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Cancer Research

ग्लियोब्लास्टोमा स्टेम कोशिकाओं के सेलुलर भेदभाव को बढ़ावा देने कि छोटे अणुओं की पहचान के लिए प्रवाह Cytometry आधारित दवा स्क्रीनिंग प्रणाली

Published: January 10, 2018 doi: 10.3791/56176
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,3, 1
1Department of Neurological Surgery, Case Comprehensive Cancer Center, Case Western Reserve University School of Medicine, 2Department of Pathology, Johns Hopkins University, School of Medicine, 3Department of Neurological Surgery, University Hospital-Case Medical Center, Case Comprehensive Cancer Center, Case Western Reserve University School of Medicine

Summary

एक कुशल स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल छोटे अणुओं है कि ग्लियोब्लास्टोमा स्टेम सेल (GSCs) में astroglial भेदभाव को बढ़ावा देने की पहचान के लिए प्रस्तुत किया है । परख एक स्टेम सेल भेदभाव रिपोर्टर जिससे बढ़ाया GFP (eGFP) की अभिव्यक्ति मानव GFAP प्रवर्तक से प्रेरित है पर आधारित है ।

Abstract

ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) वयस्कों में सबसे आम और सबसे घातक प्राथमिक मस्तिष्क ट्यूमर है, मोटे तौर पर अकेले अमेरिका में १४,००० मौतें हर साल होता है । माध्य अस्तित्व के बाद निदान अधिक से अधिक सर्जिकल लकीर, विकिरण, और temozolomide कीमोथेरेपी के साथ 15 महीने से भी कम है । अधिक प्रभावी जीबीएम उपचार के विकास में निहित चुनौतियों का तेजी से स्पष्ट हो गया है, और अपनी झुकते इनवेसिव, मानक उपचार के लिए अपने प्रतिरोध, अपनी आनुवंशिक जटिलता और आणविक अनुकूलन क्षमता, और जीबीएम की उपआबादी शामिल सामान्य स्टेम कोशिकाओं के लिए phenotypic समानता के साथ कोशिकाओं, इस के साथ साथ ग्लियोब्लास्टोमा स्टेम सेल (GSCs) के रूप में भेजा. क्योंकि GSCs ट्यूमर विकास और प्रगति के लिए आवश्यक हैं, भेदभाव आधारित चिकित्सा इन लाइलाज ट्यूमर के लिए एक व्यवहार्य उपचार रूपरेखा का प्रतिनिधित्व करता है ।

निंनलिखित प्रोटोकॉल प्रक्रियाओं का एक संग्रह का वर्णन एक उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग छोटे अणुओं है कि GSC astroglial भेदभाव को बढ़ावा देने की पहचान के उद्देश्य से मंच स्थापित करने के लिए । प्रणाली के मूल में एक glial fibrillary अंलीय प्रोटीन (GFAP) भेदभाव रिपोर्टर-निर्माण है । प्रोटोकॉल में निंनलिखित सामांय कार्यविधियां हैं: (1) GSC विभेदन रिपोर्टर लाइनें स्थापित करना; (2) GSC स्व-नवीकरण/clonogenic क्षमता के लिए रिपोर्टर की प्रासंगिकता को सत्यापित करने के लिए परीक्षण/ और (३) उच्च क्षमता वाली प्रवाह-cytometry आधारित औषध स्क्रीनिंग.

स्क्रीनिंग मंच एक सीधी और सस्ती दृष्टिकोण प्रदान करता है छोटे अणुओं है कि GSCs भेदभाव को बढ़ावा देने की पहचान । इसके अलावा, एफडीए अनुमोदित दवाओं के पुस्तकालयों का उपयोग एजेंटों की पहचान है कि अधिक तेजी से reपर्पज किया जा सकता है के लिए क्षमता रखती है । इसके अलावा, उपचार है कि कैंसर को बढ़ावा देने के सेल विभेद स्टेम वर्तमान के साथ synergistically काम करने की उंमीद कर रहे है "देखभाल के मानक" चिकित्सा कि लक्ष्य और मुख्य रूप से अधिक विभेदित कैंसर कोशिकाओं को खत्म करने के लिए दिखाया गया है ।

Introduction

हाल के अध्ययनों से पता चला है कि ट्यूमर कोशिकाओं की एक छोटी सी आबादी होते हैं, कैंसर स्टेम सेल (सीएससीएस) या ट्यूमर की शुरुआत कोशिकाओं, जो ट्यूमर प्रगति, मेटास्टेसिस, और chemo के प्रतिरोध के लिए जिंमेदार है-और रेडियो- 1चिकित्सा, 2. कैंसर की उपस्थिति स्टेम कोशिकाओं और उनके ट्यूमर के भीतर अधिक विभेदित जिन्नों intratumoral विविधता को बढ़ावा देने के एक महत्वपूर्ण कारक माना जाता है और इस प्रकार3कैंसर के इलाज में एक बड़ी बाधा का प्रतिनिधित्व करता है । ट्यूमर कोशिका पदानुक्रम, कैंसर स्टेम सेल सिद्धांत द्वारा प्रदान की गई है, नई रणनीतियों के विकास के लिए प्रेरित किया है 4कैंसर का इलाज । कैंसर को लक्षित करने के लिए एक दृष्टिकोण स्टेम सेल की पहचान करने और संकेत रास्ते है कि प्रभावित अंग के भ्रूण विकास के दौरान आवश्यक हो जाना जाता है रोकना है । दरअसल, हम और दूसरों को पहले से कई के लिए चल रही आवश्यकता का वर्णन कागजात प्रकाशित किया है स्टेम सेल-प्रासंगिक संकेतन रास्ते ध्वनि हेज हॉग और ग्लियोब्लास्टोमा में पायदान5,6,7। इस काम के कई जीबीएम नैदानिक परीक्षणों के लिए तर्क जमना में मदद मिली है । कैंसर स्टेम सेल लक्ष्यीकरण के लिए एक दूसरा दृष्टिकोण को अपने विभेद को बढ़ावा देने है । यह दृष्टिकोण retinoic एसिड (अतरा, एक विटामिन-एक एनालॉग) के साथ तीव्र promyelocytic ल्यूकेमिया के इलाज में नैदानिक और नैदानिक अध्ययनों से अनुकूल परिणाम के कारण समर्थन का एक बहुत कुछ प्राप्त हुआ है । यहां अतरा के लिए परिपक्वता ब्लॉक हटाने और कैंसर सेल विभेद8को बढ़ावा मिला था । हाल ही में, Piccirillo और सहकर्मियों को खूबसूरती से पता चला है कि BMP-4 astrocytes में महत्वपूर्ण विरोधी जीबीएम प्रभाव के साथ और vivo में9में GSC भेदभाव को बढ़ावा देता है ।

वर्तमान अध्ययन के लिए तर्क GSCs लक्ष्यीकरण के लिए एक "उलट इंजीनियरिंग" दृष्टिकोण पर आधारित है । जीबीएम में विशाल विविधता वर्तमान को देखते हुए और गरीब भेदभाव कैंसर की पहचान में से एक होने के साथ, हमने पूछा कि क्या हम एक astrocyte की तरह राज्य में एक और अधिक अनुकूल phenotype-भेदभाव को बढ़ावा देने सकता है । यहाँ, हम एक दिया ट्यूमर नमूना में GSCs बनाए रखने के संकेत रास्ते की पूर्व ज्ञान नहीं है, लेकिन बल्कि एक वांछित phenotype (उदाहरण के लिए GFAP धनात्मकता) को प्राप्त करने के लिए उद्देश्य.

इस रिपोर्ट में GSC-समृद्ध संस्कृतियों के transduction से GSC विभेदक रिपोर्टर-लाइनें स्थापित करने के लिए प्रयुक्त प्रक्रियाओं का वर्णन GSC क्लोनल चयन के लिए किया गया है । ग्लियोब्लास्टोमा neurosphere इस्तेमाल किया लाइनों अस्पताल San Raffaele में प्राथमिक ग्लियोब्लास्टोमा के निदान के साथ रोगियों से प्रोफेसर एंजेलो Vescovi की प्रयोगशाला में स्थापित किया गया-मिलानो, इटली । इन पंक्तियों में बड़े पैमाने पर कई प्रकाशनों 6,10,11,12,13,14में अध्ययन किया गया है । यह अत्यधिक की सिफारिश की है कि व्यक्तियों, जो अपनी प्रयोगशाला में इन तकनीकों को लागू करने में रुचि रखते है रिपोर्टर की प्रासंगिकता कैंसर स्टेम सेल स्वयं कोशिकाओं वे अध्ययन करने की योजना में नवीकरण क्षमता का निर्धारण (यह किसी भी रिपोर्टर के लिए सच है) । इन विट्रो clonogenic में से एक के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल क्षेत्र में स्वीकार किए जाते है परख इस15,16पूरा करने के लिए प्रदान की जाती है । अंत में, एक विस्तृत प्रोटोकॉल एक प्रवाह-cytometry आधारित दवा स्क्रीन में भिंनता रिपोर्टर लाइनों के उपयोग का वर्णन अंत में प्रदान की जाती है । नोट की, इसी तरह astroglial भेदभाव प्रणाली के लिए यहां वर्णित है, हम सफलतापूर्वक स्थापित किया है और पुष्टि GSC रिपोर्टर एक MAP2: GFP (न्यूरॉन भेदभाव) रिपोर्टर लाइनों को एकीकृत । इसलिए, इस पत्र में वर्णन के तरीके विभिंन कोशिका वंश में सेलुलर भेदभाव का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है ।

इस रिपोर्ट में कुछ आंकड़े हाल ही में एक प्रकाशन में पाया जा सकता है: "Atracurium Besylate और अंय neuromuscular ब्लॉकिंग एजेंटों astroglial भेदभाव और गिरेगा ग्लियोब्लास्टोमा स्टेम कोशिकाओं को बढ़ावा देने के18।

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Protocol

नोट: Astroglial और न्यूरॉन lentivirus रिपोर्टर सिस्टम पूर्व पैक, केंद्रित lentiviral तैयारी के रूप में खरीदा गया था. प्रवाह cytometry तकनीक के बुनियादी ज्ञान की आवश्यकता है । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल के एक पूर्ण उपयोग के लिए उपयोगकर्ता उच्च प्रवाह क्षमता के साथ एक प्रवाह cytometer के लिए उपयोग की आवश्यकता होगी (९६ स्वीकार करता है-अच्छी तरह से नमूना स्रोत के रूप में प्लेटें) ।

1. Lentiviral Transcriptional रिपोर्टर सिस्टम

नोट: आधारभूत प्रतिदीप्ति की स्थापना के लिए सभी प्रवाह cytometric विश्लेषणों में, माता-पिता, गैर-transduced, कोशिकाओं या वेक्टर-transduced (गैर-फ्लोरोसेंट) कोशिकाओं का उपयोग करें । इसके अलावा, ध्यान दें कि सभी चरणों में जहां यांत्रिक trituration के लिए कहा जाता है, कोमल हो । कठोर trituration नाजुक GSCs और प्रभाव प्रवाह cytometry परिणामों की एक महत्वपूर्ण संख्या को मार सकते हैं ।

  1. प्लेट 1x106 कोशिकाओं को पूरा तंत्रिका स्टेम सेल विकास मध्यम के 2 मिलीलीटर में एक 6-multiwell प्लेट में ।
  2. संक्रमण (मुि) की बहुलता पर lentivirus रिपोर्टर को जोड़कर Transduce कोशिकाओं को 5 के बराबर.
  3. 8 µ g/एमएल के अंतिम एकाग्रता के लिए polybrene के 2 µ l को जोड़ें ।
  4. ३७ ° c और 5% CO2 रातोंरात पर कोशिकाओं को मशीन ।
  5. अगले दिन, विकास माध्यम की जगह अनबाउंड वायरस को दूर करने के लिए । प्लेट ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह पर मशीन में वापस प्लेस2 और 24 घंटे के लिए मशीन ।
  6. फसल कुल मात्रा का ०.५ मिलीलीटर; एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए ३६० x g पर कोशिकाओं नीचे स्पिन और आकांक्षा द्वारा supernatant हटा दें । शेष कोशिकाओं के लिए ताजा तंत्रिका स्टेम सेल विकास माध्यम के ०.५ मिलीलीटर जोड़ें और जारी विस्तार के लिए मशीन के लिए थाली वापस ।
  7. जोड़ें २०० µ पृथक्करण रिएजेंट के एल और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए मशीन ।
  8. अलग कोशिकाओं को धीरे से ऊपर और नीचे pipetting ।
    नोट: कठोर trituration GSCs के महत्वपूर्ण हत्या में परिणाम हो सकता है, पूरा पृथक्करण आमतौर पर 20-30 बार के बाद हासिल की है ।
  9. कक्ष अनुलग्नक या एकत्रीकरण को कम करने के लिए, 1 मिलीलीटर के अंतिम खंड के लिए ८०० µ l को हांक के संतुलित नमक समाधान (HBSS) में जोड़ें ।
  10. स्थानांतरण २०० µ प्रत्येक कोशिका निलंबन के एल एक अच्छी तरह से एक ९६-multiwell प्लेट ।
  11. इस प्रक्रिया के लिए, ९६ के साथ एक benchtop प्रवाह cytometer-अच्छी तरह से प्लेट क्षमता उत्तेजना के लिए एक नीली लेजर के साथ और हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन का पता लगाने की क्षमता के साथ सुसज्जित का उपयोग करें । प्रत्येक अधिग्रहण के लिए कम से १०,००० व्यवहार्य कोशिकाओं के साथ प्रवाह cytometric विश्लेषण प्रदर्शन ।
  12. प्रवाह cytometry द्वारा GFP-धनात्मक कक्षों का प्रतिशत निर्धारित करें ।

2. उपक्लोन चयन, विस्तार, और मांयता

  1. १०० µ एल में प्लेट कोशिकाओं तंत्रिका स्टेम कोशिका मध्यम के एक घनत्व में ०.७ कोशिकाओं के प्रति एक ९६-multiwell प्लेट की अच्छी तरह से ।
  2. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 11 दिनों के लिए संस्कृति क्लोन और 5% सह2। यह चरण उच्च कक्ष प्रकार निर्भर है और संभव है कि उपयोग की गई कक्ष पंक्ति पर आधारित कोई समायोजन की आवश्यकता हो । एक सामांय नियम के रूप में, एक क्षेत्रः व्यास ≥ १०० µm neurospheres में clonogenic GSCs की उपस्थिति का एक अच्छा संकेत है ।
  3. एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप एक FITC फिल्टर के साथ सुसज्जित का उपयोग करना, चिह्नित कुओं है कि एक एकल neurosphere जहां कोशिकाओं के ~ 1-5% GFP-सकारात्मक होते हैं ।
    नोट: GFP के सटीक प्रतिशत का निर्धारण-सकारात्मक कोशिकाओं को भी इस बिंदु पर महत्वपूर्ण नहीं है । बाद में प्रत्येक उपक्लोन का मूल्यांकन फ्लो cytometry द्वारा किया जाएगा । यह कदम क्लोनों की कुल संख्या को कम करने के लिए neurospheres पर जोर देने के साथ विश्लेषण किया है कि विभेदित, GFAP-नकारात्मक, GSC से उत्पंन किया जाता है ।
  4. चयनित रिपोर्टर क्लोन विस्तृत करें जब तक कि प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण के लिए पर्याप्त संख्या में कक्ष न हों । एक उप-धाराप्रवाह अच्छी तरह से एक 6-multiwell प्लेट युक्त ≤ 1.5 x105 कोशिकाओं की कोशिकाओं की एक पर्याप्त संख्या प्रदान करना चाहिए ।
    नोट: अलगाव और GSCs के विस्तार के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया 17उपलब्ध है ।

3. GFAP का निर्धारण: GFP अभिव्यक्ति द्वारा प्रवाह Cytometry

  1. फसल प्रत्येक रिपोर्टर क्लोन और गैर transduced नियंत्रण से कोशिकाओं की एक aliquot (०.५ मिलीलीटर) GFP सकारात्मक कोशिकाओं का सही प्रतिशत निर्धारित करने के लिए । रिपोर्टर क्लोनों कि ~ 1-5% GFP-सकारात्मक कोशिकाओं को ध्यान में रखते ।
  2. कक्ष के तापमान पर 5 मिनट के लिए ३६० x g पर कोशिकाओं स्पिन और आकांक्षा द्वारा supernatant हटा दें ।
  3. प्रत्येक गोली करने के लिए, सेल पृथक्करण रिएजेंट के २०० µ एल जोड़ने और एक पानी ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए सेट स्नान में ट्यूबों गर्मी ।
  4. Triturate कोशिकाओं धीरे (आमतौर पर 20 से 30 बार के बीच) एक ही सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए ।
  5. कक्ष अनुलग्नक या एग्रीगेट को छोटा करने के लिए, ८०० µ l HBSS को 1 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा में जोड़ें.
  6. प्रत्येक कोशिका निलंबन से ९६-multiwell प्लेट के प्रति चहेतों को २०० µ एल स्थानांतरण ।
  7. इस कार्यविधि के लिए, ९६-well प्लेट क्षमता के साथ एक benchtop प्रवाह cytometer का उपयोग करें । प्रत्येक अधिग्रहण के लिए कम से १०,००० व्यवहार्य कोशिकाओं के साथ प्रवाह cytometric विश्लेषण प्रदर्शन ।

4. Clonogenic क्षमता का आकलन करने के लिए ELDA स्व-नवीकरण परख

नोट: नियंत्रण के लिए, दोनों माता पिता, गैर transduced, साथ ही साथ GFP-व्यक्त lentivirus-transduced कोशिकाओं, मूल clonogenic संस्कृतियों जहां से वे थे करने के लिए GSC भेदभाव रिपोर्टर लाइनों के सापेक्ष GSC क्षमता निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए प्राप्त.

  1. अलग अंतर-रिपोर्टर उपक्लोनों को एकल-कक्ष निलंबन के रूप में ऊपर वर्णित किया गया है ।
  2. ९६ में प्लेट कोशिकाओं-multiwell प्लेटों में १०० µ एल पूर्ण तंत्रिका स्टेम सेल विकास मीडिया घनत्व सेल में 5 और ५०० कोशिकाओं के बीच अच्छी तरह से प्रति ।
  3. ३७ ° c और 5% CO2पर 9 से 11 दिनों के लिए कक्षों की मशीन ।
  4. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत neurospheres के प्रत्यक्ष दृश्य द्वारा सकारात्मक कुओं स्कोर । एक अच्छी तरह से विचार किया जाना चाहिए "सकारात्मक" अगर यह शामिल है पर एक एकल बड़ी neurosphere ।
  5. डेटा प्लग: कुल कुओं का विश्लेषण किया और सकारात्मक कुओं की संख्या ELDA ऑनलाइन http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html पर उपलब्ध इंटरफेस का उपयोग कर ।

5. ड्रग लाइब्रेरी कमजोर पड़ने की तैयारी

  1. -८० ° c पर भंडारण से लाइब्रेरी प्लेटें निकालें, एल्यूमीनियम पंनी के साथ कवर (प्रकाश के प्रति संवेदनशील यौगिकों की रक्षा) । लगभग 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए गल ।
  2. एक 12-चैनल मल्टीचैनल pipettor का उपयोग करने के लिए पुस्तकालय यौगिकों को पतला करने के लिए ०.२ mM में पूर्ण तंत्रिका स्टेम सेल मध्यम । ग्रोथ मीडियम में 10% तक पतला DMSO
    नोट: DMSO के अंतिम एकाग्रता ०.१% जब कोशिकाओं को जोड़ा जाना चाहिए । संस्कृति में DMSO के एक उच्च एकाग्रता विषाक्तता में परिणाम हो सकता है । इस कारण से, यह उपचार से पहले सेल लाइन में DMSO के लिए संवेदनशीलता का परीक्षण करने के लिए सिफारिश की है ।
  3. प्रत्येक प्लेट के बाएँ और दाएँ स्तंभों में पाए जाने वाले कक्षों के उपचार के लिए वाहन नियंत्रण के रूप में DMSO का उपयोग करें (स्तंभ 1 और 12; वेल्स A से H) ।
  4. एल्यूमीनियम पंनी के साथ पतला पुस्तकालय प्लेटों को कवर और लंबी अवधि के भंडारण के लिए-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर के लिए मूल पुस्तकालय प्लेटें वापस ।

6. ड्रग स्क्रीन

नोट: DMSO-इलाज कक्षों का उपयोग आधारभूत प्रतिदीप्ति सेट करने और गेटिंग समायोजित करने के लिए किया जाना चाहिए ।

  1. प्लेट 5x103 कोशिकाओं में एक ९६-multiwell प्लेट में ९९ µ एल में पूरा तंत्रिका स्टेम सेल विकास मध्यम ।
  2. एक 12-चैनल मल्टीचैनल pipettor का प्रयोग, 2 µ एम के अंतिम एकाग्रता में पतला पुस्तकालय यौगिकों के साथ कोशिकाओं का इलाज (०.२ mM ड्रग का 1 µ एल सेल निलंबन के एल में) या µ (नियंत्रण) के साथ । ३७ ° c और 5% CO2पर ७२ h के लिए प्लेट्स की मशीन ।
  3. एक 12-चैनल मल्टीचैनल pipettor एक अच्छी तरह से और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए गर्मी के लिए सेल पृथक्करण रिएजेंट के १५० µ एल जोड़ने का उपयोग करना ।
  4. अलग कोशिकाओं को एक 12 चैनल मल्टीचैनल pipettor के साथ धीरे से triturating तक एकल सेल निलंबन (आमतौर पर 20 से 30 बार के बीच) हासिल की है । अलग neurospheres करने के लिए आवश्यक समय की मात्रा पूरी तरह से GSC रेखाओं के बीच भिन्न होगा । जबकि अनुशंसित सेल पृथक्करण रिएजेंट (सामग्री देखें) सुरक्षित है और ४५ मिनट तक के लिए गर्मी का परीक्षण किया एकाधिक GSC लाइनों में व्यवहार्यता पर कोई प्रभाव नहीं था, स्क्रीनिंग में इस्तेमाल किया जा करने के लिए प्रत्येक GSC लाइन के लिए सत्यापित करें ।
    नोट: प्रत्येक अच्छी तरह से अंतिम मात्रा में लगभग २५० µ एल (सेल निलंबन के १०० µ एल + १५० µ सेल पृथक्करण रिएजेंट के एल) होना चाहिए ।
  5. GFAP: GFP रिपोर्टर द्वारा प्रवाह cytometry व्यक्त कक्षों का प्रतिशत निर्धारित करें । मानक गेटिंग रणनीति का उपयोग करें । सबसे पहले, आगे और पक्ष तितर बितर करने के लिए सेल आकार और व्यवहार्यता के एक सामांय अर्थ मिलता है । तो व्यवहार्य एकल सेल जनसंख्या पर एक गेट जगह है । यही वह आबादी है जिसके लिए ग्रीन प्रतिदीप्ति (eGFP) का निर्धारण किया जाएगा । नियंत्रण (DMSO-इलाज) पर तीन मानक विचलन से GFP-धनात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत में वृद्धि में परिणाम किसी भी यौगिक एक सकारात्मक हिट के रूप में माना जाता है. यह थ्रेशोल्ड विशिष्ट अनुप्रयोग और इच्छित stringency के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए ।
    नोट: उच्च प्रवाह स्क्रीन के लिए एक एकल GSC रिपोर्टर उपक्लोन का उपयोग करने की सिफारिश की है । हिट पहचान के बाद, प्रत्येक हिट एक ही GSC लाइन से अतिरिक्त रिपोर्टर उपक्लोनों के खिलाफ मांय किया जाना चाहिए । सच हिट के लिए विश्वास बढ़ाने के लिए भी रिपोर्टर उपGSC अलग neurospheres लाइनों से अलग क्लोनों के खिलाफ परीक्षण यौगिकों की सिफारिश है ।

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Representative Results

तीन स्वतंत्र रोगी-व्युत्पंन neurospheres लाइनों lentivirus astroglial रिपोर्टर एक ग्रीन-फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) में आपस में जुड़े के लिए एंकोडिंग के साथ transduced थे एक Zeocin प्रतिरोध कैसेट के साथ फ्रेम और मानव GFAP प्रवर्तक तत्व द्वारा संचालित ( चित्र 1) । अगले व्यक्तिगत क्लोन एक ९६ अच्छी तरह से प्लेट में प्रति अच्छी तरह से ०.७ कोशिकाओं चढ़ाना द्वारा अलग किया गया (चित्रा 2), यह GFP व्यक्त कोशिकाओं के प्रतिशत का प्रवाह cytometric निर्धारण के बाद किया गया था (चित्रा 3) । Neurosphere क्लोन, एकल कोशिकाओं से व्युत्पंन, युक्त ≤ 5% GFP-सकारात्मक कोशिकाओं के रूप में संदर्भित कर रहे है जीएल (GFAP कम) ≥ ७५% GFP सकारात्मक कोशिकाओं के रूप में संदर्भित कर रहे है GH (GFAP उच्च) के रूप में जाना जाता है और gl की तुलना में अधिक विभेदित माना जाता है उपक्लोन (चित्र 4) ।

एजेंटों और रास्ते जो GSCs में astroglial भेदभाव को नियंत्रित कर सकते हैं की पहचान करने के लिए, एक छोटे अणु दवा दो NIH नैदानिक संग्रह पुस्तकालयों का उपयोग कर स्क्रीन प्रदर्शन किया गया था. कोशिकाओं ७२ घंटे के लिए NIH नैदानिक संग्रह मैं और द्वितीय, 2 µ मीटर या एक नियंत्रण के रूप में DMSO के एक बराबर मात्रा की एकाग्रता पर सेट से ७२७ पुस्तकालय एजेंटों के साथ इलाज किया गया । इन एजेंटों का प्रभाव हमारे सभी रोगी में सेल व्यवहार्यता पर परीक्षण किया गया था-०.२ µ मीटर से लेकर 20 µ मीटर तक सांद्रता पर जीबीएम neurosphere लाइनों व्युत्पंन, दवा स्क्रीनिंग से पहले । इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल एकाग्रता हमें यौगिकों कि astroglial भेदभाव पैदा करने में सक्षम थे और एक ही समय में पहचान करने के लिए अनुमति दी, यह उच्च दवा सांद्रता के कारण संभावित बंद लक्ष्य विषाक्त प्रभाव को कम किया ।

बाद की मशीन, हम GFAP प्रवाह cytometry द्वारा GFP रिपोर्टर व्यक्त कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित किया है । GFP की व्यवहार्यता और प्रतिशत के लिए आधारभूत-सकारात्मक कोशिकाओं को प्रत्येक पुस्तकालय की थाली के लिए कम से कम तीन कुओं में निर्धारित किया गया था, और एक सकारात्मक हिट GFP के प्रतिशत में वृद्धि के रूप में निर्धारित किया गया-सकारात्मक कोशिकाओं के आधार पर तीन मानक विचलन (DMSO) और 25% GFP सकारात्मक कोशिकाओं की एक ंयूनतम सीमा । हम 12 दवाओं है कि GFP-सकारात्मक जनसंख्या (तालिका 1) में पर्याप्त वृद्धि प्रेरित की पहचान की ।

Figure 1
चित्रा 1: Astroglial विभेदक रिपोर्टर प्रणाली ।
pGreenZeo GFAP के योजनाबद्ध आरेख: GFP रिपोर्टर. GSCs glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) प्रवर्तक को सक्रिय करने के लिए आवश्यक प्रतिलेखन कारकों का उचित संयोजन व्यक्त नहीं करते हैं और इसलिए GFP (शीर्ष पैनल) व्यक्त नहीं करेंगे । हालांकि, जब उचित प्रतिलेखन कारक मौजूद है (जैसे जब कोशिकाओं को एक astroglial भाग्य का अधिग्रहण-अंतर) GFAP प्रमोटर सक्रिय हो जाता है, और कोशिकाओं GFP रिपोर्टर (नीचे पैनल) व्यक्त करेंगे । (GSC-तंत्रिकाबंधार्बुद स्टेम सेल, T2A-प्रोटीन लिंकर, Zeo-आर-Zeocin प्रतिरोध जीन, TF-प्रतिलेखन फैक्टर) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: Astroglial विभेद-उपक्लोन चयन ।
एचएसआर-GBM1 GSC उपक्लोनों के प्रतिनिधि चित्र निंन स्तर (GL) या उच्च स्तर (GH) व्यक्त GFAP के GFP माइक्रोस्कोपी (प्रतिदीप्ति आवर्धन का उपयोग कर दिखाया गया है): 40X रिपोर्टर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: ग्रीन प्रतिदीप्ति के निर्धारण के लिए प्रवाह Cytometry ।
एचएसआर-GBM1 रोगी-व्युत्पन्न neurosphere रेखा GFAP के साथ transduced थी: GFP रिपोर्टर lentivirus और अनेक उपक्लोनों का चयन GFP में neurosphere अभिव्यक्ति के आधार पर किया गया था-सेल और प्रवाह cytometry द्वारा पुष्टि । इन क्लोनों या तो GL (GFAP कम) या GH (GFAP उच्च) नाम दिया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: एचएसआर के कार्यात्मक लक्षण-GBM1 GFAP: GFP उपक्लोनों ।
GL उपक्लोनों के रूप में अति सीमित कमजोर पड़ने विश्लेषण (ELDA) द्वारा मापा जाता है जो बढ़ी हुई GSC आवृत्तियों द्वारा संकेत के रूप में इन विट्रो में अधिक clonogenic हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

नाम GFP + कोशिकाओं में गुना वृद्धि विवरण रक्त मस्तिष्क बाधा ड्रग बैंक संभाव्यता
Vinorelbine ८.९७ एंटी-mitotic कीमोथेरेपी - ०.८८
Diphenoxylate १३.८९ Antidiarrheal + ०.९६
Lomerizine १०.८९ कैल्शियम चैनल अवरोधक/सेरेब्रल vasodilator ना ना
Phenprobamate १०.७३ Anxiolytic/बलवान ˇ, केंद्रीय अभिनय ना ना
6-Azauridine १५.०७ Antimetabolite/एंटीवायरल ना ना
irinotecan १४.१४ Topisomerase मैं अवरोध करनेवाला + ०.६३
Atracurium Besylate ८.१६ Nondepolarizing कंकाल की मांसपेशी आराम + ०.९३
बिटा ८.७५ मधुमेह + ०.७३
Hexachlorophene ९.८३ एंटीसेप्टिक + ०.९२
डिगोक्साइन ८.२३ Cardiotonic ग्लाइकोसाइड - ०.७२
Flecainide 10 एंटी-अतालता एजेंट + ०.८६
Nisoldipine ५.०५ कैल्शियम चैनल अवरोधक - ०.९५

तालिका 1: छोटे अणुओं उत्प्रेरण GFAP-GFP रिपोर्टर अभिव्यक्ति में एचएसआर-GBM1 GL-1
बारह यौगिकों GFP-व्यक्त कोशिकाओं के प्रतिशत में वृद्धि करने के लिए काफी पाया गया (गुना वृद्धि दिखाया गया है) और आधारभूत, DMSO-इलाज कोशिकाओं पर ≥ 3 मानक विचलन के कड़े मानदंडों से मुलाकात की, और कोई 25% से कम GFP-सकारात्मक कोशिकाओं के साथ. रक्त मस्तिष्क बाधा (ड्रग बैंक (−) को पार करने के लिए किसी दिए गए एजेंट की क्षमता और संभाव्यता । संक्षिप्त नाम: NA (जानकारी उपलब्ध नहीं) ।

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Discussion

जबकि GSCs के पिछले अध्ययनों के सबसे मुख्य रूप से मार्करों कि उंहें परिभाषित पर ध्यान केंद्रित, इस अध्ययन में हम रिवर्स दृष्टिकोण लेने का फैसला किया । हम GSCs द्वारा उत्पन्न विभेदित जिन्नों पर मुख्य रूप से ध्यान केंद्रित करते हैं (जैसे, कोशिकाओं astroglial और ंयूरॉंस मार्करों व्यक्त) । यहां हम एक सेल के उपयोग का प्रदर्शन उच्च प्रवाह दवा स्क्रीनिंग प्रणाली है, जो मानव GFAP प्रवर्तक GFP के आश्रित अभिव्यक्ति पर आधारित है आधारित है । सभी प्रयोगों रोगी-व्युत्पंन neurosphere ग्लियोब्लास्टोमा सेल लाइनों का उपयोग प्रदर्शन किया गया । एक विस्तृत प्रोटोकॉल अलगाव और इन पंक्तियों के विस्तार का वर्णन Galli एट अल17में वर्णित है ।

प्रणाली न केवल हमें छोटे अणुओं जो GSCs के सेलुलर भेदभाव उत्प्रेरण में सक्षम है की पहचान में सहायता प्राप्त है लेकिन यह भी हमें स्पष्ट है कि astroglial भिंनता मार्कर GFAP की अभिव्यक्ति निर्धारित करने में मदद की GSC आवृत्तियों की तुलना करके व्यक्तिगत जीबीएम कोशिकाओं की clonogenic क्षमता. ELDA परख Yifang हू और गॉर्डन कश्मीर सजल द्वारा विकसित किया गया था । पाठकों के लिए एक में परख शक्तियों और सीमाएं15की गहराई से समझ के लिए पांडुलिपि पढ़ने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है । कॉलोनी गठन स्कोरिंग कदम उच्च सेल प्रकार निर्भर है और संभावना है कि इस्तेमाल किया सेल लाइन पर आधारित एक समायोजन की आवश्यकता होगी । इसके अलावा, एक सामांय नियम के रूप में, हम एक अच्छा संकेत है कि neurosphere एक clonogenic GSC द्वारा उत्पंन किया गया था के रूप में क्षेत्रः व्यास ≥ १०० µm का उपयोग करें ।

इसके अलावा, हम यहां का वर्णन दवा स्क्रीनिंग प्रणाली उपंयास रास्ते (विशेष रूप से acetylcholine और कैल्शियम परिवहन) है कि विभेदित राज्य में GSCs बनाए रखने के लिए आवश्यक है की पहचान के लिए अनुमति देता है (1 तालिका देखें) । शुरू दवा एकाग्रता पुस्तकालय और सेल लाइन का उपयोग के आधार पर भिन्न हो सकते हैं । इसके अलावा, सेलुलर भेदभाव के लिए आवश्यक समय समायोजन की आवश्यकता हो सकती है । इसके अलावा, दवा हिट के tumorigenic सत्यापन vivo ट्यूमर दीक्षा परख 18 में एक की आवश्यकता है ।

संभवतः इस तकनीक की एक छोटी सी सीमा है कि सहज भेदभाव अनिवार्य रूप से किसी भी स्टेम सेल समृद्ध संस्कृति में होता है, और इस घटना के लिए संस्कृति में मार्ग की संख्या के साथ वृद्धि होती है और व्यक्तिगत उपक्लोनों के बीच अलग है । दरअसल, हम आम तौर पर 15 बीतने के बाद हमारे उपक्लोनों में सहज भेदभाव मनाया । इसलिए, हम सीमित संख्या पांच से अधिक नहीं है पर संस्कृतियों के लिए हमारे विभेद विश्लेषण ।

इसलिए, शायद इस पद्धति में सबसे महत्वपूर्ण बिंदु इन विट्रो passaging इन GSCs की न्यूनतम करने के लिए रखने के लिए है और जब इन विट्रो मेंकाम कर रहे, नीचे संस्कृति घनत्व को बनाए रखने के लिए 1.5 x105 कोशिकाओं/ इसके अलावा, यह अत्यधिक की सिफारिश की है कि प्रत्येक दवा "हिट" एक ही GSC लाइन से अतिरिक्त रिपोर्टर उपक्लोनों के खिलाफ मांय है, के रूप में अच्छी तरह के रूप में, रिपोर्टर उप अलग रोगी से अलग क्लोन-GSC neurospheres लाइनों व्युत्पंन । यह विश्वास है कि एक सच "हिट" हाथ में है वृद्धि होगी ।

इस मजबूत प्रोटोकॉल में वर्णित पद्धति की बहुमुखी प्रतिभा को एक दवा प्रेरित कैंसर स्टेम कोशिका भेदभाव के चिकित्सीय मूल्य को मजबूत और जीबीएम और अंय ट्यूमर के लिए संभावित उपंयास चिकित्सकीय रणनीतियों के रूप में नई दवाओं की पहचान करने में मदद करनी चाहिए । अंत में, परख के लिए गैर के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है नवोत्पादित तंत्रिका स्टेम सेल, अंय प्रकार के कैंसर, और विभिंन भिंनता संवाददाताओं के साथ अनुकूलित किया जाएगा ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को आंशिक रूप से NIH R01CA187780 ने समर्थन दिया है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ESGRO Complete Accutase EMD Millipore SF006
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2650
HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) Sigma Aldrich H6648
Human GFAP Differentiation Reporter (pGreenZeo, Virus) SBI (System Biosciences) SR10015VA-1
50 ml sterile disposable reagent reservoirs Corning 4870
6 well plate Thermo Fisher Scientific 130184
96 well plate Falcon 353072
Biolite T25 cm² Flask Vented Thermo Fisher Scientific 130189
Biolite T75 cm² Flask Vented Thermo Fisher Scientific 130190
15 ml Centrifuge tubes Celltreat 229411
1.5ml Microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-129
Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 0.5 - 20uL VistaLab Technologies 1060-0020
Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 5-250uL VistaLab Technologies 1060-0250
Multi 12-channel pipette tips 25 μl VistaLab Technologies 4060-1002
Multi 12-channel pipette tips 250 μl VistaLab Technologies 4060-9025
Guava easyCyte 5HT Benchtop Flow Cytometer EMD Millipore 0500-4005
NIH Clinical Collections 1 and 2 small molecule libraries Evotec
Name Company Catalog Number Comments
For the preparation of neural stem cell media (500 mL) Final concentration
BSA GoldBio.com A-421-250 0.20%
DMEM/F12 10X Corning 90-091-PB 1X
Heparin sodium salt Sigma Aldrich H3149 0.0002%
HEPES 1M Sigma Aldrich H4036 5.4 mM
Insulin-Transferrin- Selenium (ITS -G) (100X) Life Technologies 41400-045 1X
NaHCO3 Sigma Aldrich S-5761 14.5 mM
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) 100X Gibco 15140-122 1X
Progesterone Sigma Aldrich P8783 16 nM
Putrescine Sigma Aldrich P5780 4.8 µM
Basic FGF (FGF2), Human GoldBio 1140-02-50 10 ng/ml
EGF, Human GoldBio 1150-04-100 20 ng/ml
Bottle-Top Filter, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind Corning 431160 Use to filter sterlize media

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References

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कैंसर जीव विज्ञान अंक १३१ स्टेम सेल तंत्रिकाबंधार्बुद Astrocytic विभेद Lentivirus रिपोर्टर प्रणाली ड्रग स्क्रीन भेदभाव थेरेपी एसिटाइल Choline कैल्शियम संकेतन
ग्लियोब्लास्टोमा स्टेम कोशिकाओं के सेलुलर भेदभाव को बढ़ावा देने कि छोटे अणुओं की पहचान के लिए प्रवाह Cytometry आधारित दवा स्क्रीनिंग प्रणाली
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Spina, R., Voss, D. M., Asnaghi, L., Sloan, A., Bar, E. E. Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells. J. Vis. Exp. (131), e56176, doi:10.3791/56176 (2018).

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