollution, oxidative stress and dietary supplementation: a review. Eur Respir J. 31, 179-197 (2008).
  23. Hemming, J. M., et al. Environmental Pollutant Ozone Causes Damage to Lung Surfactant Protein B (SP-B). Biochemistry. 54, 5185-5197 (2015).
  24. Chu, H., et al. Comparison of lung damage in mice exposed to black carbon particles and ozone-oxidized black carbon particles. Sci Total Environ. 573, 303-312 (2016).
  25. Jin, M., et al. MAP4K4 deficiency in CD4(+) T cells aggravates lung damage induced by ozone-oxidized black carbon particles. Environ Toxicol Pharmacol. 46, 246-254 (2016).
  26. Brusselle, G. G., Joos, G. F., Bracke, K. R. New insights into the immunology of chronic obstructive pulmonary disease. Lancet. 378, 1015-1026 (2011).
  27. Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, K., Loridas, S. Pulmonary oxidative stress, inflammation and cancer: respirable particulate matter, fibrous dusts and ozone as major causes of lung carcinogenesis through reactive oxygen species mechanisms. Int J Environ Res Public Health. 10, 3886-3907 (2013).
  28. Medina-Ramon, M., Zanobetti, A., Schwartz, J. The effect of ozone and PM10 on hospital admissions for pneumonia and chronic obstructive pulmonary disease: a national multicity study. Am J Epidemiol. 163, 579-588 (2006).
  29. Lee, I. M., Tsai, S. S., Chang, C. C., Ho, C. K., Yang, C. Y. Air pollution and hospital admissions for chronic obstructive pulmonary disease in a tropical city: Kaohsiung, Taiwan. Inha Toxicol. 19, 393-398 (2007).
  30. Triantaphyllopoulos, K., et al. A model of chronic inflammation and pulmonary emphysema after multiple ozone exposures in mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 300, 691-700 (2011).
  31. Li, F., et al. Effects of N-acetylcysteine in ozone-induced chronic obstructive pulmonary disease model. PLoS ONE. 8, e80782 (2013).
  32. Li, F., et al. Hydrogen Sulfide Prevents and Partially Reverses Ozone-Induced Features of Lung Inflammation and Emphysema in Mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 55, 72-81 (2016).
  33. Rycroft, C. E., Heyes, A., Lanza, L., Becker, K. Epidemiology of chronic obstructive pulmonary disease: a literature review. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 7, 457-494 (2012).
  34. Washko, G. R., et al. Airway wall attenuation: a biomarker of airway disease in subjects with COPD. J Appl Physiol. 107, 185-191 (2009).
  35. Yamashiro, T., et al. Quantitative assessment of bronchial wall attenuation with thin-section CT: An indicator of airflow limitation in chronic obstructive pulmonary disease. AJR Am J Roentgenol. 195, 363-369 (2010).
  36. Tang, X., et al. Arctigenin efficiently enhanced sedentary mice treadmill endurance. PLoS ONE. 6, e24224 (2011).
  37. Schmidt, G. A., et al. Official Executive Summary of an American Thoracic Society/American College of Chest Physicians Clinical Practice Guideline: Liberation from Mechanical Ventilation in Critically Ill Adults. Am J Respir Crit Care Med. 195, 115-119 (2017).
  38. ATS Committee on Proficiency Standards for Clinical Pulmonary Function Laboratories. ATS statement: guidelines for the six-minute walk test. Am J Respir Crit Care Med. 166, 111-117 (2002).
  39. Shigemura, N., et al. Autologous transplantation of adipose tissue-derived stromal cells ameliorates pulmonary emphysema. Am J Transplant. 6, 2592-2600 (2006).
  40. Bchir, S., et al. Concomitant elevations of MMP-9, NGAL, proMMP-9/NGAL and neutrophil elastase in serum of smokers with chronic obstructive pulmonary disease. J Cell Mol Med. , 1-12 (2016).
  41. Fricker, M., Deane, A., Hansbro, P. M. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. Expert Opin Drug Discov. 9, 629-645 (2014).
  42. Perez-Rial, S., Giron-Martinez, A., Peces-Barba, G. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. Arch Bronconeumol. 51, 121-127 (2015).
  43. Antunes, M. A., et al. Effects of different mesenchymal stromal cell sources and delivery routes in experimental emphysema. Respir Res. 15, 118 (2014).
  44. Celli, B. R., MacNee, W., Force, A. E. T. Standards for the diagnosis and treatment of patients with COPD: a summary of the ATS/ERS position paper. Eur Respir J. 23, 932-946 (2004).
  45. U.S. Preventive Services Task Force. Screening for chronic obstructive pulmonary disease using spirometry: U.S. Preventive Services Task Force recommendation statement. Ann Intern Med. 148, 529-534 (2008).
  46. Ward, R. E., et al. Design considerations of CareWindows, a Windows 3.0-based graphical front end to a Medical Information Management System using a pass-through-requester architecture. Proc Annu Symp Comput Appl Med Care. , 564-568 (1991).

Tags

Medisin problemet 126 kronisk obstruktiv lungesykdom kronisk bronkitt emfysem luftstrømmen begrensning lunge parenchymal ødeleggelse ozon eksponering
Generasjon av kronisk obstruktiv lungesykdom modell i mus ved gjentatte ozon eksponering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sun, Z., Li, F., Zhou, X., Wang, W.… More

Sun, Z., Li, F., Zhou, X., Wang, W. Generation of a Chronic Obstructive Pulmonary Disease Model in Mice by Repeated Ozone Exposure. J. Vis. Exp. (126), e56095, doi:10.3791/56095 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter