Summary
Este protocolo presenta un enfoque para el análisis del transcriptoma completo de embriones de pez cebra, larvas, o clasificar las células. Se incluyen aislamiento de RNA, análisis de la vía de datos RNASeq y qRT-PCR-based validación de los cambios de expresión génica.
Abstract
El análisis de los cambios de expresión génica global es una herramienta valiosa para la identificación de nuevas vías subyacen fenotipos observados. El pez cebra es un excelente modelo para la evaluación rápida de transcriptoma conjunto de poblaciones de todo animal o individuales de la célula debido a la facilidad de aislamiento de ARN de grandes cantidades de animales. Aquí se presenta un protocolo para el análisis de expresión génica global en embriones de pez cebra, mediante secuenciación del RNA (RNASeq). Se describe la preparación del ARN de embriones enteros o de poblaciones celulares obtenidas mediante célula clasificación en animales transgénicos. También se describe un enfoque para el análisis de datos RNASeq identificar vías enriquecidas y términos de Ontology del Gene (vaya) en conjuntos de datos de expresión génica global. Por último, proporcionamos un protocolo para la validación de los cambios de expresión génica utilizando transcriptasa inversa cuantitativa PCR (qRT-PCR). Estos protocolos pueden utilizarse para el análisis comparativo de control y grupos experimentales del pez cebra para identificar cambios de expresión de gene nuevo y proporcionan la penetración molecular en fenotipos de interés.
Introduction
Análisis comparativo de expresión génica global es una herramienta valiosa para identificar nuevos genes que contribuyen a los fenotipos observados. Tales análisis normalmente dependen de evaluación cuantitativa de la abundancia de transcripción comparada entre experimentales y control de muestras. Enfoques específicos, tales como qRT-PCR son relativamente rápido y preciso para la investigación de los cambios de expresión de gen único. La secuencia de RNA (RNASeq) ofrece un enfoque amplio, libre de hipótesis para identificar cambios significativos en la expresión génica entre las muestras, lo que es ahora el estándar para tales investigaciones a través de sistemas experimentales.
Pez cebra han surgido como un modelo prominente en muchas áreas de la enfermedad. Originalmente desarrollado para su utilidad en estudios de Biología del desarrollo, debido a su alta fecundidad y relativamente bajo costo de mantenimiento, uso experimental del pez cebra ha evolucionado para incluir una amplia gama de fenotipos de embrionario a etapas adultas así como un amplia gama de molecular ensayos de1,2,3. De hecho, estas ventajas hacen estudios mecanísticos moleculares rápido y rentable debido a la facilidad de adquirir grandes cantidades de material combinado con la facilidad de manipulación genética y ambiental en todas las etapas de la vida. Por otra parte, la naturaleza transparente de larvas y embriones de pez cebra lo hacen ideal para la generación de células y tejidos específicos reportero transgénicos líneas visualización en vivo de células discretas las poblaciones4. Explotación de dichas líneas permite análisis de expresión génica global en tipos específicos de la célula aislados basados en la expresión del gen reportero.
Aquí presentamos un protocolo integral para análisis de expresión génica global usando RNASeq después de cultivo de embriones de pez cebra. Manipulación genética experimental, incluyendo morfolino (MO)-caída de base gen transitoria o la edición del genoma mediada por CRISPR, se presentan en otras partes5,6,7. Por lo tanto, centrarse en un protocolo detallado para el aislamiento del ARN de embriones enteros o clasificado transgénicas células expresando reportero seguidas por simple análisis computacional de resultados RNASeq utilizando herramientas de la vía y términos de gene ontology (GO). Por último, hemos incluido una estrategia para la validación de los cambios de expresión génica por PCR (qRT-PCR) de la transcriptasa inversa cuantitativa. Estos protocolos son aplicables a los embriones de pez cebra sujetados a una amplia gama de condiciones experimentales, incluyendo comparación de mutantes genéticos o las condiciones ambientales.
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Protocol
animal todos los protocolos se detallan a continuación están de acuerdo con y aprobado por la Universidad de Maryland institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC).
1. preparación de embriones
- generar embriones a través de monta natural
- embriones de cultura a 3 meses de edad reproductiva madurez 5 , 8 .
- Separar peces adultos macho y hembra de la cepa deseada en tanques de acoplamiento divididos la noche antes de embrión y añadir 2 machos y 3 hembras a cada tanque.
Nota: Uso de la cepa de transgénicos insulin2a:mCherry reportero fluorescente permite el análisis de células β pancreáticas. - Transferencia de peces para el acoplamiento del tanque con agua fresca del sistema y retire el divisor inmediatamente después de que las luces se encienden a la mañana siguiente.
- Permite el pescado para aparearse naturalmente hasta que los embriones se observan en el depósito inferior. Recoger embriones en intervalos de 30 min hasta que se recoge la cantidad deseada. Tienda cada recogido momento en cajas Petri separadas en medio de embriones en 28.5 ° C.
- Realizar microinyección de material genético o la colocación en medios de cultivo experimental 6, si lo desea y la cultura de los embriones en fresco Hank ' s embrión media 8 en cajas Petri de 10 cm a 28,5 ° C.
Nota: para el análisis de expresión génica en morfolino (MO) inyectada o animales mutantes, tenga en cuenta que cada manipulación puede tener impactos accidentales sobre la expresión génica. Mutantes pueden exhibir compensación genética a nivel de la transcripción que no observa que está basado en la MO gene targeting 9.
- Embriones en fase de
- los embriones en los grupos de la cultura 50 – 75 embriones por caja de Petri de 10 cm para promover la sincronización del desarrollo constante de todos los embriones.
- Vigilar la morfología del desarrollo usando microscopio de disección en blastómero y epiboly somite etapas para asegurar la progresión en el desarrollo 10.
Nota: Retire cualquier muerte o malformaciones embriones para evitar retraso en el desarrollo en el plato. - Separar los embriones basados en la edad de desarrollo. Medir la edad del embrión utilizando somite número después de la segmentación (después gastrulation, 10,33 h post la fertilización (hpf)) hasta aproximadamente 24 hpf. Etapa los embriones y larvas con longitud de cuerpo total después de 24 hpf.
Nota: Los somitas son el tejido mesodérmico en forma de chevron presente en la parte dorsal del embrión. - Coloque los embriones ordenados en una incubadora de 28,5 ° C y permitir el desarrollo al progreso de la edad deseada.
2. Unicelular disociación: Todo embrión y poblaciones celulares clasificados
- disociación de todo embrión
- eutanasia los embriones de pez cebra en la etapa deseada colocando el plato de Petri en hielo durante 5-15 min hasta que no se observe ningún movimiento .
- Transferencia de un grupo de 20 embriones a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL etiquetado. Retire cualquier medio embrión sobrante del tubo de microcentrífuga de.
- Lisis de añadir 200 μL de reactivo (véase Tabla de materiales) al tubo que contiene los embriones. Homogeneizar los embriones en reactivo de lisis mecánica usando un mortero. Añadir 800 μl de reactivo de lisis para llevar el volumen a 1 mL. Tienda a-80 ° C hasta la extracción de RNA.
- De aislamiento de células clasificadas de flujo 11
- transferir los embriones de la placa de Petri en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y quitar tanta medio embrión posible.
Nota: Dependiendo de la edad del embrión, disociación mecánica puede también requerirse en este paso. Con los embriones > 48 hpf, recomendamos el uso de un mortero para alterar la integridad del embrión antes de proceder. - Incubar los embriones con 1 mL de tampón de disociación 1 (véase Tabla de materiales) en tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Incubar durante 15-30 min a temperatura ambiente. Triturate la solución mediante pipeteo suavemente arriba y abajo usando una punta de P1000 para mezclar cada 3-4 minutos durante la etapa de incubación. NO agitar con VORTEX de no.
- Recoger los embriones por centrifugación durante 3 min a 300 x g y eliminar el sobrenadante. Vuelva a suspender los embriones en 1 mL de tampón de disociación 2 (véase Tabla de materiales). Incube durante 15-30 min a temperatura ambiente con trituración de pipeta regular.
- Evaluar la digestión diluyendo 1-2 μl de suspensión celular activado por fluorescencia clasificar búfer (FACS) microscopio.
Nota: Digestión completa ha ocurrido cuando la alícuota examinada muestra células con racimos de célula mínima y trozos de tejido embrionario. - Recoger las células por centrifugación a 300 x g por 5 minutos eliminar sobrenadante. Resuspenda las células en 1 mL FACS de buffer y filtro de gravedad a través de un colador de célula 40 μm para eliminar tejido no digerido de la muestra.
- Contar las células usando un hemocitómetro y diluir con tampón FACS de aproximadamente 1 x 10 6 células/mL en un tubo de FACS.
Nota: Para los tipos de células con un número relativamente pequeño por el embrión (menos de 5% del total), tales como β-células pancreáticas, use un mínimo de 1.000 embriones de etapa comparable. - Proporcionar el FACS clasificación de facilidad con el FACS tubos conteniendo 1 mL de muestras de la suspensión de células como tubo de FACS que contiene sólo reactivo de lisis o tampón FACS. El clasificador de flujo del FACS para recoger sólo las células que expresan el reportero fluorescente de la puerta.
- Realizar la FACS flow-clasificación hasta el número deseado de la célula ha sido recogido.
Nota: Para realizar RNASeq, hay un mínimo de ARN total. Hemos encontrado que las células de 3.000-5.000 son suficientes para aislar RNA de alta calidad, alta concentración. - Almacena las células colectadas en hielo y proceder inmediatamente a la preparación de RNA.
- transferir los embriones de la placa de Petri en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y quitar tanta medio embrión posible.
3. Preparación de RNA
- Extracto de RNA
- incubar la muestra recogida (del paso 2) con el reactivo de lisis durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- Agregar 0,2 mL de cloroformo por cada 1.0 mL de reactivo de lisis utilizado e invertir los tubos a mano para incubar s. 15 para 2-3 min a temperatura ambiente. Centrifugue las muestras a 12.000 x g durante 15 min a 4 ° C.
- Transferir la fase acuosa, separada a un tubo nuevo y agregar 0,5 mL de isopropanol para cada 1.0 mL de reactivo de lisis utilizado. Incubar 10 min a temperatura ambiente. Centrifugue las muestras a 12.000 x g durante 10 min a 4 ° C.
- Lavado con etanol al 75% y centrifugar las muestras a 7.500 x g durante 5 min a 4 ° C. sacar completamente el sobrenadante y deje secar a temperatura ambiente al aire. Resuspenda el ARN en 15-30 μL dietil pirocarbonato (DEPC)-tratamiento de agua.
- Purificar RNA de alta calidad
- combinan la suspensión de RNA con acetato de sodio de 3 M de 1/10 volumen (pH 5.5) y 1 volumen de isopropanol. Incubar por 20 min a temperatura ambiente y centrifugar las muestras a 12.500 x g durante 10 minutos a 4 ° C.
- Lavar el pellet con etanol al 70% helada en agua tratada con DEPC y centrifugar las muestras a 10.000 x g durante 5 min a 4 ° C. Repita el paso de lavado una vez.
- Quite el sobrenadante y dejar para secar a temperatura ambiente. Vuelva a suspender en agua tratada con DEPC.
- Análisis del RNA extraído de la concentración (ng/μL) y pureza (proporción de 260/230) usando un espectrómetro de absorción. Asegurar que el valor de 260/230 ~ 2.0 antes de continuar con RNASeq. Almacenar a-80 ° C hasta nosotrose (hasta 6 meses).
- Enviar las muestras de RNA a un proveedor o base para RNASeq y cambiar de expresión génica análisis basado en la cuantificación de la secuenciación Lee. Los resultados devueltos al vendedor, normalmente se proporcionan como una lista de genes exhibiendo un doblez-cambio significativo en la transcripción lee entre muestras de.
Nota: Puede utilizarse una columna si el método anterior da mala calidad RNA. La cantidad, concentración y número de integridad de ARN (RIN) para las muestras de RNA deben ser confirmados con el proveedor o el núcleo. El proveedor o núcleo típicamente evaluará RIN.
4. Vía y análisis del término GO
Nota: ver figura 1 para la salida representativa de lo análisis de expresión génica después de RNASeq proporcionado por el núcleo o el proveedor.
- Clasificación diferencialmente expresados genes
- comparando una única condición experimental frente a control
- abierto de datos (resultados) en un software de gestión de hoja de cálculo (ver tabla de materiales ).
- Seleccione la flecha desplegable junto a la ' tipo ' el botón y seleccione " Custom tipo " dentro de la hoja de cálculo que contiene los genes diferencialmente expresados en la experimental versus condición de control.
- Seleccionar la casilla de ' columna ' en la ventana que aparece arriba y elegir ordenar por la ' LFC ' columna. Asegurar ' valores ' se selecciona en el ' tipo de ' columna. Seleccione para ordenar de ' más grande a más pequeña ' en el ' orden ' columna y haga clic en " OK ".
Nota: Esto será ordenar los genes diferencialmente expresados para que aquellos con aumento de la expresión (positiva LFC) aparecerán en la parte superior de la lista mientras que ésos con expresión disminuida (LFC negativo) aparecerá en la parte inferior de la lista de.
- Comparar las múltiples condiciones experimentales a un mando único como sigue.
- Seleccione la primera celda de una columna vacía en la 1 Experimental versus hoja de Control para determinar diferencialmente expresados genes que se encuentran en dos condiciones experimentales. Escriba la siguiente ecuación en la célula:
Nota: esta ecuación es una combinación de IF, ESERROR y las funciones del partido. (i) la función MATCH, MATCH (A1, Experimental2_vs_Control! R, 0), buscará el valor en A1 (el ID de ENSEMBL) en una columna (r) de la hoja de cálculo denominada Experimental2_vs_Control (Experimental2_vs_Control.). El " 0 " indica para buscar una coincidencia exacta, y si se encuentra una coincidencia exacta, la función devolverá un valor de " 1 ", mientras que si se encuentra ninguna coincidencia, la función devolverá un error " N/A ". (ii) el resultado de la función coincidir luego de entrada en la función ESERROR, EsError (partida (A1, Experimental2_vs_Control! R, 0)), donde, si la entrada es " 1 " indicando un partido fue encontrado, volverá " falso ", y si la entrada es " N/A " indicando un partido no se ha encontrado, volverá " verdadera ". (iii) la " verdadera " o " falso " resultado es entonces entrada en la función si, si (EsError (partida (A1, Experimental2_vs_Control! R, 0)), " ", " duplicados "), donde, si la entrada es " verdadera " indicando un partido no se ha encontrado, devolverá el valor entre el primer conjunto de Comillas (" ") que está vacía, y por lo tanto la célula estará vacía. Si la entrada es " falso " que indica una coincidencia se encontró, devolverá el valor entre el segundo conjunto de Comillas (" duplicar "), y la célula va a decir " duplicar ". - Prensa " Enter " o " volver " para ejecutar la ecuación. Seleccione la celda que contiene la ecuación y haga clic en el cuadro en la esquina inferior derecha de la celda. Mantenga el ratón hacer clicado y arrastrar el área seleccionada hacia abajo la columna hasta la última ' ID de función ', para copiar la ecuación en cada celda de la columna de.
- Select " Custom tipo " otra vez, añadir un segundo nivel de ordenación haciendo clic en el " + " icono en la esquina inferior izquierda. En el primer nivel, " ordenar por ", bajo seleccione columna " duplicar ", bajo especie de selección ' valores ' y bajo selección orden ' Z a la A '. En el segundo nivel, " entonces por ", bajo seleccione columna ' LFC ', bajo especie de selección ' valores ' y bajo selección orden ' más grande a más pequeña ' y seleccione " OK ".
Nota: Esto ordena la lista de genes en 4 grupos basados en la direccionalidad del cambio de expresión. Es importante comprobar los genes que se encuentran en ambas condiciones experimentales para asegurar que el cambio en la expresión es en la misma dirección en ambos o en direcciones opuestas. - Eliminar cualquier paréntesis de la columna de símbolos de gene antes de proceder o los resultados no se encuentran en las bases de datos. Seleccione toda la columna que contiene los símbolos del gene. Seleccione " editar " entonces " reemplazar " en el menú desplegable ' archivo ' menú. Tipo " (*) " en la " encontrar lo que: " barra de la ventana de reemplazar y dejar el " reemplazar con: " bar vacío. Seleccione ' reemplazar todos ' para quitar todas las instancias de paréntesis.
Nota: El * representa cualquier número de caracteres, mediante la colocación de este personaje entre dos paréntesis el programa se le pide para encontrar ningún caso en las celdas resaltadas y cualquier instancia del paréntesis será reemplazado con nada, de tal modo eliminándolos.
- Seleccione la primera celda de una columna vacía en la 1 Experimental versus hoja de Control para determinar diferencialmente expresados genes que se encuentran en dos condiciones experimentales. Escriba la siguiente ecuación en la célula:
- comparando una única condición experimental frente a control
- Determinación enriquecido vías
- copia los símbolos del gene del conjunto para que se desea determinar las vías enriquecidas en el portapapeles. Ir a ConsensusPathDB 12. Seleccione " gen set análisis " en la barra lateral izquierda de la página web, seguido de " Análisis de la representación excesiva ".
- Pegar la lista de genes en el " pegar una lista de identificadores de gene/proteína " caja. Símbolo de selección genética en la " tipo de identificador de Gene/proteína " de la caja y haga clic en " proceder ". Seleccione la casilla junto a " caminos definidos por las bases de datos vía " bajo basada en la vía establece sección.
Nota: Un número de opciones para el análisis aparecerá entre la lista de bases de datos disponibles para buscar. Se recomienda la selección de las bases de datos excepto las bases de datos Kegg y Reactome como son la más establecida y completa. El mínimo traslapo con ajustes de corte entrados lista y valor p también se puede ajustar según necesidades del cliente. Se recomienda dejar estos ajustes en el traslapo mínimo predeterminado 2 gen y un atajo de valor 0,01 p. - Select " encontrar conjuntos enriquecidos " para obtener la lista de rutas que contiene genes de la lista de entrada.
Nota: La salida será en formato de tabla incluye el nombre de cada itinerario seguido por " fijar tamaño " (indicando el número de genes total en el camino), " candidatos figuran " (indicando el número de genes en la lista de entrada que están en ese camino ), así como el valor p y valor q (FDR) y la base de datos de la cual fue identificada la vía.
- Generación de redes de camino
- determinar vías enriquecidas como se describe arriba.
- Todos los caminos enriquecidos para visualizar en una red de camino seleccionando cada casilla de los nombres de camino a visualizarse o haciendo clic en seleccionar " todos " bajo " seleccionar " en el encabezado de columna por encima de las cajas de selección, seleccione " Visualizar conjuntos seleccionados ".
Nota: Recomendamos visualizar todas las vías si hay menos de 30; Si hay más de 30 caminos recomendamos seleccionar los caminos más enriquecidos 30 superior (aquellos que contienen el mayor número de genes de la lista de entrada). - Ajustar la " relativa superposición " y " comparten candidatos " filtros, seleccionando cualquier caja en el centro de la página y introducción de desirse superponen por ciento Ed relativa o número de candidatos compartidos, para ser más estrictos con el fin de hacer más pertinente se sobrepone dentro de las redes de camino más claras y seleccionadas " aplicar ".
Nota: Se recomienda un traslapo relativo mínimo de 0.2, que indica una superposición de gen de 20% entre 2 caminos para conectarlos y un mínimo de 2 candidatos comunes. La leyenda del gráfico se puede ver haciendo clic en la leyenda de gráfico en la parte superior izquierda de la página.
- Determinación de términos ir enriquecidos
- copiar los símbolos del gene del grupo para el cual se desea determinar las ontologías gene enriquecido en el portapapeles. Ir a la ' herramienta de análisis de enriquecimiento vaya ' en el Gene Ontology Consortium 13. Pegar la lista de los símbolos del gene de la caja en el lado izquierdo de la página de " su gene ID aquí … "
- seleccionar conjunto de términos van a utilizar, aparece debajo de la caja ID de gene: proceso biológico, la función molecular o componente celular. Elija (recomendado) ' proceso biológico '. Seleccione ' rerio del Danio ' debajo de la GO términos caja y haga clic en " enviar ".
Nota: Recomendamos usar corte predeterminado valor de p de 0.05.
5. Verificación por qRT-PCR
Nota: genes individuales identificados con los cambios de expresión de genes importantes en RNASeq deben verificarse por qRT-PCR específica en experimentos repetidos.
- síntesis de cDNA
- extraer el ARN de embriones utilizando el método descrito en la sección 3.1. Extracción RNA.
- Convertir 1 μg de RNA a cDNA usando cDNA conversión kit (véase Tabla de materiales). Combinar la enzima transcriptasa reversa, RNA y dNTPs. Realizar la reacción termociclador según el fabricante ' Especificaciones de s.
- Diluido 1:3 del cDNA en agua tratada con DEPC. Conservar a 4 ° C hasta 1-2 meses.
- verificación de qRT-PCR
- seleccionar genes para verificar por qRT-PCR a partir de resultados de la secuencia de RNA. Identificar genes con alta veces cambios en la expresión. Determinar cuál de estos genes también contienen recuentos altos de lectura, como indica abundante expresión.
- Seleccionar 10-12 objetivos del cambio doble alta, lista de lectura alta de la cuenta de los genes. Diseño de cebadores para amplificar los genes blanco que abarcan por lo menos 1 límite intrón-exón.
- Introducir el gen o región específica del gen en qPCR primer diseño sitio 14. Seleccione la " diseño de cartillas de qPCR 2 " y el sitio para crear el primer conjunto.
Nota: No olvide incluir cartillas de control interno, tales como β-actina, para normalizar las comparaciones entre las muestras. Los iniciadores de la β actina son 5 F: ' - TCGAGCTGTCTTCCCATCCA - 3 ' y R: 5 ' - TCACCAACGTAGCTGTCTTTCTG - 3 '. - Combinan el cDNA, adelante cartilla, cartilla reversa y polimerasa. Realizar amplificación de qRT-PCR para determinar la expresión relativa de genes 15.
- Analizar la expresión relativa de ARNm de genes de interés mediante la cuantificación relativa determinación 15.
- Comparar la qRT-PCR RNASeq resultados para asegurar que la direccionalidad de la expresión diferencial es constante.
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Representative Results
Clasificación de diferencialmente expresados Genes:
Para identificar genes diferencialmente expresados en la etapa larvaria del pez cebra modelos de síndrome de Alström y de síndrome de Bardet-Biedl (BBS), dirigido cualquiera alms1 o transcripciones bbs1 inyectando previamente validaron MOs En bloqueo de empalme embriones de pez cebra de tipo salvaje de16,17. A los 5 días post fertilización (dpf), dos repeticiones del ARN se extrajeron de cada condición, así como los embriones inyectados con control MO, como se describe en la sección 3 anterior. ARN de cada muestra fue ordenado a una profundidad de ~ 120 millones Lee con ~ 107 millones Lee alineados con el genoma del pez cebra. Entre 85-90% de las lecturas alineados asignado a regiones exonic del genoma.
genes total 1.348 cambiaron significativamente en el modelo de Alström y genes total 471 cambiaron significativamente en el modelo de BB. Cambios comunes en la expresión génica entre los modelos o cambios únicas a uno de los modelos fueron identificados como se describe en la sección 4.2. 1.084 genes total cambiaron únicamente en el modelo de Alström, 612 genes para arriba-regulados y 472 regula y 207 cambiaron únicamente en el modelo de BB, 176 para arriba-regulados y 31 regula (figura 2, Tabla S1y S2 de la tabla). 264 genes fueron encontrados para ser cambiado de forma significativa en ambos modelos, 73 eran para arriba-regulados y 182 fueron regula y 9 mostraron cambios opuestos en expresión entre los dos modelos (figura 2, Tabla S1y S2 de la tabla (ver Suplemento Tables.xlsx)). Las cifras discrepantes de genes diferencialmente expresados entre los dos modelos sugieren que bbs1 y alms1 pueden afectar diferentes etapas de desarrollo.
Curiosamente, el gran número de genes diferencialmente expresados en el modelo de Alström sugiere que eso alms1 desempeña un papel importante en el desarrollo en la etapa 5 PD, mientras que el menor número de cambios del gene en el modelo BBS sugiere que el papel de bbs1 puede no ser tan prominente en este momento. En contraste, previo análisis transcriptómico PD 2 sugirieron el reverso18.
Determinación de caminos enriquecidos y Gene ontologías en modelo de pez cebra de síndrome de Alström:
Para dilucidar más claramente el perfil molecular del modelo Alström, se identificaron los caminos y ontologías gene enriquecidas en genes diferencialmente expresados. Caminos enriquecidos determinaron consultando el ConsensusPathDB y enriquecido Gene ontologías determinaron consultando el Gene Ontology Consortium como se describe en las secciones 4.3 a 4.5. El más altamente enriquecido entre los genes para arriba-regulados en el Alström modelo, por el número de genes o doble enriquecimiento, fueron analizado. 31 caminos total fueron para arriba-regulados en el modelo de Alström. Aparte de la agrupación amplia de "metabolismo", los caminos más afectados fueron el sistema inmune innato y adaptativo con genes de 32 y 20, respectivamente (Figura 3A). Receptor aguas abajo β-célula señalización eventos fueron también enriquecido sugiriendo para arriba-regulación del sistema inmune en este modelo. También se enriquecieron varias vías de señalización entre los genes para arriba-regulados en el modelo de Alström, consistente con la Asociación de síndrome de Alström con disfunción del cilio primario, un importante centro de señalización de la célula (Figura 3A). Además, tres caminos asociados con la secreción de insulina fueron para arriba-regulados: ácidos grasos enlazados a GPR40, ácidos grasos libres y la acetilcolina (Figura 3A). Esto es consistente con las insulina altamente penetrante resistencia y tipo de diabetes 2 fenotipos en los pacientes de Alström. Seis términos GO se enriquecieron entre los genes para arriba-regulados en el modelo de Alström, incluyendo diferenciación de eritrocitos, la homeostasis eritrocitaria, homeostasis celular mieloide y procesos homeostáticos (figura 3B). Para evaluar la interrelación de las vías para arriba-regulados, una red de camino de Alström caminos regulados hasta modelo fue generado (figura 3). El nodo principal de vías interconectadas revelaron un alto grado de conectividad entre las vías asociadas con el sistema inmunitario y la señalización, mientras que uno de los nodos menores reveló la conectividad entre las vías reguladoras tres insulina. Por último, comprobamos los cambios de expresión génica identificados por RNASeq por evaluación de los objetivos de gen 5, que fueron ya sea arriba o abajo-regulados en el modelo de Alström. La direccionalidad de los cambios de expresión génica por qRT-PCR en aste, gck, bmb, btr26 y ifi35, en relación con control, recapituló observado por RNASeq (Figura 4A–B).
Figura 1. Salida representativa de análisis de expresión génica después de RNASeq proporcionado por el núcleo o el proveedor de. Característica ID indica el número de identificación del gene ENSEMBL. Leer cuentas indica el número de lecturas en control o muestras experimentales que alineación con ese gen en el genoma. Cambio doble y el registro del cambio de doble indican el grado de cambio en la expresión del gen entre el experimental y controlan muestra ya sea positiva (aumento) en la expresión en el sentido de la muestra experimental o negativo (disminución) en la expresión en la dirección de la muestra experimental. El valor p y el FDR son pruebas estadísticas para determinar la significación de los resultados; para RNASeq experimentos, se utiliza un valor FDR más estricto de 0.05 para determinar significación. Gene_symbol indica la identificación de genes NCBI, y gene_name muestra el nombre completo del gen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Diferencialmente expresados genes en los modelos de BB y Alström. Número de genes para arriba-regulados (rojo) o regula (amarillo) en alms1 MO (verde) inyecta embriones, embriones de MO (naranja) inyecta bbs1 o ambos en comparación con embriones de MO inyectada de control estándar. * Denota el número de genes cambiado tanto pero que frente a cambios en la expresión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
FFigura 3. Vías de alza y enriquecido GO términos en el modelo de Alström. (A) vías de alza por el número de genes. (B) alza ir términos por doble enriquecimiento. (C) conectividad vía de las vías de alza en el modelo de Alström. Las conexiones de la vía determinadas por un mínimo de 20% comparten genes entre vías y por lo menos 2 genes superponen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. validación de qRT-PCR de los cambios de expresión de gen. Cambios en la expresión génica identificado por RNASeq fueron confirmados en pareados por edad y tratamiento PD 5 embriones, inyectados con control, alms1 o bbs1 MO (A) subconjunto de genes con expresión del mRNA de genes mediante qRT-PCR. (B) datos equivalentes de lectura cuenta del conjunto de datos RNASeq. Todos los datos son relativos a control y qRT-PCR se normalizaron a la actina. Aste, homólogo del asteroide 1; GCK, glucokinase; BMB, zarzamora; btr26, familia de genes relacionados con el sanguinario, miembro 26; ifi35, proteína interferón-inducido 35. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El enfoque se describe en este protocolo ofrece una estrategia relativamente rápida y rentable para el análisis a nivel de transcriptoma de animales enteros o de poblaciones celulares específicas ordenadas. El pez cebra proporciona un modelo ventajoso para este tipo de estudio debido a la facilidad y rapidez en la generación de grandes cantidades de a partir de material, la facilidad de la aplicación de genética o ambientales condiciones experimentales y la disponibilidad de una gran espectro de líneas transgénicas reportero para el aislamiento de las poblaciones específicas y específicas de tejido tipo de la célula.
Mientras que no se detallan aquí, este método podría acomodar fácilmente las secciones de tejido obtenidas de peces juveniles o adultos como alternativa al FACs y colección. También desarrollamos una estrategia de análisis de seguimiento básico que sólo se basa en el uso de comandos básicos hoja de cálculo y bases de datos GO y camino pre-existente. La gran ventaja de este enfoque es la facilidad de acceso sin necesidad de conocimientos de alto nivel en informática de gestión programación o base de datos. Así, esta estrategia es aplicable para los investigadores de todos los fondos para el análisis informativo de conjuntos de datos grandes gene expresión.
Nuestro enfoque combina cultura larvas y embriones de pez cebra básico con técnicas estándar de extracción de RNA seguidas por RNASeq. RNASeq requiere una gran cantidad de material a partir de la alta calidad; algunos proveedores requieren 2 μg de ARN total. Como resultado, tipos raros/infrecuente de la célula o embrión individual análisis está fuera de alcance. Sin embargo, los últimos cinco años han demostrado mejoras dramáticas en los análisis de bajo rendimiento, conjuntos de datos generados a partir de muestras más pequeñas y menores cantidades de RNA, y esperamos que estas aplicaciones será posibles en un futuro cercano. Para asegurar resultados exactos, la adición de dos repeticiones técnicas, es decir, generando dos bibliotecas de RNA de una sola muestra y repeticiones biológicas, es decir, que recoge los embriones de cruzamientos múltiples, es ideal. Estos pasos permiten el control de variación en muestras y secuencias identificadas en todas las muestras son más propensos a ser verdaderos resultados, con la probabilidad reducida de que falta un menor resultado cuenta de leer.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por R01DK102001 (N.A.Z.), P30DK072488 (N.A.Z.) y T32DK098107 (T.L.H. y J.E.N.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Commercial Reagents | |||
| TriZol | Thermo Scientific | 15596026 | lysis reagent |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | dissociation buffer 1 |
| FACSMax | Genlantis | T200100 | dissociation buffer 2 |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| FirstStrand cDNA conversion | Thermo Scientific | K1621 | cDNA conversion kit |
| 2X SYBR Green Master Mix | Roche | 4707516001 | qRT-PCR Master Mix |
| FACS buffer | Fisher Scientific | 50-105-9042 | |
| chloroform | Sigma Aldrich | 288306 | |
| sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Strains | |||
| Tuebingen | ZIRC | ZL57 | |
| ins2a:mCherry | ZIRC | ZL1483 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 40 micron cell strainer | Sigma | CLS431750 | |
| FACS tube | BD Falcon | 352063 | |
| hemocytometer | Sigma | Z359629 | |
| Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Inverted Microscope | Zeiss | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Illumina HiSeq | Illumina | ||
| LightCycler 480 | Roche | ||
| Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set | Aquaneering | ZHCT100 | |
| FACS tube 5 mL polypropylene tube | BD Falcon | 352063 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | ||
| Consensus Path DB | http://cpdb.molgen.mpg.de/ | ||
| GO Enrichment Analysis | http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis |
References
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- Detrich, H. W., Zon, L., Westerfield, M. The Zebrafish: Disease Models and Chemical Screens. , 4th ed, Academic Press. (2017).
- Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. The Zebrafish: Genetics, Genomics, and Transcriptomics. , 4th ed, Academic Press. (2016).
- Detrich, H. W. The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , 3rd ed, Academic Press. (2011).
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