Summary
Durch eine doppelte Behandlung mit Colchicin, einem pflanzlichen Toxin, das trennende Zellen tötet, kann nervenfreie Hydra vulgaris erzeugt werden. Diese Hydra können nicht selbst ernähren oder bestochen werden. Dieses Papier beschreibt eine verbesserte Methode zur Langzeitpflege von nervenfreien Hydra vulgaris im Labor.
Abstract
Die interstitielle Zelllinie von Hydra umfasst multipotenten Stammzellen und deren Derivate: Drüsenzellen, Nematocyten, Keimzellen und Nervenzellen. Die interstitiellen Zellen können durch zwei aufeinanderfolgende Behandlungen mit Colchicin, einem pflanzlichen Toxin eliminiert werden, das die Trennzellen tötet, wodurch das Potenzial für die Erneuerung der differenzierten Zellen, die aus den interstitiellen Stammzellen gewonnen werden, gelöscht wird. Dies ermöglicht die Erzeugung von Hydra , die keine Nervenzellen haben. Ein nervenfreier Polypen kann seinen Mund nicht öffnen, um den osmotischen Druck zu ernähren, zu bestrafen oder zu regulieren. Solche Tiere können jedoch überleben und auf unbestimmte Zeit im Labor kultiviert werden, wenn sie regelmäßig zwangsernährt und geplatzt werden. Der Mangel an Nervenzellen ermöglicht die Untersuchung der Rolle des Nervensystems bei der Regulierung des Tierverhaltens und der Regeneration. Bisher veröffentlichte Protokolle für nervenfreie Hydra- Instandhaltung beinhalten veraltete Techniken wie Mundpipettieren mit handgezogener Mikropipette tIps, um die Hydra zu füttern und zu reinigen. Hier wird ein verbessertes Protokoll zur Pflege von nervenfreier Hydra eingeführt. Feinspitzen werden verwendet, um den Mund zu öffnen und frisch getötete Artemia einzusetzen. Nach der Zwangsernährung wird die Körperhöhle des Tieres mit frischem Medium unter Verwendung einer Spritze und einer Injektionsnadel gespült, um unverdautes Material zu entfernen, das hier als "burping" bezeichnet wird. Diese neue Methode der Kraft-Fütterung und Aufstoßen von nervenfreien Hydra durch den Einsatz von Pinzetten und Spritzen beseitigt die Notwendigkeit für Mund-Pipettieren mit handgezogenen Mikropipettenspitzen. Damit ist der Prozess sicherer und deutlich zeitaufwändiger. Um sicherzustellen, dass die Nervenzellen im Hypostom eliminiert wurden, wird die Immunhistochemie unter Verwendung von Anti-Tyrosin-Tubulin durchgeführt.
Introduction
Das Nervensystem von Hydra besteht aus einem Nervennetz, wobei Neuronen mit beiden Epithelgewebeschichten 1 assoziiert sind. Das Nervennetz ist dichter im Hypostom und Stiel und weniger dicht in der Körpersäule 2 . Die Nervenzellen stammen aus interstitiellen Stammzellen, die multipotenten Stammzellen sind, die zu sekretorischen Zellen, Nematocyten, Keimzellen und Neuronen führen. Es ist möglich, die interstitiellen Zellen von Hydra vulgaris durch die Behandlung mit Colchicin 3 , 4 , ein pflanzliches Toxin, das trennenden Zellen zu beseitigen, zu eliminieren. Obwohl Colchicin die Mikrotubulus-Polymerisation in anderen Organismen verhindert hat, hat eine frühere Studie gezeigt, dass Mikrotubuli in Hydra während der gesamten Behandlung vorhanden sind, was darauf hindeutet, dass Colchicin dies nicht in Hydra 3 bewirkt. Ein anderer stUdy schlägt vor, dass Colchicin in einigen Organismen nicht effizient an Tubulin bindet, wie Tetrahymena pyriformis, Zea mays, Chlamydomonas und Schizosaccharomyces pombe, was diesen Unterschied erklären kann 5 . Die Colchicin-Behandlung induziert die Phagozytose der interstitiellen Zellen durch die endodermalen Epithelzellen 3 und ermöglicht somit die Entstehung von Tieren, denen Nervenzellen, Drüsenzellen und Nematocyten fehlen. Es ist unklar, warum die interstitiellen Zellen besonders anfällig für Colchicin-Behandlung sind. Angesichts der Tatsache, dass sowohl post-mitotische interstitielle Zellen als auch die interstitielle Stammzelllinie beschädigt und phagozytiert sind, kam Campbell zu dem Schluss, dass Colchicin die Mitoseaktivität nicht direkt beeinflusst hat 3 . Bemerkenswert ist, dass die Colchicin-Behandlung in Hydra vulgaris gut funktioniert , aber es wurde gezeigt, dass sie auch bei anderen Spezies, wie Hydra oligactis 6 , nicht funktioniert . Hydra viridis 7 verwendet werden . Nervenfreie Hydra (auch manchmal als "Epithel- Hydra " 8 bezeichnet ) sind daher ein nützliches Hilfsmittel für die Untersuchung der Rollen dieser spezialisierten Zelltypen aus der interstitiellen Zelllinie in Geweihhomöostase und Regeneration.
Hydra kann das einzige bekannte Beispiel eines Tieres sein, das ohne Nervensystem leben kann. Nervenfreie Hydra dienen als besonders nützliches Modell für die Sezierung der Rolle des Nervenetzes bei der Regulierung der Hydra- Regeneration, Homöostase und Verhalten. Zum Beispiel erlaubte die Einführung von interstitiellen Zellen in nervenfreie Hydra über Pfropfen die Charakterisierung der Nervenzelldifferenzierung als hochregionsspezifische 9 . Darüber hinaus, weil nervenfreie Hydra regenerieren können, sieErmöglichen die Untersuchung alternativer, nervensystemunabhängiger Regenerationswege. Ein solches Beispiel ist eine apikale Neurogenese und Kopfbildung, von der gezeigt wurde, dass sie sich auf die cnox-2- Funktion im Nervensystem in Wildtyp- Hydra auswirkt , scheint aber in nervenfreier Hydra entbehrlich zu sein, was darauf hindeutet, dass es einen alternativen Kopfregenerationsprozess geben kann 10
Nervenfreie Hydra wurden auch verwendet, um Epithelzell-Expression und Regulation von neurogenen und Neurotransmission-Genen nach dem Verlust der Neurogenese zu untersuchen 11 . Nervenfreie Hydra zeigen keine spontanen Kontraktionsbursts 12 , was darauf hinweist, dass diese Bursts durch das Nervensystem reguliert werden. Nervenfreie Hydra dagegen verhalten sich als Reaktion auf das Einklemmen der Körpersäule mit Pinzette, was darauf hindeutet, dass die Kontraktion in Reaktion auf mechanische Reize durch Kopplung von Throu vermittelt wirdGh-Spaltübergänge in Epithelzellen, während das spontane kontraktile Verhalten durch Kopplung durch Spaltübergänge in Nervenzellen vermittelt wird 13 .
Nervenfreie Hydra öffnen ihre Münder nicht, wenn sie mit Nahrung oder reduziertem Glutathion 3 versehen sind , was darauf hindeutet, dass sensorische Neuronen notwendig sind, um die Anwesenheit von Nahrung zu erkennen und den Mund zu öffnen, um sich zu öffnen. Darüber hinaus scheint das Nervennetz eine Rolle bei der Erfassung des osmotischen Drucks zu spielen, weil nervenfreie Tiere nicht in der Lage sind, ihren internen hydrostatischen Druck durch die Mundöffnung autonom zu regulieren, wodurch ihr charakteristisches ballonähnliches Aussehen 3 , 4 ( Abbildung 1B ) verursacht wird. Die Regulation des hydrostatischen Drucks in der nervenfreien Hydra durch häufige manuelle Deflation führte zu einem Verlust einer abnormen Morphologie in der Hypostomie und der Körpersäule. Die chronische Deflation führte jedoch zu einer Störung des WachstumsOngation, Knospen und Gewebeorganisation 8 .
Obwohl nervenfreie Hydra nicht in der Lage sind, sich selbst zu ernähren und zu ewigen, ist es möglich, sie unbegrenzt im Labor zu pflegen, indem man jedes Tier manuell zwangsernährt und zerbricht. Bisherige Veröffentlichungen haben Methoden der Zwangsernährung und des rülpsenden nervenfreien Hydra beschrieben , wobei jedoch diese Protokolle die Verwendung von Mikropipettenspitzen beinhalten, die von Hand sorgfältig auf die entsprechende Größe gezogen werden müssen, sowie die Verwendung eines Mundstücks, das durch die Rohrleitung 14 mit der Pipette verbunden ist. Hier wird eine einfachere, sicherere und zeitgerekere Methode der Fütterung und des Rülpens beschrieben.
Darüber hinaus untersuchten frühere Studien die Abwesenheit von Nervenzellen durch die Dissoziation von fixierten Tieren in einzelne Zellen und die Untersuchung der Zellmorphologie 3 , 4 , 15 . HDie Immunhistochemie mit einem monoklonalen Antikörper gegen den tyrosinierten Carboxylterminus von alpha-Tubulin wurde als komplementäre Methode zur Mazeration verwendet, um die Erschöpfung von Neuronen im Hypostom 13 , 16 zu überprüfen. Frühere Studien haben gezeigt, dass Neuronen im Stiel auch mit diesem Antikörper 13 sichtbar gemacht werden können, aber diese Neuronen sowie die in der Körpersäule sind schwerer zu erkennen. Während die Immunhistochemie ausreicht, um die Abwesenheit von Nervenzellen im Hypostom zu bestätigen und keine Kompetenz auf die Zelltyp-Morphologie erfordert, kann sie nicht dazu verwendet werden, auf die Abwesenheit der interstitiellen Stammzellen und der anderen Derivate dieser Zellen zu prüfen. Dissoziations- und Zellmorphologie-Studien sind strenger und können eine quantitative Berücksichtigung der Anzahl der einzelnen Zelltypen, die nach jedem Stadium der Behandlung verbleiben, geben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Doppelte Colchicin-Behandlung
- Machen Sie eine 0,4% Colchicin (Gewicht / Volumen) Lösung in Hydra Medium 3 , 4 , 17 .
Achtung: Colchicin ist akut toxisch, tödlich, wenn es verschluckt wird, kann genetische Defekte verursachen und kann Augenschäden verursachen. Behandeln Sie das Pulver in einer Dunstabzugshaube und tragen Sie volle persönliche Schutzausrüstung (PSA). - Inkubation Hydra vulgaris (AEP-Stamm wurde hier verwendet), die für 24 h in 0,4% Colchicin in einem Verhältnis von 5 Hydra pro ml Colchicin-Lösung in einer Petrischale für 8 h bei Raumtemperatur im Dunkeln verhungert wurden.
Hinweis: 5 Hydra / mL Colchicin ist ein Leitfaden für die Bestimmung, wie viel Lösung zu verwenden, um zu vermeiden Überfüllung der Schale mit Hydra . Verwenden Sie für nachfolgende Reinigungs- und Lösungsänderungen das gleiche Lösungsvolumen. - Entfernen Sie die Colchicinlösung und ersetzen Sie sieMit sauberem Hydra Medium ohne Colchicin. Waschen Sie die Hydra 5 mal durch serielle Übertragung mit einer Glaspasteurpipette in ein sauberes Hydra- Medium, bevor Sie auf 50 μg / ml Rifampicin in Hydra- Medium übertragen werden. Hydra in einem 18 ° C Inkubator halten.
Anmerkung: Ausreichend 1.000X Rifampicin-Stamm (50 mg / ml) in Dimethylsulfoxid (DMSO) für 1-2 Wochen Behandlung kann bei 4 ° C gelagert werden. Die genaue Menge kann durch das Gesamtvolumen der täglich verwendeten Lösung bestimmt werden. Zum Beispiel, wenn es 2 Gerichte gibt, die jeweils 10 ml Lösung enthalten, die zweimal täglich gewechselt werden muss, werden an einem Tag insgesamt 40 mL Lösung verwendet, was 40 μl 1.000X Lager pro Tag oder 560 μL entspricht Über einen Zeitraum von zwei Wochen. Der Bestand wird dann 1: 1000 in Hydra- Medium nach Gebrauch verdünnt.
Achtung: DMSO ist eine brennbare Flüssigkeit und dringt leicht in die Haut ein, so dass andere gelöste Chemikalien in den Körper gelangen. HandLe das Lösungsmittel in einer Abzugshaube und tragen volle PSA. DESSO friert bei 4 ° C ein - Ändern Sie das Rifampicin-haltige Hydra- Medium zweimal täglich, bis die Hydra stoppt, Zellen in das Medium zu vertreiben, was in der Regel 1 Woche nach der Behandlung ist. Zu diesem Zeitpunkt kann das Medium einmal täglich gewechselt werden. Während der Tage nach der Behandlung wird die Hydra ihre Tentakeln komplett verlieren. Vermeiden Sie es, die Hydra in Kontakt zu haben, da sie zusammenschmelzen und zu seltsam geformten Hydra führen können ( Abbildung 2 A ).
- Um den Kontakt zu vermeiden, vermeiden Sie, die Schale in einer kreisförmigen Bewegung zu verwirbeln. Stattdessen schütteln Sie die Schale in vertikaler und horizontaler Richtung vorsichtig, bis die Hydra auseinandergespreizt sind. Überprüfen Sie die Schale, wenn Sie die Hydra in den 18 ° C Inkubator stellen und wie nötig einstellen.
Hinweis: Für die Tage, in denen das Medium zweimal geändert wird, wechseln Sie das MediumEinmal morgens und wieder nachmittags / abends
- Um den Kontakt zu vermeiden, vermeiden Sie, die Schale in einer kreisförmigen Bewegung zu verwirbeln. Stattdessen schütteln Sie die Schale in vertikaler und horizontaler Richtung vorsichtig, bis die Hydra auseinandergespreizt sind. Überprüfen Sie die Schale, wenn Sie die Hydra in den 18 ° C Inkubator stellen und wie nötig einstellen.
- Sobald die Tentakel anfangen zu bilden, beginnen Sie mit der Zwangsernährung und zerreißen die Hydra 3 bis 4 mal pro Woche (siehe Abschnitte 2 und 3). Etwa 8-9 Tage nach der Colchicin-Behandlung wird die Hydra beginnen, ihre Tentakeln zurück zu wachsen.
Hinweis: Tentakel Nachwachsen variiert unter den Individuen. Einige können länger als 8 - 9 Tage dauern, bevor sie Zeichen des Tentakelwachstums zeigen. Diejenigen, die ihre Tentakeln nicht nachwachsen, sowie merkwürdig geformte ( Fig. 2 B ) Tiere oder Tiere, die zu klein sind, um zu füttern, sollten entfernt werden. Diese Hydra wird wahrscheinlich nicht die zweite Behandlung überleben. Die Hydra kann auch Knospe. Allerdings können einige der Knospen noch interstitielle Zellen haben und in der Lage sein, auf eigene Faust zu essen.- Entfernen Sie alle Knospen, die ohne Hilfe essen und vom Elterntier abnehmen können. Identifizieren Sie diese Tiere durch Hinzufügen von Live Artemia an dieFütterung Gericht und beobachten, ob die Tiere fangen und essen die Artemia auf eigene Faust. 1 oder 2 Hydra kann auch in der Lage sein, auf eigene Faust zu essen. Diese sollten auch verworfen werden.
Anmerkung: Nervenfreie Hydra haben eine charakteristische Ballon-ähnliche Morphologie und Tentakeln, die kürzer und dünner als normal sind (aufgrund des Verlustes von Nematocyten) und können so leicht von normal aussehenden Tieren unterschieden werden ( Abbildung 1 A, 1B ).
- Entfernen Sie alle Knospen, die ohne Hilfe essen und vom Elterntier abnehmen können. Identifizieren Sie diese Tiere durch Hinzufügen von Live Artemia an dieFütterung Gericht und beobachten, ob die Tiere fangen und essen die Artemia auf eigene Faust. 1 oder 2 Hydra kann auch in der Lage sein, auf eigene Faust zu essen. Diese sollten auch verworfen werden.
- Drei Wochen nach der ersten Colchicinbehandlung wiederholen Sie die Colchicinbehandlung (Schritte 1.1 - 1.5). Eine zweite Colchicin-Behandlung ist notwendig, um die verbleibenden Zwischenzellen und Nervenzellen zu eliminieren 3 .
2. Zwangsernährung
- Fügen Sie Artemia Zysten zu einem schmalen und hohen Glasbehälter hinzu, der sich am Boden verjüngt. Füllen Sie den Behälter mit Artemia Wasser (6,72 M NaCl). Vermeiden Sie exce1 g Zysten pro 1 l Wasser für eine höhere Luke ausgeben.
- Die Oberseite des Behälters mit Parafilm abdecken und eine 10 mL serologische Pipette durch den Parafilm in den Behälter geben. Belüftung durch Anbringen von Schläuchen an eine Aquarium-Luftpumpe und Montage der Schläuche um die Pipette. Vergewissern Sie sich, dass die Pipettenspitze den Boden des Behälters erreicht und dass keine Zysten am Boden liegen. Die Artemia schlüpft nach 48 h.
Hinweis: Es gibt viele verschiedene Möglichkeiten, Artemia zu schlüpfen, die genauso gut funktionieren können.
- Die Oberseite des Behälters mit Parafilm abdecken und eine 10 mL serologische Pipette durch den Parafilm in den Behälter geben. Belüftung durch Anbringen von Schläuchen an eine Aquarium-Luftpumpe und Montage der Schläuche um die Pipette. Vergewissern Sie sich, dass die Pipettenspitze den Boden des Behälters erreicht und dass keine Zysten am Boden liegen. Die Artemia schlüpft nach 48 h.
- Die Artemia aus dem Artemia- Wasser in einem Artemia- Netz (erhältlich von Aquarien-Versorgungsunternehmen) abbauen und für ca. 20 s in DI-Wasser waschen, bevor sie in eine Schale mit Hydra- Medium gebracht werden. Der Salzgehalt von Artemia Wasser ist zu hoch für Hydra , so dass die Artemia gewaschen werden muss, bevor sie verwendet werden.
- Unter einem Sektionsmikroskop,Töte die Artemia, indem du sie leicht mit einem Paar feiner Pinzette drückst. Vermeiden Sie es, hart genug zu drücken, um den Mut zu vertreiben, da dies an der Pinzette haften und die Fütterung schwierig machen wird. Die Artemia, bevor sie es der Hydra zuführt, leicht zu quetschen, wird bei der Verdauung helfen. 14 Lege die frisch getötete Artemia in die Nähe der Hydra in die Schale, um die schnelle Fütterung zu erleichtern.
Hinweis: Alle nachfolgenden Schritte werden unter einem Sektionsmikroskop durchgeführt. - Verwenden Sie eine Pinzette, um die Hydra am Stiel zu halten. Setzen Sie fort, den Stiel während des Prozesses der Fütterung der Hydra zu halten . Mit einem zweiten Paar Pinzette, klemmen Sie die Körpersäule, um die Hydra Vertrag zu machen.
- Während man die Spitzen der zweiten Pinzette zusammenhält, tippe in der Mitte des Hypostoms (die gewölbte Struktur am oralen Ende des Tieres). Dies führt manchmal dazu, dass sich der Mund öffnet. ichDer Mund öffnet sich nicht durch Klopfen, punktiert den Mund, indem er die Pinzette in die Mitte des Hypostoms einsetzt und dann den Druck auf die Spitzen der Pinzette leicht löst. Das sollte die Mundöffnung durch die Punktion ausstrecken.
Anmerkung: Die Hydra kann entleeren und zusammenbrechen, wenn der Mund geöffnet ist ( Abbildung 2 C ). Wenn dies geschieht, kann die Artemia noch in die Hydra eingefügt werden. Wenn es zu schwierig ist, dies zu tun, fahren Sie auf die nächste Hydra und kehren zu der ursprünglichen Hydra einige Zeit später und versuchen Sie es erneut. Die Hydra neigen dazu, bei nachfolgenden Mundöffnungen nicht so viel zu entleeren. - Richten Sie Artemia schnell mit der Pinzette auf und stecken Sie sie in die Magenhöhle der Hydra ein . Setzen Sie so viele Artemia wie möglich ein, bis die Magenhöhle voll ist und mehr Artemia kann nicht eingefügt werden, ohne die Hydra , Unfall zu beschädigenVerbinden Sie alle Artemia im Inneren, oder verhindern, dass der Mund zu schließen. Im Durchschnitt ist dies 5 - 6 Artemia , aber bis zu 12 wurden den größeren Tieren gefüttert.
- Wenn der Mund zu schließen beginnt, dehnen Sie sich mit der Pinzette wie oben beschrieben wieder auf; Allerdings sollte Vorsicht geboten werden, da irgendeine Artemia bereits innerhalb des Tieres beginnen kann, herauszukommen, wenn der Mund wieder geöffnet wird.
- Wenn die Hydra für eine ganze Artemia zu klein ist, schneide die Artemia mit einem Skalpell und füttere die Hydra kleinere Stücke. Wenn die Artemia nicht in der Hydra bleibt, kann es notwendig sein, die Pinzette gegen die Artemia zu drücken, um sie in der Hydra zu halten, bis ihr Mund schließt.
- Übertragen Sie gefütterte Hydra mit einer Glaspasteurpipette sorgfältig, um versehentliches Aufstoßen zu vermeiden, auf eine Schale mit frischem 50 μg / ml Rifampicin in Hydra- Medium. Wenn eine Artemia vertrieben wurde fRom der Hydra während der Übertragung, reinsert es, während in der neuen Schale.
Anmerkung: Eine Glaspipette wird verwendet, um die Hydra zu übertragen, wie es gefunden wurde, dass Hydra weniger zu Glas im Vergleich zu Plastik klebt. Die Länge der Pipette spielt keine Rolle, aber mit 5-Zoll-Pipetten kann etwas einfacher sein.
3. Burping
- Burp die Hydra , um unverdaute Material jederzeit zwischen 8 und 20 h nach der Fütterung zu entfernen.
- Schieben Sie den Punkt einer 30G-Injektionsnadel mit P320 oder ähnlichem Sandpapier, bis die Spitze flach ist.
Anmerkung: Eine 27G-Injektionsnadel würde auch funktionieren, aber die kleinere Spitze der höheren Lehre ist vorzuziehen. - Befestigen Sie die Nadel mit einer 1 ml Plastikspritze und füllen Sie die Spritze mit frischem 50 μg / mL Rifampicin in Hydra Medium.
Hinweis: Das Saugen einer einzelnen Hydra dauert ca. 0,05 ml bis 0,1 ml Lösung. Ein 1 mL syriNg ist bevorzugt, da die Steuerung der Kraft und des Volumens der auskommenden Lösung mit einer größeren Volumenspritze schwieriger ist. - Unter einem Seziermikroskop halten Sie den Stiel der Hydra mit feiner Pinzette und klopfen Sie in die Mitte des Hypostoms mit der Nadel. Wenn sich der Mund nicht öffnet, führe die Pinzette in den Hypostom ein und öffne den Mund, wie oben beschrieben für die Fütterung.
Hinweis: Alle nachfolgenden Schritte werden unter einem Sektionsmikroskop durchgeführt. - Verwenden Sie die Spritze zu spülen, sehr sanft zu vermeiden, wegblasen das ganze Tier, die Magenhöhle mit der 50 μg / ml Rifampicin-Lösung bis alle Trümmer wurde vertrieben. Die Nadel muss nicht unbedingt in die Hydra eingesetzt werden, wenn die Größe der Hydra nicht zulässt. Die Nadel kann in der Nähe der Mundöffnung gehalten werden und zeigte direkt auf den Mund.
- Mit einer Glas-Pasteur-Pipette, überragt Hydra auf eine Schale mit frischen 5081; g / ml Rifampicin in Hydra- Medium.
4. Qualitätskontrolle über Immunhistochemie
ANMERKUNG: Das folgende Protokoll wird von Protokollen von Shenk, M. A, et al. 18 und Böttger, A 19 . Alle Schritte werden bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Ein Nutator kann für die Inkubationsschritte verwendet werden und kann die Färbequalität verbessern. Allerdings, wenn die Hydra sich miteinander verheddern, können alle Schritte auch ohne durchgeführt werden.
- Vorbereiten der Sperrlösung: 10% fötales Rinderserum (FBS) und 1% DMSO in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Lagern Sie diese Lösung bei 4 ° C bis zur Anwendung (Schritte 4.6 und 4.11). Die Lösung kann für 1 - 2 Tage gelagert werden.
Hinweis: Alle in diesem Protokoll verwendeten Lösungen müssen ordnungsgemäß als gefährlicher Abfall gesammelt werden. - Entspannter Hydra in 200 μl 2% urethan in Hydra mEdium für 1 min in 1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Verwenden Sie 5 Hydra pro Röhrchen für jede der 4 Bedingungen: nervenfrei, unbehandelt, unbehandelt ohne primären Antikörper und unbehandelt ohne sekundären Antikörper.
Hinweis: 1 min nicht überschreiten. Das Timing hier ist kritisch, da die Tiere in schlechter Form sein werden, nachdem sie zu viel Zeit in Urethan verbracht haben. - Entfernen Sie das Urethan und fixieren Sie die Hydra in 200 μl 4% Paraformaldehyd (PFA) in Hydra- Medium für 15 min.
- Waschen Sie die Proben 3 mal mit 1x PBS für jeweils 10 min.
Hinweis: Alle Wäschen mit PBS und PBSTx werden mit 500 μl Lösung durchgeführt. - Permeabilisieren mit 500 μl 0,5% Triton X-100 in PBS für 15 min.
- Entfernen Sie die 0,5% Triton X-100 und fügen Sie 500 μl der Sperrlösung hinzu. Blockieren Sie die Proben für mindestens 1 Stunde.
- Verdünnen Sie den Anti-Tyrosin-Tubulin-Antikörper 1: 200 in Blockierungslösung.
Anmerkung: Diese Konzentration war deExperimentell behandelt. Wenn das Signal in den Kontrollen zu schwach ist, kann die Konzentration möglicherweise erhöht werden. Wenn es unspezifische Bindung gibt, muss die Konzentration vermindert werden. Die Vorinkubation des Antikörpers kann auch dazu beitragen, die unspezifische Bindung zu reduzieren. - Entfernen Sie die Sperrlösung aus den Proben und fügen Sie 200 μl des primären Antikörpers der nervenfreien Hydra , unbehandelten Kontrollen und unbehandelten Kontrollen ohne Sekundär hinzu. Für die unbehandelten Kontrollen ohne primäre, nur 200 μl Blockierungslösung ohne den Antikörper hinzufügen.
- Die Proben über Nacht (> 12 h) bei 4 ° C inkubieren.
Hinweis: Alternativ 5 - 6 h bei RT inkubieren. - Den primären Antikörper entfernen und die Proben weitgehend mit 0,3% Triton X-100 in 1x PBS (PBSTx) waschen.
Hinweis: Sparen Sie den primären Antikörper und lagern bei 4 ° C, da er mindestens 2 - 3 mal wiederverwendet werden kann. - Verdünnung von Ziegen-Anti-Maus-HP-Sekundär-AntibiotikaOdy 1: 500 in Blockierlösung Füge 200 μl zu der nervenfreien Hydra , unbehandelten Kontrollen und unbehandelten Kontrollen ohne Primär. Für die unbehandelten Kontrollen ohne Sekundär, nur 200 μl Blockierungslösung ohne den Antikörper hinzufügen.
Hinweis: Alternativ kann ein fluoreszierender sekundärer Antikörper verwendet werden, für den die Schritte 4.13 - 4.17 nicht benötigt werden. Die Verwendung einer fluoreszierenden Sekundärspalte spart Zeit und ist in der Regel ausreichend, aber die hP-Sekundärseite bietet eine erhöhte Empfindlichkeit. Die Sekundärkonzentration wurde experimentell bestimmt. Wenn die Signale in den Kontrollen zu schwach sind, kann die Konzentration möglicherweise erhöht werden. Wenn es unspezifische Bindung gibt, muss die Konzentration vermindert werden. - Die Proben über Nacht bei 4 ° C inkubieren.
- Entfernen Sie den sekundären Antikörper und waschen Sie die Proben weitgehend mit PBSTx.
- Bereiten Sie 1x PBT: 0,2% Rinderserumalbumin (Gewicht / Volumen) und 0,05% Tween20 in 1x PBS vor. Inkubiere die sAmples in 1x PBT für 30 min.
- Entfernen Sie die 1x PBT und inkubieren Sie die Proben in 1: 1000 NHS-Fluorescein und 1: 10.000 H 2 O 2 in 1x PBT für 15 min im Dunkeln. Von diesem Schritt aus, halten Sie die Proben im Dunkeln so viel wie möglich, da das Fluoreszenzsignal sinkt, wenn sie Licht ausgesetzt sind.
Anmerkung: NHS-Fluorescein wurde nach einem detaillierten FISH-Protokoll von King, RS und Newmark, PA 20, hergestellt - Die Proben 3 mal mit PBSTx schnell waschen, dann 2 mal für 30 min.
- Lassen Sie die Proben in PBSTx über Nacht bei 4 ° C, um weiter zu waschen.
- Noch ein paar Wäsche mit 1x PBSTx. Um Zellkerne zu visualisieren, führen Sie die folgenden optionalen Schritte zur DNA-Gegenfärbung mit 4 ', 6-Diamindino-2-phenylindol, Dihydrochlorid (DAPI) durch. Andernfalls können die Proben jetzt abgebildet werden.
- 5 mg / ml DAPI-Stamm auf eine Arbeitskonzentration von 1: 500 in PBSTx verdünnen und jedem Röhrchen 200 μl zugeben. IncuBate die Proben für 30 min.
Achtung: DAPI ist ein bekanntes Karzinogen. Tragen Sie volle PSA. - Entfernen Sie das DAPI und waschen Sie die Proben 2 - 3 mal mit PBSTx vor der Imaging mit Fluoreszenzmikroskopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Unmittelbar nach der ersten 8 h colchicine Behandlung überleben alle Hydra . Einige dieser Hydra werden nur noch Tentakelstummel verbleiben ( Abbildung 3 A ), während andere ihre Tentakeln vollständig verloren haben ( Abbildung 3 B ). In den folgenden 1 oder 2 Tagen werden die Tentakeln weiter schrumpfen, bis alle Hydra ihre Tentakeln verloren haben. Etwa 1 Woche nach der Behandlung zeigt die Hydra Anzeichen von Tentakel nachwachsen, mit kleinen Stummel wie Tentakeln ( Abbildung 3 C ), bevor sie ihre Tentakeln vollständig regenerieren ( Abbildung 3 D ). Von der ursprünglichen Hydra , um 50-60% schließlich regenerieren ihre Tentakeln zwischen 1-2 Wochen nach der Behandlung.
Nach dem sEcond Behandlung, die Wiederherstellung der Tiere ist ähnlich, dass nach der ersten Behandlung. So werden etwa 10% der ursprünglichen Anzahl von Tieren, die in beide Behandlungen gingen, erholen und zu einer für das Experimentieren geeigneten Größe wachsen ( Abbildung 1 B ). Diese Hydra haben Tentakeln, die dünner erscheinen als die von unbehandelten Tieren, haben Gewebe, das transparenter ist, und wird aufgebläht wegen der Unfähigkeit, ihren Mund zu öffnen, um den osmotischen Druck zu entlasten ( Abbildung 1 A , 1B). Alle Tiere, die nicht gefüttert werden, können für ein paar Wochen überleben, aber unfed Tiere werden in Größe schrumpfen und werden immer schwieriger zu füttern.
Hydra , die sich nach der zweiten Behandlung erholen, können unbegrenzt aufrechterhalten werden. Diese Tiere sind in der Lage, Knospe, so erhalten und wachsen die Bevölkerung. Zusätzlich kann die Bevölkerung angebaut werdenIndem man diese Tiere schneidet und ihnen erlaubt, 4 zu regenerieren.
Immunhistochemie bestätigt den Verlust von Neuronen im Hypostomus nach der zweiten Colchicin-Behandlung. Das dichte Nervennetz im Hypostom kann mit einem Anti-Tyrosin-Tubulin-Antikörper 13 , 16 sichtbar gemacht werden und zeigt deutliche Fasern, die nach außen aus dem Mund und den offensichtlichen Zellkörpern ausstrahlen ( Abbildung 4 A ). Diese Fasern fehlen in nervenfreier Hydra , die durch Doppelbehandlung mit Colchicin hergestellt wurden ( Abbildung 4 B ). Darüber hinaus zeigt die Co-Färbung mit DAPI eine reduzierte Anzahl von Zellkernen in der nervenfreien Hydra im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen aufgrund des Verlustes von Zellen der interstitiellen Zelllinie als Folge der Colchicin-Behandlungen ( Abb4A , 4B ).
Abbildung 1 Vergleich von nervenfreier und unbehandelter Hydra .
(A) Unbehandelte Hydra . (B) Nervenfreie Hydra 22 Tage nach der zweiten Colchicinbehandlung. Beachten Sie die geschwollene Körpersäule und die dünnen Tentakeln im nervenfreien Tier. Maßstäbe sind 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2 Beispiele für deformierte Hydra .
(A) Zwei Hydra (B) Eine seltsam geformte Hydra . (C) Eine Hydra , die nach dem Öffnen des Mundes entleert hat. Maßstäbe sind 400 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3 Repräsentative Bilder von Hydra Nach der ersten 8 h Colchicine Behandlung.
(A) Eine Hydra mit Stubby-Tentakeln sofort nach der Behandlung. (B) Eine Hydra , die ihre Tentakel sofort nach der Behandlung vollständig verloren hat. (C) Eine Hydra , die beginnt, ihre Tentakeln 8 Tage nach der Behandlung zu umgehen. (D)Eine Hydra , die ihre Tentakel 13 Tage nach der Behandlung vollständig neu aufgelegt hat. Maßstäbe sind 400 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4 Der Verlust der Nervenzellen im Hypostom kann durch Immunhistochemie bestätigt werden.
(A) Das Hypostom eines unbehandelten Hydra- und (B) Hypostoms einer nervenfreien Hydra etwa 2 Wochen nach der zweiten Colchicin-Behandlung, markiert mit (i) Anti-Tyrosin-Tubulin-Antikörper und (ii) DAPI. (Iii) zeigt die Überlagerung. Das * zeigt die Lage des Mundes an. Maximale Z-Projektionen wurden aus Spinndiskette konfokale Fluoreszenz-Z-Stacks mit e gemachtBelichtungen von 500 ms (GFP) und 15 ms (DAPI). Helligkeit und Kontrast wurden angepasst, um die Sichtbarkeit zu verbessern. Maßstäbe sind 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hydra interstitielle Zellen können durch eine Doppel-Colchicin-Behandlung 3 , 4 eliminiert werden. In den Tagen nach der ersten Behandlung ist es entscheidend, den Kontakt zwischen der einzelnen Hydra zu verhindern, um die Verschmelzung von Hydra- Stücken in deformierte Hydra zu vermeiden. Auch Tiere, die nach der ersten Behandlung unbeaufsichtigt essen können, müssen entfernt werden, da die zweite Colchicinbehandlung nicht ausreicht, um die verbleibenden Zwischenzellen aus solchen Tieren zu eliminieren. Um die Überlebensrate der nervenfreien Hydra nach der zweiten Colchicin-Behandlung zu maximieren, sollten die Tiere nach der Erholung von der ersten Behandlung so viele Artemia wie möglich gefüttert werden, wobei 1 - 2 Tage zwischen den Fütterungen zurückgewinnen und wachsen. Jede Colchicin-Behandlung bewirkt, dass die Hydra signifikant in der Größe abnimmt, wenn die Zellen ewigen, so dass je größer die Hydra vor jeder Behandlung ist, die bDie Chancen, dass die Hydra sich auf eine Größe, die gefüttert und gepflegt werden kann, erheben.
Aufgrund der geringen Überlebensrate von Hydra nach jeder Behandlung kann es wünschenswert sein, mit vielen Hydra zu beginnen. Allerdings muss Vorsicht geboten werden, wenn man zu viele Hydra sofort beginnt. Dies wird die Fütterung nach der ersten Behandlung schwierig und extrem zeitaufwändig machen. Tiere, die nach der ersten Behandlung gut aufgeholt wurden, erholen sich zu größeren Größen und haben daher nach der zweiten Behandlung eine höhere Überlebensrate. So kann es produktiver sein, mit weniger zu beginnen und konzentrieren sich auf die Fütterung besser. Im Allgemeinen, beginnend mit 50 - 100 Tieren ist für 1 - 2 Personen überschaubar. Es ist auch am besten, mit der größten Hydra möglich zu beginnen, da diese besser die beiden Behandlungen überleben werden.
Die Methode der Kraft-Fütterung und Aufstoßen Hydra , die fehlenden Nervenzellen hier beschrieben ist, ist sicherer, einfacher und mehr Zeit-effizient als die in den letzten 3 , 4 , 14 beschriebenen Methoden. Die Verwendung von handelsüblichen Pinzetten und Spritzen beseitigt die Notwendigkeit von handgezogenen Mikropipettenspitzen, die zeitaufwendig und schwer zu machen sind. Die Verwendung dieser Werkzeuge vermeidet auch die Notwendigkeit der Mundpipette. Zwangsernährung mit Pinzette kann zunächst schwierig sein, aber genügend Zeit und Praxis gegeben, wird es ganz einfach und effizient. Man sollte zuerst Zwangsernährung und Rülpsen normaler Hydra üben, um ein Gefühl dafür zu bekommen, wie viel Kraft mit den Werkzeugen zu bedienen und wie man Hydra manipuliert. Verschiedene Pinzetten und Nadelgrößen wurden getestet, um die optimalen Werkzeuge für die Zwangsernährung und das Aufstoßen zu finden.
Die Verwendung von Antikörperfärbung, wie hier beschrieben, ist nur ausreichend, um die Abwesenheit von Nervenzellen im Hypostomus zu überprüfen. Um sicherzustellen, dass alle interstitiellen Zellen eliminiert wurden, können Tiere mazeriert undDie vorhandenen Zelltypen können untersucht werden 15 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren danken Dr. Dick Campbell (UC Irvine) für Gespräche über das ursprüngliche Protokoll zur Erstellung und Pflege von nervenfreien Tieren, Frau Rui Wang für Hilfe bei der Anpassung der Spritzen- und Nadeltechnik und Frau Danielle Hagstrom und Dr. Rob Steele (UC Irvine) für Kommentare zum Manuskript. Diese Arbeit wurde von der RCSA und NSF Grant CMMI-1463572 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colchicine | Acros Organics | 227120010 | |
| 1 mL Syringe | BD | 301025 | |
| Brine Shrimp Eggs | Brine Shrimp Direct | N/A | Can be purchased locally |
| Brine Shrimp Hatchery Dish | Brine Shrimp Direct | N/A | |
| 60 mm x 15 mm Petri Dish | Celltreat | 229663 | |
| 30 G x 3/4" Hypodermic Needle | Covidien | 1188830340 | A 27G needle may also be used |
| 2 x Fine-tip Tweezers | Dumont | 0109-5-PO | |
| Rifampicin | EMD Millipore | 557303 | |
| Goat anti-mouse lgG, Pab (HRP Conjugate) | Enzo | ADI-SAB-100-J | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Scalpel | Fisher | 08-920A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| PBS Tablets | MP Bio | 2810305 | |
| Monoclonal Anti-Tubulin, Tyrosine | Sigma | T9028 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 216763 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Triton X - 100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Air Pump | Tetra | 77846-00 | |
| Glass Pasteur Pipette | VWR | 53283-916 | Length of the pipet does not matter |
| 15 mL Tube | VWR | 89039-670 | |
| P320 Sandpaper | 3M | IBGABBV00397 | Can be purchased at local home improvement store |
References
- Bode, H. R. The interstitial cell lineage of Hydra: a stem cell system that arose early in evolution. J. Cell. Sci. 109, 1155-1164 (1996).
- Hager, G., David, C. N. Pattern of differentiated nerve cells in hydra is determined by precursor migration. Development. 124, 569-576 (1997).
- Campbell, R. D. Elimination of Hydra interstitial and nerve cells by means of colchicine. J. Cell. Sci. 21, 1-13 (1976).
- Marcum, B. A., Campbell, R. D. Development of Hydra lacking nerve and interstitial cells. J. Cell. Sci. 29, 17-33 (1978).
- Burns, R. G. 3H-colchicine binding: Failure to detect any binding to soluble proteins from various lower organisms. Exp. Cell. Res. 81, 285-292 (1973).
- Lee, H. -T., Campbell, R. D. Development and Behavior of an Intergeneric Chimera of Hydra (Pelmatohydra oligactis Interstitial Cells Hydra attenuata Epithelial Cells). Biol. Bull. 157 (2), 288-296 (1979).
- Novak, P. Preparing Hydra viridis with Nerve Cells and No Interstitial Cells, or with Neither of These Cell Types. Hydra: Research Methods. , Plenum Press. New York. 295-297 (1983).
- Wanek, N., Marcum, B. A., Lee, H. -T., Chow, M., Campbell, R. D. Effect of hydrostatic pressure on morphogenesis in nerve-free Hydra. J. Exp. Zool. 211, 275-280 (1980).
- Minobe, S., Koizumi, O., Sugiyama, T. Nerve cell differentiation in nerve-free tissue of epithelial Hydra from precursor cells introduced by grafting. Dev. Biol. 172 (1), 170-181 (1995).
- Miljkovic-Licina, M., Chera, S., Ghila, L., Galliot, B. Head regeneration in wild-type hydra requires de novo neurogenesis. Development. 134 (6), 1191-1201 (2007).
- Wenger, Y., Buzgariu, W., Galliot, B. Loss of neurogenesis in Hydra leads to compensatory regulation of neurogenic and neurotransmission genes in epithelial cells. Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (20150040), (2015).
- Campbell, R. D., Josephson, R. K., Schwab, W. E., Rushforth, N. B. Excitability of nerve-free Hydra. Nature. 262, 388-390 (1976).
- Takaku, Y., Hwang, J. S., et al. Innexin gap junctions in nerve cells coordinate spontaneous contractile behavior in Hydra polyps. Sci. Rep. 4 (3573), (2014).
- Marcum, B. A. Culturing Epithelial Hydra. Hydra: Research Methods. , Plenum Press. New York. 287-290 (1983).
- David, C. N. A quantitative method for maceration of Hydra tissue. Wilhelm Roux Arch. Entwickl. Mech. Org. 171, 259-268 (1973).
- Gröger, H., Schmid, V. Larval development in Cnidaria: A connection to Bilateria. Genesis. 29 (3), 110-114 (2001).
- Lenhoff, H. M. Water, Culture Solutions, and Buffers. Hydra: Research Methods. , Plenum Press. New York. 29-34 (1983).
- Shenk, M. A., Bode, H. R., Steele, R. E. Expression of Cnox-2, a HOM/HOX homeobox gene in hydra, is correlated with axial pattern formation. Development. 117, 657-667 (1993).
- Böttger, A., et al. Horizontal Gene Transfer Contributed to the Evolution of Extracellular Surface Structures: The Freshwater Polyp Hydra Is Covered by a Complex Fibrous Cuticle Containing Glycosaminoglycans and Proteins of the PPOD and SWT (Sweet Tooth) Families. PLoS One. 7 (12), (2012).
- King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Dev. Biol. 13 (8), (2013).
