Summary
Bir verimli tarama Protokolü glioblastoma kök hücreler (GSCs) astroglial farklılaşma teşvik küçük moleküller tanımlanması için sunulmaktadır. Tahlil sayede gelişmiş GFP (eGFP) ifade insan GFAP'nin düzenleyici tarafından tahrik edilmektedir bir kök hücre farklılaşması muhabir temel alır.
Abstract
Glioblastoma (GBM) yaklaşık 14.000 ölümlerin her yıl ABD tek başına neden erişkinlerde en sık görülen ve en ölümcül birincil beyin tümörü olduğunu. Medyan sağkalım tanı takip maksimal cerrahi rezeksiyon, radyasyon ve temozolomide kemoterapi ile 15 aydan daha az oldu. Daha etkili GBM tedaviler geliştirmede içsel sorunları giderek açık olmuştur ve onun inatçı invasiveness, dayanıklılığı, standart tedaviler, genetik karmaşıklığı ve moleküler uyum ve GBM altgrupları şunlardır normal kök hücre, fenotipik benzerlikleri hücrelerle glioblastoma kök hücreler (GSCs) burada anılacaktır. GSCs tümör büyüme ve ilerleme için gerekli olduğundan, farklılaşma tabanlı terapisi bu tedavi edilemez neoplazmlar için uygun tedavi yöntemi temsil eder.
Aşağıdaki iletişim kuralı çeşitli GSC astroglial farklılaşma teşvik küçük moleküller tanımlaması amaçlı platform eleme yüksek üretilen iş kurmak için yordamlar açıklanır. Sistemin özünde gliyal fibrillary asidik protein (GFAP'nin) ayrımında muhabir yapıdır. İletişim kuralı aşağıdaki genel yordamlar vardır: (1) GSC farklılaşma muhabir satırları; kurulması (2) doğrulama sınama?; / muhabir alaka GSC öz-yenileme/klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar kapasitesi ve (3) yüksek kapasiteli Akış Sitometresi uyuşturucu tarama tabanlı.
Tarama platform GSCs farklılaşma teşvik küçük moleküller tanımlamak için basit ve ucuz bir yaklaşım sağlar. Ayrıca, kitaplıkları FDA tarafından onaylanan ilaçların kullanımı daha hızlı güvenilemez ajanların tanımlanması için bir potansiyele sahiptir. Ayrıca, kanser kök hücre farklılaşması teşvik terapiler sinerjik hedef ve öncelikle daha fazla farklı kanser hücrelerinin ortadan kaldırmak için gösterilen geçerli "bakım standart" terapileri ile çalışması öngörülür.
Introduction
Son yıllarda yapılan çalışmalarda tümör küçük bir nüfus içerir göstermiştir kanser kök hücreleri (CSCs) veya tümör başlatılıyor hücreleri, hücrelerinin tümör ilerleme, metastaz ve direnç kemoterapi ve radyo terapi 1, sorumlu olan 2. kanser kök hücreleri ve onların daha farklılaştırılmış ettiklerinizden içinde tümör varlığı intratumoral heterojenlik teşvik önemli bir faktör olarak kabul edilir ve böylece kanser3tedavisinde büyük bir engel temsil eder. Tümör hücre sıradüzeni, kanser kök hücre teorisi tarafından sağlanan kanserleri 4tedavisi için yeni strateji geliştirme ilham kaynağı olmuştur. Kanser kök hücreleri hedefleme için bir yaklaşım tanımlamak ve etkilenen organ embriyonik gelişim sırasında gerekli olduğu bilinmektedir sinyal yolları inhibe etmektir. Nitekim, biz ve diğerleri daha önce birden fazla kağıtları sinirsel kök hücre ile ilgili sinyal yollar Sonic Kirpi ve çentik glioblastoma5,6,7devam eden gereksinimini açıklayan yayımlanmıştır. Bu eser birkaç GBM klinik deneyler için gerekçe güçlendirilerek yardımcı oldu. Kanser kök hücreleri hedefleme için ikinci bir yaklaşım kendi farklılaşma teşvik etmektir. Bu yaklaşım retinoik asit (ATRA, A vitamini analog) ile akut promyelötik lösemi tedavisinde preklinik ve klinik çalışmalar çok olumlu sonuçlar nedeniyle destek aldı. Burada ATRA olgunlaşma blok kaldırmak ve kanser hücre farklılaşması8teşvik bulundu. Daha yakın zamanlarda, Piccirillo ve meslektaşları zarif BMP-4 GSC farklılaşma astrocytes önemli anti-GBM etkileri vitro ve in vivo9içine teşvik göstermiştir.
Çalışmada için gerekçe GSCs hedefleme için "tersine mühendisliği" yaklaşımı temel alır. GBM ve kanser işaretlerinden biri olan zavallı farklılaşma ile mevcut geniş heterojenite göz önüne alındığında, biz daha olumlu bir fenotip - farklılaşma içine bir astrocyte gibi devlet teşvik istedi. Burada, biz önceden bilgi sahibi bir belirli tümör numune GSCs korumak, ancak oldukça istenen fenotip (örneğin GFAP'nin pozitifliği) elde etmek amacı sinyal yolları yok.
Bu rapor GSC farklılaşma muhabir-satırlarından GSC zenginleştirilmiş kültürlerin iletim GSC klonal seçim kurmak için kullanılan yordamları açıklar. Kullanılan glioblastoma neurosphere çizgiler Laboratuvarı Profesör Angelo Vescovi hastaların hastane San Raffaele - Milano, İtalya, birincil glioblastoma tanısı ile kuruldu. Bu satırları çeşitli yayınları 6,10,11,12,13,14' te kapsamlı bir şekilde inceledik. Onların laboratuvarda bu teknikleri uygulamak için ilgi duyan bireyler muhabir kanser kök hücre kendini yenileme kapasite çalışmaya planladıkları hücrelerdeki alaka düzeyi belirlemek önerilir (Bu herhangi bir muhabir için geçerlidir). Detaylı bir iletişim kuralı alanında kabul vitro klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar deneyleri biri için bu15,16gerçekleştirmek için sağlanmıştır. Son olarak, farklılaşma muhabir satırlarında bir Akış Sitometresi dayalı uyuşturucu testi kullanımını açıklayan ayrıntılı bir protokol vasıl belgili tanımlık son sağlanır. Belirtmek gerekirse benzer şekilde burada, açıklanan astroglial farklılaşma sistemi biz başarıyla kurulan ve bir MAP2:GFP (Nöronal Farklılaşma) muhabiri entegre GSC muhabir satırları doğrulanmış. Bu nedenle, bu yöntemleri tarif kağıt çeşitli hücre soy içine hücresel başkalaşım çalışmaya uygulanan.
Bu rapordaki rakamlar bazıları son yayında bulunabilir: "Atracurium besilat ve diğer nöromüsküler engelleyici ajanlar astroglial farklılaşma teşvik ve glioblastoma kök hücre18tüketmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Astroglial ve nöronal lentivirus muhabir sistemleri önceden, konsantre lentiviral hazırlıkları satın alındı. Akış Sitometresi tekniği temel bilgisi gereklidir. Ayrıca, bu iletişim kuralı tam kullanımı için kullanıcı Akış Sitometresi (96-şey plakaları örnek kaynağı olarak kabul eder) yüksek üretilen iş kapasitesi ile erişiminiz olmalıdır.
1. lentiviral transkripsiyon muhabir sistemi
Not: tüm akış sitometrik analizleri ebeveyn, Sigara transduced, hücreleri veya vektör transduced (floresan olmayan) hücreleri temel Floresans oluşturmak için kullanın. Tüm adımlar için mekanik toz çağrıldığı nazik ol da, unutmayın. Sert toz kırılgan GSCs önemli sayıda öldürmek ve Akış Sitometresi sonuçları etkiler.
- 6-multiwell plaka tam sinir kök hücre büyüme ortamının 2 mL 1 x 106 hücrelerde plaka.
- Hücreleri enfeksiyon (moi) 5'e eşit bir çokluğu, lentivirus muhabir ekleyerek transduce.
- Polybrene 8 µg/mL nihai bir konsantrasyon için 2 µL ekleyin.
- 37 ° C ve % 5 CO2 hücreleri gecede kuluçkaya.
- Ertesi gün, ilişkisiz virüs kaldırmak için büyüme orta yerine. Plaka da kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2 geri yerleştirin ve 24 saat kuluçkaya.
- Hasat toplam hacminin 0.5 mL; spin aşağı 15 mL konik tüp içinde oda sıcaklığında 5 min için 360 x g hücreleri ve süpernatant aspirasyon tarafından kaldırın. 0.5 mL taze nöral kök hücre büyüme ortamının kalan hücrelere ekleme ve plaka kuluçka makinesi sürekli genişleme için geri dönün.
- Ayrılma reaktif 200 µL ekleyin ve 37 ° C'de 5 min için kuluçkaya
- Hücreleri yukarı ve aşağı yavaşça pipetting tarafından ayırmak.
Not: Sert toz GSCs önemli öldürülmesi neden olabilir, tam ayrılma genellikle 20 - 30 kere sonra elde edilir. - Hücre eki veya toplama en aza indirmek için 800 µL, Hank'in dengeli tuz çözüm (HBSS) 1 ml nihai bir birim için ekleyin.
- Her hücre süspansiyon, 200 µL 96-multiwell plaka bir kuyu için transfer.
- Bu yordam için benchtop Akış Sitometresi uyarma için mavi lazer yeşil flüoresan protein algılama yeteneği ile techiz 96-şey plaka özelliği ile kullanın. Akış sitometrik analizi ile en az 10.000 hücrelerin her satın alma için gerçekleştirin.
- GFP pozitif hücre yüzdesi Akış Sitometresi tarafından belirler.
2. subclone seçim, genişleme ve doğrulama
- Plaka hücrelerinde sinir kök hücre orta iyi bir 96-multiwell plaka başına 0,7 hücre yoğunluğu, 100 µL.
- 37 ° C ve % 5 CO211 gün kültür klonlar. Bu adım çok hücre türü bağımlı olan ve büyük olasılıkla kullanılan hücre satır tabanlı bir ayarlama gerektirir. Genel bir kural olarak, bir küre çapı ≥ 100 µm neurospheres içinde klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar GSCs varlığı iyi bir göstergesidir.
- FITC filtre ile donatılmış bir floresan mikroskop kullanarak, hücrelerin % ~ 1-5 GFP pozitif nerede tek bir neurosphere içeren wells işaretleyin.
Not: GFP pozitif hücreler tam yüzdesini belirleme bu noktada çok kritik değildir. Her subclones biri daha sonra Akış Sitometresi tarafından değerlendirilecektir. Bu adımı toplam azaltmak için gerçekleştirilen farklılaşmamış klonlar tarafından kaynaklanan neurospheres vurgu ile çözümlenmesi için sayısı, GFAP'nin negatif, GSC. - Hücreleri tarafından Akış Sitometresi Analizi için yeterli sayıda kadar seçili muhabir klonlar genişletin. 6-multiwell tabakta ≤ 1.5x105 hücre/mL içeren bir alt Konfluent kuyu hücreleri yeterli sayıda sağlamalıdır.
Not: Kullanılabilir 17yalıtım ve GSCs genişlemesi için detaylı bir işlemdir.
3. Akış Sitometresi tarafından GFAP:GFP ifade tespiti
- Bir aliquot hücre (0.5 mL) her muhabir klon ve sigara transduced denetimlerden GFP pozitif hücreler tam yüzdesini belirlemek için hasat. ~ 1-%5 GFP pozitif hücre içeriyor muhabir klonlar düşünüyor.
- Senaryo Özeti 360 x g oda sıcaklığında 5 min için spin ve süpernatant aspirasyon tarafından kaldırın.
- Her Pelet için hücre ayrılma reaktif 200 µL ekleyin ve 37 ° C'ye ayarla bir su banyosu tüplerde kuluçkaya
- Hücreleri nazikçe bir tek hücre süspansiyon (genellikle arasında 20'ye 30 kere) elde etmek için triturate.
- Hücre eki veya toplama en aza indirmek için 1 mL son bir hacim için 800 µL HBSS ekleyin.
- İyi bir 96-multiwell plaka başına 200 µL her hücre süspansiyon aktarın.
- Bu yordam için benchtop Akış Sitometresi 96-şey plaka özelliği ile kullanın. Akış sitometrik analizi ile en az 10.000 hücrelerin her satın alma için gerçekleştirin.
4. ELDA kendini yenileme tahlil klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar kapasitesini değerlendirmek için
Not: denetimler için lentivirus transduced hücreleri, her iki ebeveyn, Sigara transduced, aynı zamanda GFP ifade GSC farklılaşma muhabir hatları içinden olduklarını özgün GSC kültürler için göreli klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar potansiyelini belirlemek için kullanılmalıdır türetilmiş.
- Farklılaşma-muhabir subclones tek hücreli süspansiyonlar içine yukarıda açıklandığı gibi ayırmak.
- İyi başına 5 ila 500 hücreleri arasında değişen hücre yoğunluğu, tam sinir kök hücre büyüme ortamının 100 µL 96-multiwell levha plaka hücrelerde.
- Hücreleri CO237 ° C ve % 5, 9-11 gün kuluçkaya.
- Neurospheres hafif bir mikroskop altında doğrudan görselleştirme tarafından olumlu wells puan. Bir de "en azından bir tek büyük neurosphere içeriyorsa, pozitif" düşünülmelidir.
- Veri takın: Toplam analiz wells ve olumlu kuyu http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html kullanılabilir ELDA çevrimiçi arabirimini kullanarak sayısı.
5. uyuşturucu Kütüphane seyreltme hazırlık
- Depolama-80 ° C'de kitaplık plakaları kaldırmak için kapak alüminyum folyo ile (ışığa duyarlı bileşikler korumak). Yaklaşık 30 dakika bir saat oda sıcaklığında erimek.
- 12 kanallı çok kanallı pipettor Kütüphane bileşenleri tam sinir kök hücre Orta 0.2 mm sulandırmak için kullanın. DMSO büyüme orta % 10 oranında seyreltin
Not: DMSO son konsantrasyonu hücrelere eklendiğinde % 0,1 olmalıdır. DMSO daha yüksek bir konsantrasyon kültür toksisite neden olabilir. Bu nedenle, bu, daha önce kullanılan hücre doğrultusunda DMSO duyarlılık test etmek için tavsiye edilir. - Her plaka (sütun 1 ve 12; sol ve sağ sütunda bulunan hücreleri tedavi için araç kontrol DMSO kullanın Kuyu A ile H).
- Alüminyum folyo ile seyreltilmiş Kütüphane kuruyucu ve orijinal kitaplık plakaları-80 ° C dondurucu uzun süreli depolama için geri dönün.
6. uyuşturucu testi
Not: DMSO tedavi hücreleri temel Floresans ayarla ve geçişi ayarlamak için kullanılır.
- 5 x 103 hücreleri 99 µL tam sinir kök hücre büyüme ortamının bir 96-multiwell plaka plaka.
- 12 kanallı çok kanallı pipettor kullanarak, hücreleri DMSO (kontrol) veya 2 µM (0.2 mM ilaç hücre süspansiyon, 99 µL içine 1 µL) son bir konsantrasyon, seyreltilmiş Kütüphane bileşenleri ile tedavi. Tabaklar CO237 ° C ve %5 72 h için kuluçkaya.
- 12 kanallı çok kanallı pipettor kullanarak her şey için hücre ayrılma reaktif 150 µL ekleyin ve 37 ° C'de 20 dk için kuluçkaya
- Hücreleri tek hücre süspansiyon (genellikle arasında 20'ye 30 kere) elde kadar yavaşça 12 kanallı çok kanallı pipettor ile triturating tarafından ayırmak. Neurospheres tamamen ayırmak için gereken süreyi GSC satırları arasında değişir. Önerilen hücre ayrılma reaktif (malzemeleri görmek) güvenli ve kuluçka en fazla 45 dakika için test birden çok GSC satırlarında canlılığı üzerinde bir etkisi vardı iken, tarama kullanılmak üzere her GSC satır için doğrulayın.
Not: Her son hacim de yaklaşık 250 µL (hücre süspansiyon, 100 µL + hücre ayrılma reaktif 150 µL) olmalıdır. - GFAP:GFP muhabir Akış Sitometresi tarafından ifade hücreleri yüzdesini belirleyin. Standart gating stratejiyi kullanın. İlk olarak, hücre boyutunu ve canlılığı genel bir fikir edinmek için ön ve yan scatter arsa. Sonra bir kapı üzerinde uygun tek hücreli nüfus yer. Yeşil floresan (eGFP) belirlenecektir nüfus bu. Herhangi bir bileşik bir artış yüzde GFP pozitif sonuçlar üç standart sapmalar tarafından üzerinde kontrol hücreleri (DMSO tedavi) olumlu "hit" olarak kabul edilir Bu eşik belirli uygulama ve istenen sıkılık göre ayarlanmalıdır.
Not: yüksek işlem hacmi için ekran tek GSC muhabir subclone kullanılması önerilir. Hit kimlik her ek muhabir subclones aynı GSC satırından karşı doğrulanması. Gerçek sayısı için güven artırmak için de tavsiye bileşikler muhabir subclones karşı test farklı GSC neurospheres satırları izole.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Üç bağımsız hasta kaynaklı neurospheres çizgi erimiş yeşil-floresan protein (GFP) içinde-çerçevesi için bir Zeocin direnç kaset ile kodlama lentivirus astroglial muhabir ile transduced ve insan GFAP'nin organizatörü unsuru ( tahrik Şekil 1). Sonraki bireysel klonlar 96 iyi plaka (Şekil 2) bir kuyu başına 0,7 hücre kaplama tarafından izole, bu akış sitometrik belirlenmesi GFP (şekil 3) ifade hücre yüzdesi tarafından izledi. ≥75% GFP pozitif hücreleri içeren klonlar GH (GFAP'nin yüksek) adlandırılır ve daha GL ile karşılaştırıldığında farklı kabul edilir iken Neurosphere klonlar, ≤5% GFP pozitif hücreleri içeren tek hücrelerden türetilmiş GL (GFAP'nin düşük) adlandırılır subclones (şekil 4).
İki NIH klinik koleksiyon kitaplığı kullanarak bir küçük molekül uyuşturucu testi ajanlar ve GSCs astroglial farklılaşma denetleyen yollar tanımlamak için gerçekleştirildi. I ve II, NIH klinik koleksiyonundan 727 Kütüphane ajanlar ile 72 saat kümesi için 2 µM bir konsantrasyon veya denetimi olarak DMSO eşit bir hacmi hücreleri tedavi edildi. Bu ajanların etkisi tüm hasta kaynaklı GBM neurosphere hatlarımız konsantrasyonlarda 0.2 µM uyuşturucu tarama önce 20 µM arasında değişen hücre canlılığı üzerinde test edildi. Bu iletişim kuralı astroglial farklılaşma ikna edebildik bileşikler tanımamıza izin ve aynı zamanda kullanılan konsantrasyon, potansiyel olarak kapalı hedef toksik etkileri nedeniyle daha yüksek ilaç konsantrasyonları simge durumuna küçültülmüş.
Kuluçka GFAP'nin-GFP muhabir Akış Sitometresi tarafından ifade hücre yüzdesi belirlenir. Canlılık ve GFP pozitif hücre yüzdesi için taban çizgisi her Kütüphane plaka için en az üç kuyular belirlenmiştir ve olumlu bir hit (DMSO) satır taban çizgisi üzerinde bir artış GFP pozitif hücreleri üç standart sapma yüzdesi olarak belirlendi ve minimum eşik % 25 GFP pozitif hücre. Biz yeterli GFP pozitif nüfus (tablo 1) artış indüklenen 12 uyuşturucu tespit.
Resim 1: Astroglial farklılaşma muhabir sistem.
PGreenZeo GFAP:GFP muhabir şematik diyagramı. GSCs transkripsiyon faktörleri gliyal fibrillary asidik protein (GFAP'nin) organizatörü etkinleştirmek için gereken uygun kombinasyonunu ifade değil ve bu nedenle GFP (üst panel) ifade değil. Ancak, ne zaman uygun transkripsiyon faktörleri mevcut (örneğin ne zaman hücreleri elde bir astroglial kader - ayırt etmek) GFAP'nin düzenleyici etkin hale gelir ve hücreleri GFP muhabir (alt paneli) ifade edecek. (GSC - tümörü kök hücre, T2A-protein bağlayıcı, tanımlık Zeo-R - Zeocin direnç gen, TF - transkripsiyon faktörü). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Astroglial farklılaşma - Subclone seçimi.
HSR-GBM1 GSC subclones düşük seviyelerde (GL) ya da yüksek düzeyde (GH) floresan mikroskopisi kullanılarak GFAP:GFP muhabir ifade temsilcisi resimleri (40 X büyütme gösterilir). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Akış Sitometresi yeşil Floresans belirlenmesi için.
HSR-GBM1 hasta kaynaklı neurosphere satır GFAP:GFP muhabir lentivirus ile transduced ve birden çok subclones neurosphere başlatma-hücre deyimde GFP dayalı ve Akış Sitometresi tarafından onaylanan seçildi. Bu klonlar GL (GFAP'nin düşük) veya GH (GFAP'nin yüksek) seçilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Fonksiyonel karakterizasyonu HSR-GBM1 GFAP:GFP subclones.
GL subclones aşırı sınırlama seyreltme analiz (ELDA) tarafından ölçülen GSC frekansları artan gösterildiği gibi daha fazla klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar vitro vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Adı | Kat artış GFP + hücre | Açıklama | Kan beyin bariyerini | Uyuşturucu banka olasılık |
| Vinorelbine | 8.97 | Anti-Mitotik kemoterapi | - | 0,88 |
| Diphenoxylate | 13,89 | İshal | + | 0,96 |
| Lomerizine | 10.89 | Kalsiyum kanal engelleyici / beyin damar açıcı | NA | NA |
| Phenprobamate | 10.73 | Anksiyolitik / kas gevşetici, merkezi olarak hareket | NA | NA |
| 6-Azauridine | 15.07 | Antimetabolite / Antiviral | NA | NA |
| Irinotecan | 14.14 | Topisomerase ben inhibitörü | + | 0,63 |
| Atracurium besilat | 8.16 | Nondepolarizing iskelet kas gevşetici | + | 0,93 |
| Glimepiride | 8,75 | Antidiabetic | + | 0,73 |
| Hexachlorophene | 9.83 | Antiseptik | + | 0.92 |
| Digoksin | 8.23 | Cardiotonic glikozid | - | 0,72 |
| Flecainide | 10 | Anti-aritmi Ajan | + | 0.86 |
| Nisoldipine | 5,05 | Kalsiyum kanal engelleyici | - | 0,95 |
Tablo 1: GFAP'nin-GFP muhabir ifade HSR-GBM1 GL-1 inducing küçük moleküller
On iki bileşikler GFP ifade hücre yüzdesi önemli ölçüde artırmak için bulunmuştur (kat artış gösterilir) ve ≥3 standart sapmalar sıkı kriterleri üzerinde satır taban çizgisi, hücreleri, DMSO tedavi ve en az %25 GFP pozitif hücreler ile bir araya geldi. Yetenek ve belirli bir aracı olasılık kan beyin bariyerini (uyuşturucu banka (−). geçmeye Kısaltma: NA (bilgi mevcut değil).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Öncelikle onları define işaretleri üzerinde duruldu GSCs önceki çalışmaların en, bu çalışmada geriye doğru yaklaşım almaya karar verdik. Öncelikle GSCs (örneğin, astroglial ve nöronal işaretleri ifade hücreleri) tarafından oluşturulan farklılaştırılmış ettiklerinizden odaklanmak. Burada eleme sistemi, insan GFAP'nin organizatörü bağımlı ifade GFP ve üzerinde temel alan bir hücre tabanlı yüksek üretilen iş ilaç kullanımını göstermektedir. Neurosphere hasta kaynaklı glioblastoma hücre hatları kullanan tüm deneyler yapıldı. Yalıtım ve genişleme bu satırların açıklayan ayrıntılı bir protokol Galli ve ark17' açıklanmıştır.
Sistem sadece bize GSCs hücresel farklılaşma inducing yeteneğine sahiptir ama aynı zamanda tümden astroglial farklılaşma işaret GFAP'nin ifade belirler belirlemek için bize yardımcı küçük molekülleri tanımlaması destekli GSC Frekanslar karşılaştırarak bireysel GBM hücreleri kapasitesi klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar. ELDA tahlil Yifang Hu ve Gordon K. Smyth tarafından geliştirilmiştir. Okuyucular için tahlil güçlü ve sınırlamalar15derinlemesine bir anlayış el yazması önerilir. Adım puanlama koloni oluşumu son derece hücre türü bağımlı olan ve büyük olasılıkla kullanılan hücre satır tabanlı bir ayarlama gerektirir. Ayrıca, genel bir kural olarak küre çapı ≥100 µm neurosphere klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar tarafından GSC kökenli iyi bir gösterge olarak kullanın.
Ayrıca, GSCs ve farklılaşmamış devlet korumak için gerekli yeni yollar (özellikle asetilkolin ve kalsiyum taşıma) tanımlanması için eleme sistemi tarif biz burada uyuşturucu sağlar (bkz. Tablo 1). Başlangıç uyuşturucu konsantrasyon kullanılan kitaplık ve hücre satır göre değişebilir. Ayrıca, hücresel başkalaşım için gereken süreyi ayarlama gerekebilir. Ayrıca, bir vivo içinde tümör inisiyasyon tahlil 18tumorigenic ilaç sayısı doğrulanmasını gerektirir.
Potansiyel bir küçük bu teknik spontan farklılaşma kaçınılmaz olarak herhangi bir kök hücre zenginleştirilmiş kültüründe oluşur ve bu fenomen pasajlar kültüründe sayısı artış eğilimi ve bireysel subclones arasında farklı kısıtlamasıdır. Nitekim, biz spontan farklılaşma bizim subclones genellikle geçiş 15 sonra gözlenen. Bu nedenle, bizim farklılaşma analizleri kültürler beş geçmeyen geçit numaralarından için sınırlı.
Bu nedenle, belki de en kritik nokta bu yöntembilim tüp bebek bu GSCs minimum ve vitro, için çalışırken passaging tutmaktır kültür yoğunluk 1.5x105 hücre/mL aşağıda korumak. Ayrıca, "isabet" ek muhabir subclones aynı GSC satırından karşı yanı sıra, muhabir subclones karşı doğrulanır her uyuşturucu satırları farklı hasta kaynaklı GSC neurospheres izole önerilir. Bu bir gerçek "hit" el altında ki güven artacak.
Bu sağlam protokol için açıklanan yöntemi çok yönlülük tedavi değeri bir ilaçla kanser kök hücre farklılaşma güçlendirir ve GBM ve diğer tümörler için potansiyel yeni tedavi stratejileri yeni ilaçlar tanımlama yardımcı olur. Son olarak, tahlil farklı farklılaşma gazetecilere ve neoplastik olmayan sinir kök hücreleri, diğer kanser türleri ile kullanılmak üzere optimize.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser NIH R01CA187780 tarafından kısmen destekleniyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ESGRO Complete Accutase | EMD Millipore | SF006 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Human GFAP Differentiation Reporter (pGreenZeo, Virus) | SBI (System Biosciences) | SR10015VA-1 | |
| 50 ml sterile disposable reagent reservoirs | Corning | 4870 | |
| 6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 96 well plate | Falcon | 353072 | |
| Biolite T25 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130189 | |
| Biolite T75 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130190 | |
| 15 ml Centrifuge tubes | Celltreat | 229411 | |
| 1.5ml Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 0.5 - 20uL | VistaLab Technologies | 1060-0020 | |
| Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 5-250uL | VistaLab Technologies | 1060-0250 | |
| Multi 12-channel pipette tips 25 μl | VistaLab Technologies | 4060-1002 | |
| Multi 12-channel pipette tips 250 μl | VistaLab Technologies | 4060-9025 | |
| Guava easyCyte 5HT Benchtop Flow Cytometer | EMD Millipore | 0500-4005 | |
| NIH Clinical Collections 1 and 2 small molecule libraries | Evotec | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For the preparation of neural stem cell media (500 mL) | Final concentration | ||
| BSA | GoldBio.com | A-421-250 | 0.20% |
| DMEM/F12 10X | Corning | 90-091-PB | 1X |
| Heparin sodium salt | Sigma Aldrich | H3149 | 0.0002% |
| HEPES 1M | Sigma Aldrich | H4036 | 5.4 mM |
| Insulin-Transferrin- Selenium (ITS -G) (100X) | Life Technologies | 41400-045 | 1X |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S-5761 | 14.5 mM |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) 100X | Gibco | 15140-122 | 1X |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | 16 nM |
| Putrescine | Sigma Aldrich | P5780 | 4.8 µM |
| Basic FGF (FGF2), Human | GoldBio | 1140-02-50 | 10 ng/ml |
| EGF, Human | GoldBio | 1150-04-100 | 20 ng/ml |
| Bottle-Top Filter, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind | Corning | 431160 | Use to filter sterlize media |
References
- Maher, E. A., et al. Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter. Genes Dev. 15 (11), 1311-1333 (2001).
- Bonavia, R., Inda, M. M., Cavenee, W. K., Furnari, F. B. Heterogeneity maintenance in glioblastoma: a social network. Cancer Res. 71 (12), 4055-4060 (2011).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Sul, J., Fine, H. A. Malignant gliomas: new translational therapies. Mt Sinai J Med. 77 (6), 655-666 (2010).
- Bar, E. E., Chaudhry, A., Farah, M. H., Eberhart, C. G. Hedgehog signaling promotes medulloblastoma survival via Bc/II. Am J Pathol. 170 (1), 347-355 (2007).
- Chu, Q., Orr, B. A., Semenkow, S., Bar, E. E., Eberhart, C. G. Prolonged inhibition of glioblastoma xenograft initiation and clonogenic growth following in vivo Notch blockade. Clin Cancer Res. 19 (12), 3224-3233 (2013).
- Schreck, K. C., et al. The Notch target Hes1 directly modulates Gli1 expression and Hedgehog signaling: a potential mechanism of therapeutic resistance. Clin Cancer Res. 16 (24), 6060-6070 (2010).
- Warrell, R. P. Jr, et al. Differentiation therapy of acute promyelocytic leukemia with tretinoin (all-trans-retinoic acid). N Engl J Med. 324 (20), 1385-1393 (1991).
- Piccirillo, S. G., et al. Bone morphogenetic proteins inhibit the tumorigenic potential of human brain tumour-initiating cells. Nature. 444 (7120), 761-765 (2006).
- Bar, E. E., et al. Cyclopamine-mediated hedgehog pathway inhibition depletes stem-like cancer cells in glioblastoma. Stem Cells. 25 (10), 2524-2533 (2007).
- Bar, E. E., Lin, A., Mahairaki, V., Matsui, W., Eberhart, C. G. Hypoxia increases the expression of stem-cell markers and promotes clonogenicity in glioblastoma neurospheres. Am J Pathol. 177 (3), 1491-1502 (2010).
- Kahlert, U. D., et al. CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component. Folia Neuropathol. 50 (4), 357-368 (2012).
- Lim, K. S., et al. Inhibition of monocarboxylate transporter-4 depletes stem-like glioblastoma cells and inhibits HIF transcriptional response in a lactate-independent manner. Oncogene. 33 (35), 4433-4441 (2014).
- Kahlert, U. D., et al. ZEB1 Promotes Invasion in Human Fetal Neural Stem Cells and Hypoxic Glioma Neurospheres. Brain Pathol. 25 (6), 724-732 (2014).
- Hu, Y., Smyth, G. K. ELDA: extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. J Immunol Methods. 347 (1-2), 70-78 (2009).
- Meyer, M., et al. Single cell-derived clonal analysis of human glioblastoma links functional and genomic heterogeneity. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 851-856 (2015).
- Galli, R., et al. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64 (19), 7011-7021 (2004).
- Spina, R., Voss, D. M., Asnaghi, L., Sloan, A., Bar, E. E. Atracurium Besylate and other neuromuscular blocking agents promote astroglial differentiation and deplete glioblastoma stem cells. Oncotarget. 7 (1), 459-472 (2016).
