Summary
هذا البروتوكول يقدم نهجاً لتحليل الترنسكربيتوم كله من الأجنة الزرد، اليرقات، أو فرز الخلايا. نحن تشمل عزلة من الجيش الملكي النيبالي، وتحليل المسار للبيانات رناسيق، والمستندة إلى بكر qRT التحقق من صحة التغييرات التعبير الجيني.
Abstract
تحليل التغيرات التعبير الجيني العالمي أداة قيمة لتحديد مسارات الرواية الأساسية تعمل الملاحظة. الزرد نموذج ممتاز للتقييم السريع لأسرة الترنسكربيتوم من السكان الخلية الحيوانية أسرة أو فرد بسبب السهولة لعزل الحمض النووي الريبي من إعداد كبيرة من الحيوانات. ويرد هنا بروتوكولا لتحليل التعبير الجيني العالمي في الأجنة الزرد استخدام تسلسل الحمض النووي الريبي (رناسيق). يصف لنا إعداد الجيش الملكي النيبالي من الأجنة كله أو من السكان الخلية التي تم الحصول عليها باستخدام الخلية الفرز في الحيوانات المحورة وراثيا. كما يصف لنا نهج لتحليل البيانات رناسيق لتحديد مسارات المخصب وشروط الجينات علم الوجود (GO) في مجموعات البيانات التعبير الجيني العالمي. وأخيراً، نحن نقدم بروتوكول للتحقق تغييرات التعبير الجيني باستخدام المنتسخة العكسية الكمي PCR (قرت-PCR). يمكن استخدامها لتحليل مقارن للتحكم ومجموعات تجريبية من الزرد لتحديد التغييرات التعبير الجيني رواية هذه البروتوكولات، والتبصير الجزيئية تعمل لمصلحة.
Introduction
تحليل مقارن للتعبير الجيني العالمي أداة قيمة لتحديد الجينات الجديدة المساهمة تعمل الملاحظة. هذه التحليلات عادة تعتمد على التقييم الكمي لوفرة نسخة مقارنة بين التجريبية والتحكم في العينات. النهج المستهدفة، مثل قرة-بكر نسبيا سريعة ودقيقة لتحقيق تغييرات التعبير الجيني واحد. تسلسل الحمض النووي الريبي (رناسيق) يقدم نهجاً واسع النطاق وخالية من فرضية لتحديد التغيرات الهامة في التعبير الجيني بين العينات، مما يجعل الآن معياراً لمثل هذه التحقيقات عبر أنظمة تجريبية.
وظهرت الزرد نموذجا بارزا عبر مجالات أمراض عديدة. وضعت أصلاً لفائدتها في دراسات علم الأحياء التنموي، نظراً للخصوبة العالية والتكلفة المنخفضة نسبيا للصيانة، والاستخدام التجريبي من الزرد تطورت لتشمل طائفة واسعة من تعمل من الجنينية إلى مراحل الكبار، وكذلك مجموعة واسعة من الجزيئات فحوصات1،،من23. في الواقع، هذه المزايا تجعل الدراسات الميكانيكية الجزيئية السريعة والفعالة من حيث التكلفة بسبب سهولة الحصول على كميات كبيرة من المواد جنبا إلى جنب مع سهولة التلاعب الوراثية والبيئية على السواء في جميع مراحل الحياة. وعلاوة على ذلك، الطبيعة الشفافة لليرقات والأجنة الزرد تجعله مثاليا لتوليد خطوط مراسل المعدلة وراثيا المحددة للخلايا والأنسجة مما يسمح في فيفو التصور لخلية منفصلة السكان4. استغلال هذه الخطوط يسمح تحليل التعبير الجيني العالمي في أنواع الخلايا المعزولة محددة استناداً إلى مراسل الجينات.
وهنا يقدم بروتوكول شامل لتحليل التعبير الجيني العالمي باستخدام رناسيق بعد ثقافة الأجنة الزرد. التلاعب التجريبية الوراثية، بما في ذلك morpholino (ميسوري)-ضربة قاضية على أساس الجينات عابرة أو تحرير كريسبر بوساطة الجينوم، وقد عرضت في مكان آخر5،،من67. ولذلك نحن التركيز على بروتوكول مفصل لعزل الحمض النووي الريبي من الأجنة كله أو فرز الخلايا المحورة وراثيا معربا عن مراسل متبوعاً بالتحليل الحسابي البسيط للنتائج رناسيق باستخدام أدوات المسار ومصطلحات علم الوجود (GO) الجينات. أخيرا، لقد شملت استراتيجية من أجل التحقق من صحة التغييرات التعبير الجيني بالكمية عكس المنتسخة بكر (قرت-PCR). هذه البروتوكولات قابلة للتطبيق للأجنة الزرد التعرض لمجموعة واسعة من الظروف التجريبية، بما في ذلك مقارنة من طفرات وراثية أو الظروف البيئية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
كافة البروتوكولات الحيوانية المبينة أدناه وفقا وأقرتها جامعة "ميريلاند رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك)-
1-"إعداد الجنين"
،- توليد أجنة عن طريق التزاوج الطبيعي
- ثقافة الأجنة لمدة 3 أشهر عمر، الإنجابية النضج 5 8 .
- فصل الأسماك الذكور والإناث البالغين من سلالة المرجوة في صهاريج التزاوج مقسمة في المساء قبل جمع الأجنة، وإضافة 2 من الذكور والإناث 3 لكل صهريج.
ملاحظة: تحليل β-خلايا البنكرياس يسمح باستخدام سلالة مراسل الفلورسنت المعدلة وراثيا insulin2a:mCherry. - خزان المياه العذبة نظام نقل الأسماك للتزاوج وإزالة الفاصل فور الأضواء تأتي في الصباح اليوم التالي-
- تسمح للسمك إلى رفيقه بطبيعة الحال حتى الأجنة ولوحظت في أسفل دبابة. جمع الأجنة في فترات 30 دقيقة حتى يتم جمع المبلغ المطلوب. تخزين كل تجمع نقطة الوقت في أطباق بتري منفصلة في وسائل الإعلام الجنين في 28.5 درجة مئوية.
- أداء microinjection من المواد الجينية أو التنسيب في وسائل الإعلام ثقافة تجريبية 6، إذا رغبت في ذلك، وثقافة الأجنة في هانك الطازجة ' s الجنين المتوسط 8 في أطباق بتري 10 سم في 28.5 درجة مئوية.
ملاحظة: لتحليل التعبير الجيني في morpholino (MO) حقن أو الحيوانات المسخ، ملاحظة أن كل تلاعب قد آثار عرضية على التعبير الجيني. يمكن أن يحمل طفرات التعويض الوراثية على مستوى النسخ التي لا تحترم بالجينات مو على أساس استهداف 9.
- الأجنة مرحلة
- ثقافة الأجنة في مجموعات من 50 – الأجنة 75 كل طبق بيتري 10 سم النهوض بتوقيت التنموية تتسق جميع أجنة.
- رصد مورفولوجية التنموية باستخدام مجهر تشريح في مراحل بلاستوميري، وابيبولي، وسميط لضمان التقدم التنموي 10-
ملاحظة: إزالة أي الأجنة يموتون أو تالف لمنع تأخر في النمو في الطبق. - فصل الأجنة على أساس السن التنموية. قياس عمر الجنين باستخدام رقم سوميتي بعد تجزئة (gastrulation بعد، ح 10.33 وظيفة التسميد (hpf)) حتى ما يقرب من 24 هبف. مرحلة الأجنة واليرقات باستخدام طول الجسم الكلي بعد 24 هبف.
ملاحظة: سوميتيس هي الأنسجة ميسوديرمال على شكل رتبة عسكرية موجودة على الجزء الظهري من الجنين. - مكان الأجنة تم فرزها في حاضنة 28.5 درجة مئوية والسماح للتنمية إلى التقدم بالسن المطلوب.
2. تفكك خلية واحدة: الجنين كله وفرز السكان خلية
- تفارق الجنين كله
- Euthanize الأجنة الزرد في المرحلة المطلوبة بوضع طبق بتري على الجليد لمدة 5-15 دقيقة حتى يتم ملاحظة أي حركة .
- نقل مجموعة أجنة 20 إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي مسمى 1.5 مل. قم بإزالة أية وسائط الجنين الزائد من أنبوب ميكروسينتريفوجي. كاشف
- تحلل إضافة 200 ميليلتر (انظر الجدول للمواد) إلى الأنبوبة التي تحتوي على الأجنة. مجانسة الأجنة في الكاشف تحلل ميكانيكيا باستخدام مدقة. إضافة 800 ميليلتر تحلل الكاشف لكي إجمالي حجم 1 مل. مخزن في-80 درجة مئوية حتى استخراج الحمض النووي الريبي.
- عزل الخلية فرز تدفق 11
- نقل الأجنة من طبق بيتري في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل وإزالة المتوسطة الجنين قدر الإمكان.
ملاحظة: تبعاً لعمر الجنين، تفارق الميكانيكية كما يلزم في هذه الخطوة. مع الأجنة > 48 هبف، نوصي باستخدام مدقة الإخلال بسلامة الجنين قبل المتابعة. - احتضان الأجنة مع 1 مل من تفكك المخزن المؤقت 1 (انظر الجدول للمواد) في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل. احتضان لمدة 15-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تريتوراتي الحل قبل بيبيتينج بلطف إلى أعلى وأسفل باستخدام تلميح P1000 لخلط كل دقيقة 3-4 خلال الخطوة حضانة. دوامة لا. جمع الأجنة بالطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 300 x ز
- وإزالة المادة طافية. تعليق إعادة الأجنة في المخزن المؤقت للانفصال من 1 مل 2 (انظر الجدول للمواد). احتضان لمدة 15-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع تريتوريشن العادية بيبيت. تقييم
- الهضم بتمييع 1-2 ميليلتر من تعليق في خلية تنشيط fluorescence الفرز المخزن المؤقت (نظام مراقبة الأصول الميدانية) تحت المجهر-
ملاحظة: حدث الهضم الكامل عندما يظهر قاسمة فحص خلايا مفردة مع مجموعات خلية الحد الأدنى وقطع من الأنسجة الجنينية. - جمع الخلايا باستخدام الطرد المركزي في 300 غرام x للحد الأدنى 5 إزالة المادة طافية. تعليق إعادة الخلايا إلى المخزن المؤقت 1 مل نظام مراقبة الأصول الميدانية، وتصفية الجاذبية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرون لإزالة الأنسجة عسر الهضم من العينة- عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير
- ويضعف مع المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية لحوالي 1 × 10 6 خلايا/مل في أنبوب نظام مراقبة الأصول الميدانية-
ملاحظة: لأنواع الخلايا مع عدد صغير نسبيا للجنين (أقل من 5 في المائة مجموع)، مثل β-خلايا البنكرياس، استخدام الحد ني أجنة مرحلة المطابقة 1,000. - توفير نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز المرفق مع نظام مراقبة الأصول الميدانية أنابيب تحتوي على 1 مل عينات تعليق خلية، فضلا عن نظام مراقبة الأصول الميدانية الأنبوبة التي تحتوي على فقط الكاشف تحلل أو المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية. بوابة التدفق-أرز نظام مراقبة الأصول الميدانية لجمع الخلايا المفردة فقط التي تعبر عن المراسل الفلورسنت.
- تنفيذ نظام مراقبة الأصول الميدانية التدفق-الفرز حتى تم جمع عدد الخلايا المطلوب.
ملاحظة: لإجراء رناسيق، يوجد حد أدنى مطلوب إجمالي الجيش الملكي النيبالي. لقد وجدنا أن خلايا 3,000 5,000 تكفي لعزل عالية الجودة، وتركيزات عالية من الحمض النووي الريبي. - تخزين الخلايا التي يتم جمعها على الجليد، والشروع فورا في إعداد الجيش الملكي النيبالي-
- نقل الأجنة من طبق بيتري في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل وإزالة المتوسطة الجنين قدر الإمكان.
3. إعداد الجيش الملكي النيبالي
- استخراج الحمض النووي الريبي
- احتضان العينة التي تم جمعها (من الخطوة 2) مع كاشف تحلل لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة-
- إضافة 0.2 مل كلوروفورم لكل مل 1.0 للكاشف تحلل المستخدمة وعكس الأنابيب باليد على إينكوباتي س. 15 لمدة 2-3 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. الطرد المركزي هذه العينات في 12,000 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 ° C.
- نقل في مرحلة المنفصلين عن ذويهم، والمائية إلى أنبوب جديد وإضافة 0.5 مل الايزوبروبانول لكل مل 1.0 للكاشف تحلل المستخدمة. احتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. الطرد المركزي هذه العينات في 12,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 ° C.
- المياه والصرف الصحي مع الإيثانول 75% والطرد المركزي هذه العينات في 7,500 س ز لمدة 5 دقائق في 4 ° C. إزالة المادة طافية بشكل كامل، والسماح للهواء الجاف في درجة حرارة الغرفة. إعادة تعليق الجيش الملكي النيبالي في 15-30 ميليلتر إثيل بيروكاربوناتي (ديبك)-المياه المعالجة.
- نق عالية الجودة الجيش الملكي النيبالي
- الجمع بين تعليق الجيش الملكي النيبالي بحجم 1/10 م 3 خلات الصوديوم (pH 5.5) وحجم 1 من الايزوبروبانول. احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة والطرد المركزي هذه العينات في 12,500 س ز لمدة 10 دقائق في 4 ° C.
- يغسل بيليه مع المثلج إيثانول 70% في المياه المعالجة ديبك والطرد المركزي هذه العينات في س 10,000 ز لمدة 5 دقائق في 4 ° جيم تكرار الخطوة يغسل مرة واحدة.
- إزالة المادة طافية والسماح لتجف في درجة حرارة الغرفة. إعادة تعليق في المياه المعالجة ديبك.
- الاعتداء الحمض النووي الريبي المستخرج لتركيز (نانوغرام/ميليلتر) والنقاء (نسبة 260/230) باستخدام مطياف امتصاص. تأكد من أن قيمة 260/230 ~ 2.0 قبل الشروع في رناسيق. تخزين في-80 درجة مئوية حتى لناﻫ (تصل إلى 6 أشهر)-
- إرسال عينات الحمض النووي الريبي لمورد أو الأساسية رناسيق وتغيير التعبير الجيني التحليل القائم على التقدير الكمي لتسلسل ما يلي. وترد النتائج التي تم إرجاعها من البائع عادة كقائمة جينات العارضة إضعاف-تغيير كبير في ما يلي نص بين العينات.
ملاحظة: يمكن استخدام عمود إذا كان الأسلوب أعلاه تؤدي رداءة نوعية الجيش الملكي النيبالي. ينبغي تأكيد كمية وتركيز وعدد سلامة الحمض النووي الريبي (رين) لعينات الحمض النووي الريبي مع البائع أو الأساسية. المورد أو الأساسية وستقيم أيضا عادة رين-
4. المسار والتحليل مصطلح الذهاب
ملاحظة: انظر الشكل 1 لإخراج تمثيلية لتحليل التعبير الجيني بعد رناسيق يقدمها الأساسية أو بائع.
- خلطات أعرب فرز الجينات
- مقارنة شرط تجريبي واحد مقابل السيطرة
- فتح البيانات (النتائج) في جدول بيانات إدارة برامج (انظر "الجدول للمواد" ).
- حدد السهم المنسدل بجانب ' نوع ' الزر وحدد " "فرز مخصص" " داخل جدول البيانات يحتوي على الجينات الأثران المعرب عنها في التجريبية مقابل حالة عنصر التحكم.
- حدد المربع ضمن ' العمود ' في نافذة أن الملوثات العضوية الثابتة حتى واختر للفرز حسب ' لفك ' العمود. ضمان ' القيم ' محدداً في ' "الفرز على" ' العمود. حدد هذا الخيار لفرز من ' الأكبر إلى الأصغر ' في ' أمر ' العمود، وانقر فوق " موافق ".
ملاحظة: هذا سيتم فرز الجينات الأثران المعرب عنها حيث أن تلك مع زيادة تعبير (لفك الإيجابية) سوف تظهر في الجزء العلوي من القائمة بينما تلك مع تناقص التعبير (لفك السلبية) سوف تظهر في الجزء السفلي من القائمة-
- مقارنة شروط تجريبية متعددة إلى عنصر تحكم واحد على النحو التالي.
وأعرب عن
- تحديد أول خلية في عمود فارغ على 1 تجريبية مقابل عنصر تحكم جدول البيانات لتحديد الأثران الجينات الموجودة في هذين الشرطين التجريبية. اكتب المعادلة التالية في الخلية:
ملاحظة: هذه المعادلة مزيج من IF، ISERROR، ومطابقة الوظائف. (ط) الدالة MATCH، تطابق (A1, Experimental2_vs_Control! A:A، 0)، سيقوم بالبحث عن القيمة في A1 (معرف انسيمبل) في العمود A في جدول البيانات المسمى Experimental2_vs_Control (A:A) (Experimental2_vs_Control!). " 0 " يشير إلى البحث عن تطابق تام، وإذا تم العثور على تطابق تام، سترجع الدالة قيمة " 1 "، في حين إذا تم العثور على أي تطابق، سترجع الدالة خطأ " n/A ". (ثانيا) نتيجة الدالة MATCH ثم إدخال في الدالة ISERROR، ISERROR (مطابقة (A1, Experimental2_vs_Control! A:A، 0))، حيث، إذا كان الإدخال " 1 " عثر على مما يدل على تطابق، فإنه سيعود " كاذبة "، وإذا كان الإدخال " n/A " مشيراً إلى تطابق لم يتم العثور على، فإنه سيعود " الحقيقي ". (ثالثا) " الحقيقية " أو " كاذبة " والنتيجة هي ثم الإدخال إلى الدالة IF، إذا (ISERROR (مطابقة (A1, Experimental2_vs_Control! A:A، 0))، " "، " المكررة ")، حيث، إذا كان الإدخال " الحقيقية " مشيراً إلى تطابق لم يتم العثور على، وأنها ستقوم بإرجاع قيمة ما بين أول مجموعة من علامات الاقتباس (" ") وهي فارغة، وبالتالي يكون الخلية فارغة. إذا كان الإدخال " كاذبة " مشيراً إلى تطابق تم العثور عليها، وأنها ستقوم بإرجاع قيمة ما بين المجموعة الثانية من علامات الاقتباس (" المكررة ")، وسوف أقول الخلية " المكررة ". - الصحافة " أدخل " أو " العودة " لتشغيل المعادلة. حدد الخلية التي تحتوي على المعادلة، وانقر فوق المربع في الزاوية اليمنى السفلي من الخلية. الاحتفاظ بالنقر فوق الماوس واسحب المنطقة المختارة وصولاً إلى أسفل العمود حتى آخر ' معرف الميزة '، لنسخ المعادلة في كل خلية في العمود.
- تحديد " "فرز مخصص" " مرة أخرى، إضافة مستوى ثاني من الفرز بواسطة النقر فوق " + " الرمز في الركن الأيمن السفلي. في المستوى الأول، " فرز حسب "، تحت تحديد عمود " المكررة "، تحت "الفرز في" تحديد ' قيم '، وتحت أمر تحديد ' Z إلى A '. في المستوى الثاني، " ثم حسب "، تحت تحديد عمود ' لفك '، تحت "الفرز في" تحديد ' قيم '، وتحت أمر تحديد ' الأكبر إلى الأصغر ' وحدد " موافق ".
ملاحظة: هذا سيتم فرز قائمة الجينات إلى 4 مجموعات استناداً إلى اتجاه لتغيير التعبير. من المهم التحقق من الجينات الموجودة في كل الظروف التجريبية للتأكد من أن هذا التغيير في التعبير في نفس الاتجاه في كليهما أو في اتجاهين متعاكسين. - إزالة أي أقواس من العمود رموز الجينات قبل الدعوى أو النتائج لن نجد في قواعد البيانات. قم بتحديد العمود بأكمله الذي يحتوي على رموز الجينات. حدد " تحرير " ثم " محل " في القائمة المنسدلة ' ملف ' القائمة. نوع " (*) " في " العثور على ما: " بار لاستبدال نافذة، وإجازة " استبدال مع: " بار فارغ. حدد ' "استبدال جميع" ' لإزالة كافة مثيلات الأقواس.
ملاحظة: * يمثل سيتم استبدال أي عدد من الأحرف، بوضع هذا الحرف بين الأقواس اثنين يتم مطالبة البرنامج للعثور على أي مثيل في الخلايا المميزة وأي مثيل من الأقواس بشيء، ومن ثم إزالتها.
- تحديد أول خلية في عمود فارغ على 1 تجريبية مقابل عنصر تحكم جدول البيانات لتحديد الأثران الجينات الموجودة في هذين الشرطين التجريبية. اكتب المعادلة التالية في الخلية:
- مقارنة شرط تجريبي واحد مقابل السيطرة
- أثري تحديد مسارات
- نسخ رموز الجينات المحددة لأي واحدة ترغب في تحديد مسارات المخصب إلى الحافظة. اذهب إلى كونسينسوسباثدب 12. حدد " الجينات تعيين تحليل " على الشريط الجانبي الأيسر من صفحة الويب، تليها " تحليل التمثيل المفرط ".
- لصق قائمة الجينات في " لصق قائمة معرفات الجينات/البروتين " مربع. رمز تحديد الجينات في " الجينات/البروتين معرف نوع " مربع وانقر فوق " تابع ". حدد المربع المجاور ل " مسارات حسب تعريف مسار قواعد البيانات " تحت المسار على أساس مجموعات القسم.
ملاحظة: سوف تظهر عددا من الخيارات للتحليل بما في ذلك قائمة قواعد البيانات المتاحة للبحث. نوصي بإلغاء تحديد كافة قواعد البيانات ما عدا قواعد البيانات كج ورياكتومي كما هي ثابتة وأكثرها شمولاً. ويمكن أيضا تعديل التداخل الحد الأدنى مع إعدادات إدخال قائمة وقيمة p استقطاع استناداً إلى الاحتياجات. من المستحسن ترك هذه الإعدادات في تداخل الحد الأدنى الافتراضي الجين 2 وقطع قيمة p 0.01. - تحديد " العثور على مجموعات المخصب " للحصول على قائمة المسارات التي تحتوي على الجينات في قائمة الإدخال.
ملاحظة: سوف يكون الإخراج في تنسيق الجدول، بما في ذلك اسم كل المسار الذي يتبعه " تعيين حجم " (التي تشير إلى عدد إجمالي الجينات في المسار)، " المرشحين الواردة " (التي تشير إلى عدد الجينات في قائمة الإدخال الموجودة في هذا المسار )، وكذلك فالقيمه والقيمة q (فرانكلين روزفلت)، وقاعدة البيانات التي تم تحديد المسار-
- جيل من مسار الشبكات
- تحديد مسارات المخصب كما هو موضح أعلاه.
- تحديد كافة المسارات المخصب لتصور في شبكة طريق أما تحديد كل خانة بجوار أسماء المسار تصور أو بالنقر فوق " جميع " تحت " حدد " في رأس العمود أعلاه مربعات التحديد، ثم حدد " تصور مجموعات مختارة ".
ملاحظة: من المستحسن تصور جميع المسارات إذا كان هناك أقل من 30؛ إذا كان هناك أكثر من 30 من مسارات نوصي بتحديد مسارات المخصب الأكثر 30 الأعلى (تلك التي تحتوي على أكبر عدد من الجينات من قائمة الإدخال). - ضبط " التداخل النسبي " و " المشتركة المرشحين " المرشحات، عن طريق تحديد مربع أما في وسط أعلى الصفحة وإدخال ديسيرالتداخل النسبي في المئة اد أو يتداخل مع عدد من المرشحين المشتركة، لتكون أكثر صرامة من أجل تحقيق قدر أكبر من الأهمية داخل شبكات المسار أكثر وضوحاً، وحدد " تطبيق ".
ملاحظة: نوصي تداخل نسبي الحد أدنى من 0.2، مما يدل تداخل جينات 20% بين مسارات 2 للاتصال بها، والحد أدنى من المرشحين المشتركة 2. يمكن رؤية وسيلة إيضاح الرسم البياني بواسطة النقر فوق وسيلة إيضاح الرسم البياني في الجزء الأيمن العلوي من الصفحة.
- تصميم المخصب الذهاب المصطلحات
- نسخ رموز الجينات من المجموعة التي أحد يرغب في تحديد مدى الجينات المخصب إلى الحافظة. الذهاب إلى ' أداة "تحليل تخصيب" الذهاب ' في "الجينات علم الوجود اتحاد" 13. لصق قائمة رموز الجينات في مربع على الجانب الأيسر من الصفحة تحت " الجينات الخاصة بك معرفات هنا … "
- تحديد أي مجموعة من شروط الذهاب لاستخدام، المدرجة تحت خانة معرفات الجينات: عملية بيولوجية أو الدالة الجزيئية، أو المكونات الخلوية. اختر (مستحسن) ' العملية البيولوجية '. حدد ' دانيو rerio ' تحت الذهاب شروط مربع وانقر فوق " إرسال ".
ملاحظة: نوصي باستخدام قطع قيمة p الافتراضي 0.05.
5. التحقق من قرة-بكر
ملاحظة: ينبغي التحقق من الجينات الفردية المحددة مع تغييرات التعبير الجيني الكبير في رناسيق ببكر qRT المستهدفة في تكرار التجارب.
- التوليف كدنا استخراج الجيش الملكي النيبالي من الأجنة باستخدام الطريقة الموضحة في الفرع 3-1. استخراج الحمض النووي الريبي.
- تحويل 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي لاستخدام التحويل كدنا كدنا كيت (انظر الجدول للمواد). تجميع الجيش الملكي النيبالي ودنتبس وإنزيم المنتسخة العكسية. القيام برد فعل ثيرموسيكلير وفقا للشركة المصنعة ' مواصفات s-
- تمييع كدنا 1:3 في المياه المعالجة ديبك. مخزن في 4 درجات مئوية لتصل إلى 1-2 أشهر.
- التحقق قرت-بكر
- تحديد الجينات أن تتحقق عن طريق PCR قرت من نتائج تسلسل الحمض النووي الريبي. تحديد الجينات مع التغييرات حظيرة عالية في التعبير. تحديد أي من هذه الجينات تحتوي أيضا على التهم قراءة عالية، كما يشير هذا التعبير وفيرة.
- تحديد الأهداف 10-12 من التغيير حظيرة عالية، وارتفاع عدد مرات قراءة قائمة بالجينات. تصميم كبسولة تفجير لتضخيم الجينات المستهدفة التي تمتد على الأقل 1 إكسون-إنترون الحدود.
- إدخال الجينات أو المنطقة المستهدفة من الجينات في قبكر التمهيدي تصميم الموقع 14. حدد " تصميم كبسولة تفجير قبكر 2 " والمطالبة موقع لإنشاء مجموعة التمهيدي.
ملاحظة: يجب التأكد من أن تدرج كبسولة تفجير للمراقبة الداخلية، مثل β-أكتين، لتطبيع مقارنات بين العينات. كبسولة تفجير β أكتين هي 5 واو: '-تكجاجكتجتكتكككاتككا-3 ' و 5 r: '-تكاككاكجتاجكتجتكتتكتج-3 '- - تجمع كدنا، التمهيدي إلى الأمام، وعكس التمهيدي وبوليميراز. أداء التضخيم qRT-PCR لتحديد التعبير النسبي للجينات 15-
- تحليل التعبير مرناً النسبي للجينات للفائدة بالقياس الكمي النسبي عزم 15-
- مقارنة قرة-بكر لنتائج رناسيق ضمان اتساق اتجاهية التعبير التفاضلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وأعرب عن الفرز من خلطات الجينات:
نحن استهدفت تحديد الجينات الأثران المعرب عنها في مرحلة اليرقات الزرد نماذج من مرض Alström ومرض متلازمة باردت-بيدل (BBS)، أما alms1 أو النصوص bbs1 بالحقن قبل التحقق من صحة موس إلى حجب الوصلة الزرد البرية من نوع الأجنة16،17. في 5 أيام بعد الإخصاب (إدارة الشرطة الاتحادية)، replicates اثنين من الجيش الملكي النيبالي استخرجت من كل حالة، فضلا عن الأجنة حقن بمراقبة مو، كما هو موضح في الفقرة 3 أعلاه. كان تسلسل الحمض النووي الريبي من كل عينة بعمق ~ 120 مليون يقرأ مع ~ 107 مليون يقرأ المنحازة للجينوم الزرد. بين 85-90% القراءات المنحازة تعيينها إلى مناطق اكسونيك الجينوم.
1,348 مجموع الجينات قد تغيرا كبيرا في طراز Alström وجينات المجموع 471 كانت تغيرا كبيرا في نموذج BBS. وتم تحديد التغييرات المشتركة في التعبير الجيني بين نماذج أو تغييرات فريدة من نوعها لواحد من النماذج كما هو موضح في القسم 4-2. تم تغيير الجينات مجموع 1,084 فريد في طراز Alström، تم تغيير الجينات تنظم لأسفل، و 207 حتى ينظم و 472 612 فريد في طراز BBS، 176 حتى ينظم و 31 ينظم لأسفل (الشكل 2و الجدول S1 S2 الجدول). تم العثور على جينات 264 إلى تغيير كبير في كلا النموذجين، 73 تم تنظيمها حتى 182 ينظم أسفل، و 9 أظهرت التغييرات المقابلة في التعبير بين النموذجين(الشكل 2 والجدول S1و S2 الجدول (انظر Tables.xlsx تكميلية)). أرقام discrepant الجينات أعرب متفاوتاً بين النموذجين تشير إلى أن bbs1 و alms1 قد تؤثر على مراحل مختلفة من التنمية.
من المثير للاهتمام، اقترح عدد كبير من الجينات الأثران المعرب عنها في نموذج Alström أن alms1 يلعب دوراً هاما في التنمية في المرحلة 5 إدارة الشرطة الاتحادية، بينما عدد أصغر من التغييرات الجينات في نموذج BBS توحي بأن دور bbs1 قد لا تكون بارزة كما في هذه المرحلة الزمنية. وفي المقابل، اقترح التحليلات ترانسكريبتوميك السابقة في 2 إدارة الشرطة الاتحادية بعكس18.
تحديد مسارات المخصب والانتولوجيا الجينات في النموذج الزرد لمتلازمة Alström:
لتوضيح أكثر وضوح الشخصية الجزيئية من طراز Alström، حددت مسارات والانتولوجيا الجينات أثري في الجينات الأثران المعرب عنها. تم تحديد مسارات المخصب عن طريق الاستعلام كونسينسوسباثدب والمخصب "الجينات الانتولوجيا" تتحدد عن طريق الاستعلام عن "الكونسورتيوم علم الوجود الجينات" كما هو موضح في المقاطع 4.3-4.5. الأكثر المخصب بين الجينات تنظم حتى في Alström نموذج، بعدد الجينات أو إضعاف الإثراء، حللت. وكانت مسارات إجمالي 31 ينظم أعلى في نموذج Alström. وبصرف النظر عن التجميع الواسع "الأيض"، وكانت الممرات الأكثر تضررا نظام المناعة الفطرية والتكيف مع الجينات 32 و 20، على التوالي (الشكل 3A). مستقبلات خلايا β المصب مما يشير إلى الأحداث كانت أيضا أثري مما يشير إلى نظام المناعة متابعة التنظيم في هذا النموذج. تم إثراء عدة مسارات إشارات أيضا بين الجينات حتى-وينظم في نموذج Alström، اتساقا مع رابطة Alström متلازمة مع خلل هدب الأولية، مما يشير إلى مركز رئيسي للخلية (الشكل 3A). وباﻹضافة إلى ذلك، كانت ثلاثة مسارات المرتبطة بإفراز الأنسولين حتى ينظم: الأحماض الدهنية منضمة إلى GPR40 والأحماض الدهنية الحرة أستيل (الشكل 3A). وهذا يتسق مع الأنسولين الاختراق عالية المقاومة ونوع 2 من داء السكري تعمل في Alström المرضى. تم إثراء ستة شروط الانتقال بين الجينات حتى-وينظم في نموذج Alström، بما في ذلك التمايز كرات الدم الحمراء وكرات الدم الحمراء التوازن والتوازن خلية النقوي وعمليات التماثل الساكن (الشكل 3B). تقييم الترابط بين المسارات حتى ينظم، إنشاء شبكة طريق من Alström كان نموذج ينظم متابعة مسارات (الشكل 3). وكشف العقدة الرئيسية لمسارات مترابطة بدرجة عالية من الربط بين المسارات المرتبطة بالجهاز المناعي، والإشارات، بينما إحدى العقد الثانوية كشفت عن الربط بين المسارات الثلاثة الأنسولين التنظيمية. وأخيراً، نحن التحقق من التغييرات التعبير الجينات التي حددها التقييم 5 أهداف الجينات، التي كانت أما أعلى أو أسفل-التنظيم في طراز Alström من رناسيق. اتجاه التغيرات التعبير الجيني ببكر qRT aste، جك، bmb، btr26، و ifi35، بالنسبة لعنصر التحكم، لخص التي لاحظها رناسيق (4A الرقم–ب).
رقم 1. إخراج تمثيلية لتحليل التعبير الجيني بعد رناسيق يقدمها الأساسية أو بائع. سمة معرف يشير إلى رقم معرف انسيمبل الجينات. قراءة التهم تشير إلى عدد القراءات في عنصر التحكم أو العينات التجريبية التي تتماشى مع تلك الجينات في الجينوم. تغيير إضعاف وسجل التغيير إضعاف تشير إلى درجة التغير في التعبير عن الجينات بين التجريبية والتحكم عينة أما الإيجابية (الزيادة) في التعبير في الاتجاه عينة تجريبية، أو السلبية (النقصان) في التعبير في الاتجاه عينة تجريبية. تكون قيمة p فرانكلين روزفلت والاختبارات الإحصائية تحديد أهمية النتائج؛ لتجارب رناسيق، يتم استخدام قيمة فرانكلين روزفلت أكثر صرامة من 0.05 تحديد أهمية. Gene_symbol يشير إلى معرف الجينات نكبي، و gene_name بسرد الاسم الكامل للجينات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2. خلطات أعرب عن الجينات في نماذج BBS و Alström- عدد الجينات حتى-وينظم (أحمر) أو ينظم لأسفل (أصفر) في alms1 مو (الأخضر) حقن الأجنة والأجنة مو (برتقالي) حقن bbs1 أو كليهما مقارنة بالأجنة مو حقن التحكم القياسية. * تشير إلى عدد الجينات تتغير في كلا ولكن وجود عكس التغييرات في التعبير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
وإيجوري 3. مسارات أوبريجولاتيد وشروط الذهاب المخصب في نموذج Alström. (أ) مسارات Upregulated من عدد من الجينات. (ب) Upregulated الذهاب عبارات بتخصيب إضعاف. (ج) الاتصال مسار من مسارات upregulated في نموذج Alström. مسار الاتصالات تحدد الحد أدنى من 20% تقاسم الجينات بين مسارات وتداخل الجينات 2 على الأقل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4. بكر qRT التحقق من صحة التغييرات التعبير الجيني- تم تأكيد التغييرات في التعبير الجيني حددها رناسيق في العمر ومعاملة مطابقة الأجنة 5 إدارة الشرطة الاتحادية، حقن مع عنصر التحكم أو alms1، أو bbs1 مو (A) مجموعة فرعية من الجينات يظهر التعبير مرناً للجينات باستخدام PCR قرت. (ب) ما يعادل البيانات عرض القراءة التهم من dataset رناسيق. كانت تطبيع PCR قرت إلى أكتين، وكافة البيانات بالنسبة لعنصر التحكم. aste، homolog الكويكب 1؛ جك، جلوكوكيناسي؛ bmb, برامبليبيري؛ btr26، جين متعطش للدماء المتصلة الأسرة، الأعضاء 26؛ ifi35، الناجمة عن الانترفيرون البروتين 35. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويوفر النهج المبينة في هذا البروتوكول استراتيجية فعالة من حيث التكلفة وسريعة نسبيا لتحليل مستوى الترنسكربيتوم للحيوانات كله أو السكان خلية معينة تم فرزها. الزرد يوفر نموذجا مفيداً لهذا النوع من الدراسة بسبب السهولة والسرعة في توليد كميات كبيرة من ابتداء من المواد وسهولة تنفيذ الوراثية أو البيئية الظروف التجريبية، وتوافر كبير مجموعة خطوط مراسل المعدلة وراثيا مما يسمح لعزل السكان نوع الخلية المحددة والخاصة بالانسجة.
بينما لم تذكر بالتفصيل هنا، هذا الأسلوب يمكن أن تستوعب بسهولة أقسام الأنسجة التي جمعت من الأسماك الأحداث أو الكبار كبديل لنظام مراقبة الأصول الميدانية وجمع. نحن أيضا وضع استراتيجية تحليل متابعة أساسية يعتمد فقط على استخدام الأوامر الأساسية من جدول البيانات ومسار موجود مسبقاً والذهاب قواعد البيانات. والميزة الرئيسية لهذا النهج هو سهولة الوصول دون الحاجة إلى خبرة رفيعة المستوى في إدارة الكمبيوتر البرمجة أو قاعدة البيانات. على هذا النحو، هذه الاستراتيجية المطبقة للمحققين من جميع الخلفيات للمعلومات تحليل مجموعات البيانات التعبير الجيني كبيرة.
لدينا نهج يجمع بين الجنين الزرد الأساسية والثقافة اليرقات مع تقنيات استخراج الحمض النووي الريبي القياسي متبوعاً رناسيق. رناسيق يتطلب كمية كبيرة من مواد انطلاق عالية الجودة؛ وتتطلب بعض البائعين 2 ميكروغرام من مجموع الجيش الملكي النيبالي. كنتيجة لذلك، أنواع الخلايا النادرة/نادرة أو تحليل الجنين الفردية بعيد المنال. ومع ذلك، أظهرت السنوات الخمس الماضية تحسينات هائلة في تحليلات المنخفضة الغلة، مجموعات البيانات التي تم إنشاؤها من عينات صغيرة، وكميات أقل من الجيش الملكي النيبالي، ونتوقع أن هذه التطبيقات يكون ممكناً في المستقبل القريب. لضمان دقة النتائج، الإضافة لكلا replicates التقنية، أيإنشاء مكتبتين الجيش الملكي النيبالي من عينة واحدة، و replicates البيولوجية، أيجمع الأجنة من ماتينجس متعددة، يعتبر مثاليا. تسمح هذه الخطوات الباحثون إلى مراقبة للتباين في عينات، وتسلسل المحددة في جميع عينات من المرجح أن تكون النتائج الحقيقية، مع احتمال انخفاض في عداد المفقودين نتيجة انخفاض عدد مرات القراءة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيده هذا العمل R01DK102001 (N.A.Z.) و P30DK072488 (N.A.Z.) T32DK098107 (T.L.H. و J.E.N.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Commercial Reagents | |||
| TriZol | Thermo Scientific | 15596026 | lysis reagent |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | dissociation buffer 1 |
| FACSMax | Genlantis | T200100 | dissociation buffer 2 |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| FirstStrand cDNA conversion | Thermo Scientific | K1621 | cDNA conversion kit |
| 2X SYBR Green Master Mix | Roche | 4707516001 | qRT-PCR Master Mix |
| FACS buffer | Fisher Scientific | 50-105-9042 | |
| chloroform | Sigma Aldrich | 288306 | |
| sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Strains | |||
| Tuebingen | ZIRC | ZL57 | |
| ins2a:mCherry | ZIRC | ZL1483 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 40 micron cell strainer | Sigma | CLS431750 | |
| FACS tube | BD Falcon | 352063 | |
| hemocytometer | Sigma | Z359629 | |
| Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Inverted Microscope | Zeiss | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Illumina HiSeq | Illumina | ||
| LightCycler 480 | Roche | ||
| Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set | Aquaneering | ZHCT100 | |
| FACS tube 5 mL polypropylene tube | BD Falcon | 352063 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | ||
| Consensus Path DB | http://cpdb.molgen.mpg.de/ | ||
| GO Enrichment Analysis | http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis |
References
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. (2002).
- Detrich, H. W., Zon, L., Westerfield, M. The Zebrafish: Disease Models and Chemical Screens. , 4th ed, Academic Press. (2017).
- Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. The Zebrafish: Genetics, Genomics, and Transcriptomics. , 4th ed, Academic Press. (2016).
- Detrich, H. W. The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , 3rd ed, Academic Press. (2011).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J Vis Exp. (109), (2016).
- MPIMG. ConsenusPathDB. , Available from: http://cpdb.molgen.mpg.de/ (2017).
- Consortium, G. O. Enrichment analysis Tool. , Available from: http://www.geneontology.org/ (2017).
- IDT. IDT Primerquest Tool. , Available from: https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index (2017).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M.
- Leitch, C. C., Lodh, S., Prieto-Echague, V., Badano, J. L., Zaghloul, N. A. Basal body proteins regulate Notch signaling through endosomal trafficking. J Cell Sci. 127 (Pt 11), 2407-2419 (2014).
- Lodh, S., Hostelley, T. L., Leitch, C. C., O'Hare, E. A., Zaghloul, N. A. Differential effects on beta-cell mass by disruption of Bardet-Biedl syndrome or Alstrom syndrome genes. Hum Mol Genet. 25 (1), 57-68 (2016).
- Hostelley, T. L., Lodh, S., Zaghloul, N. A. Whole organism transcriptome analysis of zebrafish models of Bardet-Biedl Syndrome and Alstrom Syndrome provides mechanistic insight into shared and divergent phenotypes. BMC Genomics. 17, 318 (2016).
