Summary
Здесь мы описываем простой и широко доступный метод травмирования сегментных нервов у личинок дрозофилы для визуализации и количественной оценки нейродегенерации моторных нейронов в нервно-мышечном соединении (NMJ) личинок третьего возраста.
Abstract
Дегенерация нейронов происходит при нормальном развитии и в ответ на травмы, стресс и болезнь. Клеточные признаки нейрональной дегенерации удивительно похожи у людей и беспозвоночных, а также молекулярные механизмы, которые приводят к этим процессам. Фруктовая мушка Drosophila melanogaster предоставляет мощный, но простой генетический модель организма для изучения клеточных проблем нейродегенеративных заболеваний. Фактически, около 70% связанных с болезнью генов человека имеют гомологи Drosophila, а множество инструментов и анализов описано с использованием мух для изучения нейродегенеративных заболеваний человека. Более конкретно, нейромышечный переход (NMJ) у Drosophila оказался эффективной системой для изучения нейромышечных заболеваний из-за способности анализировать структурные связи между нейроном и мышцей. Здесь мы сообщаем об анализе травматического повреждения нейронов in vivo у Drosophila , которыйВоспроизводимо индуцирует нейродегенерацию в NMJ через 24 часа. Используя эту методологию, мы описали временную последовательность клеточных событий, приводящих к дегенерации моторных нейронов. Метод травматизма имеет разнообразные применения и также используется для идентификации конкретных генов, необходимых для нейродегенерации, и для анализа транскрипционных ответов на повреждение нейронов.
Introduction
Дегенерация нейронов происходит при нормальном развитии и может быть вызвана естественным процессом старения, травмой, стрессом или болезненными состояниями. Drosophila melanogaster , общая плодовая муха, обеспечивает простой и мощный модельный организм для изучения нейродегенерации из-за замечательных сходств в молекулярных механизмах, которые приводят к дегенерации нейронов. Эти сходства подчеркиваются тем фактом, что около 70% связанных с заболеванием человеческих генов имеют гомологи Drosophila . 1 Кроме того, были разработаны и использованы в Drosophila многочисленные анализы и технологические инструменты для изучения нейродегенеративных заболеваний человека. 2 , 3 Внутри дрозофилы нейромышечный переход (NMJ) позволяет анализировать как клеточные, так и электрофизиологические свойства и оказался важной системой для изучения нервно-мышечного заболевания из-за видимого nЭврон-мышечные связи. 2 В этом исследовании мы описываем анализ травм in vivo нейронов у личинок дрозофилы, который позволяет воспроизводить повреждение сегментных нервов. Эта травма мотонейронов приводит к временной последовательности клеточных событий, приводящей к нейродегенерации при 38-часовой травме NMJ. Способность воспроизводственно травмировать мотонейроны, приводящие к нейродегенерации, имеет разнообразные применения, такие как идентификация специфических генов, необходимых для дегенеративного процесса, раскрытие транскрипционных ответов на повреждение нейронов и анализ защитных сигнальных каскадов. 4 , 5 , 6 Этот метод также использовался в сочетании с микрофлюидикой для изучения дегенерации нейронов и регенерации у живых животных. 7
Мы используем установленный количественный анализ для изучения дегенерации моторных нейроновИон на Drosophila NMJ после механического повреждения. Этот анализ основан на том факте, что потеря пресинаптической мембраны и белков предшествует разборке сусинаптического ретикулума (SSR), характеризующегося складками постсинаптической мышечной мембраны. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 Этот анализ позволяет количественно определить «синаптические следы», где пресинаптический нейрон потерял связь с соседней постсинаптической мышцей. Показано, что дегенеративный процесс является прогрессирующим в течение развития личинок 12 и не может быть объяснен измененным развитием синапса или прорастанием. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 ОбъявлениеПреимущество использования механического повреждения перед существующими мутациями заключается в том, что он позволяет рассекать временную последовательность клеточных событий, ведущих к нейродегенерации в NMJ. 13
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка реагентов и оборудования
- Приготовить 1x Диссекторный буфер (70 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 0,02 мМ CaCl 2 , 20 мМ MgCl 2 , 10 мМ NaHCO 3 , 115 мМ сахарозы, 5 мМ трегалозы, 5 мМ HEPES, pH 7,2).
- Подготовьте 1 х фосфат-буферный солевой раствор (PBS).
- Подготовьте 1x PBT, используя 1x PBS с 0,01% Triton X-100.
- Приготовьте чашки с агаром из фруктового сока. 14 Вкратце, смешать 30 г агара в 700 мл H 2 O и автоклаве. Растворить 0,5 г метилпарабена в 10 мл этанола и добавить раствор в 300 мл концентрата фруктового сока (виноград или яблоко). Смешайте концентрат в автоклавированном растворе агара и вылейте в крышки чашки Петри размером 10 мм х 35 мм.
ПРИМЕЧАНИЕ. Премикс мощности виноградного агара также можно приобрести у различных компаний (см. Таблицы материалов ). - Получите щипцы размером 5, которые позволяют механически ранить личинок.
- Использовать стандартный Drosophila CO 2
2. Выбор личинок дрозофилы
- Возьмите флакон или бутылку дрозофилы с блуждающими личинками третьего возраста, которые были культивированы при 25 ° C.
- Выберите десять индивидуальных личинок 2- го или 3- го возраста на основе внешнего вида. Личинки третьего возраста могут быть идентифицированы по появлению передних разветвленных дыхальцев, тогда как личинки второго возраста меньше и имеют больше клубничных передних дыхальцев.
ПРИМЕЧАНИЕ. Стадии личинок также можно определить по времени. При 25 ° C личинки второго возраста появляются примерно через 48 часов после вылупления, а личинки третьего возраста линяют примерно через 24 часа. Если вы заинтересованы в изучении нейродегенерации в NMJ, личинки второго возраста должны быть ранены.
3. Подготовка личинок дрозофилы к механическим повреждениям
- Тщательно подбирайте отдельных личинок щипцами или кистью, осторожноНе сжимать его в любом случае.
- Непосредственно поместите десять личинок в стеклянную посуду, содержащую холодный 1X PBS или буфер для вскрытия, чтобы удалить остатки пищи и замедлить подвижность личинок.
4. Механическая травма и лечение личинок дрозофилы
- Поместите каждую личинку на аппарат для обезболивания CO 2 .
- Под рассекающим микроскопом осторожно сверните каждую личинку на их спинную сторону, чтобы визуализировать сегментные нервы через кутикулу.
- Размер положения 5 зажимает примерно от 1/2 до 2/3 пути по длине личинки, начиная с крючков для рта. После размещения зажмите приблизительно 1/3 вентральной кутикулы, содержащей сегментные нервы с щипцами размера 5.
- Чтобы обеспечить повреждение личиночных сегментных нервов, нанесите достаточную силу, чтобы раздавить сегментные нервы, но оставите кутикулу неповрежденной. Чтобы определить правильное количество силы, раздавить 10 личинок и обеспечитьСмертность через 5 ч составляет менее 50%.
- После травмы тщательно переносите личинки на пластинку с агаром из фруктового сока, содержащую приблизительно 0,5 г дрожжевой пасты. Поместите каждую личинку, чтобы ее передний конец находился на дрожжевой пасте, для продолжения кормления, несмотря на разрушенную подвижность.
ПРИМЕЧАНИЕ. Чтобы гарантировать, что личиночные сегментные нервы были повреждены, нарушенная подвижность личинок может наблюдаться после переноса на пластину агара. Поврежденная личинка эффективно парализована позади места повреждения, но все еще может перемещать крючки для рта и кормить. Высокая смертность животных после травмы распространена, поэтому лучше всего нанести на 20-50% больше животных, чем это необходимо для эксперимента. - Поместите агаровые пластины, содержащие дрожжевую пасту, и 10 раненых личинок на дно пустой чашки Петри размером 100 х 15 мм. Накройте эту чашку Петри, теперь содержащую раненых личинок на агаровой тарелке с влажным бумажным полотенцем, гарантируя, что бумажное полотенце не касается личинок или пластин агара. Поместите этоПетри в большой воздушный контейнер, при комнатной температуре.
- Извлекайте личинок для вскрытия после определенных периодов (6, 12 или 24 ч) после травмы.
ПРИМЕЧАНИЕ. Для изучения непосредственного воздействия травмы на аксоновский цитоскелет личинки могут быть разрезаны непосредственно после травмы. Чтобы исследовать дефекты переноса аксонов, личинки могут быть расчленены примерно через 6 часов после травмы. Примерно через 12 ч после травмы можно наблюдать нарастание убиквитиновых белков и через 24 часа после травмы можно наблюдать дегенерацию моторных нейронов в NMJ.
5. Анализ нейродегенерации в NMJ
- Расчтите личиночный лишай Drosophila NMJ, как описано ранее. 15 , 16 Вкратце, личинки личинок на плите Сильгара, разрезанные по дорзальной поверхности, и филе с булавками в капле буфера для рассечения, чтобы обнажить мускулатуру стенки тела. Зафиксируйте личинки либо в 4% параформальдегиде (PFA), либо в растворе Буина в зависимости от анти-Тела, используемые для визуализации нейронов и мышц.
ПРИМЕЧАНИЕ. Фиксацию PFA следует использовать, если флуоресцентные белковые метки, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP), должны быть визуализированы, поскольку фиксация Буина может быть слишком резкой. - Выполните иммунофлюоресценцию, которая была описана ранее 11 , 13 , 16 , чтобы одновременно отметить пресинаптические двигательные нейроны и смежные постсинаптические (SSR) мышечные складки. Визуализируйте пресинаптические мембраны и аксоны с флуоресцентно конъюгированной пероксидазой хрена (HRP) (1: 300) 17, а активные зоны можно окрашивать с использованием антитела против Брухпилота (Brp) (nc82, 1: 100, Hybridoma Bank Developmental Studies). Одновременно маркируют постсинаптические мышцы с анти-Dics Large (Dlg) антителом (1: 10000). 18
- Выполните установленный анализ для количественной оценки нейродегенерации в NMJ, как описано ранее. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 Вкратце, одновременно визуализируйте отдельные NMJ как для пред-, так и для постсинаптических компартментов. Любые бутоны, помеченные постсинаптическими маркерами, но не пресинаптические маркеры, указывают на сайты нейродегенерации ( рисунок 1 ). Среднее количество бутонов на NMJ, а также среднее количество NMJ на животное можно количественно определить.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя представленную здесь процедуру, мы продемонстрировали, что механическое повреждение нейронов позволяет временно рассекать нейродегенеративные события. 14 , 18 Последовательность событий была ранее охарактеризована и начинается с немедленного нарушения цитоскелета, с последующими дефектами торможения аксоном, накоплением убиквитированных белков и последующей нейродегенерацией через 24 часа после травмы. До травмы WT NMJ показывают маркер предварительной активности пресинаптической зоны Brp в приложении к постсинаптическому маркеру Dlg по всему NMJ ( рис. 1A ). Механическое повреждение сегментных нервов может индуцировать умеренную и тяжелую нейродегенерацию, в которой у бутонов, окрашенных Dlg, в настоящее время нет пресинаптической активной зоны белка Brp ( рисунок 1B ). Любой бутон, окрашенный Dlg, но не имеющий окрашивания Brp, считается «синaptic след»и может быть подсчитан и количественно , как нейродегенеративный событие. И частота и серьезность нейродегенеративный фенотипа могут быть определены количественно , как описано ранее. 11
Рисунок 1: Механическая нейрональная травма индуцирует нейродегенерацию в NMJ мышцы 6/7. ( A ) Uninjured NMJ показывают маркер предварительной синаптической активной зоны, Brp (зеленый) в приложении к постсинаптическому маркеру, Dlg (красный) по всему NMJ. ( B ) Механическая травма нейронов индуцирует нейродегенерацию, указанную Dlg окрашенными бутонами (красный) с потерей Brp. Стрелки указывают отдельные участки нейродегенерации. Шкала шкалы = 10 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версиюэта фигура.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Обнаруженная здесь нейронная механическая травма может быть использована для индуцирования травмы / стресса в сегментных нервах личинок дрозофилы . 4 , 5 , 6 , 14 Этот экспериментальный метод был использован ранее для анализа временной последовательности событий, приводящих к нейродегенерации, а также для изучения транскрипционных изменений в телах клеток нейронов после повреждения. 5 , 14 Кроме того, этот метод был описан в сочетании с микрофлюидическими микросхемами для наблюдения и изучения дегенерации и регенерации аксонов у личинок дрозофилы . 7 Ограничения этого метода включают гибель личинок из-за прокола кутикулы во время введения травмы. Однако большое количество личинок может быть раздроблено в shВ течение периода времени, чтобы преодолеть высокий уровень смертности личинок. Модификацией, которую мы включили, является повреждение личинок 2- го возраста или раннего 3- го возраста, что имеет решающее значение для визуализации дегенерации моторных нейронов в NMJ, что происходит через 24 часа после травмы.
Здесь мы демонстрируем, что нейронная механическая травма может быть использована для изучения дегенерации моторных нейронов в NMJ. Мы используем установленный метод количественной оценки нейродегенерации, который использует тот факт, что нейроны и связанные с ними белки вырождаются быстрее, чем смежные мышцы. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 Чтобы наблюдать и количественно оценивать нейродегенерацию, важно, чтобы NMJ был одновременно окрашен как для пред-, так и для постсинаптических маркеров. Здесь мы dЭмулировать использование маркера активной зоны Brp и постсинаптического маркера Dlg, однако имеется множество других пред- и постсинаптических маркеров, которые могут быть использованы для изучения нейродегенерации в NMJ. Кроме того, флуоресцентно меченные молекулы по своему выбору могут быть использованы для изучения их эффектов во время нейродегенеративного процесса. Существуют более сложные методы изучения дегенерации после травмы аксонов, такие как микрофлюиды 7 , однако наш метод имеет несколько преимуществ: 1) он очень недорогой, 2) большинство лабораторий Drosophila уже имеют необходимое оборудование, 3) ткань фиксируется так Обычная флуоресцентная микроскопия может использоваться для количественной оценки повреждений нейродегенеративных событий после травмы.
Мы предполагаем, что этот протокол может быть адаптирован для изучения широкого спектра клеточных и молекулярных механизмов, связанных с нейродегенерацией после травмы. В частности, эти методы могут быть использованы для изучения поведенияAvior любого флуоресцентно-меченного белка до и после повреждения нейронов и дегенерации и регенерации моторных нейронов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить всех членов Лаборатории Келлера и Маги в Университете Куиннипак за полезные предложения. В частности, мы хотели бы поблагодарить Barron L. Lincoln II за разработку этого теста на рану в лаборатории Keller. Мы также хотели бы поблагодарить Куиннипакский университетский колледж искусств и науки «Грант-ин-Эйд», присужденный LC Keller.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro-dissecting scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| CO2 Air Tank | Tech Air | UN 1013 | Various tank sizes can be purchased |
| CO2 Anesthetizing Apparatus | Genesee Scientific | 59-114 | |
| Stainless-steel pins, size 0.1 | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| SylGard 184 Silicone Elastomer, Base and Curing Agent | Dow Corning | 3097358-1004 | To pour dissecting plates |
| Bouin's Solution | Sigma | HT 10132-1L | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) in Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Affymetrix | FLY-8030-20 | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| Dissecting Stereo MIcroscope | AmScope | SM-1BZ | |
| Light Source | AmScope | HL150-AY-220V | |
| anti- nc82 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82-s | |
| anti-discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | AF3 | |
| Alexa Fluor anti-horseradish peroxidase | Jackson Immunoresearch | 123-545-021; 123-585-021; 123-605-021 | One can you Alexa Fluor® 488, 594 or 647 |
| Flystuff Grape Juice Agar Premix | Genesee Scientific | 47-102 | |
| Microscope slides | Genesee Scientific | 29-101 | |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-87 | |
| Thermo Scientific Nalgene Utility Box | Fisher Scientific | 03-484C | Used to create humid chamber for larval recovery |
References
- Bier, E. Drosophilia, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat. Rev. Genet. 6 (1), 9-23 (2005).
- Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).
- McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
- Shin, J. E., Cho, Y., Beirowski, B., Milbrandt, J., Cavalli, V., DiAntonio, A. Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration. Neuron. 74 (6), 1015-1022 (2012).
- Xiong, X., Wang, X., Ewanek, R., Bhat, P., Diantonio, A., Collins, C. A. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J Cell Biol. 191 (1), 211-223 (2010).
- Xiong, X., Collins, C. A. A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade. J Neurosci. 32 (2), 610-615 (2012).
- Mishra, B., Ghannad-Rezaie, M., Li, J., Wang, X., Hao, Y., Ye, B., Chronis, N., Collins, C. A. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. J Vis Exp. (84), e50998 (2014).
- Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactic is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).
- Eaton, B. A., Davis, G. W. LIM Kinase1 controls synaptic stability downstream of the type II BMP receptor. Neuron. 47 (5), 695-708 (2005).
- Pielage, J., Fetter, R. D., Davis, G. W. Presynaptic spectrin is essential for synapse stabilization. Curr Biol. 15 (10), 918-928 (2005).
- Pielage, J., Cheng, L., Fetter, R. D., Carlton, P. M., Sedat, J. W., Davis, G. W. A presynaptic giant Ankyrin stabilizes the NMJ through regulation or presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion. Neuron. 58 (2), 195-209 (2008).
- Massaro, C. M., Pielage, J., Davis, G. W. Molecular mechanisms that enhance synapse stability despite persistent disruption of the spectrin/ankryin/microtubule cytoskeleton. J Cell Biol. 187 (1), 101-117 (2009).
- Lincoln, B. L. 2nd, Alabsi, S. H., Frendo, N., Freund, R., Keller, L. C. Drosophila neuronal injury follows a temporal sequence of cellular events leading to degeneration at the neuromuscular junction. J Exp Neurosci. 9, Suppl 2. 1-9 (2015).
- Drosophila apple juice-agar plates. Cold Spring Harb Protoc. , (2011).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ immunohistochemistry. J Vis Exp. (25), (2009).
- Smith, R., Taylor, J. P. Dissection and imaging of active zones in the Drosophila neuromuscular junction. J Vis Exp. (50), (2011).
- Jan, L., Jan, Y. Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. 79 (8), 2700-2704 (1982).
- Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X., Budnik, V. The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure. Neuron. 13 (4), 823-835 (1994).
