Summary
이 프로토콜에서 zebrafish 태아, 애벌레, 전체 transcriptome 분석에 대 한 접근을 제공 하거나 셀을 정렬 합니다. 우리는 RNA의 격리, RNASeq 데이터의 통로 분석 및 유전자 표정 변화의 qRT-PCR 기반 유효성 검사를 포함합니다.
Abstract
글로벌 진 식 변화의 분석 기본 관찰된 phenotypes 소설 경로 식별 하는 데 유용한 도구입니다. Zebrafish는 동물의 많은 수에서 RNA의 분리의 용이성으로 인해 전체 동물 또는 개별 세포 인구에서 전체 transcriptome의 신속한 평가 위한 훌륭한 모델입니다. 여기에서 zebrafish 태아 RNA 시퀀싱 (RNASeq)를 사용 하 여 글로벌 진 식 분석을 위한 프로토콜 제공 됩니다. 우리는 전체 배아 또는 유전자 변형 동물에서 정렬 셀을 사용 하 여 얻은 세포 인구에서 RNA의 준비를 설명 합니다. 또한 RNASeq 데이터 농축된 경로 및 글로벌 유전자 표현 데이터 세트에 유전자 존재론 (가십시오) 용어를의 분석에 대 한 접근 방식을 설명 합니다. 마지막으로, 우리는 유전자 식 변경 정량 역전사 PCR (qRT-PCR)를 사용 하 여 유효성 검사에 대 한 프로토콜을 제공 합니다. 이러한 프로토콜 사용할 수 있습니다 제어의 비교 분석 및 실험 세트 zebrafish의 소설 유전자 표현 변화를 식별 하 고 분자 통찰력의 고기를 제공 합니다.
Introduction
글로벌 유전자 발현의 비교 분석 관찰된 고기에 기여 하는 새로운 유전자를 식별 하는 중요 한 도구입니다. 이러한 분석 일반적으로 사본 풍부 실험 사이 비교의 양적 평가에 의존 및 샘플을 제어. QRT-PCR 등 타겟된 방법을 상대적으로 신속 하 고 정확한 단일 유전자 식 변경의 조사에 대 한 있습니다. RNA 시퀀싱 (RNASeq) 샘플, 그건 지금 그런 수사에 대 한 표준 실험 시스템 사이의 유전자 발현에 중요 한 변화를 식별 하는 광범위 한, 가설-무료 접근을 제공 합니다.
Zebrafish는 많은 질병 분야에 걸쳐 눈에 띄는 모델로 떠오르고 있다. 원래 발달 생물학 연구, 그들의 높은 통치 및 유지 보수, 상대적으로 낮은 비용 때문에 그들의 유틸리티에 대 한 개발 zebrafish의 실험적인 사용 진화 했다 다양 한로 서 뿐만 아니라 성인 단계 배아에서 고기를 포함 한 다양 한 분자의1,2,3분석 실험. 사실, 이러한 장점을 분자 기계 연구 급속 한 만들고 많은 양의 자료를 습득의 용이성 때문에 비용 효율적인 생활의 모든 단계에서 유전과 환경 조작의 용이성과 결합. 또한, zebrafish 태아 그리고 애벌레의 투명 한 자연 세포-조직-특정 유전자 변형 기자 라인 개별 셀 인구4의 비보에 시각화 수 있도록 생성에 대 한 이상적인 게. 같은 라인의 착취 리포터 유전자 발현에 따라 특정 격리 된 세포 유형에서 글로벌 유전자 표정 분석을 허용 합니다.
여기 선물이 zebrafish 태아의 문화 후 RNASeq를 사용 하 여 글로벌 유전자 표정 분석에 대 한 포괄적인 프로토콜. Morpholino (모)를 포함 하 여 유전 실험 조작-기반된 변이 유전자 최저 또는 CRISPR 중재 게놈 편집, 제시 된 다른5,,67. 우리는 따라서 전체 배아에서 RNA의 격리에 대 한 자세한 프로토콜에 초점 또는 경로 도구와 유전자 존재론 (가십시오) 용어를 사용 하 여 RNASeq 결과의 간단한 계산 분석 뒤 유전자 변형 기자 표현 셀 정렬. 마지막으로, 우리 정량 역전사 PCR (qRT-PCR)에 의해 유전자 표현 변경의 유효성 검사에 대 한 전략을 포함 했다. 이러한 프로토콜 zebrafish 태아 다양 한 실험 조건, 유전 돌연변이 또는 환경 조건 비교를 포함 하 여 대상에 적용 됩니다.
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Protocol
아래에 설명 된 모든 동물 프로토콜 따라 고 메릴랜드 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 대학에 의해 승인.
1. 배아 준비
- 자연 교배를 통해 배아를 생성
- 3 개월, 문화 배아 생식 성숙 5 , 8 .
- 배아 컬렉션, 전에 저녁에 나누어 짝짓기 탱크에 원하는 긴장에서 성인 남성과 여성 물고기를 분리 하 고 각 탱크 2 남성 및 여성 3 추가.
참고: 유전자 변형 insulin2a:mCherry 형광 기자 긴장의 사용 허용 췌 장 β-세포의 분석. - 전송 물고기 짝짓기를 신선한 시스템 물 탱크 및 다음 아침에와 서 불 후에 즉시 구분선 제거.
- 배아 하단 탱크에서 관찰 된다 때까지 자연스럽 게 짝을 물고기 허용. 원하는 금액을 수집 될 때까지 30 분 간격으로 배아를 수집 합니다. 각 저장소 수집 시간 포인트에서 28.5 배아 미디어에서 별도 접시에 ° c.
- 바란다면, 실험적인 문화 미디어 6, 유전 물질 또는 배치의 microinjection를 수행 하 고 신선한 행 크에 배아를 문화 ' s 배아 중간 8 28.5 ° c.에 10 cm 배양 접시에
참고: morpholino (MO) 주입 또는 돌연변이 동물 유전자 표정 분석, 참고 각 조작 유전자 발현에 부수적 영향을 미칠 수 있습니다. 뮤턴트 전사 모 기반 유전자 9를 대상으로 관찰 되지 않는 수준에서 유전자 보상을 전시할 수 있다.
- 단계 배아
- 배아의 그룹에서 문화 50 – 75 배아 모든 배아의 일관 된 발달 타이밍 홍보 10 cm 배양 접시 당.
- 모니터링 발달 형태를 사용 하 여 해 현미경 blastomere, epiboly, 및 somite 단계에서 발달 진행 10.
참고: 제거 접시에 발달 지연을 방지 하기 위해 모든 죽어가는 또는 잘못 된 배아. - 배아 발달 연령에 따라 구분 합니다. 약 24까지 세분화 (포스트 gastrulation, 10.33 h 게시물 수정 (hpf)) 후 somite 번호를 사용 하 여 태아 나이 측정 hpf. 배아와 24 후 몸 전체 길이 사용 하 여 애벌레 hpf.
참고:는 somites는 태아의 등 쪽 부분에 쉐 브 론 모양의 mesodermal 조직. - 28.5 ° C 인큐베이터에 정렬 된 배아를 놓고 원하는 시대에 진행에 개발을 허용.
2. 단일 셀 분리: 모든 배아 및 정렬 셀 인구
- 전체 태아 분리
- 운동 관찰 될 때까지 5-15 분 동안 얼음에 페 트리 접시를 배치 하 여 원하는 단계에서 zebrafish 태아 안락사 .
- 레이블이 1.5 mL microcentrifuge 튜브 수영장 20 배아 전송. Microcentrifuge 튜브에서 초과 배아 미디어를 제거.
- 추가 200 µ L 세포 시 약 (재료의 표 참조) 배아를 포함 하는 관에. 기계적으로 방 앗 공이 사용 하 여 세포 시 약에 배아 균질 1 ml 전체 볼륨을가지고 800 µ L 세포 시 약을 추가 합니다. RNA 추출까지-80 ° C에서 저장소.
- 흐름 정렬 셀 격리 11
- 1.5 mL microcentrifuge 튜브로 페 트리 접시에서 배아를 전송 하 고 가능한 많은 배아 매체 제거.
참고: 배아 나이 따라 기계적 분리도 필요할 수 있습니다이 단계에서. 배아와 > 48 hpf, 좋습니다 계속 하기 전에 배아 무결성을 방해 하는 유 봉 사용. - 분리 버퍼 1의 1 mL와 함께 태아를 품 어 (재료의 표 참조) 1.5 mL microcentrifuge 관에서. 실 온에서 15-30 분 동안 품 어. 부드럽게 인큐베이션 단계 마다 3-4 분 섞어 P1000 팁을 사용 하 여 위아래로 pipetting으로 솔루션을 triturate. 와 동 하지 마십시오.
- X 300g에 3 분 동안 원심 분리 하 여 배아를 수집 하 고는 상쾌한 제거. 다시 1 mL 분리 버퍼 2 (재료의 표 참조)에 태아를 일시 중단 합니다. 일반 피펫으로 분쇄와 실 온에서 15-30 분 동안 품 어.
- 현미경 (FACS) 버퍼를 정렬 하는 형광 활성화 셀에서 서 스 펜 션의 1-2 µ L를 diluting 하 여 소화를 평가.
참고: 완전 한 소화 시험된 약 수 최소 셀 클러스터 및 배아 조직의 조각으로 단일 셀 때 발생 했습니다. - 5 분 제거 상쾌한에 대 한 300 x g에서 원심 분리 하 여 세포를 수집합니다. 다시 1 mL FACS 버퍼, 그리고 중력 필터에 소화 되지 않은 조직 샘플에서 제거 하려면 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 셀을 중단.
- 는 hemocytometer를 사용 하 여 셀의 개수 및 FACS 버퍼 약 1 x 10 6 셀/mL FACS 튜브에서를 희석.
참고: 셀 배아 (5% 미만 총의), 췌 장 β-세포 등 당 상대적으로 작은 수를 사용 하 여 1000 단계 일치 하는 배아의 최소. - FACS 정렬 FACS 관 세포 시 약 또는 FACS 버퍼만 포함 된 뿐만 아니라 FACS 튜브 셀 서 스 펜 션의 1 mL를 포함 하는 시설을 제공 합니다. 형광 기자를 나타내는 단일 셀만 수집 FACS 흐름 정렬 게이트.
- FACS 흐름 정렬 원하는 셀 번호가 수집 될 때까지 수행.
참고: RNASeq를 수행 하려면 저기는 최소한 총 RNA. 우리 3000-5000 셀 충분 한 높은-품질, 고 농도 RNA를 분리 하는 것으로 나타났습니다. - 얼음에 수집 된 세포를 저장 하 고 즉시 RNA 준비 진행.
- 1.5 mL microcentrifuge 튜브로 페 트리 접시에서 배아를 전송 하 고 가능한 많은 배아 매체 제거.
3. RNA 준비
- RNA 추출
- 세포 시 약 실 온에서 5 분으로 (2 단계)에서 수집 된 샘플을 품 어.
- 추가 세포 시 약의 각 1.0 ml 클로 프롬의 0.2 mL 사용 하 고 실 온에서 2-3 분 15 미 품에 대 한 손으로 튜브를 반전. 4에서 15 분 동안 12000 x g에서 샘플을 원심 ° c.
- 신선한 튜브를 분리, 수성 단계를 전송 하 고 세포 시 약 사용의 각 1.0 ml 소 프로 파 놀의 0.5 mL를 추가 합니다. 실 온에서 10 분 동안 품 어. 4에서 10 분 동안 12000 x g에서 샘플을 원심 ° c.
- 75% 에탄올 세척 및 4에 5 분 동안 7500 x g에서 샘플을 원심 ° c.는 상쾌한을 완전히 제거 하 고 실 온에서 건조 공기를 허용. 다시 15-30 µ L diethyl pyrocarbonate (DEPC)에서 RNA를 중단-물 처리.
- Purify 높은-품질 RNA
- 1/10 볼륨 3 M 나트륨 아세테이트 (pH 5.5) RNA 서 스 펜 션 결합 및 소 프로 파 놀의 1 볼륨. 실 온에서 20 분 동안 품 어와 4에서 10 분 동안 12500 x g에서 샘플을 원심 ° c.
- DEPC 처리 물에 얼음 처럼 차가운 70% 에탄올과 펠 릿을 세척 하 고 4 시 5 분에 대 한 10000 x g에서 샘플을 원심 ° C. 반복 세척 단계를 한 번.
- 는 상쾌한을 제거 하 고 실 온에서 건조를 허용. DEPC 처리 물에 다시 중단.
- 농도 (ng / µ L) 및 순도 (260/230 비율)는 흡수 분 광 계를 사용 하 여 추출 된 RNA 분석 결과. 260/230 값 인지 확인 ~ 2.0 RNASeq와 함께 진행 하기 전에. 우리까지-80 ° C에서 저장e (최대 6 개월).
- RNA 샘플 공급 업체 또는 코어에 RNASeq에 대 한 보내고 유전자 발현 분석 읽기 시퀀싱의 정량화에 따라 변경 하십시오. 공급 업체에서 반환 되는 결과 일반적으로 샘플 사이 대 본 읽기에 중요 한 배 변화를 전시 하는 유전자의 목록으로 제공.
참고: 위의 방법 품질 RNA를 생성 하는 경우 열 사용할 수 있습니다. 금액, 농도, 및 RNA 무결성 번호 (린) RNA 샘플에 대 한 코어를 확인 한다. 공급 업체 또는 코어 린 평가 또한 일반적으로 것입니다.
4. 통로 이동 기간 분석
참고: 코어 또는 공급 업체에서 제공 하는 RNASeq 후 그림 1 유전자 표정 분석의 대표적인 출력을 참조 하십시오.
스프레드시트 관리 소프트웨어에서- 오픈 컨트롤에 대 한 실험 조건 비교
- 정렬 차동 유전자 표현 데이터 (결과) (참조 자료 테이블 ).
- 선택 드롭-다운 화살표 옆에 ' 정렬 ' 단추 및 선택 " 사용자 정의 정렬 " 제어 조건 대 실험에서 차동 표현한 유전자를 포함 하는 스프레드시트 내에서.
- 선택 아래에 있는 상자 ' 열 ' 팝업 창에서 고 기준으로 정렬 하려면 선택 합니다 ' LFC ' 열. 확인 ' 값 '에서 선택은 '에 정렬 ' 열. 정렬 선택 ' 내림차순 오름차순 '에 ' 순서 ' 열과 클릭 " 확인 ".
참고:이 정렬 됩니다 차동 표현한 유전자는 그 감소 식 (부정적인 LFC) 목록 하단에 나타납니다 동안 증가 식 (긍정적인 LFC)와 그 목록의 상단에 나타납니다.
- 다음과 같이 단일 컨트롤에 여러 실험 조건 비교.
- 선택
- 차동 결정 제어 스프레드시트 대 실험 1에 빈 열에서 첫 번째 셀 두 실험 조건에서 발견 하는 유전자 표현. 셀에 다음 수식을 입력:
참고:이 식은 if, ISERROR, 조합 및 일치 기능. (i) MATCH 함수를 일치 (A1, Experimental2_vs_Control! A:A, 0), a 1에 값에 대 한 보이는 것입니다 (합 ID) Experimental2_vs_Control 라는 스프레드시트의 A 열 (A:A)에서 (Experimental2_vs_Control!). " 0 ", 정확 하 게 일치 찾아가 정확히 일치 하는 경우 함수 값을 반환 합니다 " 1 ", 일치 하는 것이 없는 경우 함수는 오류를 반환 합니다 " n / ". (ii) 일치 함수의 결과 다음 ISERROR 함수, ISERROR (일치 (A1, Experimental2_vs_Control로 입력! A:A, 0)), 어디에, 입력이 " 1 " 반환 됩니다 발견 일치 하는 항목을 나타내는 " FALSE ", 그리고 입력이 " n / " 나타내는 일치 하는 찾을 수 없습니다, 그것은 반환 됩니다 " 진정한 ". (iii)는 " 진정한 " 또는 " FALSE " 결과 다음 IF 함수에 입력 하는 경우 (ISERROR (일치 (A1, Experimental2_vs_Control! A:A, 0)), " ", " 중복 "), 어디에, 입력이 " 진정한 " 나타내는 일치 하는 항목을 찾을 수 없습니다, 그것은 첫 번째 집합 따옴표의 사이 값을 반환 합니다 (" ")는 빈, 그리고 따라서 해당 셀이 비어 있을 것입니다. 입력이 " FALSE " 발견 일치 하는 항목을 나타내는, 그것의 따옴표 두 번째 집합의 중간 값을 반환 합니다 (" 중복 "), 그리고 셀 말할 것 이다 " 중복 ". - 기자 " 입력 " 또는 " 반환 " 방정식을 실행. 방정식에 포함 된 셀을 선택 하 고 셀의 오른쪽 하단 모서리에 있는 상자를 클릭 합니다. 마우스 클릭을 유지 하 고 마지막까지 열 아래로 선택된 영역을 끌어 ' 기능 ID ', 열에 있는 각 셀에 수식 복사.
- 선택 " 사용자 정의 정렬 " 다시 클릭 하 여 정렬의 두 번째 수준 추가 " + " 왼쪽된 하단 모서리에 아이콘. 첫 번째 레벨에서 "으로 정렬 ", 열 선택에서 " 중복 ", 정렬에 선택에서 ' 값 ', 주문 선택 아래 ' a Z '. 두 번째 레벨에서 "에 의해 다음 ", 열 선택에서 ' LFC ', 선택 정렬에에서 ' 값 ', 주문 선택 아래 ' 내림차순 오름차순 ' 선택 " 확인 ".
참고:이 식 변경의 방향에 따라 4 그룹으로 유전자 목록이 정렬 됩니다. 식에서 변화 같은 방향 또는 반대 방향에서 둘 다에 되도록 두 실험 조건에서 발견 하는 유전자를 확인 하는 것이 중요 하다. - 절차 또는 결과 데이터베이스에서 발견 되지 것입니다 하기 전에 유전자 기호 열에서 모든 괄호를 제거 합니다. 유전자 기호를 포함 하는 전체 열을 선택 합니다. 선택 " 편집 " 다음 " 대체 " 드롭-다운에서 ' 파일 ' 메뉴. 유형 " (*) "에 " 찾을 내용: " 바꾸기 창과 휴가의 바는 " 바꿉니다: " 빈 바. 선택 ' 모두 ' 괄호의 모든 인스턴스를 제거 하려면.
참고:는 * 임의 개수의 문자, 프로그램은 강조 표시 된 셀에서 모든 인스턴스를 찾을 것인지 묻는 메시지가 두 괄호 및 괄호의 모든 인스턴스 사이이 문자를 배치 하 여 아무것도, 그로 인하여 그들을 제거 교체 될 것 이다 나타냅니다.
- 복사 클립보드에 농축된 경로 결정 하는 한 세트의 유전자 기호 소원. ConsensusPathDB 12로 이동 합니다. 선택 " 유전자 분석 설정 " 다음 웹 페이지의 왼쪽된 사이드바에서 " 이상의 표현 분석 ".
- 에 유전자의 목록을 붙여 넣습니다는 " 유전자/단백질 식별자의 목록을 붙여 넣습니다 " 상자. 선택 유전자 기호는 " 유전자/단백질 식별자 형식 " 상자와 클릭 " 진행 ". 옆에 있는 상자를 선택 " 경로 경로 데이터베이스에 정의 된 대로 " 통로-기반 설정 섹션.
참고: 다양 한 분석에 대 한 옵션 검색 가능한 데이터베이스의 목록을 포함 하 여 표시 됩니다. 그들은 가장 설립 하 고 포괄적인 드 Kegg 및 Reactome 데이터베이스를 제외한 모든 데이터베이스를 선택 하는 것이 좋습니다. 입력 목록 및 p-값 컷오프 설정 최소 중복 또한 필요에 따라 조정할 수 있다. 이러한 설정은 기본 2 유전자 최소 중복 및 0.01 p-값 구분에서 떠나는 것이 좋습니다. - 선택 " 찾을 풍부한 세트 " 입력된 목록에서 유전자를 포함 하는 경로 목록을 가져올 수.
참고: 출력 다음 각 통로의 이름을 포함 하는 표 형식에 있을 것입니다 " 크기 설정 " (통로에서 전체 유전자의 수를 나타내는), " 후보자 포함 된 " (그 경로에 있는 입력된 목록에 있는 유전자의 수를 나타내는 ), p-값 및 q 값 (루즈벨트), 및 통로 식별 되.
- 농축된 경로 위에서 설명한 대로 결정.
- 모든 수를 경로 이름 옆에 있는 각 상자를 선택 하 여 또는 클릭 하 여 경로 네트워크에 시각화 하 농축된 경로 선택 " 모든 " 아래 " 선택 " 선택 상자 위에 열 머리글에서 다음 선택 " 시각화 선택 된 세트 ".
참고: 좋습니다 미만 30; 있다면 모든 경로 시각화 30 경로 보다 큰 경우 (입력된 목록에서 유전자의 많은 수를 포함 하는 그들) 최고 30 가장 풍부한 경로 선택 하면 것이 좋습니다. - 조정은 " 상대 오버랩 " 및 " 공유 후보 " desir 페이지의 위쪽 가운데의 중 상자를 선택 하 고 입력 필터,에 드 % 상대 겹치거나 통로 네트워크, 명확 하 고 선택에서 더 많은 관련 있도록 더 엄격한 것 공유 후보자의 수 겹치는 " 적용 ".
참고: 좋습니다 0.2, 최소 상대 중복을 연결, 2 경로와 2 공유 후보자의 최소 20% 유전자 중복을 나타내는. 그래프 범례 페이지의 왼쪽 상단에 있는 그래프 범례를 클릭 하 여 볼 수 있습니다.
- 하나 클립보드에 풍부한 유전자 온톨로지를 결정 하고자 하는 그룹의 유전자 기호를 복사. 이동 하는 '가 농축 분석 도구 ' 유전자 존재론 협회 13에. 유전자 기호 목록 아래에 있는 페이지의 왼쪽에 있는 상자에 붙여 " 여기 당신의 유전자 Id … "
- 유전자 Id 상자 아래에 나열 됩니다를 사용 하려면 이동 용어 집합 선택: 생물 학적 과정, 분자 또는 세포 구성 요소. (권장) 선택 ' 생물 학적 과정 '. 선택 ' Danio rerio ' 이동 아래 조건 상자와 클릭 " 제출 ".
참고: 사용 하 여 좋습니다 0.05의 기본 p-값 컷오프.
5. QRT-PCR 확인
참고: RNASeq에 중요 한 유전자 식 변경으로 확인 된 개별 유전자 복제 실험에서 대상된 qRT-PCR에 의해 확인 되어야 한다.
- cDNA 합성
- 섹션 3.1에 설명 된 방법을 사용 하 여 태아에서 RNA를 추출 합니다. RNA 추출.
- CDNA cDNA 변환을 사용 하 게 RNA의 변환 1 µ g 키트 (재료의 표 참조). RNA, dNTPs, 역전사 효소를 결합. 제조 업체에 따르면 thermocycler 반응 수행 ' s 사양.
- 는 CDNA DEPC 처리 물에 1:3 희석. 1-2 개월까지 4 ° C에서 저장소.
- qRT-PCR 확인
- 유전자 RNA 시퀀싱 결과에서 qRT-PCR에 의해 확인를 선택 합니다. 식에 높은 배 변화 유전자를 식별 합니다. 또한 높은 읽기 수를 포함 하는 하는이 유전자의 결정이 풍부한 식 나타냅니다.
- 높은 배 변화, 유전자의 높은 읽기 수 목록에서에서 10-12 목표를 선택합니다. 적어도 1 intron-엑손 경계에 걸쳐 있는 대상 유전자를 증폭 하는 뇌관 디자인.
- 정량 Pcr 뇌관 디자인 사이트 14에 유전자 또는 유전자의 대상된 영역을 입력합니다. 선택은 " 2 정량 Pcr 뇌관 디자인 " 및 뇌관 세트를 만드는 사이트.
참고: 샘플 사이의 비교를 정상화 하 내부 제어 뇌관, β-걸, 등을 포함 해야 합니다. Β-말라 뇌관은 f: 5 '-TCGAGCTGTCTTCCCATCCA-3 ' r: 5 '-TCACCAACGTAGCTGTCTTTCTG-3 '. - 는 CDNA, 앞으로 뇌관, 역방향 뇌관, 및 중 합 효소 결합. QRT-PCR 증폭 유전자 15의 상대 식을 결정 하려면 수행.
- 상대 부 량 결정 15 관심사의 유전자의 상대적 mRNA 표정 분석.
- QRT-PCR RNASeq 차동 식의 방향을 일치 하는지 확인 결과를 비교.
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Representative Results
차동 정렬 유전자 표현:
Zebrafish 모델의 Alström 증후군 및 Bardet Biedl 증후군 (게시판)의 애벌레 단계에서 차동 표현한 유전자를 식별 하기 위해 우리 중 alms1 타겟 또는 주입 bbs1 녹취 록 이전 스플라이스 차단 MOs로 검증 야생-타입 zebrafish 태아16,17. 5 일에서 포스트 수정 (dpf), 제 3 항에에서 설명 된 대로 RNA의 2 개의 복제 배아 제어 모, 주사 뿐만 아니라 각 조건에서 추출 되었다. 각 샘플에서 RNA의 깊이에 시퀀싱 했다 ~ 120 백만으로 읽습니다 ~ 107 백만 읽고 zebrafish 게놈에 정렬. 게놈의 exonic 영역에 매핑된 정렬된 읽기의 85-90% 사이
1,348 총 유전자 Alström 모델에서 크게 바뀌었다 고 471 총 유전자 게시판 모델에서 크게 바뀌었다. 모델 또는 모델 중 하나에 변경 사이 유전자 발현에서 공유 변경 섹션 4.2에 설명 된 대로 확인 되었다. 1,084 총 유전자 Alström 모델에서 유일 하 게 바뀌었다, 612 위로 472 다운 통제, 및 207 유전자 게시판 모델, 176 위로 및 아래로 31 (그림 2, 테이블 S1, s 2 테이블)에서 고유 하 게 바뀌었다. 264 유전자 두 모델에서 크게 바뀔 것을 발견 했다, 73 위로 182 아래로 통제 했다 그리고 9 식 (그림 2, 테이블 S1및 테이블 S2 (참조 두 모델 사이에서 반대로 변화를 보여준 추가 Tables.xlsx)). 두 모델 간의 차동 표현한 유전자의 어긋나는 숫자는 bbs1 및 alms1 개발에서 다른 단계 영향을 수 있습니다 것이 좋습니다.
흥미롭게도, Alström 모델에서 차동 표현한 유전자의 다 수는 alms1 역할 5 dpf 단계에서 개발에 중요 한 역할 유전자 변화 게시판 모델에 더 작은 수는 제안 하는 동안 의 제안 bbs1 이 시간 시점으로 눈에 띄는 되지 않을 수 있습니다. 반면, 2 dpf에 이전 transcriptomic 분석18역 제안 했다.
농축된 경로 및 Zebrafish 모델 Alström 증후군의 유전자 온톨로지의 결정:
더 명확 하 게 명료 하 게 하는 Alström 모델의 분자 프로 파일, 경로 및 유전자 온톨로지 차동 표현한 유전자에서 풍성 하 게 확인 되었다. 농축된 경로 ConsensusPathDB 쿼리하여 결정 했다 그리고 풍부한 유전자 온톨로지 섹션 4.3-4.5에 설명 된 대로 유전자 존재론 협회를 쿼리하여 결정 했다. Alström에서 위로 통제 하는 유전자 중 가장 높은 농축 모델, 유전자의 수에 의해 또는 배 농축, 분석 되었다. 31 총 경로 Alström 모델에서 최대 통제 했다. "대사"의 광범위 한 그룹, 이외에도 가장 높은 영향을 받는 경로 각각 32와 20 유전자 타고 난 및 적응형 면역 체계가 있었다 (그림 3A). 다운스트림 β-세포 수용 체 신호 또한 되었다 농축 면역 시스템 업 레 귤 레이 션이 모델에서을 제안 합니다. 여러 신호 경로 또한 기본 cilium 부전, (그림 3A) 셀의 주요 신호 센터 Alström 증후군의 협회와 Alström 모델에서 위로 유전자 중 농축 했다. 또한, 인슐린 분 비와 관련 된 3 개의 통로 위로 했다: 지방산 바인딩된 GPR40, 자유로운 지방산, 아 세 틸 콜린 (그림 3A). 이것은 Alström 환자에 높은 침투 인슐린 저항 및 유형 2 당뇨병 고기 일치 합니다. 6 이동 용어 등 적혈구 감 별 법, 적혈구 항상성, 골수성 세포 항상성, homeostatic 프로세스 (그림 3B) Alström 모델에서 위로 유전자 중 농축 했다. 위로 통로의 상호 평가를 모델 위로 경로 Alström의 통로 네트워크 생성 (그림 3C). 상호 연결 된 통로의 주요 노드 경로 및 신호, 보조 노드 중 하나가 공개 3 인슐린 규정 경로 간의 연결 하는 동안 면역 체계와 관련 된 사이 연결의 높은 학위를 밝혔다. 마지막으로, 어느 최대-또는 아래로 통제 되는 Alström 모델에 있던 5 유전자 대상의 평가 의해 RNASeq로 식별 유전자 식 변경 확인 합니다. QRT-PCR aste, gck, bmb, btr26, 및 ifi35, 제어, 기준에 의해 유전자 표현 변화의 방향을 RNASeq (그림 4A-B)에 의해 관찰 하는 지.
그림 1입니다. 코어 또는 공급 업체에서 제공 하는 RNASeq 후 유전자 표정 분석의 대표적인 출력. 기능 ID 합 유전자 ID 번호를 나타냅니다. 읽기 개수 읽기 제어 또는 그 유전자는 게놈에 정렬 실험 샘플의 수를 나타냅니다. 배 변화 및 배 변경의 로그 실험 사이 유전자의 표현에 변화의 정도 나타냅니다 및 제어에 샘플 실험 샘플 방향에 식에서 긍정적인 (증가) 또는 식에서 (감소)를 제외 실험 샘플 방향. P-값과 루즈벨트는 결과;의 의미를 확인 하기 위해 통계적 테스트 RNASeq 실험, 0.05의 더 엄격한 루즈벨트 값 의미를 결정 하기 위해 사용 됩니다. Gene_symbol NCBI 유전자 ID를 나타내고 gene_name 유전자의 전체 이름을 나열 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 차동 게시판 및 Alström 모델에서 유전자 표현. 유전자 위로 (빨강) 또는 아래로 (노랑) alms1 모 (녹색) 주입 태아, bbs1 모 (오렌지) 주입 태아, 또는 표준 제어 모 주입 태아에 비해 둘 다의 수입니다. * 모두에서 변경 하지만 변경 식에 반대 하는 유전자의 수를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Figure 3입니다. Upregulated 경로 그리고 Alström 모델에서 풍부한 이동 용어. (A) 유전자의 수에 의해 Upregulated 경로. (B) Upregulated가 배 농축에 의해 조건. (C) Alström 모델에서 upregulated 통로의 통로 연결. 최소 20%에 의해 결정 하는 통로 연결 경로 사이 유전자를 공유 하 고 2 유전자 중복. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4. qRT-PCR 유전자 식 변경의 유효성 검사. RNASeq로 식별 하는 유전자 발현에서 변화는 나이 및 치료 일치 5 dpf 배아, 제어, alms1, 또는 bbs1 모 (A) 하위 집합 qRT-PCR를 사용 하 여 유전자의 mRNA 표정 보여주는 유전자의 주입에서 확인 되었다. (B) 해당 데이터 읽기를 보여주는 RNASeq 데이터 집합에서 계산 합니다. 모든 데이터, 컨트롤에 상대적인 고 qRT-PCR 걸으로 표준화 되었다. aste, 소행성 체 1; gck, glucokinase; bmb, brambleberry; btr26, 피에 굶주린 관련 유전자 가족 회원 26; ifi35, 인터페론 유도 된 단백질 35 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 프로토콜에서 설명 하는 접근의 전체 또는 특정 정렬된 셀 인구 transcriptome 수준 분석에 대 한 상대적으로 신속 하 고 비용 효과적인 전략을 제공 합니다. Zebrafish는 편리 함과 소재, 유전 구현의 용이성 또는 환경 실험 조건, 및 큰의 가용성을 시작 하는 많은 양의 생성 속도 때문에 연구의이 유형에 대 한 유리한 모델을 제공 합니다. 셀 형 구체적이 고 조직 특정 인구의 격리를 허용 하는 유전자 변형 기자 라인의 스펙트럼.
여기서 설명 하지, 하는 동안이 방법을 수 쉽게 조직 단면도 FACs 및 수집 하는 대신 청소년 이나 성인 물고기에서 수집을 수용 하 게 됩니다. 우리는 또한 기본적인 스프레드시트 명령 및 기존 통로 및 이동 데이터베이스의 사용에만 의존 하는 기본적인 후속 분석 전략을 개발 했다. 이 방법의 주요 장점은 컴퓨터 프로그래밍 이나 데이터베이스 관리에서 높은 수준의 전문성을 필요로 하지 않고 접근의 용이성입니다. 따라서,이 전략은 큰 유전자 표현 데이터 세트의 정보 분석을 위해 모든 백그라운드의 조사를 위해 적용 가능한.
우리의 접근 뒤에 RNASeq 표준 RNA 추출 기법 기본 zebrafish 태아 그리고 애벌레 문화 결합 합니다. RNASeq 필요한 많은 양의 양질의 시작 물자; 일부 공급 업체는 총 RNA의 2 µ g을 필요합니다. 그 결과, 희귀 동식물 세포 유형 또는 개별 배아 분석에 도달입니다. 그러나, 지난 5 년 동안 낮은 수익률 분석, 작은 샘플 및 낮은 RNA 수량에서 생성 된 데이터 집합에 있는 극적인 개선 증명 하고있다 그리고 우리는 이러한 응용 프로그램이 될 것으로 기대 가능한 가까운 장래에. 정확한 결과, 즉, 두 기술 복제의 추가 두 RNA 라이브러리를 생성 하는 단일 샘플 및 생물 복제, 즉, 여러 matings에서 수집 배아에서 이상적 이다. 이 단계 샘플, 변화에 대 한 제어 연구를 허용 하 고 모든 샘플에서 식별 하는 시퀀스는 더 낮은 읽기 카운트 결과 누락의 감소 가능성과 실제 결과 될 것.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작업은 R01DK102001 (N.A.Z.), P30DK072488 (N.A.Z.), 및 T32DK098107에 의해 지원 되었다 (T.L.H. 및 J.E.N.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Commercial Reagents | |||
| TriZol | Thermo Scientific | 15596026 | lysis reagent |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | dissociation buffer 1 |
| FACSMax | Genlantis | T200100 | dissociation buffer 2 |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| FirstStrand cDNA conversion | Thermo Scientific | K1621 | cDNA conversion kit |
| 2X SYBR Green Master Mix | Roche | 4707516001 | qRT-PCR Master Mix |
| FACS buffer | Fisher Scientific | 50-105-9042 | |
| chloroform | Sigma Aldrich | 288306 | |
| sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Strains | |||
| Tuebingen | ZIRC | ZL57 | |
| ins2a:mCherry | ZIRC | ZL1483 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 40 micron cell strainer | Sigma | CLS431750 | |
| FACS tube | BD Falcon | 352063 | |
| hemocytometer | Sigma | Z359629 | |
| Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Inverted Microscope | Zeiss | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Illumina HiSeq | Illumina | ||
| LightCycler 480 | Roche | ||
| Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set | Aquaneering | ZHCT100 | |
| FACS tube 5 mL polypropylene tube | BD Falcon | 352063 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | ||
| Consensus Path DB | http://cpdb.molgen.mpg.de/ | ||
| GO Enrichment Analysis | http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis |
References
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