Summary
Hier beschreiben wir eine einfache und weit zugängliche Methode, um die Segmentnerven in Drosophila- Larven zu verletzen, um die Neurodegeneration von motorischen Neuronen an der neuromuskulären Kreuzung (NMJ) der dritten Larven der Larven zu visualisieren und zu quantifizieren.
Abstract
Die Degeneration von Neuronen tritt während der normalen Entwicklung und als Reaktion auf Verletzungen, Stress und Krankheit auf. Die zellulären Merkmale der neuronalen Degeneration sind bei Menschen und Invertebraten bemerkenswert ähnlich wie die molekularen Mechanismen, die diese Prozesse antreiben. Die Fruchtfliege, Drosophila melanogaster , bietet einen mächtigen, aber einfachen genetischen Modellorganismus, um die zellulären Komplexität neurodegenerativer Erkrankungen zu untersuchen. Tatsächlich haben etwa 70% der krankheitsassoziierten menschlichen Gene ein Drosophila- Homolog und eine Fülle von Werkzeugen und Assays wurden beschrieben, indem sie fliegt, um menschliche neurodegenerative Erkrankungen zu untersuchen. Genauer gesagt hat sich der neuromuskuläre Knotenpunkt (NMJ) in Drosophila als wirksames System erwiesen, um neuromuskuläre Erkrankungen zu untersuchen, da die Fähigkeit besteht, die strukturellen Verbindungen zwischen dem Neuron und dem Muskel zu analysieren. Hier berichten wir über einen in vivo motorischen Neuronenverletzungsassay in DrosophilaReproduzierbar neurodegeneration am NMJ um 24 h induziert. Mit dieser Methodik haben wir eine zeitliche Abfolge von zellulären Ereignissen beschrieben, die zu einer motorischen Neuronendegeneration führen. Die Verletzungsmethode hat vielfältige Anwendungen und wurde auch verwendet, um spezifische Gene zu identifizieren, die für die Neurodegeneration erforderlich sind, und die Transkriptionsreaktionen auf neuronale Verletzungen zu zerlegen.
Introduction
Neuronale Degeneration tritt während der normalen Entwicklung auf und kann durch den natürlichen Alterungsprozess, die Verletzung, den Stress oder die Krankheitszustände verursacht werden. Drosophila melanogaster , die gemeinsame Fruchtfliege, bietet einen einfachen und leistungsfähigen Modellorganismus, um die Neurodegeneration aufgrund der bemerkenswerten Ähnlichkeiten in den molekularen Mechanismen zu untersuchen, die die Degeneration von Neuronen antreiben. Diese Ähnlichkeiten werden durch die Tatsache hervorgehoben, dass etwa 70% der krankheitsassoziierten menschlichen Gene ein Drosophila- Homolog haben. 1 Darüber hinaus wurden zahlreiche Assays und technologische Werkzeuge zur Untersuchung menschlicher neurodegenerativer Erkrankungen in Drosophila entwickelt und genutzt. 2 , 3 Innerhalb von Drosophila erlaubt der neuromuskuläre Knotenpunkt (NMJ) die Analyse sowohl der zellulären als auch der elektrophysiologischen Eigenschaften und hat sich als ein wichtiges System erwiesen, um die neuromuskuläre Erkrankung aufgrund des sichtbaren n zu untersuchenEuron-Muskel-Verbindungen. 2 In dieser Studie beschreiben wir einen in vivo Neuronenverletzungsassay in Drosophila- Larven, der die reproduzierbare Verletzung der segmentalen Nerven ermöglicht. Diese Motoneuron-Verletzung führt zu einer zeitlichen Abfolge von zellulären Ereignissen, die zu einer Neurodegeneration bei der NMJ 24 h nach der Verletzung führen. Die Fähigkeit zur reproduzierbaren Verletzung von Motoneuronen, die zu einer Neurodegeneration führen, hat vielfältige Anwendungen, wie die Identifizierung spezifischer Gene, die für den degenerativen Prozess erforderlich sind, die Sezierung von Transkriptionsreaktionen auf neuronale Verletzungen und die Analyse von schützenden Signalkaskaden. 4 , 5 , 6 Diese Methode wurde auch in Kombination mit Mikrofluidik verwendet, um neuronale Degeneration und Regeneration bei lebenden Tieren zu untersuchen. 7
Wir verwenden einen etablierten quantitativen Assay, um den motorischen Neuron degenerat zu untersuchenIon bei der Drosophila NMJ nach mechanischer Verletzung. Dieser Assay basiert auf der Tatsache, dass der Verlust der präsynaptischen Membran und der Proteine der Zerlegung des subsynaptischen Retikulums (SSR) vorangeht, das durch die postsynaptischen Muskelmembranfalten charakterisiert ist. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 Dieser Assay erlaubt die Quantifizierung von "synaptischen Abdrücken", bei denen das vor-synaptische Neuron die Verbindung zum benachbarten postsynaptischen Muskel verloren hat. Der degenerative Prozeß hat sich in der Larvenentwicklung 12 als fortschrittlich erwiesen und kann nicht durch eine veränderte Synapsenentwicklung oder Keimung erklärt werden. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 Die AnzeigeVorteil der mechanischen Verletzung über bereits vorhandene Mutationen ist, dass es die Sezierung der zeitlichen Abfolge von zellulären Ereignissen ermöglicht, die zur Neurodegeneration am NMJ führen. 13
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vorbereitung von Reagenzien und Geräten
- 1 × Dissektionspuffer (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,02 mM CaCl 2 , 20 mM MgCl 2 , 10 mM NaHCO 3 , 115 mM Saccharose, 5 mM Trehalose, 5 mM HEPES, pH 7,2) herstellen.
- 40 Phosphat-gepufferte Saline (PBS) zubereiten.
- Vorbereitung von 1x PBT mit 1x PBS mit 0,01% Triton X-100.
- Fruchtsaft-Agarplatten vorbereiten. 14 Mischen Sie 30 g Agar in 700 ml H 2 O und Autoklav. 0,5 g Methylparaben in 10 ml Ethanol auflösen und 300 ml Fruchtsaftkonzentrat (Traube oder Apfel) zugeben. Konzentrieren Sie das Konzentrat in eine autoklavierte Agarlösung und gießen Sie in die Deckel von 10 mm x 35 mm Petrischalen.
HINWEIS: Traube Agar Power Premix kann auch von verschiedenen Firmen gekauft werden (siehe Tabls of Materials ). - Erhalten Sie Größe 5 Pinzette, die es erlaubt, die Larven mechanisch zu verletzen.
- Verwenden Sie Standard Drosophila CO 2
2. Auswahl von Drosophila- Larven
- Nehmen Sie eine Durchstechflasche oder eine Flasche Drosophila mit wandernden dritten Larven, die bei 25 ° C kultiviert wurden.
- Wählen Sie zehn Einzel 2. oder 3. Larvenstadium anhand von Aussehen. Dritte Larven der Larven können durch das Auftreten von anterioren verzweigten Spiralen identifiziert werden, während die Larven der zweiten Larven kleiner sind und mehr klumpenartige vordere Spiralen haben.
HINWEIS: Larval Stufen können auch durch Timing identifiziert werden. Bei 25 ° C erscheinen die Larven der zweiten Larven nach dem Schraffur etwa 48 h und die Larven der dritten Larven etwa 24 h später. Wenn es darum geht, die Neurodegeneration am NMJ zu untersuchen, müssen die Larven der zweiten Larven verletzt werden.
3. Vorbereitung von Drosophila- Larven auf mechanische Verletzungen
- Sorgfältig einzelne Larven mit Pinzette oder einem Pinsel abwischen, vorsichtig seinUm es nicht zu komprimieren.
- Direkte Platzierung von zehn Larven in Glasschale mit kaltem 1X PBS oder Dissektionspuffer, um jeglichen Nahrungsmittelschutt zu entfernen und die Larvenmotilität zu verzögern.
4. Mechanische Verletzung und Behandlung von Drosophila- Larven
- Legen Sie jede einzelne Larve auf eine CO 2 -Anästhesierungsvorrichtung.
- Unter einem Seziermikroskop rollen Sie jede Larve sorgfältig auf ihre dorsale Seite, um die Segmentnerven durch die Nagelhaut zu visualisieren.
- Positionsgröße 5 Pinzette ca. 1/2 bis 2/3 Weg nach unten die Länge der Larve beginnend an den Mundhaken. Sobald sie positioniert sind, kneifen Sie etwa 1/3 der ventralen Nagelhaut, die die Segmentnerven mit der Größe 5 Pinzette enthält.
- Um sicherzustellen, dass die Larvensegmentnerven verletzt werden, wenden Sie sich genügend Kraft an, um die Segmentnerven zu zermalmen, aber die Nagelhaut intakt zu lassen. Um die richtige Menge an Kraft zu bestimmen, 10 Larven zerkleinern und sicherstellenDie Sterberate nach 5 h liegt bei 50%.
- Nach der Verletzung sorgfältig Larven auf eine Fruchtsaft-Agarplatte mit etwa 0,5 g Hefepaste übertragen. Lege jede Larve so, dass ihr vorderes Ende auf der Hefepaste ist, für die fortgesetzte Fütterung trotz gestörter Motilität.
HINWEIS: Um sicherzustellen, dass die Larvensegmentnerven verletzt worden sind, kann nach der Übertragung auf die Agarplatte eine gestörte Larvenmotilität beobachtet werden. Verletzte Larven sind wirksam hinter dem Ort der Verletzung gelähmt, können aber trotzdem ihre Mundhaken bewegen und füttern. Eine hohe Sterberate von Tieren nach Verletzung ist üblich, so ist es am besten, 20-50% mehr Tiere zu verletzen, als es für ein Experiment notwendig ist. - Legen Sie Agarplatten mit Hefepaste und 10 verletzten Larven in den Boden einer leeren 100 x 15 mm Petrischale. Bedecken Sie diese Petrischale, die jetzt die verletzten Larven auf einer Agarplatte mit einem feuchten Papiertuch enthält, um sicherzustellen, dass das Papiertuch die Larven oder die Agarplatten nicht berührt. PlatzierenPetrischale in einen größeren luftdichten Behälter, bei RT.
- Holmer Larven zur Sezierung nach bestimmten Zeiträumen (6, 12 oder 24 h) nach der Verletzung abrufen.
HINWEIS: Um sofortige Auswirkungen der Verletzung auf das axonale Zytoskelett zu untersuchen, können Larven direkt nach Verletzung seziert werden. Um axonale Transportfehler zu untersuchen, können Larven etwa 6 h nach Verletzung seziert werden. Etwa 12 h nach Verletzung kann ein Aufbau von ubiquitinierten Proteinen beobachtet werden, und 24 h nach Verletzung kann eine Degeneration von motorischen Neuronen am NMJ beobachtet werden.
5. Analyse der Neurodegeneration am NMJ
- Dissektil- Drosophila- Larven-NMJ, wie zuvor beschrieben. 15 , 16 Strömen Sie die Larven auf eine Sylgard-Platte, schneiden Sie entlang der dorsalen Oberfläche und füllen Sie mit Stiften in einem Tropfen Dissektionspuffer, um die Körperwandmuskulatur freizulegen. Fixieren Sie Larven in entweder 4% Paraformaldehyd (PFA) oder Bouins Lösung je nach AntiKörper verwendet, um Neuronen und Muskeln zu visualisieren.
HINWEIS: Die PFA-Fixierung sollte verwendet werden, wenn fluoreszierende Protein-Tags wie Green Fluorescent Protein (GFP) sichtbar gemacht werden sollen, da Bouins Fixativ zu hart sein kann. - Führen Sie die Immunfluoreszenz durch, die zuvor beschrieben wurde 11 , 13 , 16 , um gleichzeitig präsynaptische Motorneuronen und benachbarte postsynaptische (SSR) Muskelfalten zu markieren. Visualisierung von präsynaptischen Membranen und Axonen mit fluoreszenz konjugierter Meerrettichperoxidase (HRP) (1: 300) 17 und aktive Zonen können mit einem Anti-Bruchpilot (Brp) Antikörper (nc82; 1: 100; Developmental Studies Hybridoma Bank) gefärbt werden. Gleichzeitig markieren Sie post-synaptische Muskeln mit einem Anti-Dics Large (Dlg) Antikörper (1: 10.000). 18
- Führen Sie einen etablierten Test zur Quantifizierung der Neurodegeneration am NMJ wie oben beschrieben durch. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 In kurzer Zeit visualisieren wir gleichzeitig einzelne NMJs sowohl für vor- als auch post-synaptische Kompartimente. Alle mit postsynaptischen Markern markierten Boutons, aber nicht präsynaptische Marker weisen auf Neurodegeneration hin ( Abb. 1 ). Die durchschnittliche Anzahl der Boutons pro NMJ sowie die durchschnittliche Anzahl der NMJs pro Tier kann quantifiziert werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mit dem hier vorgestellten Verfahren haben wir gezeigt, dass mechanische neuronale Verletzungen eine zeitliche Dissektion von neurodegenerativen Ereignissen ermöglichen. 14 , 18 Die Reihenfolge der Ereignisse wurde zuvor charakterisiert und beginnt mit einer sofortigen Unterbrechung des Zytoskeletts, gefolgt von axonalen Menschenhandlungsdefekten, einer Anhäufung von ubiquitinierten Proteinen und anschließender Neurodegeneration 24 h nach der Verletzung. Vor der Verletzung zeigen WT NMJs den präsynaptischen aktiven Zonenmarker Brp in Apposition zum postsynaptischen Marker Dlg während des gesamten NMJ ( Abbildung 1A ). Die mechanische Verletzung der segmentalen Nerven kann eine mäßige bis schwere Neurodegeneration hervorrufen, bei der mit Dlg gefärbte Boutons nun das präsynaptische aktive Zonenprotein Brp fehlen ( Abbildung 1B ). Jeder Bouton, der mit Dlg gefärbt ist aber fehlt Brp Färbung gilt als "synaptic Fußabdruck“und kann gezählt und als neurodegenerative Ereignis quantifiziert werden. Sowohl die Häufigkeit und Schwere der neurodegenerativen Phänotyp quantifiziert werden können , wie zuvor beschrieben. 11
Abbildung 1: Mechanische neuronale Verletzung induziert Neurodegeneration am NMJ des Muskels 6/7. ( A ) Unverletzte NMJs zeigen den prä-synaptischen aktiven Zonenmarker, Brp (grün) in Apposition mit dem postsynaptischen Marker, Dlg (rot) während des gesamten NMJ. ( B ) Neuronale mechanische Verletzung induziert die Neurodegeneration, die durch Dlg-gefärbte Boutons (rot) mit dem Verlust von Brp angezeigt wird. Pfeilspitzen zeigen einzelne Orte der Neurodegeneration an. Maßstab = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehendiese Figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die hier beschriebene neuronale mechanische Verletzung kann hier verwendet werden, um Verletzungen / Stress in den Segmentnerven der Drosophila- Larven zu induzieren. 4 , 5 , 6 , 14 Diese experimentelle Technik wurde bisher verwendet, um die zeitliche Abfolge von Ereignissen, die zur Neurodegeneration führen, zu sezieren, sowie die Transkriptionsänderungen in den motorischen Neuronzellkörpern nach Verletzungen zu untersuchen. 5 , 14 Darüber hinaus wurde diese Technik in Verbindung mit Mikrofluidik-Chips beschrieben, um die axonale Degeneration und Regeneration in Drosophila- Larven zu beobachten und zu untersuchen. 7 Einschränkungen dieser Technik sind der Tod der Larven aufgrund der Punktierung der Nagelhaut während der Einführung der Verletzung. Allerdings kann eine große Anzahl von Larven in einem sh zerkleinert werdenOrt Zeit, um eine hohe Larval-Sterberate zu überwinden. Eine Änderung , die wir aufgenommen haben , ist die Verletzung des 2. Larvenstadium oder frühen 3. Larvenstadium, die kritisch zu Motoneurondegeneration an der NMJ zu visualisieren, die 24 h nach der Verletzung auftritt.
Hier zeigen wir, dass neuronale mechanische Verletzungen genutzt werden können, um die motorische Neurondegeneration am NMJ zu untersuchen. Wir verwenden eine etablierte Methode zur Quantifizierung der Neurodegeneration, die von der Tatsache profitiert, dass Neuronen und ihre assoziierten Proteine schneller degenerieren als der angrenzende Muskel. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 Um die Neurodegeneration zu beobachten und zu quantifizieren, ist es entscheidend, dass der NMJ gleichzeitig sowohl für prä- als auch postsynaptische Marker gefärbt wird. Hier haben wir dUnterstreicht die Verwendung des aktiven Zonenmarkers Brp und des postsynaptischen Markers Dlg, aber es gibt eine Fülle von anderen prä- und postsynaptischen Markern, die zur Untersuchung der Neurodegeneration am NMJ verwendet werden können. Zusätzlich können fluoreszenzmarkierte Moleküle der eigenen Wahl verwendet werden, um ihre Wirkungen während des neurodegenerativen Prozesses zu untersuchen. Es gibt kompliziertere Methoden, um Degeneration nach axonaler Verletzung zu untersuchen, wie zB Mikrofluidik 7 , aber unsere Methode hat mehrere Vorteile: 1) es ist sehr preiswert, 2) Die meisten Drosophila- Labore haben bereits die notwendige Ausrüstung und 3) das Gewebe ist so fixiert Konventionelle Fluoreszenzmikroskopie kann verwendet werden, um neurodegenerative Ereignisse nach Verletzung zu quantifizieren.
Wir stellen vor, dass dieses Protokoll angepasst werden kann, um eine breite Palette von zellulären und molekularen Mechanismen im Zusammenhang mit Neurodegeneration nach Verletzung zu untersuchen. Insbesondere könnten diese Methoden verwendet werden, um das Verhalten zu untersuchenAvior von jeglichem fluoreszierend markierten Protein vor und nach neuronaler Verletzung und motorischer Neurondegeneration und Regeneration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir danken allen Mitgliedern der Keller und Magie Labs an der Quinnipiac University für hilfreiche Anregungen. Insbesondere möchten wir uns bei Barron L. Lincoln II für die Entwicklung dieses Verletzungsassays im Keller Lab bedanken. Wir danken auch der Quinipiac University College of Arts und Science Grant-In-Aid, die an LC Keller verliehen wurden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro-dissecting scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| CO2 Air Tank | Tech Air | UN 1013 | Various tank sizes can be purchased |
| CO2 Anesthetizing Apparatus | Genesee Scientific | 59-114 | |
| Stainless-steel pins, size 0.1 | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| SylGard 184 Silicone Elastomer, Base and Curing Agent | Dow Corning | 3097358-1004 | To pour dissecting plates |
| Bouin's Solution | Sigma | HT 10132-1L | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) in Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Affymetrix | FLY-8030-20 | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| Dissecting Stereo MIcroscope | AmScope | SM-1BZ | |
| Light Source | AmScope | HL150-AY-220V | |
| anti- nc82 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82-s | |
| anti-discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | AF3 | |
| Alexa Fluor anti-horseradish peroxidase | Jackson Immunoresearch | 123-545-021; 123-585-021; 123-605-021 | One can you Alexa Fluor® 488, 594 or 647 |
| Flystuff Grape Juice Agar Premix | Genesee Scientific | 47-102 | |
| Microscope slides | Genesee Scientific | 29-101 | |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-87 | |
| Thermo Scientific Nalgene Utility Box | Fisher Scientific | 03-484C | Used to create humid chamber for larval recovery |
References
- Bier, E. Drosophilia, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat. Rev. Genet. 6 (1), 9-23 (2005).
- Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).
- McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
- Shin, J. E., Cho, Y., Beirowski, B., Milbrandt, J., Cavalli, V., DiAntonio, A. Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration. Neuron. 74 (6), 1015-1022 (2012).
- Xiong, X., Wang, X., Ewanek, R., Bhat, P., Diantonio, A., Collins, C. A. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J Cell Biol. 191 (1), 211-223 (2010).
- Xiong, X., Collins, C. A. A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade. J Neurosci. 32 (2), 610-615 (2012).
- Mishra, B., Ghannad-Rezaie, M., Li, J., Wang, X., Hao, Y., Ye, B., Chronis, N., Collins, C. A. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. J Vis Exp. (84), e50998 (2014).
- Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactic is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).
- Eaton, B. A., Davis, G. W. LIM Kinase1 controls synaptic stability downstream of the type II BMP receptor. Neuron. 47 (5), 695-708 (2005).
- Pielage, J., Fetter, R. D., Davis, G. W. Presynaptic spectrin is essential for synapse stabilization. Curr Biol. 15 (10), 918-928 (2005).
- Pielage, J., Cheng, L., Fetter, R. D., Carlton, P. M., Sedat, J. W., Davis, G. W. A presynaptic giant Ankyrin stabilizes the NMJ through regulation or presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion. Neuron. 58 (2), 195-209 (2008).
- Massaro, C. M., Pielage, J., Davis, G. W. Molecular mechanisms that enhance synapse stability despite persistent disruption of the spectrin/ankryin/microtubule cytoskeleton. J Cell Biol. 187 (1), 101-117 (2009).
- Lincoln, B. L. 2nd, Alabsi, S. H., Frendo, N., Freund, R., Keller, L. C. Drosophila neuronal injury follows a temporal sequence of cellular events leading to degeneration at the neuromuscular junction. J Exp Neurosci. 9, Suppl 2. 1-9 (2015).
- Drosophila apple juice-agar plates. Cold Spring Harb Protoc. , (2011).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ immunohistochemistry. J Vis Exp. (25), (2009).
- Smith, R., Taylor, J. P. Dissection and imaging of active zones in the Drosophila neuromuscular junction. J Vis Exp. (50), (2011).
- Jan, L., Jan, Y. Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. 79 (8), 2700-2704 (1982).
- Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X., Budnik, V. The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure. Neuron. 13 (4), 823-835 (1994).
