Summary
Det overordnede målet med denne protokollen er å demonstrere hvordan man kan presentere luktemidler med lav volatilitet for single-sensillum-opptak fra Drosophila- olfaktoriske reseptorneuroner som reagerer på langkjede kutikulære feromoner.
Abstract
Insekter er avhengige av luktesansen for å lede et bredt spekter av atferd som er kritiske for deres overlevelse, for eksempel matssøkende, rovdyr unnvikelse, oviposisjon og parring. Myriad kjemikalier med varierende volatiliteter har blitt identifisert som naturlige luktstoffer som aktiverer insekt Olfactory Receptor Neurons (ORNs). Imidlertid har det studert de olfaktoriske responsene på lavvolatilitets luktstoffer blitt hindret av manglende evne til effektivt å presentere slike stimuli ved bruk av konvensjonelle lukt-leveringsmetoder. Her beskriver vi en prosedyre som tillater effektiv presentasjon av luktstoffer med lav volatilitet for in vivo Single-Sensillum Recording (SSR). Ved å minimere avstanden mellom luktkilden og målvevet, tillater denne metoden anvendelse av biologisk fremtredende men hittil utilgjengelige luktemidler, inkludert palmitolsyre, en stimulerende feromon med en påvist effekt på ORN som er involvert i frieri og parringsoppførsel 1 .Vår prosedyre gir dermed en ny avenue for å analysere en rekke lavvolatilitets luktstoffer for studiet av insektflukt og feromontommunikasjon.
Introduction
Drosophila ORNs reagerer på et stort antall luktstoffer, med vidtgående karbonkjedelengder og en rekke funksjonelle grupper, inkludert estere, alkoholer, ketoner, laktoner, aldehyder, terpener, organiske syrer, aminer, svovelforbindelser, heterocykliske forbindelser og aromater 2 , 3 . Luktstoffer variert i deres fysisk-kjemiske egenskaper kan ha markant forskjellige volatiliteter, indisert ved damptrykk av forbindelsen. Spesielt, biologisk relevante luktemidler for Drosophila melanogaster varierer enormt i deres volatilitet. For eksempel reagerer Ir92a ORNs på ammoniakk 4 , som er svært flyktig, med et damptrykk på 6.432 mmHg ved 20 ° C. I motsetning svarer Or67d ORNs til en mannlig feromon, cis- va-acetat ( c VA) 5 , 6 , hvis damptrykk er 43 mmHg ved 20 ° C.
Ove_content "> Det er spesielt utfordrende å studere det olfaktoriske svaret på luktstoffer med lav volatilitet med konvensjonelle lukt-leveringsmetoder, der luktemidler leveres via en luftbærer i en bærer over en relativt lang avstand ( dvs. flere centimeter). Som sådan er de rapporterte olfaktoriske svarene Til en gitt lavvolatilitet luktemiddel kan variere sterkt, avhengig av utformingen av lukt-forsyningssystemet. For eksempel varierer det rapporterte responsen av Or67d ORN til en høy dose av c VA fra ~ 40 7 -> 200 pigger / s 6 Videre er den ineffektive levering av c VA med konvensjonelle leveringsmetoder sannsynligvis tilskrevet falsk-negative resultater, hvilket fører til tolkningen at c VA i seg selv ikke er tilstrekkelig til å aktivere Or67d ORN 8. Denne tolkningen ble senere utfordret av en annen studie ved bruk av en Lukk-lukt-leveringsmetode 9. Det er derfor imperaTive å utvikle et robust lukt-levering system for effektiv presentasjon av luktstoffer med lav volatilitet.Nylig identifiserte vi flere langkjede kutikulære fettsyrer som ligander for Or47b ORNs. De er plassert i type 4 Antennal Trichoid Sensillum (at4). Blant de langkjedede fettsyre-luktene fant vi at palmitolsyre fungerer som et afrodisiakumferomon som fremmer mannlig frieri ved å aktivere Or47b ORNs 1 . I en annen studie ved bruk av en konvensjonell lukt-leveringsmetode ble metyllaurat vist å fremkalle responser fra Or47b ORN, mens palmitolsyre fremkalte ingen respons når den ble presentert fra samme avstand 10 . Sammenlignet med c VA er langkjedede fettsyrer enda mindre flyktige, med damptrykk mindre enn 0.001 mmHg ved 25 ° C 11 . Den iboende lave volatiliteten til langkjedede fettsyre luktstoffer, som utelukker effektiv presentasjon til antennen viaKonvensjonelle lukt-leveransesystemer, antakelig sannsynlig for de falsk negative resultatene 10 . Denne inkonsekvensen fremhever mangelfullhet av konvensjonelle lukt-leveransesystemer ved å presentere luktstoffer med lav volatilitet. Det ble tidligere vist at effektiv tilførsel av kutikulære lukt krever nærhet mellom luktkilden og målvevet 6 . For å fullt ut karakterisere effektene av biologisk aktive feromoner mens de etterligner avstanden fra hvilke de sannsynligvis er truffet av fruktfluer i naturen 12 , 13 , er det enighet om at minimal avstand må prioriteres høyt i vår prosedyre.
Vår metode har ytterligere fordeler, inkludert kompatibilitet med standard elektrofysiologi rigger og teknikker. For eksisterende riggsettinger krever minimal modifikasjon for å imøtekomme denne protokollen, og de fleste SSR-trinn krever bare mindre justeringer. DetteGjør vår teknikk lett tilgjengelig for forskere med erfaring i SSR. Videre tillater vår teknikk presentasjonen av luktstoffer med lav volatilitet med skarp utbrudd og kompensasjon, korrelerende stimuluslevering med nevronrespons. Endelig muliggjør maskinvareoppsettet raske utvekslinger mellom luktpatroner, og fremskynder datainnsamling over et ønsket doseringsområde.
Vi begynner med å gjennomgå forberedelsen av referanse- og innspillingselektroder, Voksne Hemolymph-liknende (AHL) -løsning, luktende blekkpatroner og tilsvarende olfaktometer. Vi diskuterer deretter forberedelsen av palmitolsyre luktende løsninger, etterfulgt av forberedelsen av flyet til opptak. Vi fortsetter å vurdere kriteriene for å velge et trichoid sensillum for å registrere og nærmere undersøke plasseringen av luktpatronen før du presenterer representative data som er oppnådd ved hjelp av denne metoden. Til slutt konkluderer vi med å utforske nyttige anvendelser av denne teknikkenUe, noen oppstod problemer, og deres løsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse av maskinvaren for at4-opptak
- Bruk et pipetttrekkinstrument for å forberede elektroder med aluminosilikatglasskapillærer (OD 1,0 mm, ID 0,64 mm). Stryk spissen av referanselektroden litt med et par fine tang for å lette innføringen i flygelens clypeus ( dvs. en avrundet plate på forsiden av fluehodet, over munnstykkene).
MERK: 7-dag gamle WT hanner (Berlin) ble brukt i denne studien. Bruk AHL saltoppløsning 14 som elektrolytt for begge elektroder. - Fremstill en l av AHL ved blanding av 900 ml destillert vann, med 6,312 g NaCl, 0,373 g KCl, 0,337 g av NaHCO3, 0,1120 g NaH 2PO 4, 1,892 g Trehalose ּ 2 H2O, 3,423 g sukrose, 1,192 g HEPES og 8,2 ml 1M MgCl2. Ved å bruke destillert vann, bring totalt volum opp til 1 L. Ta pH til 7,4 ved bruk av 1 N NaOH og steriliser løsningen med enVakuumdrevet filter system. For langsiktig lagring, hold AHL-alikvoter ved 4 ° C.
MERK: Konsistente leveranser av palmitolsyre er betinget av enhetlighet mellom patroner. Det er kritisk at hver patron er montert på en reproduserbar måte. - Ved hjelp av et knivblad, fjern 0,9 cm fra spissen av en 200 μL pipettespiss for å lage den første patrondelen, målt 4,1 cm; Referer til dimensjonene som er beskrevet i figur 1A . Bruk en annen pipettepip på 200 μL og fjern 1,7 cm og 1,5 cm fra henholdsvis spissen og basen for å lage den andre patronen, som måler 1,8 cm ( figur 1A ). Bruk en linjal for å sikre reproduserbarhet.
- Bruk en ⅛ "hullpuncher til å kutte plater fra filterpapir.
- Bruk tanger for å plassere en filterpapirplate på spissen av den andre patrondelen. Visuelt bekreft at det er en åpning i patronspissen gjennom hvilken luft kan passere.
- Fest den første og den andre patronen sammen, som vist på figur 1A . Vinkel den andre patron-delen nedover for å lette kvadratisk sikte på prep ( Figur 1B ).
- Koble patronen med luktrøret, som er montert på en mikromanipulator.
MERK: Dette designet gjør at patronen kan svinges utover for å lette utvekslingen ( figur 1C ). - Still den konstant fuktede luftstrømmen til 2 L / min i en massestyring, og luktanten strømmer til 500 ml / min i en annen massestyring.
- Ved hjelp av programvaren (se Materialebordet ), programmer prosedyren for å administrere en 500 ms luktpust.
2. Fremstilling av Palmitoleic Acid Odorant Solutions for Levering
MERK: Or47b ORNs reagerer på både cis- og trans- palmitolsyre. Som palmitolsyre er ustabil ved RT, lagrene lagres ved -20 ° C og brukes innen en måned ved åpning. Etanol er løsningsmidlet av valget for palmitolsyre.
- Bruk en vortexblander til grundig å blande 10 μl cis- eller trans- palmitolsyreholdige stoffer eller fortynninger med 90 μl 100% etanol for ti ganger serielle fortynninger i 1,7 ml mikrotubes. Forbered fersk palmitolsyre fortynninger daglig før eksperimenter og bruk innen en dag.
MERK: For luktemidler som ikke er oppløselige i etanol, anbefales et glass hetteglass for å forberede luktfortynninger med andre typer organiske løsningsmidler. - Bruk en P10 mikropipett, påfør 5 μl cis- palmitolsyreoppløsninger av de ønskede fortynninger til filterpapiret i hver tilsvarende patron.
MERK: Den høyeste dosen (10 -1 ) inneholder 450 μg av forbindelsen. For trans- palmitolsyreoppløsninger, bruk 4,5 μL i stedet slik at den høyeste dosen (10 -1 ) også inneholder 450 μg tHan sammensatte. - For å fullstendig fordampe løsningsmidlet, plasser palmitolsyrepatronene i en vakuum-desikator i 1 time ved RT og 7,59 mmHg trykk.
MERK: Kassettene kan brukes i opptil 4 timer ved RT.
3. Fremstilling av Drosophila for klar tilgang til at4 Sensilla for in vivo elektrofysiologiske opptak
MERK: WT flyr (Berlin) blir oppdrettet i standard maisgrønsmedium ved 25 ° C i en 12:12 lysmyk syklus. Ved eclosion blir fluer adskilt etter kjønn i grupper på ti, hvor de grupperes inntil 7 d. Or47b ORNer i både mannlige og kvinnelige fluer reagerer på palmitolsyre. For enkelhet er bare mannlige fluer undersøkt i den nåværende studien.
- Monter en glidelås på glidelåsen: Legg på glassdisplayet (18 x 18 mm 2 ) på en liten mengde modelleringsleir som danner en ~ 3 ° vinkel med glassruten. Plasser dobbeltsidig tape på den indre eDge av dekselet og på området av lysbildet umiddelbart nedenfor. Bytt ut med nytt tape for hver dag med opptak ( figur 2A ).
- Bruk en luftsuger 15 for å samle fly av interesse i slangen og pass så en 200-l pipettespiss over enden av slangen. Samtidig flår røret forover mens du blåser luft inn i røret for å skyve flyet til enden av pipettespissen. Bruk et knivblad til å klippe like under flyets kropp og 2 hode lengder over flyet.
- Tøm bunnen av pipettespissen med modelleringsleir, skyv flyet oppover til både antennene og clypeusene blir utsatt ( figur 2B ). For å unngå å drepe flyet, legg til bare nok leire for å utsette antennene og aristaene, da dette forhindrer at flyets underliv blir knust. Videre legger leir sakte og forsiktig for å forhindre plutselig innsnevring. Bekreft at flyet er i live ved å se etter antennalEller proboscis bevegelse.
- Bruk tanger for å manøvrere pipettespissen som huser flyet. Orienter hodet slik at clypeus vender mot høyre for observatøren. Juster prep langs dekslet med fine tang, til antennens sidelengs side ligger mot den tapede dekseloverflaten ( figur 2B ).
- Sett en holderstang på arista for å sikre antennen til dobbeltsidig tape for å hindre bevegelse ( figur 2B ).
MERK: Holdestangen trekkes fra en borosilikatglasskapillar med en pipettuttak og holdes på plass med modelleringsleire ( figur 2A ). - Plasser prep på riggets scene ( figur 2C ). Ved hjelp av mikroskopet, bekreft at trichoider er synlige langs den fjerntliggende kanten av det tredje segmentet av antennen.
MERK: Ideell skal sensillen være tydelig silhouettet mot bakgrunnen, noe som forenkler deres Identifisering og letter opptaket ( figur 3 ). I dette preparatet er flertallet av den tilgjengelige trichoid sensilla av typen at4. - Hold prep under konstant fuktig luftstrøm (2 l / min) levert via et separat lufttilførselsrør fra en avstand på ca 2 cm fra prep ( figur 4 ) som beskrevet tidligere 2 , 15 .
4. Opptak av at4 Sensillum Aktivitet fra Or47b ORNer i at4 trichoider som respons på palmitolsyre
- Sett referanselektroden inn i clypeusen ( figur 3A ). For å unngå vevskader, sørg for at elektroden er satt inn like under overflaten, der den kan ta kontakt med hemolymfen under kutikken, med en rask og jevn bevegelse.
- Senk opptakselektroden sakte inntil den går inn i samme synsvinkel som mål-sensillumet (= "Xfig"> Figur 3B). Ta opp under en 50X objektivlins.
MERK: Den tøffe trichoidale kutikulaen krever at innspillingselektroden settes inn i sensillarbasen, hvis bredere område gir et større mål som reduserer sannsynligheten for at elektroden avbøyes ( figur 3B , innsett). - Før du bruker lukt stimuli til en sensillum, observere følgende utvalgskriterier; Noen trichoid som ikke oppfyller disse standardene bør avvises og en annen sensillum velges i stedet.
- Vær oppmerksom på et høyt signal-støyforhold (se figur 3C for et eksempel).
- Se på identifiserbare pigger fra at4A og at4C neuroner ( figur 3C ).
MERK: Av notatet, vises at4B spikeramplitude svært lik at4A 10 og kan ikke være lett identifiseres uten lukt stimulering. - Vær oppmerksom på at den basale avfyringshastigheten til at4A-neuronene erRundt eller under 20 Hz.
MERK: Dette kriteriet er spesifikt for at4A fordi den basale avfyringshastigheten for nevronen er høyere enn den for de basiske ORNene 2 . En mye høyere basal skyting indikerer at nevronene kan ha blitt skadet under elektrodeinnsetting.
- Koble patronen til lukteduksjonsrøret. Start med løsemiddelkontrollen og deretter luktene, fra lav til høy konsentrasjoner. Bruk mikromekanipulatoren til å manøvrere patronen mot prep mens du sikter patronen helt i hodet på prep. Visuelt bekreft at patronen peker direkte på antennen ( figur 4 ) fra noen få millimeter unna.
MERK: Målet er å orientere patronens åpning direkte ved antennen og plassere den i nærheten av målvevet. - Forsikre deg om at luktpatronen er skilt fra opptakselektroden på høyre side av 1 - 2 mm og fra flygelegemetP glide under med ca 1 mm.
MERK: I oppsettet som er beskrevet her, er luktpatronen tett grenset av opptakselektroden, referanselektroden og fly-prep-lysbildet ( figur 4 ).
MERK: Vær oppmerksom på avstanden mellom patronen og opptaks- / referanselektroder. En avstand på rundt 4 mm anbefales 1 . Uavhengig kontakt kan avslutte signalet og bryte spissen av opptakselektroden, skade den nåværende nevronen og komplisere ytterligere innspillinger.
MERK: Vurder avstanden som skiller patronen og fly-prep-lysbildet. Ved å berøre dekselglasset kan det også løsnes opptakselektroden for å forstyrre opptaket. - Trykk på "Record" i datainnsamlingsprogramvaren for å starte opptaket.
MERK: For hver 10 s-opptak leveres en enkelt 500 ms luktpuls direkte til antennen, som beskrevet i trinn 1.9. - Etter lukterapplikasjonen,Trekk forsiktig inn patronen før du erstatter den med en patron med den nærmeste høyeste konsentrasjonen. Fortsett til hele doseringsområdet er oppnådd.
MERK: Det anbefales at bare én Or47b ORN er registrert fra hvert fly for å unngå eventuelle effekter av tilpasning. - Skyll innspillingselektroden grundig med destillert vann etter at du har fullført opptaket for dagen.
- Analyser og plott dataene ved hjelp av kommersielt tilgjengelig offlineanalysesoftware.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vår teknikk ble vellykket anvendt for å bestemme den relative effekten av trans ( Figur 5A ) versus cis ( Figur 5B ) isomerer av palmitolsyre. Våre data viser at representative trans -palmitoleic syre er en mer effektiv ligand for Or47b Orns når sammenlignet med cis-isoformen (figur 5C). En enkelt neuron ble registrert fra hver fly, med tolv fluer registrert per dosekurve, for totalt 24 fluer. De kollektive data ble oppnådd fra tre uavhengige gjentagelser av forsøkene, med 8 fluer registrert i hver. Feilstavene representerer sema
Av oppmerksomheten har avstanden mellom åpningen av luktpatronen og flygelederen en betydelig innvirkning på utfallet av opptaket. Å fremkalle en betydelig respons på sAlmitoleinsyre i Or47b ORNs, presenterte vi luktemidlet på nært hold, rundt 4 mm fra antennen 1 ( Figur 6A ). Når palmitolsyre presenteres lenger unna antennen (~ 11 mm), kunne vi nesten ikke observere noen signifikant respons fra de samme Or47b-ORNene ( figur 6B ). Disse resultatene understreker betydningen av nærtliggende presentasjon av palmitolsyre ( Figur 6C- D ). Dataene ble samlet fra parallelle eksperimenter fra 6 mannlige fluer (Berlin, 7 d gamle). En enkelt Or47b ORN ble registrert / fløy. Feilstavene representerer sema
Figur 1: Oppsett av kassett og olfaktometer. ( A ) Fremstilling av luktpatroner. Fra venstre til høyre: en standard 200 μlPipettespiss, første og andre patroner, og en ferdig luktpatron. ( B ) Kassetten er koblet til olfaktometeret, som viser nedadgående vinkling av den andre delen. ( C ) Olfaktometeroppsett som viser luktens leveringsrør montert på mikromanipulatoren, med en festet luktpatron. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Drosophila Preparation. ( A ) Et komplett preparat, som viser de relative posisjonene til flyet, dekselglasset og holdestangen. ( B ) Nærbilde av prep, som viser plasseringen av flyet, dens antennretning, og dens clypeus. Holdestangen er plassert over aristaen,Sikring av det tredje antennalsegmentet til dobbeltsidig tape. ( C ) Rig oppsett. Alle hovedkomponentene er merket. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Identifisering av at4 Sensillum for SSR. ( A ) 4X visning av prep, som viser referanselektroden satt inn i clypeus, holdestangen oppe på aristaen og opptakselektroden plassert nær det tredje antennalsegmentet. ( B ) 50X visning av elektroden, klar for innføring i at4 trichoid. Inset: Illustrasjon av posisjonen til opptakselektroden. ( C ) Representative SSR-spor av baseline spike aktivitet, som viser god (topp) eller dårlig (bunn) signal-til-noisE forhold. Godt signal-støyforhold tillater pålitelig identifisering av at4A og at4C pigger. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Plassering av kassett. ( A ) Luktpatronen er rettet rett i flyvehodet fra en avstand på noen få mm. ( B ) En annen visning av prep og olfactometer fra en annen vinkel. ( C ) En nærbilde av prep og olfactometer, som viser posisjonen til luktkassetten over fly-prep-lysbildet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Representative spor og doseringskurver for Or47b ORN som respons på cis- eller trans- palmitolsyre. ( AB ) SSR fra at4A-ORN som uttrykker Or47b-reseptoren med trans- ( A ) eller cis- palmitolsyre ( B ). Opptak ble utført med 7-dag gamle WT Berlin menn. Tilsvarende spike raster (midt) og peri-stimulus tid histogram (bunn, inned ved 50 ms) er vist under prøve sporene (n = 12). ( C ) Dose-respons kurver som sammenligner Or47b ORN spike responsene til cis- eller trans- palmitolsyre. Mean ± sem (* p <0,05; ** p <0,01; t- test). Ctrl: Negativ kontroll uten palmitolsyre. Vennligst klikk herFor å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Aktivering av at4A med palmitolsyre krever nærområdet stimulering. ( AB ) SSR fra at4A-ORNene i 7-dag gamle wildtype Berlin menn. Cis- palmitolsyre ble levert i nærheten (~ 4 mm) eller lenger unna (~ 11 mm) (n = 6). ( C ) Sammenligning av de tilsvarende spikresponsene (innen ved 50 ms, glatt peri-stimulus-tidshistogrammer). ( D ) Sammenligning av de tilsvarende gjennomsnittlige spike responsene. Svarene fra at4A til palmitolsyre faller markant som stimulusavstanden øker. Gjengitt med tillatelse fra figur S4 i referanse 1 . Vennligst klikk her for å se enStørre versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskrev vi en prosedyre hvor responsene fra Or47b ORN til palmitolsyre kan induceres og registreres robust. Vi modifiserte en konvensjonell langdistance luktleveringsmetode 2 , 7 , 10 for å feilsøke problemet med utilstrekkelig feromon luktende levering. Vi løste problemet med lav luktantvolatilitet ved å levere forbindelsen via luktende patroner, hvor åpningen er plassert i millimeter av prep. Når det tas hensyn til den konsistente konstruksjon og plassering av hver luktpatron, manifesterer denne protokoll seg som en effektiv metode for å presentere ellers utilgjengelige luktstoffer på en reproduserbar måte.
Luktprosessen for luktpresentasjon beskrevet her er betydelig med hensyn til eksisterende luktleveringsmetoder. Det tillater en rekke fremtidige applikasjoner, inkludert screening av andre lOw-flyktighet luktemidler for svar i ikke bare ORNer innkapslet i trichoid sensilla 1 , men de som finnes i en hvilken som helst sensillum type. Prosedyren tillater effektiv tilførsel av feromon luktstoffer via en puls i luft i stedet for ved fysisk å flytte en glasskapillær som bærer luktene mot antennene 6 . Vår modifikasjon minimerer muligheten for å berøre vevet direkte med luktemiddelholdig glasskapillar, som støttet av eksperimentelle resultater der vi observert palmitolsyre-fremkalte responser først etter at vi har levert luktpulsen. I tillegg gir vår metode utmerket temporal kontroll av rask luktsinngang og offset.
Det skal bemerkes at, til tross for det demonstrerte potensialet i prosedyren, er det ikke uten begrensninger. I vår prosedyre er plasseringen av patronen helt avhengig av manuell justering, noe som gjør det teknisk vanskelig å plassere patronenSely på samme sted fra prøve til prøve. I tillegg kreves det spesiell oppmerksomhet til kritiske trinn i protokollen for å sikre at den utføres vellykket. Av og til oppstår svært variable svar på en gitt luktkonsentrasjon. I de fleste tilfeller er årsaken sporet til inkonsekvent patronplassering. I tillegg må strenge utvalgskriterier for at4 sensilla observeres før opptak. Ensartede at4A-spikstørrelser av høye signal-til-støyforhold ( figur 3C ) er et nøkkeltal, mens en beskjeden basal avfyringshastighet indikerer fraværet av nevronskader. Graden av tekniske vanskeligheter med denne prosedyren er mer enn kompensert av sin evne til å levere feromon luktstoffer fra områder som nøyaktig simulerer den observerte nærheten mellom en hovende mann og målkvinnen.
Sammendrag, gir vår metode for luktende presentasjon tilgang til palmitolsyre til bruk i SSR fra Or47b ORNs. Men anvendelsen avDenne teknikken er ikke begrenset til en enkelt feromon, men er lett å tilpasse seg enhver annen lavvolatilitets luktemiddel som er valgt, noe som gjør den til en allsidig analytisk teknikk når man analyserer tidligere utilgjengelige luktemidler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Ye Zhang for hjelpen med utvalgsporene og Tin Ki Tsang for hjelpen med bildene. Dette arbeidet ble støttet av en Ray Thomas Edwards Foundation Early Career Award og et NIH-stipend (R01DC015519) til C.-YS og NIH tilskudd (R01DC009597 og R01DK092640) til JWW
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Prep Setup & Miscellaneous Materials | |||
| Pipette Puller Instrument | Sutter Instruments Novato CA USA |
P97 | Pipette Puller |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments Sarasota FL USA |
1B100F-4 | to make holding rods |
| Aluminosilicate Glass Capillaries | Sutter Instruments Novato CA USA |
AF100-64-10 | to make electrodes |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific Pittsburgh PA USA |
12-550-143 | for fly-prep station |
| Permanent Double Sided Tape | Scotch St. Paul MN USA |
NA | for fly-prep station |
| Upright microscope | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
BX51 | for recording rig |
| Plastalina modeling clay | Van Aken North Charleston SC USA |
B0019QZMQQ | for prep station and to stablize the holding rod |
| Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Unit with SFCA Membrane, 0.45 mm | Nalgene Rochester NY USA |
#156-4045 | to sterilize AHL solution |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cartridge Materials | |||
| 200 µL pipette tip | VWR Radnor PA USA |
53508-810 | to make odor cartridges and fly prep |
| Filter Paper | Whatman Maidstone Kent UK |
740-E | to make odor cartridges |
| Vacuum Desiccator | Cole-Parmer Vernon Hills IL USA |
VX-06514-30 | to vaporize ethanol solvent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Odorant Materials | |||
| cis-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#10009871 (CAS # 373-49-9) | Or47b odorant |
| trans-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#9001798 (CAS # 10030-73-6) | Or47b odorant |
| Ethanol | Spectrum Chemical MFG. New Brunswick NJ USA |
E1028-500MLGL | to dilute palmitoleic acid |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rig Setup Materials | |||
| Odorant Cartridge Micromanipulator | Siskiyou Grants Pass OR USA |
MX130R | to position the olfactometer |
| Flow Vision software | Alicat Tuscon AZ USA |
FLOWVISIONSC | software to control flow rate |
| Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-2SLPM-D | to control the flow rate for humidified air |
| Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-500SCCM-D | to control the flow rate for odor stimulation |
| Clampex | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | Data acquisition software |
| Air delivery tube | Ace Glass Vineland NJ USA |
8802-936 | to deliver humidified air |
| 50X objective lens | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
LMPLFL50X | recording rig |
| Clampfit 10 | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | software for spike analysis |
| Igor Pro 6 | WaveMetrics Lake Oswego OR USA |
Ver. 6.37 | software for data analysis |
| Audio Monitor | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXB-AUDIS-08B | Aurally reports individual spikes |
| Extracellular Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXT-02F | to increase the amplitude of electrical signals |
| Valve Controller | Warner Instruments | VC-8 | to control the opening of the valve for odor stimulation |
| Recording Electrode Micromanipulator | Sutter Instruments Novato CA USA |
MP-285 | to position recording electrode |
| Headstage Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
EQ-16.0008 | to increase the amplitude of electrical signals |
| Oscilloscope | Tektronix Beaverton OR USA |
TDS2000C | Visual report of individual spikes |
References
- Lin, H. -H., et al. Hormonal modulation of pheromone detection enhances male courtship success. Neuron. 90 (6), 1272-1285 (2016).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
- Silbering, A. F., et al. Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems. J Neurosci. 31 (38), 13357-13375 (2011).
- Min, S., Ai, M., Shin, S. A., Suh, G. S. B. Dedicated olfactory neurons mediating attraction behavior to ammonia and amines in Drosophila. Proc Nat Acad Sci USA. 110, 1321-1329 (2013).
- Kurtovic, A., Widmer, A., Dickson, B. J. A single class of olfactory neurons mediates behavioural responses to a Drosophila sex pheromone. Nature. 446 (7135), 542-546 (2007).
- Van der Goes van Naters, W., Carlson, J. R. Receptors and neurons for fly odors in Drosophila. Curr Biol. 17, 606-612 (2007).
- Schlief, M. L., Wilson, R. I. Olfactory processing and behavior downstream from highly selective receptor neurons. Nat Neurosci. 10 (5), 623-630 (2007).
- Laughlin, J. D., Ha, T. S., Jones, D. N. M., Smith, D. P. Activation of Pheromone-sensitive neurons is mediated by conformational activation of pheromone-binding protein. Cell. 133 (7), 1255-1265 (2008).
- Gomez-Diaz, C., Reina, J. H., Cambillau, C., Benton, R. Ligands for pheromone-sensing neurons are not conformationally activated odorant binding proteins. PLoS Biol. 11 (4), e1001546 (2013).
- Dweck, H. K. M., et al. Pheromones mediating copulation and attraction in Drosophila. Proc Nat Acad USA. 112, 2829-2835 (2015).
- Cappa, C. D., Lovejoy, E. R., Ravishankara, A. R. Evaporation rates and vapor pressures of the even-numbered C8-C18monocarboxylic acids. J Phys Chem A. 112 (17), 3959-3964 (2008).
- Kimura, K. -I., Sato, C., Yamamoto, K., Yamamoto, D. From the back or front: the courtship position is a matter of smell and sight in Drosophila melanogaster males. J Neurogenet. 29 (1), 18-22 (2015).
- Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478 (7368), 236-240 (2011).
- Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112 (2), 271-282 (2003).
- Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J Vis Exp. (36), e1-e5 (2010).
