Summary
Das Gesamtziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, wie man Geruchsstoffe mit geringer Flüchtigkeit für die Single-Sensillum-Aufzeichnung von Drosophila- olfaktorischen Rezeptor-Neuronen, die auf langkettige cutikuläre Pheromone reagieren, präsentieren kann.
Abstract
Insekten verlassen sich auf ihren Geruchssinn, um eine breite Palette von Verhaltensweisen zu führen, die für ihr Überleben kritisch sind, wie z. B. Nahrungssuchende, Raubtiervermeidung, Eiablage und Paarung. Unzählige Chemikalien unterschiedlicher Volatilitäten wurden als natürliche Geruchsstoffe identifiziert, die Insekten-Olfaktor-Rezeptor-Neuronen (ORNs) aktivieren. Allerdings wurde das Studium der olfaktorischen Reaktionen auf niedervolatile Geruchsstoffe durch eine Unfähigkeit behindert, solche Reize mit herkömmlichen Geruchsabgabemethoden effektiv zu präsentieren. Hier beschreiben wir ein Verfahren, das die wirksame Darstellung von Geringheitsröhrchen mit geringer Volatilität für in vivo Single-Sensillum Recording (SSR) ermöglicht. Durch Minimierung 1 den Abstandes zwischen der Geruchsquelle und dem Zielgewebe, ermöglicht diese Methode zur Anwendung von biologisch ausgeprägten aber bisher unzugänglichen Riechstoffe, einschließlich Palmitoleinsäure, eine stimulierende Pheromon mit einer nachgewiesenen Wirkung auf ORNs in Balz und Paarungsverhalten beteiligt.Unsere Prozedur bietet somit eine neue Avenue, um eine Vielzahl von niedervolatilen Geruchsstoffen für das Studium der Insekten-Olfusion und Pheromon-Kommunikation zu untersuchen.
Introduction
Drosophila ORNs reagieren auf eine Vielzahl von Geruchsstoffen mit weitreichenden Kohlenstoffkettenlängen und einer Vielzahl von funktionellen Gruppen, einschließlich Estern, Alkoholen, Ketonen, Lactonen, Aldehyden, Terpenen, organischen Säuren, Aminen, Schwefelverbindungen, Heterocyclen und Aromaten 2 , 3 Geruchsstoffe, die in ihren physikalisch-chemischen Merkmalen variieren, können deutlich unterschiedliche Volatilitäten aufweisen, die durch den Dampfdruck der Verbindung gekennzeichnet sind. Bemerkenswerterweise unterscheiden sich biologisch relevante Geruchsstoffe für Drosophila melanogaster in ihrer Flüchtigkeit stark. Zum Beispiel reagieren Ir92a ORNs auf Ammoniak 4 , das sehr flüchtig ist, mit einem Dampfdruck von 6,432 mmHg bei 20 ° C. Im Gegensatz dazu reagieren Or67d ORNs auf ein männliches Pheromon, cis- Vccccylacetat ( c VA) 5 , 6 , dessen Dampfdruck 43 mmHg bei 20 ° C beträgt.
Ove_content "> Das Studium der olfaktorischen Reaktion auf Geruchsstoffe mit geringer Flüchtigkeit ist bei herkömmlichen Geruchsabgabemethoden besonders anspruchsvoll, bei denen die Geruchsstoffe über einen Trägerluftstrom über einen relativ langen Abstand ( dh mehrere Zentimeter) zugeführt werden, so dass die berichteten Geruchsreaktionen vorliegen Zu einem gegebenen geringe Volatilitätsgeruch kann je nach Ausgestaltung des Geruchsabgabesystems stark variieren. Beispielsweise reicht die berichtete Reaktion von Or67d ORNs auf eine hohe Dosis von c VA von ~ 40 7 -> 200 Spikes / s 6 Darüber hinaus ist die ineffektive Abgabe von c VA mit konventionellen Verabreichungsmethoden wahrscheinlich auf falsch-negative Ergebnisse zurückzuführen, was zu der Interpretation führt, dass c VA allein nicht ausreicht, um Or67d ORNs 8 zu aktivieren. Diese Interpretation wurde später von einer anderen Studie mit einem Nahbereichs-Geruchslieferungsverfahren 9. Es ist daher imperaUm ein robustes Geruchsabgabesystem für die effektive Darstellung von Geruchsstoffen mit geringer Volatilität zu entwickeln.Vor kurzem haben wir mehrere langkettige cutikuläre Fettsäuren als Liganden für Or47b ORNs identifiziert. Sie sind im Typ 4 Antennal Trichoid Sensillum (at4) untergebracht. Unter den langkettigen Fettsäure-Geruchsstoffen fanden wir, dass Palmitoleinsäure als aphrodisiakales Pheromon wirkt, das die männliche Balz durch die Aktivierung von Or47b ORNs 1 fördert. Jedoch wurde in einer anderen Studie, die ein herkömmliches Geruchsverabreichungsverfahren verwendete, Methyllaurat gezeigt, um Reaktionen von Or47b-ORNs hervorzurufen, während Palmitoleinsäure keine Antwort hervorrief, wenn sie aus dem gleichen Abstand 10 präsentiert wurde . Im Vergleich zu c VA sind langkettige Fettsäuren noch weniger flüchtig, mit Dampfdrücken von weniger als 0,001 mmHg bei 25 ° C 11 . Die inhärent geringe Flüchtigkeit von langkettigen Fettsäure-Geruchsstoffen, die eine effiziente Darstellung der Antenne ausschließtKonventionelle Geruchsabgabesysteme, wahrscheinlich die falsch-negativen Ergebnisse 10 . Diese Inkonsistenz hebt die Unzulänglichkeit konventioneller Geruchsabgabesysteme bei der Präsentation von Geringmachter-Geruchsstoffen hervor. Es wurde zuvor gezeigt, dass die effektive Abgabe von Fliegen-Cuticular-Gerüchen eine enge Nähe zwischen der Geruchsquelle und dem Zielgewebe 6 erfordert. Um also die Wirkungen von biologisch aktiven Pheromonen vollständig zu charakterisieren, während man den Abstand, von dem sie wahrscheinlich von Fruchtfliegen in der Natur 12 , 13 angetroffen werden, imitiert, haben wir vereinbart, dass der minimalen Abstand in unserem Verfahren eine hohe Priorität eingeräumt werden muss.
Unsere Methode hat weitere Vorteile, einschließlich der Kompatibilität mit Standard-Elektrophysiologie Rigs und Techniken. Vorhandene Rig-Setups erfordern eine minimale Modifikation, um dieses Protokoll aufzunehmen, und die meisten SSR-Schritte erfordern nur geringfügige Anpassungen. DiesMacht unsere Technik für Forscher, die in SSR erfahren sind, leicht zugänglich. Darüber hinaus ermöglicht unsere Technik die Präsentation von geringen Volatilitätsgerüchen mit scharfem Einsetzen und Offset, Korrelation der Stimulusabgabe mit neuronaler Reaktion. Schließlich erleichtert das Hardware-Layout einen schnellen Austausch zwischen Duftkartuschen und beschleunigt die Datenerfassung über einen gewünschten Dosierungsbereich.
Wir beginnen mit der Überprüfung der Vorbereitung von Referenz- und Aufzeichnungselektroden, Adult Hemolymph-Like (AHL) -Lösung, Odorant-Patronen und dem entsprechenden Olfaktometer. Wir diskutieren dann die Vorbereitung der Palmitoleinsäure-Geruchslösungen, gefolgt von der Vorbereitung der Fliege zur Aufzeichnung. Wir betrachten die Kriterien für die Auswahl eines Trichoid-Sensillums, um die Positionierung der Odoranzpatrone aufzuzeichnen und genauer zu untersuchen, bevor repräsentative Daten, die mit dieser Methode gewonnen wurden, präsentiert werden. Schließlich schließen wir durch die Erforschung nützlicher Anwendungen dieser techniqUe, einige begegnete Probleme und ihre Lösungen.
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Protocol
1. Vorbereitung der Hardware für at4 Aufnahme
- Zur Herstellung von Elektroden mit Aluminosilikatglas-Kapillaren (OD 1,0 mm, ID 0.64 mm) ein Pipetten-Puller-Instrument verwenden. Stumpfen Sie die Spitze der Referenzelektrode leicht mit einem Paar feiner Pinzette, um das Einsetzen in den Clypeus der Fliege zu erleichtern ( dh eine abgerundete Platte an der Vorderseite des Fliegenkopfes, über den Mundstücken).
HINWEIS: In dieser Studie wurden 7 Tage alte WT-Männer (Berlin) verwendet. Verwenden Sie die AHL-Salzlösung 14 als Elektrolyt für beide Elektroden. - 1 l AHL durch Mischen von 900 ml destilliertem Wasser mit 6,312 g NaCl, 0,373 g KCl, 0,337 g NaHCO 3 , 0,1120 g NaH 2 PO 4 , 1,892 g Trehalose ּ 2 H 2 O, 3,4423 g Saccharose, 1,192 g HEPES und 8,2 ml 1 M MgCl 2 . Mit destilliertem Wasser das Gesamtvolumen auf 1 L bringen. Den pH-Wert mit 1 N NaOH auf 7,4 bringen und die Lösung mit a. SterilisierenVakuum-angetriebenes Filtersystem. Zur Langzeitlagerung die AHL-Aliquote bei 4 ° C aufbewahren.
HINWEIS: Konsequente Lieferungen von Palmitoleinsäure sind abhängig von der Gleichmäßigkeit der Patronen. Es ist entscheidend, dass jede Patrone reproduzierbar zusammengebaut wird. - Mit einer Rasierklinge 0,9 cm von der Spitze einer 200 μl Pipettenspitze entfernen, um den ersten Patronenabschnitt zu erzeugen, der 4,1 cm misst; Beziehen sich auf die in Abbildung 1A angegebenen Abmessungen. Benutzen Sie eine weitere 200 μl Pipettenspitze und entfernen Sie 1,7 cm und 1,5 cm von der Spitze und der Basis, um den zweiten Patronenabschnitt zu erzeugen, der 1,8 cm misst ( Abbildung 1A ). Verwenden Sie ein Lineal, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.
- Verwenden Sie einen ⅛ "Lochpuncher, um Scheiben aus Filterpapier zu schneiden.
- Verwenden Sie eine Pinzette, um eine Filterpapierscheibe an der Spitze des zweiten Patronenabschnitts zu platzieren. Visuell bestätigen, dass es eine Öffnung in der Patronenspitze gibt, durch die Luft hindurchtreten kann.
- Befestigen Sie die ersten und zweiten Patronenabschnitte wie in Abbildung 1A gezeigt . Winkeln Sie den zweiten Patronenabschnitt nach unten, um das quadratische Ziel auf die Präparation zu erleichtern ( Abbildung 1B ).
- Verbinden Sie die Patrone mit dem Geruchsabgaberohr, das auf einem Mikromanipulator montiert ist.
HINWEIS: Mit dieser Konstruktion kann die Patrone nach außen geschwenkt werden, um den Austausch zu erleichtern ( Abbildung 1C ). - Setzen Sie den konstanten befeuchteten Luftstrom auf 2 l / min in einem Massenregler und der Riechstofffluss auf 500 mL / min in einem anderen Massenkontroller.
- Verwenden Sie die Software (siehe Tabelle der Materialien ), programmieren Sie die Prozedur, um einen 500 ms Geruch puff zu verabreichen.
2. Vorbereitung von Palmitoleinsäure-Geruchslösungen zur Lieferung
HINWEIS: Or47b ORNs reagieren sowohl auf cis - als auch auf trans - Palmitoleinsäure. Da Palmitoleinsäure bei R instabil istT, die Lagerbestände werden bei -20 ° C gelagert und innerhalb eines Monats nach dem Öffnen verwendet. Ethanol ist das Lösungsmittel der Wahl für Palmitoleinsäure.
- Verwenden eines Vortex - Mischers gründlich 10 ul cis- zu mischen oder Palmitoleinsäure Aktien oder Verdünnungen mit 90 & mgr; l 100% Ethanol für zehnfache Reihenverdünnungen in 1,7 ml Mikroröhrchen trans-. Bereiten Sie frische Palmitoleinsäure-Verdünnungen täglich vor Versuchen und Gebrauch innerhalb eines Tages vor.
HINWEIS: Für Geruchsstoffe, die in Ethanol nicht löslich sind, wird eine Glasampulle zur Herstellung von Geruchsverdünnungen mit anderen organischen Lösemitteln empfohlen. - Unter Verwendung einer P10-Mikropipette werden in jeder entsprechenden Patrone 5 & mgr; l cis- Palmitoleinsäure-Lösungen der gewünschten Verdünnungen auf das Filterpapier gegeben.
HINWEIS: Die höchste Dosierung (10 -1 ) enthält 450 μg der Verbindung. Für trans- Palmitoleinsäurelösungen gelten stattdessen 4,5 μl, so dass die höchste Dosierung (10 -1 ) auch 450 μg t enthältEr zusammen. - Um das Lösungsmittel vollständig zu verdampfen, legen Sie die Palmitoleinsäurepatronen in einen Vakuumexsikkator für 1 h bei RT und 7,59 mmHg Druck.
HINWEIS: Die Patronen können bis zu 4 h bei RT verwendet werden.
3. Vorbereitung von Drosophila für den reinen Zugang zu den at4 Sensilla für In-vivo- elektrophysiologische Aufnahmen
ANMERKUNG: WT-Fliegen (Berlin) werden im Standard-Maismehl-Medium bei 25 ° C im 12:12 Hell-Dunkel-Zyklus aufgezogen. Nach der Eklosion werden die Fliegen durch Geschlecht in Gruppen von zehn getrennt, wobei sie bis 7 Jahre alt sind. Or47b ORNs in männlichen und weiblichen Fliegen reagieren auf Palmitoleinsäure. Zur Vereinfachung werden in der aktuellen Studie nur männliche Fliegen untersucht.
- Montieren Sie eine Fly-Prep-Folie: Auf einem Glasschieber legen Sie ein Glasdeckel (18 x 18 mm 2 ) auf eine kleine Menge von Modellier-Ton, bilden einen ~ 3 ° Winkel mit der Glasrutsche. Legen Sie doppelseitiges Klebeband auf die innere eDge des Deckglases und auf dem Bereich der Rutsche unmittelbar darunter. Ersetzen Sie mit frischem Klebeband für jeden Tag der Aufnahme ( Abbildung 2A ).
- Benutze einen Fliegenaspirator 15 , um die Fliege des Interesses in den Schlauch zu sammeln und dann eine 200-μl Pipettenspitze über das Ende des Schlauches zu platzieren. Gleichzeitig blättern Sie die Röhre nach vorne, während Sie Luft in die Röhre blasen, um die Fliege zum Ende der Pipettenspitze zu drücken. Verwenden Sie eine Rasierklinge, um direkt unter dem Körper der Fliege und 2 Köpfe Längen über der Fliege zu schneiden.
- Tamp den Boden der Pipettenspitze mit modellierendem Ton und drückt die Fliege nach oben, bis sowohl die Antennen als auch der Clypeus ausgesetzt sind ( Abbildung 2B ). Um zu vermeiden, die Fliege zu töten, füge nur genug Lehm hinzu, um die Antennen und die Arena zu entlarven, da dies verhindert, dass der Fliegenabdomen zerdrückt wird. Darüber hinaus fügen Sie Ton langsam und sanft, um jede plötzliche Verengung zu verhindern. Vergewissern Sie sich, dass die Fliege am Leben ist, indem Sie auf Antenne prüfenOder Rüsselbewegung.
- Verwenden Sie Pinzette, um die Pipettenspitze zu manövrieren, die die Fliege beherbergt. Orientieren Sie den Kopf so, dass der Clypeus dem Recht des Beobachters gegenüber steht. Stellen Sie die Vorbereitung entlang des Deckglases mit feiner Pinzette ein, bis die laterale Seite der Antenne an der geklebten Deckglasoberfläche anliegt ( Abbildung 2B ).
- Legen Sie eine Haltestange auf den Arista, um die Antenne auf dem doppelseitigen Klebeband zu befestigen, um eine Bewegung zu verhindern ( Abbildung 2B ).
HINWEIS: Die Haltestange wird aus einer Borosilikatglaskapillare mit einem Pipettenabzieher gezogen und mit modelliertem Ton in Position gehalten ( Abbildung 2A ). - Legen Sie die Vorbereitung auf die Bühne der Anlage ( Abbildung 2C ). Mit dem Mikroskop bestätigen Sie, dass die Trichoide entlang der distal-lateralen Kante des dritten Segments der Antenne sichtbar sind.
HINWEIS: Im Idealfall sollte die Sensilla vor dem Hintergrund klar silhouettiert werden, was sie vereinfacht Identifizierung und erleichtert die Aufnahme ( Abbildung 3 ). Bei dieser Vorbereitung ist die Mehrheit der zugänglichen Trichoid-Sensilla vom Typ "at4". - Halten Sie die Vorbereitung unter konstant befeuchtetem Luftstrom (2 l / min), die über ein separates Luftförderrohr aus einem Abstand von etwa 2 cm von der Vorbereitung ( Abbildung 4 ) geliefert wird, wie zuvor beschrieben, 2 , 15 .
4. Aufzeichnung von at4 Sensillum-Aktivität von Or47b-ORNs in den at4-Trichoiden in Reaktion auf Palmitoleinsäure
- Setzen Sie die Referenzelektrode in den Clypeus ein ( Abbildung 3A ). Um Gewebeschäden zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass die Elektrode direkt unter der Oberfläche eingesetzt wird, wo sie die Hämolymphe unter der Nagelhaut mit einer schnellen und sanften Bewegung berühren kann.
- Senken Sie die Aufzeichnungselektrode langsam ab, bis sie in die gleiche Draufsicht tritt wie das Ziel-Sensillum (= "Xfig"> Abbildung 3B). Aufnehmen unter einem Objektiv von 50X.
HINWEIS: Die zähe Trichoidkohle macht das Einsetzen der Aufzeichnungselektrode in die sensilläre Basis, deren breiterer Bereich ein größeres Ziel bietet, das die Wahrscheinlichkeit verringert, dass die Elektrode abgelenkt wird ( Abbildung 3B , Einfügung). - Bevor Sie Geruchsreize auf ein Sensillum anwenden, beachten Sie die folgenden Selektionskriterien. Jeder Trichoid, der diese Standards nicht erfüllt, sollte abgelehnt und stattdessen ein anderes Sensillum gewählt werden.
- Beachten Sie ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis (siehe Abbildung 3C für ein Beispiel).
- Beobachten Sie identifizierbare Spikes von at4A und at4C Neuronen ( Abbildung 3C ).
HINWEIS: Die Note der at4B-Spitze ist sehr ähnlich zu at4A 10 und kann nicht leicht ohne Geruchsstimulation identifiziert werden. - Beachten Sie, dass die basale Zündrate der at4A Neuronen istUm oder unter 20 Hz.
HINWEIS: Dieses Kriterium ist für at4A spezifisch, da die basale Brennrate für das Neuron höher ist als die der basiconischen ORNs 2 . Eine viel höhere Basalfeuerung zeigt an, dass die Neuronen während der Elektrodeneinfügung beschädigt worden sein könnten.
- Verbinden Sie die Patrone mit dem Riechentransportrohr. Beginnen Sie mit der Lösungsmittelkontrolle und dann den Geruchsstoffen von niedrigen zu hohen Konzentrationen. Benutzen Sie den Mikromanipulator, um die Patrone in Richtung Prep zu manövrieren, während Sie die Patrone quadratisch an den Kopf der Präp. Achten Sie darauf, dass die Patrone von wenigen Millimetern direkt direkt auf die Antenne ( Abbildung 4 ) gerichtet ist.
HINWEIS: Ziel ist es, das Öffnen der Patrone direkt an der Antenne auszurichten und in der Nähe des Zielgewebes zu positionieren. - Vergewissern Sie sich, dass die Duftstoffpatrone von der Aufzeichnungselektrode rechts von 1 - 2 mm und von der Fliege vorn getrennt istP um ca. 1 mm nach unten schieben.
HINWEIS: Bei der hier beschriebenen Einrichtung wird die Duftstoffpatrone eng von der Aufzeichnungselektrode, der Referenzelektrode und der Fliegenvorbereitungsschiene ( Abbildung 4 ) begrenzt.
HINWEIS: Achten Sie auf den Abstand zwischen der Patrone und den Aufzeichnungs- / Referenzelektroden. Ein Abstand von ca. 4 mm wird empfohlen 1 . Der unbeabsichtigte Kontakt kann das Signal beenden und die Spitze der Aufzeichnungselektrode brechen, das aktuelle Neuron beschädigen und weitere Aufnahmen komplizieren.
HINWEIS: Betrachten Sie den Abstand, der die Patrone trennt, und die Fly-Prep-Folie. Das Berühren des Deckglases kann auch die Aufzeichnungselektrode entfernen, um die Aufzeichnung zu stören. - Drücken Sie "Record" in der Datenerfassungssoftware, um die Aufnahme zu starten.
HINWEIS: Für jede 10-s-Aufzeichnung wird ein einziger 500 ms-Geruchsimpuls direkt an die Antenne geliefert, wie in Schritt 1.9 beschrieben. - Nach riechender Anwendung,Ziehen Sie die Patrone vorsichtig zurück, bevor Sie sie mit einer Patrone der nächsthöheren Konzentration ersetzen. Weiter bis der gesamte Dosierungsbereich erreicht ist.
HINWEIS: Es wird empfohlen, von jeder Fliege nur ein Or47b ORN zu erfassen, um eventuelle Auswirkungen der Anpassung zu vermeiden. - Spülen Sie die Aufzeichnungselektrode gründlich mit destilliertem Wasser ab, nachdem Sie die Aufzeichnung für den Tag abgeschlossen haben.
- Analysieren und zeichnen Sie die Daten mit handelsüblicher Offline-Analyse-Software.
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Representative Results
Unsere Technik wurde erfolgreich angewendet, um die relative Wirksamkeit der trans ( Abbildung 5A ) gegenüber cis ( Fig. 5B ) Isomeren der Palmitoleinsäure zu bestimmen. Unsere repräsentativen Daten zeigen, dass trans- Palmitoleinsäure ein effektiverer Ligand für Or47b-ORNs im Vergleich zur cis- Isoform ist ( Abbildung 5C ). Ein einzelnes Neuron wurde von jeder Fliege aufgezeichnet, mit zwölf Fliegen, die pro Dosiskurve aufgezeichnet wurden, für insgesamt 24 Fliegen. Die kollektiven Daten wurden aus drei unabhängigen Wiederholungen der Experimente erhalten, wobei jeweils 8 Fliegen aufgezeichnet wurden. Die Fehlerbalken repräsentieren die sem
Der Abstand zwischen der Öffnung der Geruchsverpackung und dem Kopf der Fliege hat einen signifikanten Einfluss auf das Ergebnis der Aufzeichnung. Um eine signifikante Antwort auf p zu lösenAlmitoleinsäure in Or47b ORNs, präsentierten wir den Geruchstoff in der Nähe, etwa 4 mm entfernt von der Antenne 1 ( Abbildung 6A ). Wenn Palmitoleinsäure weiter weg von der Antenne (~ 11 mm) dargestellt wird, konnten wir kaum eine signifikante Antwort von denselben Or47b-ORNs beobachten ( Abbildung 6B ). Diese Ergebnisse heben die Bedeutung der Nahbereichspräsentation von Palmitoleinsäure hervor ( Abbildung 6C -D ). Die Daten wurden aus Parallelversuchen von 6 männlichen Fliegen (Berlin, 7 d alt) gesammelt. Ein einziges Or47b ORN wurde aufgezeichnet / fliegen. Die Fehlerbalken repräsentieren die sem
Abbildung 1: Patronen- und Olfaktometer-Setup. ( A ) Vorbereitung von Geruchsverpackungen. Von links nach rechts: ein Standard 200-μLPipettenspitze, die ersten und zweiten Patronenabschnitte und eine fertige Duftstoffpatrone. ( B ) Die Patrone, die mit dem Olfaktometer verbunden ist, zeigt das Abwärts-Angeln des zweiten Abschnitts. ( C ) Olfaktometer-Setup, das das auf dem Mikromanipulator angebrachte Geruchsabgaberohr mit einer angeschlossenen Duftstoffkartusche darstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Drosophila- Vorbereitung. ( A ) Eine vollständige Vorbereitung, die die relativen Positionen der Fliege, des Deckglases und der Haltestange zeigt. ( B ) Nahansicht der Vorbereitung, zeigt die Positionierung der Fliege, ihre Antennenorientierung und ihre Clypeus. Die Haltestange wird über die Arista gelegt,Sicherung des dritten Antennensegments auf dem doppelseitigen Klebeband. ( C ) Rig-Setup Alle wichtigen Komponenten werden kommentiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Identifizierung der at4 Sensillum für SSR. ( A ) 4X-Ansicht der Vorbereitung, wobei die in den Clypeus eingefügte Referenzelektrode, die Haltestange auf dem Arista und die Aufzeichnungselektrode in der Nähe des dritten Antennensegments angeordnet sind. ( B ) 50X Ansicht der Elektrode, für die Einfügung in die at4 Trichoid balanciert. Inset: Darstellung der Position der Aufzeichnungselektrode. ( C ) Repräsentative SSR-Spuren von Baseline-Spike-Aktivität, die eine gute (obere) oder schlechte (untere) Signal-to-Nois zeigenE-Verhältnis. Ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis ermöglicht die zuverlässige Identifikation von at4A- und at4C-Spikes. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Platzierung der Patrone. ( A ) Die Duftstoffpatrone richtet sich quer an der Spitze der Fliege aus einem Abstand von wenigen mm. ( B ) Eine andere Ansicht des Vorbereitungs- und Olfaktometers aus einem anderen Blickwinkel ( C ) Eine Nahansicht des Präparats und des Olfaktometers, die die Position der Duftstoffpatrone oberhalb der Fliegenpfeife zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Repräsentative Spuren und Dosierungskurven von Or47b ORNs in Reaktion auf cis - oder trans - Palmitoleinsäure. ( AB ) SSR aus den at4A-ORNs, die den Or47b-Rezeptor mit trans- ( A ) oder cis- Palmitoleinsäure ( B ) exprimieren. Aufnahmen wurden mit 7-tägigen WT Berliner Männern durchgeführt. Entsprechende Spike-Raster (Mitte) und ein Peri-Stimulus-Zeit-Histogramm (unten, bei 50 ms gebündelt) sind unterhalb der Probenspuren (n = 12) dargestellt. ( C ) Dosis-Wirkungs-Kurven, die die Or47b-ORN-Spike-Reaktionen mit cis- oder trans- Palmitoleinsäure vergleichen. Mittelwert ± sem (* p <0,05; ** p <0,01; t- test). Ctrl: Negative Kontrolle ohne Palmitoleinsäure. Klicken Sie bitte hierUm eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6: Die Aktivierung von at4A durch Palmitoleinsäure erfordert eine Nahbereichsstimulation. ( AB ) SSR von der at4A ORNs in 7-Tage alten Wildtyp-Berliner Männchen. Cis- Palmitoleinsäure wurde in einem nahen Bereich (~ 4 mm) oder weiter weg (~ 11 mm) (n = 6) abgegeben. ( C ) Vergleich der entsprechenden Spike-Reaktionen (bei 50 ms gebogen, geglättete Peri-Stimulus-Zeit-Histogramme). ( D ) Vergleich der entsprechenden mittleren Spike-Reaktionen. Die Reaktionen von at4A auf Palmitoleinsäure fallen deutlich, wenn die Stimulusdistanz zunimmt. Nachdruck mit Genehmigung aus Abbildung S4 in Ziffer 1 . Bitte klicken Sie hier um eineGrößere Version dieser Figur.
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Discussion
Hier haben wir ein Verfahren beschrieben, mit dem die Reaktionen von Or47b ORNs auf Palmitoleinsäure robust induziert und aufgezeichnet werden können. Wir haben eine herkömmliche Langstrecken-Geruchsabgabemethode 2 , 7 , 10 modifiziert , um das Problem der unzureichenden Pheromon-Geruchsabgabe zu beheben. Wir haben das Problem der geringen Geruchsbelastung angesprochen, indem wir die Verbindung über Odorantpatronen liefern, deren Öffnung innerhalb von Millimetern der Präparation positioniert ist. Bei der Berücksichtigung der konsequenten Konstruktion und Platzierung jeder Duftstoffpatrone manifestiert sich dieses Protokoll als eine wirksame Methode, um ansonsten unzugängliche Geruchsstoffe reproduzierbar darzustellen.
Die hier beschriebene Nahbereichs-Geruchsdarstellung ist in Bezug auf bestehende Geruchsabgabemethoden signifikant. Es erlaubt eine Vielzahl von zukünftigen Anwendungen, einschließlich Screening anderen lOv-Volatilität Odoranten für Reaktionen in nicht nur ORNs in Trichoid Sensilla 1 untergebracht , aber die in jedem sensillum Typ gefunden. Das Verfahren ermöglicht die effiziente Abgabe von Pheromon-Geruchsstoffen über einen Luftpuls anstatt durch physikalische Bewegung einer Glaskapillare, die die Geruchsstoffe in Richtung der Antennen 6 trägt . Unsere Modifikation minimiert die Möglichkeit, das Gewebe direkt mit der odoranthaltigen Glaskapillare zu berühren, da es durch die experimentellen Ergebnisse unterstützt wird, in denen wir die Palmitoleinsäure-induzierten Reaktionen nur beobachteten, nachdem wir den Geruchsimpuls abgegeben hatten. Darüber hinaus bietet unsere Methode eine exzellente zeitliche Kontrolle über schnellen Geruchsbeginn und Offset.
Es ist zu beachten, dass es trotz des nachgewiesenen Potenzials des Verfahrens nicht ohne Einschränkungen ist. In unserer Prozedur beruht die Positionierung der Patrone ganz auf die manuelle Einstellung, was es technisch schwierig macht, die Patrone präzitiv zu platzierenSely an der gleichen Stelle von Versuch zu Prozeß Darüber hinaus ist besonderes Augenmerk auf kritische Schritte des Protokolls erforderlich, um sicherzustellen, dass es erfolgreich ausgeführt wird. Gelegentlich sind sehr variable Reaktionen auf eine gegebene Geruchskonzentration angetroffen. In den meisten Fällen wird die Ursache auf eine inkonsistente Patronenplatzierung zurückgeführt. Darüber hinaus müssen vor der Aufnahme strenge Auswahlkriterien für at4 sensilla beachtet werden. Uniform at4A-Spike-Größen von hohen Signal-Rausch-Verhältnissen ( Abbildung 3C ) sind ein wichtiger Maßstab, während eine bescheidene basale Zündrate die Abwesenheit von neuronalen Schäden anzeigt. Der Grad der technischen Schwierigkeiten dieses Verfahrens wird durch seine Fähigkeit, Pheromon-Geruchsstoffe aus Bereichen, die die beobachtete Nähe zwischen einem Mann und der Zielfrau genau simulieren, mehr als kompensiert.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unsere Methode der Geruchsdarstellung Zugang zu Palmitoleinsäure zur Verwendung in SSR von Or47b ORNs bietet. Die Anwendung vonDiese Technik ist nicht auf ein einzelnes Pheromon beschränkt, sondern ist leicht an jeden anderen niedervolatilen Geruch der Wahl anpassbar, was es zu einer vielseitigen analytischen Technik macht, wenn man zuvor unzugängliche Geruchsstoffe untersucht.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir danken Ye Zhang für die Hilfe mit den Musterspuren und Tin Ki Tsang für die Hilfe mit den Bildern. Diese Arbeit wurde von einem Ray Thomas Edwards Foundation Early Career Award und einem NIH Grant (R01DC015519) an C.-YS und NIH Zuschüsse (R01DC009597 und R01DK092640) an JWW unterstützt
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Prep Setup & Miscellaneous Materials | |||
| Pipette Puller Instrument | Sutter Instruments Novato CA USA |
P97 | Pipette Puller |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments Sarasota FL USA |
1B100F-4 | to make holding rods |
| Aluminosilicate Glass Capillaries | Sutter Instruments Novato CA USA |
AF100-64-10 | to make electrodes |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific Pittsburgh PA USA |
12-550-143 | for fly-prep station |
| Permanent Double Sided Tape | Scotch St. Paul MN USA |
NA | for fly-prep station |
| Upright microscope | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
BX51 | for recording rig |
| Plastalina modeling clay | Van Aken North Charleston SC USA |
B0019QZMQQ | for prep station and to stablize the holding rod |
| Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Unit with SFCA Membrane, 0.45 mm | Nalgene Rochester NY USA |
#156-4045 | to sterilize AHL solution |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cartridge Materials | |||
| 200 µL pipette tip | VWR Radnor PA USA |
53508-810 | to make odor cartridges and fly prep |
| Filter Paper | Whatman Maidstone Kent UK |
740-E | to make odor cartridges |
| Vacuum Desiccator | Cole-Parmer Vernon Hills IL USA |
VX-06514-30 | to vaporize ethanol solvent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Odorant Materials | |||
| cis-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#10009871 (CAS # 373-49-9) | Or47b odorant |
| trans-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#9001798 (CAS # 10030-73-6) | Or47b odorant |
| Ethanol | Spectrum Chemical MFG. New Brunswick NJ USA |
E1028-500MLGL | to dilute palmitoleic acid |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rig Setup Materials | |||
| Odorant Cartridge Micromanipulator | Siskiyou Grants Pass OR USA |
MX130R | to position the olfactometer |
| Flow Vision software | Alicat Tuscon AZ USA |
FLOWVISIONSC | software to control flow rate |
| Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-2SLPM-D | to control the flow rate for humidified air |
| Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-500SCCM-D | to control the flow rate for odor stimulation |
| Clampex | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | Data acquisition software |
| Air delivery tube | Ace Glass Vineland NJ USA |
8802-936 | to deliver humidified air |
| 50X objective lens | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
LMPLFL50X | recording rig |
| Clampfit 10 | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | software for spike analysis |
| Igor Pro 6 | WaveMetrics Lake Oswego OR USA |
Ver. 6.37 | software for data analysis |
| Audio Monitor | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXB-AUDIS-08B | Aurally reports individual spikes |
| Extracellular Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXT-02F | to increase the amplitude of electrical signals |
| Valve Controller | Warner Instruments | VC-8 | to control the opening of the valve for odor stimulation |
| Recording Electrode Micromanipulator | Sutter Instruments Novato CA USA |
MP-285 | to position recording electrode |
| Headstage Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
EQ-16.0008 | to increase the amplitude of electrical signals |
| Oscilloscope | Tektronix Beaverton OR USA |
TDS2000C | Visual report of individual spikes |
References
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