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Genetics

नमूना तैयारी और Zebrafish से RNASeq आधारित जीन अभिव्यक्ति डेटा का विश्लेषण

Published: October 27, 2017 doi: 10.3791/56187
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Division of Endocrinology, Diabetes and Nutrition, Department of Medicine, University of Maryland School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल zebrafish भ्रूण, लार्वा, या हल कोशिकाओं से पूरे transcriptome विश्लेषण के लिए एक दृष्टिकोण प्रस्तुत करता है । हम आरएनए के अलगाव, RNASeq डेटा के मार्ग विश्लेषण शामिल हैं, और qRT-पीसीआर-जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन के सत्यापन आधारित है ।

Abstract

वैश्विक जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन के विश्लेषण मनाया phenotypes अंतर्निहित उपंयास रास्ते की पहचान के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है । zebrafish पूरे पशु या व्यक्तिगत सेल पशुओं की बड़ी संख्या से आरएनए के अलगाव की आसानी के कारण आबादी से पूरे transcriptome के तेजी से मूल्यांकन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है । यहां आरएनए अनुक्रमण (RNASeq) का उपयोग कर zebrafish भ्रूण में वैश्विक जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है । हम पूरे भ्रूण से या सेल आबादी ट्रांसजेनिक पशुओं में छंटाई सेल का उपयोग प्राप्त से आरएनए की तैयारी का वर्णन । हम भी वैश्विक जीन अभिव्यक्ति डेटा सेट में समृद्ध रास्ते और जीन आंटलजी (GO) शब्दों की पहचान करने के लिए RNASeq डेटा के विश्लेषण के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन । अंत में, हम मात्रात्मक रिवर्स transcriptase पीसीआर (qRT-पीसीआर) का उपयोग जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन के सत्यापन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । इन प्रोटोकॉल नियंत्रण और zebrafish के प्रयोगात्मक सेट के तुलनात्मक विश्लेषण के लिए उपंयास जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन की पहचान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और ब्याज की phenotypes में आणविक अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं ।

Introduction

वैश्विक जीन अभिव्यक्ति के तुलनात्मक विश्लेषण के लिए एक महत्वपूर्ण उपंयास को मनाया phenotypes योगदान जीन की पहचान उपकरण है । इस तरह के विश्लेषण आम तौर पर प्रयोगात्मक और नियंत्रण के नमूनों के बीच की तुलना में प्रतिलिपि की मात्रात्मक मूल्यांकन पर निर्भर हैं । लक्षित दृष्टिकोण, जैसे qRT-पीसीआर अपेक्षाकृत तेजी से और सटीक एकल जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन की जांच के लिए कर रहे हैं । आरएनए अनुक्रमण (RNASeq) नमूनों के बीच जीन अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण परिवर्तन की पहचान करने के लिए एक व्यापक, परिकल्पना मुक्त दृष्टिकोण प्रदान करता है, यह अब प्रयोगात्मक प्रणालियों में इस तरह की जांच के लिए मानक बना ।

Zebrafish कई रोग क्षेत्रों में एक प्रमुख मॉडल के रूप में उभरा है । मूलतः विकास जीव विज्ञान के अध्ययन में उनकी उपयोगिता के लिए विकसित की है, उनके उच्च fecundity और रखरखाव के अपेक्षाकृत कम लागत के कारण, zebrafish के प्रायोगिक उपयोग के लिए भ्रूण से phenotypes की एक व्यापक रेंज वयस्क चरणों के रूप में शामिल करने के लिए विकसित किया गया है के रूप में अच्छी तरह से एक आणविक परख के वाइड सरणी1,2,3। दरअसल, इन फायदों आणविक यंत्रवत अध्ययन तेजी से और लागत प्रभावी सामग्री की बड़ी मात्रा में दोनों आनुवंशिक और पर्यावरण हेरफेर के जीवन के सभी चरणों में आसानी के साथ संयुक्त प्राप्त करने में आसानी की वजह से । इसके अलावा, zebrafish भ्रूण और लार्वा की पारदर्शी प्रकृति कोशिका पैदा करने और ऊतक-विशिष्ट ट्रांसजेनिक रिपोर्टर असतत कोशिका आबादी4के vivo दृश्य में अनुमति देने के लिए आदर्श बनाते हैं । इस तरह की लाइनों के शोषण रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति के आधार पर विशिष्ट पृथक कोशिका प्रकार में वैश्विक जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण परमिट ।

यहां हम वैश्विक जीन अभिव्यक्ति zebrafish भ्रूण की संस्कृति के बाद RNASeq का उपयोग विश्लेषण के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । आनुवंशिक प्रयोगात्मक जोड़तोड़, morpholino सहित (एमओ)-क्षणिक जीन पछाड़ना या CRISPR मध्यस्थता जीनोम संपादन आधारित है, कहीं प्रस्तुत किया गया है5,6,7. इसलिए हम पूरे भ्रूण से आरएनए के अलगाव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल पर ध्यान केंद्रित करने या ट्रांसजेनिक रिपोर्टर व्यक्त कोशिकाओं मार्ग उपकरण और जीन आंटलजी (जाओ) शर्तों का उपयोग कर RNASeq परिणामों के सरल गणनात्मक विश्लेषण द्वारा पीछा किया । अंत में, हम मात्रात्मक रिवर्स transcriptase पीसीआर (qRT-पीसीआर) द्वारा जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन के सत्यापन के लिए एक रणनीति शामिल है । इन प्रोटोकॉल zebrafish आनुवंशिक म्यूटेंट या पर्यावरणीय स्थितियों की तुलना सहित प्रयोगात्मक शर्तों की एक विस्तृत श्रृंखला के अधीन भ्रूण के लिए लागू कर रहे हैं ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > नीचे उल्लिखित सभी पशु प्रोटोकॉल के अनुसार और मैरीलैंड संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित कर रहे हैं ।

< p class = "jove_title" > 1. भ्रूण वडा

  1. प्राकृतिक सहवास के माध्यम से भ्रूण उत्पादन
    1. संस्कृति भ्रूण को 3 माह की आयु, जनन परिपक्वता < सुप वर्ग = "xref" > 5 , < सुप वर्ग = "xref" > 8 .
    2. भ्रूण संग्रह से पहले शाम को विभाजित संभोग टैंक में वांछित तनाव से वयस्क पुरुष और महिला मछली अलग, और प्रत्येक टैंक के लिए 2 पुरुषों और 3 महिलाओं को जोड़ने.
      नोट: ट्रांसजेनिक insulin2a के उपयोग: mCherry फ्लोरोसेंट रिपोर्टर तनाव की अनुमति दी विश्लेषण के अग्नाशय & #946;-cells.
    3. ताजा प्रणाली पानी के साथ संभोग टैंक के लिए मछली हस्तांतरण और तुरंत बाद सुबह रोशनी पर आने के बाद डिवाइडर हटा दें ।
    4. स्वाभाविक रूप से जब तक भ्रूण नीचे टैंक में मनाया जाता है दोस्त के लिए मछली की अनुमति । 30 मिनट के अंतराल में भ्रूण इकट्ठा जब तक वांछित राशि एकत्र की है । प्रत्येक एकत्र समय बिंदु पर भ्रूण मीडिया में अलग पेट्री व्यंजन में संग्रह २८.५ & #176; ग.
    5. प्रदर्शन microinjection आनुवंशिक सामग्री या प्रायोगिक संस्कृति मीडिया में प्लेसमेंट < सुप क्लास = "xref" > 6 , यदि वांछित, और संस्कृति ताजा हांक & #39 में भ्रूण, एस भ्रूण माध्यम < सुप वर्ग = "xref" > 8 में 10-सेमी पेट्री डिश में २८.५ & #176; सी.
      नोट: morpholino में जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए (मो) इंजेक्शन या उत्परिवर्ती पशुओं, ध्यान दें कि प्रत्येक हेरफेर जीन अभिव्यक्ति पर आकस्मिक प्रभाव हो सकता है । म्यूटेंट प्रतिलेखन के स्तर पर आनुवंशिक क्षतिपूर्ति प्रदर्शित कर सकता है जो एमओ द्वारा स्वीकार्य नहीं है-आधारित जीन लक्ष्यीकरण < सुप वर्ग = "xref" > 9 .
  2. स्टेज भ्रूण
    1. संस्कृति के समूहों में भ्रूण ५० & #8211; ७५ भ्रूण प्रति 10-मुख्यमंत्री पकवान सभी भ्रूण के अनुरूप विकासात्मक समय को बढ़ावा देने के लिए पेट्री ।
    2. विकासात्मक प्रगति सुनिश्चित करने के लिए blastomere, epiboly, और somite चरणों में विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर विकासात्मक आकृति की निगरानी करें < सुप वर्ग = "xref" > १० .
      नोट: पकवान में विकास की देरी को रोकने के लिए किसी भी मर या विकृत भ्रूण निकालें ।
      3. विकासात्मक उम्र के आधार पर भ्रूण को अलग
    3. । माप के बाद भ्रूण somite संख्या का उपयोग कर उम्र (पोस्ट-gastrulation, १०.३३ एच पोस्ट निषेचन (hpf)) जब तक लगभग 24 hpf. 24 hpf.
      के बाद कुल शरीर की लंबाई का उपयोग भ्रूण और लार्वा का मंचन नोट: somites धरण के आकार का mesodermal भ्रूण के पृष्ठीय भाग पर मौजूद ऊतक हैं ।
    4. एक २८.५ में हल भ्रूण जगह & #176; सी मशीन और विकास की अनुमति के लिए वांछित उंर के लिए प्रगति ।
< p class = "jove_title" > 2. एकल सेल पृथक्करण: पूरे भ्रूण और क्रमबद्ध सेल आबादी

  1. पूरे भ्रूण पृथक्करण
    1. Euthanize 5-15 मिनट के लिए बर्फ पर zebrafish पकवान रखकर वांछित मंच पर पेट्री भ्रूण जब तक कोई आंदोलन मनाया जाता है .
    2. एक लेबल १.५ एमएल microcentrifuge ट्यूब के लिए 20 भ्रूण के एक पूल हस्तांतरण । microcentrifuge ट्यूब से किसी भी अतिरिक्त भ्रूण मीडिया निकालें.
    3. Add २०० & #181; एल lysis रिएजेंट ( सामग्री की टेबल देखें ) भ्रूण युक्त ट्यूब को. Homogenize lysis में भ्रूण को एक मूसल का प्रयोग यांत्रिक रूप से करते हैं । Add ८०० & #181; L lysis एजेंट को 1 मिलीलीटर में कुल मात्रा लाने के लिए । स्टोर पर-८० & #176; ग जब तक आरएनए निष्कर्षण.
  2. प्रवाह-सॉर्ट किए गए कक्ष आइसोलेशन < सुप वर्ग = "xref" > ११
    1. पेट्री डिश से भ्रूण एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में स्थानांतरण और संभव के रूप में ज्यादा भ्रूण माध्यम के रूप में हटा दें ।
      नोट: भ्रूण की आयु के आधार पर, यांत्रिक पृथक्करण भी इस कदम पर आवश्यक हो सकता है । भ्रूण के साथ & #62; ४८ hpf, हम अनुशंसा करते है एक खल के उपयोग के लिए आगे बढ़ने से पहले भ्रूण अखंडता को बाधित ।
    2. पृथक्करण बफर 1 के 1 मिलीलीटर के साथ भ्रूण मशीन (देखें सामग्री की टेबल) १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में । कमरे के तापमान पर 15-30 मिनट के लिए मशीन । Triturate धीरे से समाधान pipetting ऊपर और नीचे एक P1000 टिप का उपयोग करने के लिए मशीन कदम के दौरान हर 3-4 मिनट मिश्रण । भंवर मत करो.
    3. ३०० x जी पर 3 मिनट के लिए केंद्रापसारक द्वारा भ्रूण इकट्ठा और supernatant हटा दें । फिर से 1 मिलीलीटर पृथक्करण बफर 2 में भ्रूण को निलंबित (सामग्री के तालिका देखें) । नियमित प्लास्टिक trituration.
      4. के साथ कमरे के तापमान पर 15-30 मिनट के लिए मशीन
    4. द्वारा पाचन का आकलन कमजोर 1-2 & #181; प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष सॉर्टिंग (FACS) बफ़र में माइक्रोस्कोप के तहत निलंबन के एल.
      नोट: पूर्ण पाचन हुआ है जब जांच की aliquot ंयूनतम सेल समूहों और भ्रूण ऊतक के टुकड़ों के साथ एकल कोशिकाओं से पता चलता है ।
    5. 5 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा supernatant निकालें । कक्षों को 1 मिलीलीटर FACS बफ़र में पुन: निलंबित करें, और गुरुत्वाकर्षण फ़िल्टर के माध्यम से ४० & #181; मीटर सेल छलनी नमूना से अपच ऊतक को दूर करने के लिए ।
    6. एक hemocytometer का उपयोग कर कोशिकाओं गिनती और FACS बफर के साथ लगभग 1x 10 6 कोशिकाओं/एमएल FACS ट्यूब में पतला ।
      नोट: प्रति एक अपेक्षाकृत छोटी संख्या के साथ सेल प्रकार के लिए भ्रूण (कुल का 5% से कम), जैसे अग्नाशय & #946;-कोशिकाओं, १,००० चरण-मिलान भ्रूण की एक ंयूनतम का उपयोग करें ।
    7. सेल सस्पेंशन नमूनों की 1 मिलीलीटर के साथ ही lysis रिएजेंट या FACS बफर युक्त FACS ट्यूब युक्त FACS ट्यूबों के साथ FACS छंटाई सुविधा प्रदान करते हैं । गेट FACS फ्लो-सॉर्टर फ्लोरोसेंट रिपोर्टर एक्सप्रेस केवल एकल कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए ।
    8. FACS प्रवाह-छंटाई जब तक इच्छित कक्ष संख्या एकत्र किया गया है प्रदर्शन करते हैं ।
      नोट: RNASeq प्रदर्शन करने के लिए, वहाँ एक न्यूनतम कुल आरएनए की आवश्यकता है । हमने पाया है कि 3000-5000 कोशिकाओं उच्च गुणवत्ता, उच्च एकाग्रता आरएनए को अलग करने के लिए पर्याप्त हैं ।
    9. बर्फ पर एकत्र कोशिकाओं की दुकान और आरएनए तैयारी करने के लिए तुरंत आगे बढ़ना ।
< p class = "jove_title" > 3. आरएनए वडा

  1. निकालें आरएनए
    1. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए lysis एजेंट के साथ (कदम 2 से) एकत्र नमूना ।
    2. क्लोरोफॉर्म के प्रत्येक १.० मिलीलीटर lysis रिएजेंट के लिए इस्तेमाल किया और हाथ से ट्यूबों के लिए 15 एस के लिए ०.२ मिलीलीटर जोड़ने के कमरे के तापमान पर 2-3 मिनट के लिए मशीन । 15 मिनट के लिए १२,००० x g पर नमूनों को 4 & #176 पर केंद्रापसारक; C.
    3. एक ताजा ट्यूब के लिए अलग, जलीय चरण हस्तांतरण और इस्तेमाल किया lysis रिएजेंट के प्रत्येक १.० मिलीलीटर के लिए isopropanol के ०.५ मिलीलीटर जोड़ें । कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए मशीन । 4 & #176 पर 10 मिनट के लिए १२,००० x g पर नमूने केंद्रापसारक; C.
    4. ७५% इथेनॉल के साथ धो और 4 & #176 पर 5 मिनट के लिए ७,५०० x g पर नमूने केंद्रापसारक; C. supernatant को पूरी तरह से निकालें और कमरे के तापमान पर शुष्क हवा की अनुमति दें । आरएनए को पुनः निलंबित 15-30 & #181; L diethyl pyrocarbonate (DEPC)-स्वास्थ्यकर्मी जल.
  2. शुद्ध उच्च गुणवत्ता आरएनए
    1. 1/10 मात्रा 3m सोडियम एसीटेट (पीएच ५.५) और isopropanol के 1 मात्रा के साथ आरएनए निलंबन गठबंधन । कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए मशीन और 4 & #176 पर 10 मिनट के लिए १२,५०० x g पर नमूने केंद्रापसारक; C.
    2. बर्फ के साथ गोली धो-शीत ७०% DEPC में इथेनॉल-इलाज पानी और 5 मिनट के लिए १०,००० x g पर नमूनों के केंद्रापसारक 4 & #176; C. एक बार धो चरण दोहराएँ.
    3. supernatant निकालें और कमरे के तापमान पर शुष्क करने के लिए अनुमति देते हैं । DEPC-इलाज पानी में री-सस्पेंड ।
    4. परख एकाग्रता के लिए निकाली आरएनए (एनजी/& #181; L) और शुद्धता (260/230 अनुपात) एक अवशोषण स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग कर. सुनिश्चित करें कि 260/230 मान RNASeq के साथ आगे बढ़ने से पहले ~ २.० है । Store at-८० & #176; C तक हम जब तकई (6 महीने तक).
    5. एक विक्रेता या RNASeq और जीन अभिव्यक्ति बदलें विश्लेषण के लिए कोर के लिए शाही सेना के नमूनों को भेजने के sequencing ठहराव के आधार पर पढ़ता है । विक्रेता से लौटे परिणाम आम तौर पर एक महत्वपूर्ण मोड़-प्रतिलिपि में परिवर्तन का प्रदर्शन जीन की एक सूची के रूप में प्रदान की जाती है नमूनों के बीच पढ़ता है ।
      नोट: यदि उपरोक्त विधि गरीब गुणवत्ता आरएनए पैदावार एक कॉलम इस्तेमाल किया जा सकता है । आरएनए नमूनों के लिए राशि, एकाग्रता, और आरएनए अखंडता संख्या (रिण) विक्रेता या कोर के साथ पुष्टि की जानी चाहिए । विक्रेता या कोर भी आम तौर पर रिण का आकलन करेगा.
< p class = "jove_title" > 4. मार्ग और GO टर्म विश्लेषण

< p class = "jove_content" > नोट: देखें < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 1 कोर या विक्रेता द्वारा प्रदान RNASeq के बाद जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के प्रतिनिधि उत्पादन के लिए.

  1. छंटाई अंतर व्यक्त की जीन
    1. एक एकल प्रयोगात्मक शर्त बनाम नियंत्रण
      1. ओपन डाटा (परिणाम) एक स्प्रेडशीट प्रबंधन सॉफ्टवेयर में तुलना (देखें सामग्री की तालिका ).
      2. & #39 के आगे ड्रॉप-डाउन तीर का चयन करें; सॉर्ट & #39; बटन और select & #34; कस्टम सॉर्ट & #34; प्रयोगात्मक बनाम नियंत्रण शर्त में विभेदक व्यक्त जीन युक्त स्प्रेडशीट के भीतर.
      3. के तहत बॉक्स का चयन करें & #39; कॉलम & #39; ऊपर चबूतरे वाली विंडो में और & #39 द्वारा क्रमबद्ध करने के लिए चुनें; एलएफसी & #39; स्तंभ । चत & #39; मान & #39; में चयनित है & #39; सॉर्ट ऑन & #39; स्तंभ । से सॉर्ट करने के लिए चयन करें & #39; सबसे बड़ी से छोटी & #39; म & #39; क्रम & #39; कॉलम और लिक & #34; ओके & #34;.
        नोट: यह अंतर व्यक्त जीन तरह होगा ताकि वृद्धि हुई अभिव्यक्ति के साथ उन (सकारात्मक एलएफसी) सूची के शीर्ष पर दिखाई देगा, जबकि कम अभिव्यक्ति के साथ उन (नकारात्मक एलएफसी) सूची के तल पर दिखाई देगा.
    2. एक ही नियंत्रण करने के लिए एक से अधिक प्रयोगात्मक शर्तों की तुलना निंनानुसार है ।
      1. प्रयोगात्मक 1 बनाम नियंत्रण स्प्रेडशीट पर एक खाली कॉलम में पहली सेल का चयन करने के लिए दो प्रयोगात्मक स्थितियों में पाया अंतर व्यक्त जीन निर्धारित करते हैं । कक्ष में निंन समीकरण टाइप करें:
        < img alt = "समीकरण" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56187/56187eq1.jpg"/>
        नोट: यह समीकरण IF, ISERROR, और MATCH फ़ंक्शंस का एक संयोजन है. (i) मैच फंक्शन, मैच (A1, Experimental2_vs_Control! A:A, 0), A1 (ENSEMBL आईडी) में मान के लिए एक कॉलम (A:A) में Experimental2_vs_Control नाम (Experimental2_vs_Control!) स्प्रेडशीट के लिए दिखेगा । द & #34; 0 & #34; किसी सटीक मिलान के लिए देखने के लिए इंगित करता है, और यदि कोई सटीक मिलान मिलता है, तो फ़ंक्शन & #34 का मान लौटेगा; 1 & #34;, जबकि यदि कोई मेल नहीं मिलता है, तो फ़ंक्शन एक त्रुटि वापस आ जाएगा & #34; N/a & #34; । (ii) match फ़ंक्शन का परिणाम तब ISERROR फ़ंक्शन में इनपुट होता है, ISERROR (match (A1, Experimental2_vs_Control! A:A, 0)), जहां, अगर इनपुट & #34 है; 1 & #34; किसी मेल का संकेत मिलता है, तो उसे वापस कर दिया जाएगा & #34; झूठा & #34;, और यदि इनपुट है & #34; N/a & #34; संकेत कोई मेल नहीं मिला, तो उसे वापस कर देंगे & #34; सच & #34;. (iii) द & #34; सच & #34; या & #34; FALSE & #34; परिणाम if फ़ंक्शन में इनपुट है, यदि (ISERROR (A1, Experimental2_vs_Control! A:A, 0)), & #34; & #34;, & #34;D uplicate & #34;), कहां, अगर इनपुट है & #34; TRUE & #34; किसी मेल का संकेत नहीं मिला, तो वह मान को उद्धरण चिह्नों के पहले सेट के बीच में वापस कर देगा (& #34; & #34;) जो खाली है, और इसलिए कक्ष रिक्त होगा । यदि इनपुट & #34; FALSE & #34; किसी मेल का संकेत मिलता है, तो वह उद्धरण चिह्नों के दूसरे सेट के बीच में मान लौटा देगा (& #34;D uplicate & #34;), और कक्ष कहेगा & #34;D uplicate & #34;.
      2. प्रेस & #34; लिहा & #34; या & #34; Return & #34; समीकरण को चलाने के लिए । उस कक्ष का चयन करें जिसमें समीकरण है और कक्ष के नीचे दाएं कोने में बॉक्स क्लिक करें । माउस को क्लिक करके रखें और चयनित क्षेत्र को स्तंभ के नीचे सभी तरह खींचकर अंतिम & #39 तक; फ़ीचर ID & #39;, स्तंभ में प्रत्येक कक्ष में समीकरण की प्रतिलिपि बनाने के लिए.
      3. Select & #34; कस् सॉर्ट & #34; फिर से, निचले बाएँ कोने में & #34; + & #34; चिह्न पर क्लिक करके सॉर्टिंग का दूसरा स्तर जोड़ें. प्रथम स्तर में, & #34; के अनुसार सॉर्ट करें & #34;, के अंतर्गत स्तंभ चयन & #34;D uplicate & #34;, के तहत चयन पर छांटें & #39; मान & #39;, और के तहत आदेश का चयन & #39; Z से अ & #39;. दूसरे स्तर में & #34; तब तक & #34;, के अधीन कॉलम चय & #39; एलएफसी & #39;, के तहत चयन पर छांटें & #39; मान & #39;, और के तहत आदेश का चयन & #39; सबसे छोटे से छोटी & #39; व चय & #34; ओके & #34;.
        नोट: यह 4 अभिव्यक्ति परिवर्तन के दिशात्मकता पर आधारित समूहों में जीन की सूची तरह होगा । दोनों में या विपरीत दिशाओं में एक ही दिशा में अभिव्यक्ति में परिवर्तन सुनिश्चित करने के लिए दोनों प्रयोगात्मक स्थितियों में पाए जाने वाले जीन की जांच करना जरूरी है ।
      4. आगे बढ़ने से पहले जीन प्रतीक स्तंभ से कोई लघुकोष्ठक निकालें या परिणाम डेटाबेस में नहीं मिल जाएगा । जीन प्रतीकों वाले संपूर्ण स्तंभ का चयन करें. Select & #34; संपा & #34; तो & #34; स्थ & #34; म ड्रॉप-डाउन & #39; फाइल & #39; menu. Type & #34;(*) & #34; म & #34; पा क्या: & #34; बार बदलें विंडो के, और छोड़ें & #34; साथ बदलें: & #34; पट्टी खाली है । Select & #39; सभी & #39 को प्रतिस्थापित करें; कोष्ठकों की सभी आवृत्तियों को निकालने के लिए.
        नोट: * वर्ण के किसी भी संख्या का प्रतिनिधित्व करता है, दो लघुकोष्ठकों के बीच इस वर्ण को रखने के द्वारा प्रोग्राम को हाइलाइट किए गए कक्षों में किसी भी उदाहरण को ढूँढने के लिए संकेत दिया जाता है और कोष्ठकों की कोई भी आवृत्ति कुछ भी नहीं के साथ प्रतिस्थापित किया जाएगा, जिससे उन्हें हटाने.
  2. समृद्ध मार्ग का निर्धारण
    1. सेट के जीन प्रतीकों की प्रतिलिपि बनाता है जिसके लिए एक इच्छा के लिए क्लिपबोर्ड को समृद्ध रास्ते निर्धारित करते हैं । ConsensusPathDB < सुप वर्ग पर जाएं = "xref" > 12 . Select & #34; जीन सेट एनालिसिस & #34; वेबपेज के बाएं साइडबार पर, उसके बाद & #34; ओवर-जनप्रतिनिधि विश्लेषण & #34;.
    2. में जीन की सूची चिपकाएं & #34;P ऑसटे जीन/प्रोटीन पहचानकर्ता & #34; बॉक्स की सूची । जीन प्रतीक का चयन & #34; जीन/प्रोटीन पहचानकर्ता प्रकार & #34; बॉक्स और क्लिक करें & #34;P roceed & #34;. & #34 के आगे के बॉक्स का चयन करें;P athways के रूप में मार्ग डेटाबेस द्वारा परिभाषित & #34; मार्ग-आधारित सेट अनुभाग के अंतर्गत.
      नोट: विश्लेषण के लिए विकल्प की एक संख्या खोज करने के लिए उपलब्ध डेटाबेस की सूची सहित दिखाई देगा । हम अनुशंसा करते है de-चयन Kegg और Reactome डेटाबेस को छोड़कर सभी डेटाबेस के रूप में वे सबसे अधिक स्थापित और व्यापक हैं । न्यूनतम इनपुट सूची और पी-वैल्यू कटऑफ सेटिंग्स के साथ ओवरलैप भी जरूरतों के आधार पर समायोजित किया जा सकता है. हम डिफ़ॉल्ट 2 जीन कम से कम ओवरलैप और एक ०.०१ पी-वैल्यू कटऑफ पर इन सेटिंग्स छोड़ने की सलाह देते हैं ।
    3. Select & #34; ढूँढें समृद्ध सेट & #34; इनपुट सूची में जीन युक्त रास्ते की सूची प्राप्त करने के लिए.
      नोट: आउटपुट, & #34 के बाद प्रत्येक मार्ग का नाम सहित तालिका स्वरूप में होगा; सेट आकार & #34; (मार्ग में कुल जीनों की संख्या का संकेत), & #34; उम्मीदवारों निहित & #34; (उस मार्ग में हैं कि इनपुट सूची में जीन की संख्या का संकेत ), और साथ ही p-मान और q-मान (एफडीआर), और डेटाबेस से जिस मार्ग की पहचान की गई थी ।
  3. पीढ़ी के मार्ग नेटवर्क
    1. के रूप में ऊपर वर्णित समृद्ध रास्ते निर्धारित करते हैं ।
    2. मार्ग के नाम के बगल में प्रत्येक बॉक्स का चयन करके या तो visualized किया जा करने के लिए या क्लिक करके एक मार्ग नेटवर्क में कल्पना करने के लिए समृद्ध रास्ते के सभी का चयन करें & #34; सभी & #34; के अधीन & #34; चयन & #34; चयन बक्सों के ऊपर स्तंभ शीर्ष लेख में, फिर & #34 का चयन करें; टयूब चयनित सेट्स & #34;.
      नोट: हम अनुशंसा करते हैं सभी रास्ते visualizing अगर 30 से कम हैं; अगर वहाँ से अधिक 30 रास्ते हम शीर्ष 30 सबसे समृद्ध रास्ते का चयन की सिफारिश कर रहे हैं (उन इनपुट सूची से जीन की सबसे बड़ी संख्या युक्त).
    3. समायोजित करें & #34; सापेक्ष ओवरलैप & #34; और & #34; साझा उम् & #34; फ़िल्टर्स, पृष्ठ के शीर्ष केंद्र में या तो बॉक्स का चयन करके और इच्छुकएड प्रतिशत रिश्तेदार ओवरलैप या साझा उंमीदवारों की संख्या, के लिए और अधिक सख्त करने के लिए मार्ग नेटवर्क के भीतर अधिक प्रासंगिक ओवरलैप बनाने के लिए स्पष्ट है, और चयन & #34; गू & #34;.
      नोट: हम अनुशंसा करते हैं, ०.२ के एक ंयूनतम सापेक्ष ओवरलैप, एक 20% जीन ओवरलैप 2 रास्ते के बीच उंहें जोड़ने के लिए, और 2 साझा उंमीदवारों की एक ंयूनतम का संकेत है । ग्राफ लीजेंड पृष्ठ के ऊपरी बाएं में ग्राफ लीजेंड पर क्लिक करके देखा जा सकता है ।
  4. दृढ करण्याचा क्षेत्राच्या सार् मुदत
    1. कॉपी समूह के जीन प्रतीकों के लिए जो एक इच्छा को समृद्ध जीन ontologies का निर्धारण करने के लिए क्लिपबोर्ड । जाओ & #39; गो संवर्धन विश्लेषण उपकरण & #39; म जीन आंटलजी कंसोर्टियम < सुप वर्ग = "xref" > १३ . इसके तहत पृष्ठ के बाईं ओर के बॉक्स में जीन प्रतीकों की सूची का पेस्ट & #34; आपकी जीन आईडी यहाँ & #8230; & #34;
    2. का चयन करें जो जाने के लिए शब्दों का सेट का उपयोग करें, जीन आईडी बॉक्स के नीचे सूचीबद्ध: जैविक प्रक्रिया, आणविक समारोह, या सेलुलर घटक. चुनें (अनुशंसित) & #39; जैविक प्रक्रिया & #39;. Select & #39; ढाणियो rerio & #39; नीचे जाएं शर्तें बॉक्स और क्लिक करें & #34; Submit & #34;.
      नोट: हम ०.०५.
      3. के डिफ़ॉल्ट p-मान कटऑफ का उपयोग करने की सलाह देते हैं
< p class = "jove_title" > 5. qRT द्वारा सत्यापन-पीसीआर

< p class = "jove_content" > नोट: RNASeq में महत्वपूर्ण जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन के साथ पहचाने जाने वाले व्यक्तिगत जीन को लक्षित qRT-पीसीआर द्वारा दोहराने वाले प्रयोगों में सत्यापित किया जाना चाहिए.

  1. सीडीएनए संश्लेषणे
    1. धारा ३.१ में वर्णित विधि का उपयोग कर भ्रूण से आरएनए निकालें. आरएनए निष्कर्षण.
    2. Convert 1 & #181; आरएनए के जी सीडीएनए रूपांतरण किट का उपयोग करके सीडीएनए करने के लिए ( तालिका सामग्री देखें). आरएनए, dNTPs, और रिवर्स transcriptase एंजाइम का मिश्रण । निर्माता & #39; s विनिर्देशों के अनुसार thermocycler प्रतिक्रिया निष्पादित करें ।
    3. पतला सीडीएनए 1:3 DEPC-इलाज पानी में । पर दुकान 4 & #176; ग 1-2 माह तक के लिए ।
  2. qRT-पीसीआर वेरिफिकेशन
    1. . आरएनए अनुक्रमण परिणाम से qRT-पीसीआर द्वारा सत्यापित करने के लिए जीन का चयन करें । अभिव्यक्ति में उच्च गुना परिवर्तन के साथ जीन की पहचान । यह प्रचुर मात्रा में अभिव्यक्ति इंगित करता है के रूप में इन जीनों का निर्धारण भी उच्च पढ़ें गिनती, होते हैं.
    2. चुनें 10-12 उच्च गुना बदलने से लक्ष्य, उच्च जीन की गिनती की सूची पढ़ें । डिजाइन प्राइमरों लक्ष्य जीन बढ़ाना है कि कम से intron-एक्सॉन सीमा पर अवधि ।
    3. जीन के जीन या लक्षित क्षेत्र में प्रवेश qPCR प्राइमर डिजाइन साइट < सुप वर्ग = "xref" > १४ . Select & #34;d esign 2 qPCR प्राइमरी & #34; और साइट को प्राइमरी सेट बनाने के लिए संकेत दें.
      नोट: नमूनों के बीच तुलना को सामान्य करने के लिए आंतरिक नियंत्रण प्राइमरों, जैसे & #946;-actin , को शामिल करना सुनिश्चित करें. द & #946;-actin प्राइमर हैं F: 5 & #39;-TCGAGCTGTCTTCCCATCCA-3 & #39; व R: 5 & #39;-TCACCAACGTAGCTGTCTTTCTG-3 & #39;.
    4. सीडीएनए, फॉरवर्ड प्राइमर, रिवर्स प्राइमर, और पोलीमरेज़ गठबंधन । प्रदर्शन qRT-पीसीआर प्रवर्धन जीन के सापेक्ष अभिव्यक्ति का निर्धारण करने के लिए < सुप वर्ग = "xref" > १५ .
    5. सापेक्ष ठहराव निर्धारण द्वारा ब्याज की जीन के सापेक्ष mRNA अभिव्यक्ति का विश्लेषण < सुप वर्ग = "xref" > १५ .
    6. qRT-पीसीआर की तुलना RNASeq परिणामों के लिए सुनिश्चित करें कि अंतर अभिव्यक्ति की दिशा अनुरूप है ।

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Representative Results

विभेदक व्यक्त जीन की छंटाई:

Alström सिंड्रोम और Bardet-Biedl सिंड्रोम (किउ) के zebrafish मॉडल के लार्वा चरण में अंतर व्यक्त जीन की पहचान करने के लिए, हम पहले से मांय ब्याह इंजेक्शन द्वारा या तो alms1 या bbs1 टेप लक्षित-राज्यमंत्री में अवरुद्ध जंगली प्रकार zebrafish भ्रूण16,17। 5 दिनों के बाद निषेचन (dpf), आरएनए के दो दोहराने प्रत्येक हालत से निकाले गए थे, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से नियंत्रण मो के साथ भ्रूण इंजेक्शन, के रूप में ऊपर धारा 3 में वर्णित । प्रत्येक नमूने से आरएनए ~ १२०,०००,००० पढ़ता ~ १०७,०००,००० zebrafish जीनोम के लिए गठबंधन के साथ की गहराई के लिए अनुक्रम था । 85-90% के बीच के जीनोम के exonic क्षेत्रों के लिए मैप की गई संरेखित पढ़ता है ।

१,३४८ कुल जीन Alström मॉडल में काफी बदल गए थे और ४७१ कुल जीनों को किउ मॉडल में काफी बदल दिया गया था. मॉडल या एक मॉडल के लिए अद्वितीय परिवर्तन के बीच जीन अभिव्यक्ति में साझा परिवर्तन खंड ४.२ में वर्णित के रूप में पहचाने गए । १,०८४ कुल जीन Alström मॉडल में अनोखे ढंग से बदले गए, ६१२ अप विनियमित और ४७२ नीचे विनियमित, और २०७ जीन विशिष्ट किउ मॉडल, १७६ अप-विनियमित और 31 नीचे विनियमित (चित्रा 2, तालिका एस1, और तालिका S2) में बदल रहे थे । २६४ जीन के लिए काफी दोनों मॉडलों में बदल पाए गए थे, ७३ अप विनियमित थे और १८२ नीचे विनियमित थे, और 9 दो मॉडलों के बीच अभिव्यक्ति में विपरीत परिवर्तन दिखाया (चित्रा 2, तालिका एस1, और तालिका S2 (देखें पूरक tables. xlsx)). दो मॉडलों के बीच अंतर व्यक्त जीन की प्रतिकूल संख्या का सुझाव है कि bbs1 और alms1 विकास में विभिंन चरणों का प्रभाव हो सकता है ।

दिलचस्प है, Alström मॉडल में अंतर व्यक्त जीन की बड़ी संख्या का सुझाव है कि alms1 विकास में 5 dpf मंच पर एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जबकि किउ मॉडल में जीन परिवर्तन की छोटी संख्या का सुझाव है कि की भूमिका bbs1 इस समय बिंदु के रूप में प्रमुख नहीं हो सकता है । इसके विपरीत, 2 dpf में पिछले transcriptomic विश्लेषण पर18रिवर्स का सुझाव दिया ।

Alström सिंड्रोम के Zebrafish मॉडल में समृद्ध रास्ते और जीन Ontologies का निर्धारण:

को और अधिक स्पष्ट रूप से Alström मॉडल के आणविक प्रोफ़ाइल स्पष्ट, रास्ते और जीन ontologies अंतर व्यक्त जीन में समृद्ध की पहचान की गई । समृद्ध रास्ते ConsensusPathDB और समृद्ध जीन Ontologies की क्वेरी द्वारा निर्धारित किया गया था के रूप में 4.3-4.5 वर्गों में वर्णित जीन आंटलजी कंसोर्टियम क्वेरी द्वारा निर्धारित किया गया । सबसे उच्च जीन अप के बीच समृद्ध-Alström मॉडल में विनियमित, जीन या गुना संवर्धन की संख्या से, विश्लेषण किया गया । 31 कुल रास्ते थे-Alström मॉडल में विनियमित । के अलावा व्यापक समूहीकरण के "चयापचय," सबसे अधिक प्रभावित रास्ते थे सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली के साथ ३२ और 20 जीन, क्रमशः (चित्र 3ए). बहाव β-सेल रिसेप्टर सिग्नलिंग घटनाओं भी प्रतिरक्षा प्रणाली का सुझाव समृद्ध थे अप-विनियमन इस मॉडल में. कई संकेत रास्ते भी Alström मॉडल में विनियमित जीन के बीच समृद्ध थे, प्राथमिक पपनी रोग, सेल के एक प्रमुख संकेतन केंद्र (चित्र 3ए) के साथ Alström सिंड्रोम के संघ के अनुरूप. इसके अलावा, तीन रास्ते इंसुलिन स्राव के साथ जुड़े विनियमित थे: फैटी एसिड GPR40 करने के लिए बाध्य, मुक्त फैटी एसिड, और acetylcholine (चित्रा 3). यह अत्यधिक व्याप्ति इंसुलिन प्रतिरोध और प्रकार 2 Alström रोगियों में मधुमेह phenotypes के साथ संगत है । छह जाने की शर्तें अप के बीच समृद्ध थे Alström मॉडल में विनियमित जीन, एरिथ्रोसाइट भेदभाव, एरिथ्रोसाइट homeostasis, माइलॉयड सेल homeostasis, और समस्थिति प्रक्रियाओं (चित्र बी) सहित । अप-विनियमित रास्ते का एक मार्ग के नेटवर्क का आकलन करने के लिए, Alström मॉडल अप-विनियमित रास्ते का एक रास्ते का संजाल (चित्रा 3सी) उत्पन्न किया गया था. परस्पर रास्ते की प्रमुख नोड प्रतिरक्षा प्रणाली और संकेतन के साथ जुड़े रास्ते के बीच एक उच्च स्तर की कनेक्टिविटी का पता चला, जबकि मामूली नोड्स में से एक तीन इंसुलिन विनियामक रास्ते के बीच कनेक्टिविटी का पता चला । अंत में, हम जीन अभिव्यक्ति RNASeq द्वारा 5 जीन लक्ष्य है, जो या तो ऊपर या नीचे थे Alström मॉडल में विनियमित के आकलन द्वारा की पहचान परिवर्तन सत्यापित । qRT द्वारा जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन का डायरेक्शन-पीसीआर में ऑसटे, gck, bmb, btr26, और ifi35, नियंत्रण के सापेक्ष, recapitulated कि RNASeq द्वारा मनाया (चित्रा 4a-बी).

Figure 1
चित्र 1. प्रतिनिधि RNASeq के बाद जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के उत्पादन कोर या विक्रेता द्वारा प्रदान की । फ़ीचर id ENSEMBL जीन id संख्या को इंगित करता है । पढ़ें गिनती या तो नियंत्रण या प्रयोगात्मक नमूनों कि जीनोम में है कि जीन के लिए गठबंधन में पढ़ता की संख्या इंगित करता है । मोड़ो बदलें और गुना परिवर्तन के प्रवेश प्रयोगात्मक नमूना दिशा में अभिव्यक्ति में या तो सकारात्मक (वृद्धि) में प्रयोगात्मक और नियंत्रण के नमूने के बीच जीन की अभिव्यक्ति में परिवर्तन की डिग्री से संकेत मिलता है, या अभिव्यक्ति में नकारात्मक (कमी) प्रायोगिक नमूना दिशा में । p-मान और एफडीआर परिणामों के महत्व को निर्धारित करने के लिए सांख्यिकीय परीक्षण कर रहे हैं; RNASeq प्रयोगों के लिए, ०.०५ के एक अधिक कड़े एफडीआर मूल्य महत्व निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है । Gene_symbol NCBI जीन आईडी इंगित करता है, और gene_name जीन का पूरा नाम सूचीबद्ध करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. अंतर किउ और Alström मॉडल में जीन व्यक्त की । ऊपर के जीन की संख्या विनियमित (लाल) या नीचे विनियमित (पीला) alms1 मो में (हरा) भ्रूण इंजेक्शन, bbs1 मो (नारंगी) भ्रूण, या दोनों मानक नियंत्रण एमओ की तुलना में इंजेक्शन भ्रूण इंजेक्शन । । * दोनों में बदल लेकिन अभिव्यक्ति में विपरीत परिवर्तन होने जीन की संख्या का अर्थ है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चigure 3. Alström मॉडल में विनियमित रास्ते और समृद्ध शब्दों जाओ । (क) जीन की संख्या के आधार पर विनियमित मार्ग । (ख) गुना संवर्धन द्वारा नियमों को विनियमित जाना । (ग) Alström मॉडल में विनियमित मार्ग के मार्ग संपर्क । रास्ते के बीच 20% साझा जीन की एक ंयूनतम द्वारा निर्धारित मार्ग कनेक्शन और कम से 2 जीन ओवरलैप । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4. qRT-पीसीआर जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन का सत्यापन । जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन RNASeq द्वारा की पहचान की उंर में पुष्टि की गई-और उपचार-5 dpf भ्रूण मिलान, नियंत्रण, alms1, या bbs1 मो के साथ इंजेक्शन (क) mRNA का उपयोग जीन की अभिव्यक्ति दिखा जीन के सबसेट-पीसीआर । (B) RNASeq dataset से पठन गणनाएं दिखाने वाले समतुल्य डेटा । सभी डेटा नियंत्रण के सापेक्ष हैं, और qRT-पीसीआर actin को सामान्यीकृत किया गया । ऑसटे, क्षुद्रग्रह homolog 1; gck, glucokinase; bmb, brambleberry; btr26, जालिम-संबंधी जीन परिवार, सदस्य 26; ifi35, इंटरफेरॉन-प्रेरित प्रोटीन ३५ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में वर्णित दृष्टिकोण एक अपेक्षाकृत तेजी से और पूरे पशुओं या विशिष्ट हल कोशिका आबादी के transcriptome स्तर के विश्लेषण के लिए लागत प्रभावी रणनीति प्रदान करता है । zebrafish क्योंकि आसानी और शुरू करने की बड़ी मात्रा में उत्पादन में तेजी के अध्ययन के इस प्रकार के लिए एक लाभप्रद मॉडल प्रदान करता है सामग्री, आनुवंशिक या पर्यावरणीय प्रयोगात्मक शर्तों को लागू करने की आसानी, और एक बड़े की उपलब्धता ट्रांसजेनिक रिपोर्टर लाइनों के स्पेक्ट्रम सेल प्रकार विशिष्ट और ऊतक विशिष्ट आबादी के अलगाव के लिए अनुमति देता है ।

हालांकि यहां विस्तृत नहीं है, इस विधि को आसानी से ऊतक FACs और संग्रह के लिए एक विकल्प के रूप में किशोर या वयस्क मछली से एकत्र वर्गों को समायोजित कर सकता है । हम भी एक बुनियादी अनुवर्ती विश्लेषण रणनीति है कि केवल बुनियादी स्प्रेडशीट आज्ञाओं और पूर्व मौजूदा मार्ग और जाओ डेटाबेस के उपयोग पर निर्भर करता है विकसित की है । इस दृष्टिकोण का प्रमुख लाभ कंप्यूटर प्रोग्रामिंग या डाटाबेस प्रबंधन में उच्च स्तर की विशेषज्ञता की आवश्यकता के बिना पहुंच की सुगमता है । जैसे, इस रणनीति बड़े जीन अभिव्यक्ति डेटा सेट के जानकारीपूर्ण विश्लेषण के लिए सभी पृष्ठभूमि के जांचकर्ताओं के लिए लागू है ।

हमारे दृष्टिकोण RNASeq द्वारा पीछा मानक आरएनए निष्कर्षण तकनीकों के साथ बुनियादी zebrafish भ्रूण और लार्वा संस्कृति को जोड़ती है । RNASeq उच्च गुणवत्ता वाले प्रारंभिक सामग्री की एक बड़ी मात्रा की आवश्यकता है; कुछ विक्रेताओं को कुल आरएनए के 2 µ g की आवश्यकता होती है । परिणामस्वरूप, दुर्लभ/निराला सेल प्रकार या व्यक्तिगत भ्रूण विश्लेषण पहुंच से बाहर है । हालांकि, पिछले पांच वर्षों में कम उपज विश्लेषण में नाटकीय सुधार का प्रदर्शन किया है, छोटे नमूनों से उत्पंन डेटासेट, और कम आरएनए मात्रा, और हम उंमीद करते है कि इन आवेदनों को निकट भविष्य में संभव हो जाएगा । सटीक परिणाम सुनिश्चित करने के लिए, दोनों तकनीकी प्रतिकृति के अलावा, यानी, एक एकल नमूने से दो आरएनए पुस्तकालयों पैदा, और जैविक प्रतिकृति, यानी, कई संभोग से भ्रूण का संग्रह, आदर्श है. इन चरणों के नमूने में भिन्नता के लिए नियंत्रण करने के लिए शोधकर्ताओं की अनुमति दें, और सभी नमूनों में पहचाने अनुक्रम कम पढ़ने-गणना परिणाम गुम होने की कम संभावना के साथ, सही परिणाम होने की संभावना है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को R01DK102001 (N.A.Z.), P30DK072488 (N.A.Z.), और T32DK098107 (T.L.H. और J.E.N.) ने सपोर्ट किया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Commercial Reagents
TriZol Thermo Scientific 15596026 lysis reagent
TrypLE Gibco 12604013 dissociation buffer 1
FACSMax Genlantis T200100 dissociation buffer 2
DEPC-treated water Sigma 95284
FirstStrand cDNA conversion Thermo Scientific K1621 cDNA conversion kit
2X SYBR Green Master Mix Roche 4707516001 qRT-PCR Master Mix
FACS buffer Fisher Scientific 50-105-9042
chloroform Sigma Aldrich 288306
sodium acetate Sigma Aldrich S2889
Name Company Catalog Number Comments
Zebrafish Strains
Tuebingen ZIRC ZL57
ins2a:mCherry ZIRC ZL1483
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
40 micron cell strainer Sigma CLS431750
FACS tube BD Falcon 352063
hemocytometer Sigma Z359629
Dissecting Microscope Zeiss
Inverted Microscope Zeiss
Nanodrop Thermo Scientific
Illumina HiSeq Illumina
LightCycler 480 Roche
Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set Aquaneering ZHCT100
FACS tube 5 mL polypropylene tube BD Falcon 352063
Name Company Catalog Number Comments
Software
Excel Microsoft
Consensus Path DB http://cpdb.molgen.mpg.de/
GO Enrichment Analysis http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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  2. Detrich, H. W., Zon, L., Westerfield, M. The Zebrafish: Disease Models and Chemical Screens. , 4th ed, Academic Press. (2017).
  3. Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. The Zebrafish: Genetics, Genomics, and Transcriptomics. , 4th ed, Academic Press. (2016).
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  18. Hostelley, T. L., Lodh, S., Zaghloul, N. A. Whole organism transcriptome analysis of zebrafish models of Bardet-Biedl Syndrome and Alstrom Syndrome provides mechanistic insight into shared and divergent phenotypes. BMC Genomics. 17, 318 (2016).

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Hostelley, T. L., Nesmith, J. E., Zaghloul, N. A. Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish. J. Vis. Exp. (128), e56187, doi:10.3791/56187 (2017).

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