Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

अध्ययन करने के लिए एक साधारण न्यूरॉनल मैकेनिकल इंजेक्शन पद्धति Published: July 19, 2017 doi: 10.3791/56128
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Quinnipiac University

Summary

यहां हम तीसरे इन्स्टार लार्वा के न्यूरोमस्कुलर जंक्शन (एनएमजे) में मोटर न्यूरॉन्स की न्यूरोडिगेनरेशन को कल्पना और मात्रात्मक बनाने के लिए ड्रोसोफिला लार्वा में कमानी नसों को घायल करने के लिए एक सरल और व्यापक रूप से सुलभ विधि का वर्णन करते हैं।

Abstract

न्यूरॉन्स के अध: पतन सामान्य विकास के दौरान होता है और चोट, तनाव और रोग के जवाब में होता है। न्यूरॉनल डिएनेजेरेशन के सेल्युलर हॉलमार्क, इंसानों और अकशेरुकीय रूप में असामान्य रूप से समान हैं जैसे आणविक तंत्र हैं जो इन प्रक्रियाओं को संचालित करते हैं। फल मक्खी, ड्रोसोफिला मेलेनोगास्टर , न्यूरोडेनेरेटिव रोगों की सेलुलर जटिलताओं का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली अभी तक सरल आनुवंशिक मॉडल जीव प्रदान करता है। वास्तव में, लगभग 70% रोग जुड़े मानव जीनों में एक ड्रोसोफिला होलोलोल है और बहुत अधिक उपकरण और assays का वर्णन मानव न्यूरोडिनेरेटिव रोगों का अध्ययन करने के लिए मक्खियों का वर्णन किया गया है। अधिक विशेष रूप से न्यूरोस्कुल्युलर जंक्शन (एनएमजे) में ड्रोसोफिला ने न्यूरोमस्क्युलर रोगों का अध्ययन करने के लिए एक प्रभावी प्रणाली साबित कर दी है क्योंकि न्यूरॉन और मांसपेशियों के बीच संरचनात्मक कनेक्शन का विश्लेषण करने की क्षमता है। यहां, हम ड्रोसोफिला में एक विवो मोटर न्यूरॉन की चोट परख की रिपोर्ट करते हैं, जो24 घंटे के द्वारा एनएमजे पर प्रजननशील रूप से neurodegeneration लाती है। इस पद्धति का उपयोग करते हुए हमने सेलुलर घटनाओं के एक अस्थायी अनुक्रम का वर्णन किया है जिसके परिणामस्वरूप मोटर न्यूरॉन अध: पतन हुआ। चोट की विधि में विविध अनुप्रयोग हैं और न्यूरॉइडजनन के लिए आवश्यक विशिष्ट जीनों की पहचान करने और न्यूरोनल चोट के प्रति transcriptional प्रतिक्रिया काटना करने के लिए इसका उपयोग भी किया गया है।

Introduction

सामान्य विकास के दौरान न्यूरॉनल डिएनेरेशन होता है और यह प्राकृतिक बुढ़ापे की प्रक्रिया, चोट, तनाव या बीमारी के कारण हो सकता है। ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर , आम फल मक्खी, न्यूरॉन्स के अध: पतन को चलाने वाले आणविक तंत्रों में उल्लेखनीय समानता के कारण neurodegeneration का अध्ययन करने के लिए एक सरल और शक्तिशाली मॉडल जीव प्रदान करता है। ये समानताएं इस तथ्य से उजागर की जाती हैं कि लगभग 70% रोग-जुड़े मानव जीन में ड्रोसोफिला होमोल है। 1 इसके अतिरिक्त, ड्रोसोफिला में मानव neurodegenerative रोगों का अध्ययन करने के लिए कई assays और तकनीकी उपकरण विकसित और उपयोग किया गया है। 2 , 3 ड्रोसोफिला के भीतर, न्यूरोमस्कुलर जंक्शन (एनएमजे) सेलुलर और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों दोनों के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है और न्यूरोमस्क्युलर रोग के अध्ययन के लिए दृश्यमान एनयूरो-स्नायु कनेक्शन 2 इस अध्ययन में, हम ड्रोसोफिला लार्वा में vivo neuron injury inay का वर्णन करते हैं जो कमानी तंत्रिकाओं की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने वाली चोट के लिए अनुमति देता है। सेलुलर घटनाओं के एक अस्थायी अनुक्रम में परिणामस्वरूप इस मोटोनेरोन चोट के परिणामस्वरूप एनएमजे 24 एच पोस्ट की चोट में neurodegeneration के परिणामस्वरूप। Neurodegeneration में जिसके परिणामस्वरूप neutodegeneration चोट में reproducibly चोट करने की क्षमता में degenerative प्रक्रिया के लिए आवश्यक विशिष्ट जीन, न्यूरॉनल चोट के लिए transcriptional प्रतिक्रिया का विच्छेदन, और सुरक्षात्मक संकेत cascades के विश्लेषण के रूप में विविध अनुप्रयोगों है। 4 , 5 , 6 इस विधि का उपयोग जीवित जानवरों में न्यूरॉनल डिएनेरेशन और पुनर्जनन के अध्ययन के लिए माइक्रोफ्लुइडिक्स के साथ संयोजन में भी किया गया है। 7

हम मोटर न्यूरॉन डिगेनेर की जांच करने के लिए एक निर्धारित मात्रात्मक परख का उपयोग करते हैंयांत्रिक चोट के बाद ड्रोसोफिला एनएमजे में आयन। इस परख इस तथ्य पर आधारित है कि प्रीसीनैप्टिक झिल्ली और प्रोटीन के नुकसान में पोस्ट-एन्टेप्टिक मांसपेशियों झिल्ली परतों की विशेषता subsynaptic reticulum (एसएसआर) के disassembly से पहले होता है। 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 यह परख "अन्तर्ग्रथनी पैरों के निशान" की मात्रा का ठहराव करने के लिए अनुमति देता है जहां पूर्व-अन्तर्ग्रथनी न्यूरॉन आसन्न पोस्टिनेप्टिक पेशी से कनेक्शन खो गया है। Degenerative प्रक्रिया लार्वा विकास के दौरान प्रगतिशील होना दिखाया गया है 12 और बदला synapse विकास या अंकुरण के द्वारा के लिए जिम्मेदार नहीं किया जा सकता है। 8 , 9 , 10 , 11 , 12 विज्ञापनपूर्ववर्ती उत्परिवर्तन से यांत्रिक चोट का उपयोग करने का फायदा यह है कि यह एनएमजे पर न्यूरोडेगएनेरेशन तक अग्रणी सेल्यूलर घटनाओं के अस्थायी अनुक्रम के विच्छेदन की अनुमति देता है। 13

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. अभिकर्मकों और उपकरणों की तैयारी

  1. 1x विसर्जन बफर (70 एमएम NaCl, 5 एमएम केएलएल, 0.02 एमएम CaCl 2 , 20 मिमी एमजीसीएल 2 , 10 एमएम एनएचओओ 3 , 115 एमएम सुक्रोज, 5 मिमी तिहलोस, 5 मिमी एचईपीस, पीएच 7.2) तैयार करें।
  2. 1x फॉस्फेट-बफर्ड सलाईन (पीबीएस) तैयार करें
  3. 1x पीबीटी का उपयोग 1x पीबीएस के साथ 0.01% ट्राइटन एक्स -100 करें।
  4. फलों का रस एगर प्लेटें तैयार करें 14 संक्षेप में, 700 एमएल एच 2 ओ और आटोक्लेव में 30 ग्राम अगर मिश्रण करें। 10 मिलीलीटर इथेनॉल में 0.5 ग्राम मिथाइल पाराबेन भंग करें और 300 मिलीलीटर फलों के रस का ध्यान केंद्रित करें (अंगूर या सेब)। आटोक्लेवड अगर समाधान में ध्यान केंद्रित करें और 10 मिमी x 35 मिमी पेट्री डिश के लिड्स में डालें।
    नोट: ग्रेप एगर पावर प्रीमिक्स को भी विभिन्न कंपनियों से खरीदा जा सकता है ( सामग्रियों के टेबल्स देखें)
  5. आकार 5 संदंश प्राप्त करें जो कि एक यंत्रवत् लार्वा को चोट पहुंचाए।
  6. मानक ड्रोसोफिला सीओ 2 का उपयोग करें

2. ड्रोसोफिला लार्वा का चयन

  1. 25 डिग्री सेल्सियस पर सुसंस्कृत किया गया है भटकती तीसरे instar लार्वा युक्त ड्रोसोफिला की एक शीशी या बोतल लो
  2. दस अलग-अलग 2 या 3 इनस्टार लार्वा उपस्थिति के आधार पर चयन करें। तीसरा instar लार्वा की पहचान पूर्वकाल ब्रंच स्प्रैमल्स के रूप में की जा सकती है, जबकि दूसरा इन्स्टार लार्वा छोटा है और अधिक क्लब की तरह पूर्वकाल सर्पिल हैं।
    नोट: समय से लैरव्यू के चरणों को पहचाना जा सकता है। 25 डिग्री सेल्सियस पर, दूसरे इन्स्टार लार्वा में अंडे सेने के बाद लगभग 48 घंटे दिखाई देते हैं, और तीसरे इन्स्टार लार्वा मोल्ट लगभग 24 घंटे बाद में दिखाई देते हैं। अगर एनएमजे में न्यूरोडेगएनेरेशन की जांच करने में दिलचस्पी है, तो दूसरे इंस्टाल लार्वा को घायल होने की जरूरत है।

3. यांत्रिक चोट के लिए ड्रोसोफिला लार्वा तैयार करना

  1. संदंश या एक पेंटब्रश द्वारा व्यक्तिगत लार्वा को सावधानी से उठाएं, सावधान रहनाइसे किसी भी तरह से संपीड़ित करने के लिए नहीं।
  2. किसी भी खाद्य मलबे को हटाने के लिए और लार्वा गतिशीलता को कम करने के लिए सीधे 1 लीटर लार्वा को कांच के डिब्बे में रखें, जिसमें ठंड 1 एक्स पीबीएस या विच्छेदन बफर शामिल हैं।

4. यांत्रिक चोट और ड्रोसोफिला लार्वा का उपचार

  1. सीओ 2 एनेस्थेटीज़िंग तंत्र पर प्रत्येक व्यक्तिगत लार्वा को रखें।
  2. एक विदारक खुर्दबीन के तहत, छल्ली के माध्यम से कमानी नसों की कल्पना करने के लिए सावधानी से प्रत्येक लार्वा को अपने पृष्ठीय पक्ष पर रोल करें।
  3. स्थिति आकार 5 मुंह हुक पर शुरू होने वाले लार्वा की लंबाई के नीचे लगभग 1/2 से 2/3 तरीके से संदंश। एक बार स्थिति में, आकार 5 संदंश के साथ कंबल तंत्रिकाओं युक्त उदर छल्ली के लगभग 1/3 छिद्रित करें।
    1. यह सुनिश्चित करने के लिए कि लार्वा कमानी तंत्रिका घायल हो गए हैं, कमानी नसों को कुचलने के लिए पर्याप्त बल लागू होते हैं, लेकिन छल्ली को बरकरार छोड़ दें। बल की सही मात्रा निर्धारित करने के लिए, 10 लार्वा को कुचलने और सुनिश्चित करें5 घंटे के बाद मृत्यु दर 50% से कम है
  4. चोट के बाद, ध्यान से लार्वा को फलों के रस की थाली में रख दें, जिसमें लगभग 0.5 ग्राम खमीर का पेस्ट होता है। प्रत्येक लार्वा को रखें ताकि इसके अन्तराल का अंत खमीर पेस्ट पर हो, क्योंकि बाधित गतिशीलता के बावजूद जारी रखा भोजन।
    नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए कि लार्वा कमानी नसों को घायल किया गया है, इससे पहले कि अगर थावर स्थानांतरण के बाद लार्वा की गति को बाधित किया जा सकता है। घायल लार्वा को प्रभावी रूप से चोट लगने की जगह के पीछे से लकवाग्रस्त किया जाता है, लेकिन फिर भी उनका मुंह हुक और फीड को स्थानांतरित कर सकता है। चोट के बाद पशुओं की उच्च मृत्यु दर सामान्य है इसलिए प्रयोग के लिए जरूरी है कि 20-50% अधिक जानवरों को घायल करना सबसे अच्छा है।
  5. एक खाली 100 x 15 मिमी पेट्री डिश के तल में खमीर पेस्ट और 10 घायल लार्वा युक्त प्लेस प्लेटें रखें। इस पेट्री प्लेट को कवर करें, अब एक नम पेपर तौलिया के साथ एक अगर प्लेट पर घायल लार्वा युक्त है, यह सुनिश्चित करना कि कागज तौलिया लार्वा या अगर प्लेटों को नहीं छूती है। इसे रखेंपेट्री डिश आरटी पर एक बड़े हवादार कंटेनर में
  6. विशिष्ट अवधि (6, 12, या 24 घंटे) बाद की चोट के बाद विच्छेदन के लिए लार्वा को पुनः प्राप्त करें।
    नोट: axonal cytoskeleton पर चोट के तात्कालिक प्रभाव की जांच के लिए लार्वा को चोट के बाद सीधे विच्छेदित किया जा सकता है। अक्षीय परिवहन संबंधी दोषों की जांच करने के लिए, चोट के बाद लार्वा लगभग 6 घंटे विच्छेदित किया जा सकता है। चोट के बाद के बारे में 12 घंटे ubiquitinated प्रोटीन का निर्माण किया जा सकता है, और चोट के बाद 24 घंटे, एनएमजे में मोटर न्यूरॉन्स के अध: पतन देखा जा सकता है।

5. एनएमजे में न्यूरोड अपरनेरेशन का विश्लेषण

  1. पहले बताए अनुसार ड्रोसोफिला लार्वल एनएमजे काटना। 15 , 16 संक्षेप में, एक सिल्गर्ड प्लेट पर लार्वा को पिन करें, पृष्ठीय सतह पर काट लें, और पिंस के साथ पित्ती को विच्छेदन बफ़र की एक बूंद में शरीर की दीवार मांसलता का पर्दाफाश करने के लिए। लार्वा को या तो 4% पैराफॉर्मालाडीहाइड (पीएफए) या बुविन के समाधान में विरोधी के आधार पर ठीक करेंनिकायों न्यूरॉन्स और मांसपेशियों को देखने के लिए इस्तेमाल किया
    नोट: यदि फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग, जैसे कि ग्रीन फ्लूरोसेन्ट प्रोटीन (जीएफपी) को ब्यूनिन की लगानेवाला बहुत कठोर हो सकता है, तो पीएफए ​​निर्धारण का उपयोग किया जाना चाहिए।
  2. इम्यूनोफ्लोरेसेंस करें, जिसे पहले 11 , 13 , 16 का वर्णन किया गया है, साथ में साथ में प्रेज़ैनेप्टिक मोटर न्यूरॉन्स और आसन्न पोस्टसीनप्टिक (एसएसआर) पेशी परतों को चिह्नित किया गया है। फ्लोरोसेंट रूप से संयुग्मित घोड़े की हड्डी के पेरोक्साइड (एचआरपी) (1: 300) 17 के साथ प्रीसंनैप्टिक झिल्ली और एसिन्स का विज़ुअलाइज़ करें और एंटी-ब्रूपीपोलॉट (ब्रप) एंटीबॉडी (एनसी 82; 1: 100; डिवेलपमेंट स्टडीज हाइब्रिडोमा बैंक) का उपयोग करके सक्रिय क्षेत्र को दाग किया जा सकता है। इसके साथ ही एंटी-डीिक्स लार्ज (डीएलजी) एंटीबॉडी (1: 10,000) के साथ पोस्ट-सिनाप्टीक मांसपेशियों को लेबल करें। 18
  3. पूर्व में वर्णित एनएमजे में न्यूरॉइड जनरेशन को मापने के लिए एक स्थापित परख करें। 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 संक्षेप में, एक साथ पूर्व- और बाद-अन्तर्ग्रथनी डिब्बों दोनों के लिए व्यक्तिगत एनएमजे की कल्पना करना। पोस्ट-इनेप्टिक मार्करों के साथ लेबल किए गए कोई भी बोनस नहीं बल्कि प्रीसंनैप्टिक मार्कर न्यूरोडिगेनरेशन ( चित्रा 1 ) की साइटें दर्शाते हैं। प्रति एनएमजे प्रति बैटन की औसत संख्या और प्रति पशु एनएमजे की औसत संख्या मात्रा निर्धारित की जा सकती है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

यहां दी गई प्रक्रिया का उपयोग करके, हमने यह दर्शाया है कि यांत्रिक तंत्रिका संबंधी चोट से न्यूरोड-जेनरेटिव घटनाओं के अस्थायी विच्छेदन की अनुमति मिल सकती है। 14 , 18 घटनाओं का अनुक्रम पहले से वर्णित किया गया है और साइटोस्केलेटन के तत्काल बाधा के साथ शुरू होता है, इसके बाद अक्षय तस्करी संबंधी दोष, ubiquitinated प्रोटीन का एक संग्रह, और बाद में neurodegeneration 24 घंटे के बाद चोट। चोट से पहले, डब्ल्यू टी एनएमजे पूरे एनएमजे ( चित्रा 1 ए ) के दौरान पोस्ट-इनोनटेप्टिक मार्कर डीएलजी के लिए प्रीझोनैप्टिक सक्रिय ज़ोन मार्कर एआरपी को जोड़ते हैं। कमानी नसों की यांत्रिक चोट मध्यम से गंभीर न्यूरोडिजन पैदा कर सकती है जिसमें डीएलजी के साथ दाग वाले बंटोन में प्रीस्कैनाटेप्टिक सक्रिय क्षेत्र प्रोटीन ब्र्पी ( चित्रा 1 बी ) की कमी है। कोई भी बंटोन जिसे डीएलजी के साथ दाग किया गया है लेकिन इसमें ब्रप स्टेंसिंग का अभाव है, इसे "सिंक" माना जाता हैaptic पदचिह्न "और गिना जा सकता है और एक न्यूरोडीजेनेरेटिव घटना के रूप में मात्रा निर्धारित किया। जैसा कि पहले वर्णित दोनों आवृत्ति और न्यूरोडीजेनेरेटिव फेनोटाइप की गंभीरता मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। 11

आकृति 1
चित्रा 1: मैकेनिकल न्यूरोनल इजा ने एनएमजे की मांसपेशियों में neuroodegeneration को लाया 6/7। ( ए ) असंबद्ध एनएमजे पूरे एनएमजे भर में पोस्ट-एननटैप्टिक मार्कर, डीएलजी (लाल) के साथ पूर्व-अन्तर्ग्रथनी सक्रिय क्षेत्र मार्कर, ब्रप (हरा) दिखाते हैं। ( बी ) न्यूरॉनल मैकेनिकल इजाज ने ग्रुप की हानि के साथ डीएलजी स्टेन्ड बॉटन (लाल) द्वारा संकेतित neurodegeneration को लाया है। एरोहेड न्यूरोडेगनेरेशन की व्यक्तिगत साइटें दर्शाते हैं। स्केल बार = 10 माइक्रोन का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंइस चित्र।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

पहले वर्णित न्यूरॉनल मैकेनिकल इजाज और ड्रोसोफिला लार्वा के कंबल तंत्रिकाओं में चोट / तनाव पैदा करने के लिए इसका इस्तेमाल किया जा सकता है। 4 , 5 , 6 , 14 इस प्रयोगात्मक तकनीक को पहले न्यूरोड अपरेशन के लिए घटनाओं के अस्थायी अनुक्रम काटना करने के साथ-साथ मोटर न्यूरॉन कोशिका निकायों के पोस्ट चोट में ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तन की जांच करने के लिए कार्यरत किया गया है। 5 , 14 इसके अलावा, ड्रोसोफिला लार्वा में axonal degeneration और regeneration का अध्ययन करने और अध्ययन करने के लिए, इस तकनीक को माइक्रॉफ्लुइडिक्स चिप्स के साथ संयोजन में वर्णित किया गया है। 7 इस तकनीक की सीमाओं में चोट लगने के दौरान छल्ली की छिद्रण के कारण लार्वा की मृत्यु शामिल है। हालांकि, बड़ी संख्या में लार्वा को एक शराबी में कुचल दिया जा सकता हैएक उच्च लार्वाल मौत दर से उबरने के लिए समय की अवधि एक संशोधन है कि हम को शामिल किया है 2 इनस्टार या जल्दी 3 इनस्टार लार्वा, जो NMJ है, जो 24 घंटे के बाद चोट लगने पर मोटर न्यूरॉन विकृति कल्पना करने के लिए महत्वपूर्ण है की चोट है।

यहां, हम यह दर्शाते हैं कि एनएमजे में मोटर न्यूरॉन अपरेशन के अध्ययन के लिए तंत्रिका संबंधी यांत्रिक चोट का उपयोग किया जा सकता है। हम न्यूरॉइड जनरेशन की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक स्थापित विधि का उपयोग करते हैं जो इस तथ्य का फायदा उठाते हैं कि न्यूरॉन्स और उनके संबंधित प्रोटीन आसन्न मांसपेशियों की तुलना में अधिक तेज़ हो जाते हैं। 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 न्यूरॉइडजन का निरीक्षण करने और मात्रा निर्धारित करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि एनएमजे को पूर्व और पोस्ट-एनाप्टीक मार्कर दोनों के लिए एक साथ दाग किया जाएगा। यहाँ, हम घसक्रिय ज़ोन मार्कर brp और पोस्टअन्तर्ग्रथिक मार्कर डीएलजी के उपयोग को दर्शाते हैं, हालांकि, अन्य पूर्व और पोस्ट-एन्टीपेटिक मार्कर उपलब्ध हैं जो एनएमजे में न्यूरोडेगियरेशन के अध्ययन के लिए उपयोग किए जा सकते हैं। इसके अतिरिक्त, किसी के चयन के फ्लोरोसेंटली-टैग किए गए अणुओं को न्यूरोडिगेनरेटिव प्रक्रिया के दौरान अपने प्रभावों का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है। माइक्रोफ़्लुइडिक्स 7 जैसे अक्षीय चोट के बाद अध: पतन के अध्ययन के लिए और अधिक जटिल तरीके हैं, हालांकि हमारी विधि में कई फायदे हैं: 1) यह बहुत सस्ती है, 2) सबसे अधिक ड्रोसोफिला प्रयोगशालाओं में पहले से ही आवश्यक उपकरण हैं, और 3) ऊतक ठीक है पारम्परिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग न्यूरोडेनरेटिव घटनाओं के बाद पोस्ट चोट के लिए किया जा सकता है।

हम यह सोचते हैं कि चोट के बाद neurodegeneration से संबंधित सेलुलर और आणविक तंत्र की एक विस्तृत श्रृंखला की जांच के लिए इस प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया जा सकता है। विशेष रूप से, इन तरीकों का इस्तेमाल बर्ताव करने के लिए किया जा सकता हैन्यूरॉनल चोट और मोटर न्यूरॉन अध: पतन और पुनर्जनन से पहले और बाद में किसी भी फ्लोरोसेंटली-टैग प्रोटीन का एविऑर।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

उपयोगी सुझावों के लिए हम क्विन्निपियाक विश्वविद्यालय में केलर और मैगी लैब्स के सभी सदस्यों का धन्यवाद करना चाहते हैं। विशेष रूप से, हम केरर लैब के भीतर इस चोट परख के विकास के लिए बैरोन एल। लिंकन II को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम एलसी केलर को दिए गए क्विन्निपियाक यूनिवर्सिटी कॉलेज ऑफ आर्ट्स एंड साइंस ग्रांट इन इन एडिरे को भी धन्यवाद देना चाहेंगे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Micro-dissecting scissors Fine Science Tools 15000-08
Dumont #3 Forceps Fine Science Tools 11231-30 Some people prefer size 3, while others prefer size 5
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-30 Some people prefer size 3, while others prefer size 5
CO2 Air Tank Tech Air UN 1013 Various tank sizes can be purchased
CO2 Anesthetizing Apparatus Genesee Scientific 59-114
Stainless-steel pins, size 0.1 Fine Science Tools 26002-10
SylGard 184 Silicone Elastomer, Base and Curing Agent Dow Corning 3097358-1004 To pour dissecting plates
Bouin's Solution Sigma HT 10132-1L Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA
4% Paraformaldehyde (PFA) in Phosphate-Buffered Saline (PBS) Affymetrix FLY-8030-20 Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA
Dissecting Stereo MIcroscope AmScope SM-1BZ
Light Source AmScope HL150-AY-220V
anti- nc82 antibody Developmental Studies Hybridoma Bank nc82-s
anti-discs large antibody Developmental Studies Hybridoma Bank AF3
Alexa Fluor anti-horseradish peroxidase Jackson Immunoresearch 123-545-021; 123-585-021; 123-605-021 One can you Alexa Fluor® 488, 594 or 647
Flystuff Grape Juice Agar Premix Genesee Scientific 47-102
Microscope slides Genesee Scientific 29-101
Glass Coverslips Fisher Scientific 12-545-87
Thermo Scientific Nalgene Utility Box Fisher Scientific 03-484C Used to create humid chamber for larval recovery

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bier, E. Drosophilia, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat. Rev. Genet. 6 (1), 9-23 (2005).
  2. Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).
  3. McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
  4. Shin, J. E., Cho, Y., Beirowski, B., Milbrandt, J., Cavalli, V., DiAntonio, A. Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration. Neuron. 74 (6), 1015-1022 (2012).
  5. Xiong, X., Wang, X., Ewanek, R., Bhat, P., Diantonio, A., Collins, C. A. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J Cell Biol. 191 (1), 211-223 (2010).
  6. Xiong, X., Collins, C. A. A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade. J Neurosci. 32 (2), 610-615 (2012).
  7. Mishra, B., Ghannad-Rezaie, M., Li, J., Wang, X., Hao, Y., Ye, B., Chronis, N., Collins, C. A. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. J Vis Exp. (84), e50998 (2014).
  8. Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactic is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).
  9. Eaton, B. A., Davis, G. W. LIM Kinase1 controls synaptic stability downstream of the type II BMP receptor. Neuron. 47 (5), 695-708 (2005).
  10. Pielage, J., Fetter, R. D., Davis, G. W. Presynaptic spectrin is essential for synapse stabilization. Curr Biol. 15 (10), 918-928 (2005).
  11. Pielage, J., Cheng, L., Fetter, R. D., Carlton, P. M., Sedat, J. W., Davis, G. W. A presynaptic giant Ankyrin stabilizes the NMJ through regulation or presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion. Neuron. 58 (2), 195-209 (2008).
  12. Massaro, C. M., Pielage, J., Davis, G. W. Molecular mechanisms that enhance synapse stability despite persistent disruption of the spectrin/ankryin/microtubule cytoskeleton. J Cell Biol. 187 (1), 101-117 (2009).
  13. Lincoln, B. L. 2nd, Alabsi, S. H., Frendo, N., Freund, R., Keller, L. C. Drosophila neuronal injury follows a temporal sequence of cellular events leading to degeneration at the neuromuscular junction. J Exp Neurosci. 9, Suppl 2. 1-9 (2015).
  14. Drosophila apple juice-agar plates. Cold Spring Harb Protoc. , (2011).
  15. Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ immunohistochemistry. J Vis Exp. (25), (2009).
  16. Smith, R., Taylor, J. P. Dissection and imaging of active zones in the Drosophila neuromuscular junction. J Vis Exp. (50), (2011).
  17. Jan, L., Jan, Y. Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. 79 (8), 2700-2704 (1982).
  18. Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X., Budnik, V. The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure. Neuron. 13 (4), 823-835 (1994).

Tags

तंत्रिका जीव विज्ञान अंक 125, यांत्रिक चोट अक्षतंतु तीसरा instar लार्वा कमानी नसों मोटर न्यूरॉन्स न्यूरोमस्क्युलर जंक्शन (एनएमजे)
अध्ययन करने के लिए एक साधारण न्यूरॉनल मैकेनिकल इंजेक्शन पद्धति<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; मोटर न्यूरॉन अध: पतन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Danella, E. B., Keller, L. C. A… More

Danella, E. B., Keller, L. C. A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration. J. Vis. Exp. (125), e56128, doi:10.3791/56128 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter