Summary
Denne protokollen gir en tilnærming for hele transcriptome analyse fra sebrafisk embryo, larvene, eller sortert celler. Vi inkluderer isolering av RNA, sti analyse av RNASeq data, og qRT-PCR-baserte valideringen av genet uttrykk endringer.
Abstract
Analyse av globale gene expression endringer er et verdifullt verktøy for å identifisere romanen trasé underliggende observert fenotyper. Sebrafisk er en utmerket modell for rask vurdering av hele transcriptome fra hele dyr eller personlige celle populasjoner på grunn av brukervennlighet for isolering av RNA fra et stort antall dyr. Her vises en protokoll for globale gene expression analyse i sebrafisk embryoer ved hjelp av RNA sekvensering (RNASeq). Vi beskriver utarbeidelse av RNA fra hele embryo eller celle populasjoner får celle sortering i transgene dyr. Vi har også beskriver en tilnærming for analyse av RNASeq data å identifisere beriket veier og Gene ontologi (gå) vilkårene i globale gene expression datasett. Til slutt gir vi en protokoll for valideringen av genet uttrykk endringer ved hjelp av kvantitative revers transkriptase PCR (qRT-PCR). Disse protokollene kan brukes for komparativ analyse av kontroll og eksperimentelle sett sebrafisk for å identifisere romanen gene expression endringer, og gi molekylær innsikt i fenotyper rundt.
Introduction
Komparativ analyse av globale genuttrykk er et verdifullt verktøy for å identifisere romanen gener bidra til observert fenotyper. Slike analyser er vanligvis avhengig av kvantitativ vurdering av transkripsjon overflod forhold mellom eksperimentelle og kontroll prøver. Målrettede tilnærminger, som qRT PCR er relativt rask og nøyaktig for undersøkelse av ett gen uttrykk endringer. RNA sekvensering (RNASeq) tilbyr en bred, hypotese-fri tilnærming for å identifisere viktige endringer i genuttrykk mellom prøvene, gjør det nå standarden for slike undersøkelser over eksperimentell systemer.
Sebrafisk har dukket opp som en fremtredende modell, over mange sykdom områder. Opprinnelig utviklet for deres nytte i utviklingsbiologi studier, på grunn av deres høy fruktbarhet og relativt lave kostnadene ved vedlikehold, eksperimentell bruk av sebrafisk har utviklet seg med et bredt spekter av fenotyper fra embryonale til voksen scener så vel som en bredt utvalg av molekylære søk1,2,3. Faktisk disse fordelene gjør molekylær mekanistisk studier rask og kostnadseffektivt på grunn av enkelt anskaffe store mengder materiale kombinert med brukervennlighet både genetiske og miljømessige manipulasjon i alle faser av livet. Videre gjennomsiktig natur sebrafisk befruktede egg og larver gjør det ideelt for å generere celle - og vev-spesifikk transgene reporter linjer slik at i vivo visualisering av diskrete celle populasjoner4. Utnyttelse av slike linjer tillater globale gene expression analyse i bestemte isolert celletyper basert på reporter genuttrykk.
Her presenterer vi en omfattende protokoll for globale genet uttrykk analyse med RNASeq etter kultur sebrafisk embryoer. Genetisk eksperimentelle manipulasjoner, inkludert morpholino (MO)-basert forbigående genet knockdown eller CRISPR-mediert genomet redigering har blitt presentert andre steder5,6,7. Vi har derfor fokusere på en detaljert protokoll for isolering av RNA fra hele embryo eller sortert transgene reporter-uttrykke celler etterfulgt av enkel beregningsorientert analyse av RNASeq resultater bruker veien verktøy og gene ontologi (gå) vilkårene. Endelig har vi inkludert en strategi for valideringen av genet uttrykk endringer av kvantitative revers transkriptase PCR (qRT-PCR). Disse protokollene gjelder for sebrafisk embryo utsatt for en rekke eksperimentelle forhold, inkludert sammenligning av genetisk mutanter eller miljøforhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle dyr protokoller skissert nedenfor er i samsvar med og godkjent av University of Maryland institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC).
1. embryo forberedelse
- generere embryo gjennom naturlig mating
- kultur embryo 3 måneders alder, reproduktive modenhet 5 , 8 .
- Skille voksne mannlige og kvinnelige fisk fra ønsket belastningen i delt parring tanker på kvelden før embryoet samling, og legge til 2 menn og 3 kvinner i hvert kar.
Merk: Bruk av transgene insulin2a:mCherry fluorescerende reporter belastningen tillatt analyse av bukspyttkjertelen β-celler. - Overføring fisk for mating tank med frisk system vann og fjerne skillet straks lampene morgenen.
- Kan fisken å mate naturlig til embryoer er observert i bunnen tank. Samle embryo i 30 min intervaller inntil ønsket mengde samles. Lagre hver samlet tidspunkt i separate Petri retter i fosteret medier på 28.5 ° C.
- Utføre microinjection av genetisk materiale eller plassering i eksperimentell kultur medier 6, om ønskelig, og kultur embryoene i frisk Hank ' s embryoet middels 8 i 10 cm Petri retter på 28,5 ° C.
Merk: For gene expression analyse i morpholino (MO) injiseres eller mutanter, oppmerksom på at hver manipulasjon kan ha utilsiktede konsekvenser på genuttrykk. Mutanter kan vise genetisk kompensasjon på nivå med transkripsjon som ikke er observert av MO-baserte genet målrette 9.
- Scenen embryo
- kultur embryo i grupper på 50 – 75 embryo per 10 cm Petriskål å fremme konsekvent utviklingsmessige timing av alle embryoer.
- Overvåke utviklingsmessige morfologi bruke dissecting mikroskopet på blastomere, epiboly og somite stadier for å sikre utviklingsmessige progresjon 10.
Merk: Fjern alle døende eller misformede embryo for å hindre utviklingsmessige forsinkelser i fatet. - Skille embryoene basert på den utviklingsmessige alderen. Måle embryo alder med somite nummer etter segmentering (etter gastrulation, 10.33 h innlegget befruktning (hpf)) til ca 24 hpf. Stadium befruktede egg og larver bruke totale Kroppslengden etter 24 hpf.
NOTE Somites er chevron-formet mesodermal vev på den dorsal delen av fosteret. - Plasserer de sorterte embryoene i en 28,5 ° C inkubator og tillate utvikling til fremgang til ønsket alder.
2. Encellede dissosiasjon: Hele fosteret og sortert celle populasjoner
- hele fosteret dissosiasjon
- Euthanize sebrafisk embryoer på ønsket scenen ved å plassere Petriskål på is 5-15 minutter før ingen bevegelse er observert .
- Overføre en pool av 20 embryo slik merket 1,5 mL microcentrifuge. Fjerne overflødig embryoet medier fra microcentrifuge røret.
- Legge til 200 µL lysis reagens (se Tabell of Materials) til røret som inneholder embryoer. Homogenize embryoene i lyse reagens mekanisk med en støter. Legge til 800 µL lysis reagens for å bringe det totale volumet til 1 mL. Butikken på-80 ° C til RNA utvinning.
- Flyt-sortert cellen aisolering 11
- overføre embryoene fra Petriskål til en 1,5 mL microcentrifuge rør og fjerne så mye embryoet medium som mulig.
Merk: Avhengig av embryo alder, mekanisk dissosiasjon kan også være nødvendig på dette trinnet. Med embryo > 48 hpf, anbefaler vi bruk av en støter å forstyrre embryoet integritet før du fortsetter. - Ruge embryo med 1 mL av dissosiasjon buffer 1 (se Tabell for materiale) i 1,5 mL microcentrifuge tube. Inkuber i 15-30 min ved romtemperatur. Triturate løsningen av pipettering forsiktig opp og ned ved hjelp av et P1000 tips for å blande hvert 3-4 min under inkubasjon trinnet. GJØR ikke VORTEX.
- Samle embryoene med sentrifugering for 3 min 300 x g og fjerne nedbryting. Nytt avbryte embryoene 1 mL dissosiasjon buffer 2 (se Tabell for materiale). Inkuber i 15-30 min ved romtemperatur med vanlig Pipetter føden.
- Vurdere fordøyelsen fortynne 1-2 µL av suspensjon i fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) buffer under mikroskop.
Merk: Komplett fordøyelsen oppstod når den undersøkt aliquot viser enkeltceller med minimal celle klynger og embryonale vev. - Samle cellene med sentrifugering 300 x g for 5 min. Fjern nedbryting. Nytt suspendere cellene i 1 mL FACS buffer og tyngdekraften filter gjennom en 40 µm celle sil for å fjerne ufordøyd vev fra eksempel.
- Telle celler ved hjelp av en hemocytometer og fortynn med FACS buffer ca 1 x 10 6 celler/mL i et FACS rør.
Merk: For celletyper med et relativt lite antall per embryo (mindre enn 5% av totalen), for eksempel bukspyttkjertelen β-celler, bruke minst 1000 scenen-matchet embryoer. - Gir FACS sortering anlegg med FACS rør som inneholder 1 mL av cellen suspensjon prøver samt FACS rør som inneholder bare lysis reagens eller FACS Buffer. Gate FACS flyt-sorter å samle bare enkeltceller som uttrykker fluorescerende reporteren.
- Utføre FACS flyt-sortering før ønsket celle tall har vært samlet.
Merk: For å utføre RNASeq, det er et minimum totale RNA kreves. Vi har funnet at 3,000-5,000 celler er tilstrekkelig til å isolere høy kvalitet, høy-konsentrasjon RNA. - Lagre det avhentet celler på is og videre umiddelbart til RNA forberedelse.
- overføre embryoene fra Petriskål til en 1,5 mL microcentrifuge rør og fjerne så mye embryoet medium som mulig.
3. RNA forberedelse
- Ekstra RNA
- ruge samlet prøven (fra trinn 2) med lyse reagens i 5 minutter ved romtemperatur.
- Legg til 0,2 mL kloroform for hver 1,0 mL av lysis reagens brukt og invertere rør for hånd for 15 s. Incubate i 2-3 min i romtemperatur. Sentrifuge prøvene 12.000 x g i 15 min 4 ° C.
- Overføre den separerte, vandige fasen til en frisk rør og Legg til 0,5 mL isopropanol for hver 1,0 mL av lysis reagens som brukes. Inkuber i 10 min ved romtemperatur. Sentrifuge prøvene 12.000 x g i 10 min 4 ° C.
- Vask med 75% etanol og sentrifuge prøvene 7500 x g i 5 min på 4 ° C. fjerne nedbryting helt og la luften tørr ved romtemperatur. Nytt suspendere RNA i 15-30 µL diethyl pyrocarbonate (DEPC)-behandlet vann.
- Rense høykvalitets RNA
- kombinerer RNA suspensjon med 1/10 volume 3 M natrium acetate (pH 5.5) og 1 isopropanol. Ruge for 20 min ved romtemperatur og sentrifuge prøvene 12 500 x g i 10 minutter på 4 ° C.
- Vask pellets med iskald 70% etanol i DEPC-behandlet vann og sentrifuge prøvene 10.000 x g i 5 min på 4 ° C. Gjenta wash trinn når.
- Fjern nedbryting og la det tørke i romtemperatur. Nytt avbryte DEPC-behandlet vann.
- Analysen den utpakkede RNA for konsentrasjonen (ng/µL) og renhet (260/230 ratio) bruker en absorpsjon spectrometer. Kontroller at 260/230 verdien er ~ 2.0 før du fortsetter med RNASeq. Lagre på-80 ° C til osse (opptil 6 måneder).
- Sende RNA prøvene til en leverandør eller en kjerne for RNASeq og genuttrykk endre analyse basert på kvantifisering av sekvensering leser. Resultatene som returneres fra leverandøren tilbys vanligvis som en liste av gener viser en betydelig fold-endring i transkripsjon leser mellom eksempler.
Merk: En kolonne kan brukes hvis metoden ovenfor gir dårlig kvalitet RNA. Beløpet, konsentrasjon og RNA integritet nummer (RIN) for RNA prøver skal bekreftes med leverandøren eller core. Leverandør- eller kjerne vil også vanligvis vurdere RIN.
4. Stien og gå Term Analysis
Merk: se figur 1 for representant ut av gene expression analyse etter RNASeq gitt av kjernen eller leverandøren.
- Sortering ulikt uttrykt gener
- sammenligne én eksperimentelle betingelse versus kontroll
- Open data (resultater) i en regneark ledelse programvare (se tabell for materiale ).
- Velger du pilen ved siden av ' Sorter ' og velger " Egendefinert sortering " i regnearket som inneholder ulikt uttrykt gener i det eksperimentelle forhold kontroll tilstand.
- Velg under ' kolonnen ' i vinduet som dukker opp, og velg å sortere etter den ' LFC ' kolonnen. Sikre ' verdier ' er valgt i den ' Sorter etter ' kolonnen. Velg sortere fra ' størst til minst ' i den ' ordre ' kolonnen og klikker " OK ".
Merk: Dette vil sortere ulikt uttrykt gener slik at de med økt uttrykk (positiv LFC) vises øverst i listen mens de med redusert uttrykk (negativ LFC) vises nederst på listen.
- Sammenligne flere eksperimentelle forhold til én kontroll som følger.
- Merk den første cellen i en tom kolonne på eksperimentell 1 versus kontroll regneark til å bestemme ulikt uttrykt gener i to eksperimentelle forhold. Skriv inn denne formelen i cellen:
Merk: Dette er en kombinasjon av hvis, ERFEIL og kamp. (i) funksjonen sammenligne, MATCH (A1, Experimental2_vs_Control! Kolonnebokstav, 0), vil se etter verdien i celle A1 (ENSEMBL-ID) i A kolonnen (kolonnebokstav) regneark kalt Experimental2_vs_Control (Experimental2_vs_Control!). Den " 0 " angir for å lete etter et eksakt treff, og hvis et eksakt treff, returnerer funksjonen verdien " 1 ", mens hvis ingen treff, returnerer funksjonen en feil " N/A ". (ii) resultatet av sammenligne-funksjonen går deretter inn i ISERR, ISERROR (MATCH (A1, Experimental2_vs_Control! Kolonnebokstav, 0)), hvor, hvis input er " 1 " indikerer et samsvar ble funnet, returneres " falske ", og er " N/A " indikerer en kamp ikke ble funnet, returneres " sant ". (iii) den " sanne " eller " falske " resultatet er deretter innspill til hvis-funksjonen hvis (ISERROR (MATCH (A1, Experimental2_vs_Control! Kolonnebokstav, 0)), " ", " kopiere "), hvor, hvis input er " ekte " indikerer en kamp ble ikke funnet, returneres verdien mellom det første settet med anførselstegn (" ") som er tom, og derfor cellen være tom. Hvis inndata er " falske " som angir et samsvar ble funnet, returneres verdien mellom det andre settet med anførselstegn (" kopiere "), og cellen vil si " duplisere ". - Trykk " Enter " eller " returnerer " kjøre ligningen. Velg cellen som inneholder formelen, og klikk boksen i nederste høyre hjørne i cellen. Holde musen klikkes og dra det merkede området hele veien ned kolonnen til sist ' funksjons-ID ', kopiere formelen i hver celle i kolonnen.
- Velg " Egendefinert sortering " igjen, legge til et nytt nivå av sortering ved å klikke på " + " ikonet i nedre venstre hjørne. I det første nivået, " sortere etter ", under søylen velge " kopiere ", under Sorter etter velger ' verdier ', og under rekkefølge velger ' å til A '. I det andre nivået, " deretter ", under søylen velge ' LFC ', under Sorter etter velger ' verdier ', og under rekkefølge velger ' størst til minst ' og velg " OK ".
Merk: Dette vil sortere gener i 4 grupper basert på retningen for uttrykket endres. Det er viktig å sjekke genene i både eksperimentelle forhold å sikre at endringen i uttrykket er i samme retning i begge eller i motsatte retninger. - Fjerne eventuelle parenteser genet symboler-kolonnen før du fortsetter eller resultatene ikke vil finnes i databaser. Merk hele kolonnen som inneholder genet symboler. Velg " Rediger " deretter " erstatte " i rullegardinlisten ' fil ' menyen. Type " (*) " i den " Søk etter: " bar i Erstatt vinduet, og la den " Erstatt med: " bar er tom. Velg ' Erstatt alle ' å fjerne alle forekomster av parenteser.
Merk: Den * representerer flere tegn, ved å plassere denne tegn mellom to parenteser programmet blir bedt om å finne en forekomst i de markerte cellene og en forekomst av parenteser erstattes med ingenting, og dermed fjerne dem.
- Merk den første cellen i en tom kolonne på eksperimentell 1 versus kontroll regneark til å bestemme ulikt uttrykt gener i to eksperimentelle forhold. Skriv inn denne formelen i cellen:
- sammenligne én eksperimentelle betingelse versus kontroll
- Determining beriket veier
- kopi genet symboler på settet som ønsker å finne de beriket veiene til utklippstavlen. Gå til ConsensusPathDB 12. Velg " Gene satt analyse " på venstre side av websiden, etterfulgt av " over representasjon analyse ".
- Lim inn listen over gener i den " lime inn en genet/protein identifikatorer " boksen. Velg genet symbol i den " Gene/protein ID type " boksen og klikker " Fortsett ". Merk siden " veier som definert av veien databaser " under den veien-baserte angir delen.
Merk: En rekke alternativer for analyse vil bli inkludert i listen over tilgjengelige databaser å søke. Vi anbefaler de velge alle databaser unntatt Kegg og Reactome databasene som de er den mest etablerte og omfattende. Minimum overlapping med liste og p-verdien cutoff innstillinger kan også justeres basert på behov. Vi anbefaler forlate disse innstillingene på standard 2 gen minimum overlappingen og en 0,01 p-verdien cutoff. - Velg " finne beriket sett " liste over baner som inneholder gener i inndatalisten.
Merk: Utdataene blir i tabellformat inkludert navnet på hver vei etterfulgt av " angi " (som viser antall totale gener i veien), " kandidater inneholdt " (som angir antall gener i inndatalisten i at skoleveien ), samt den p-verdien og q-verdi (FDR) og databasen veien ble identifisert som.
- Generasjon pathway nettverk
- bestemmer beriket veier som beskrevet ovenfor.
- Merker alle beriket veier å visualisere en sti nettverk ved enten å merke hver vei navnene til visualiseres eller ved å klikke " alle " under " Velg " i kolonneoverskriften over boksene utvalg, Velg " Visualisere merkede settene ".
Merk: Vi anbefaler visualisere alle veiene hvis det er mindre enn 30; Hvis det er større enn 30 trasé anbefaler vi å velge Topp 30 mest beriket veier (som inneholder det største antallet gener fra inndatalisten). - Juster den " relative overlapping " og " delt kandidater " filtre, ved å merke enten i øverst i midten på siden og skrive desirEd prosent relativ overlappe eller antall delte kandidater, skal strengere for å gjøre den mer relevant overlapper innen pathway nettverk klarere, og velg " bruker ".
Merk: Vi anbefaler en minimum relative overlapping mellom 0,2, som angir en 20% genet overlapping mellom 2 Veier å koble dem, og minimum 2 delt kandidater. Grafen legenden kan sees ved å klikke på grafen forklaringen øverst til venstre på siden.
- Fastsettelse av beriket gå vilkårene
- kopierer genet symbolene av gruppen som man ønsker å finne de beriket genet ontologies til utklippstavlen. Gå til den ' gå berikelse analyseverktøyet ' i Gene ontologi Consortium 13. Lim inn listen over genet symboler i boksen til venstre på siden under " din genet IDer her … "
- velge hvilket sett med gå ord å bruke, vises under boksen genet IDer: biologisk prosess, molekylær funksjon eller cellulære komponenten. Velg (anbefales) ' biologisk prosess '. Velg ' Danio rerio ' under farten vilkårene boksen og klikker " Send ".
Merk: Vi anbefaler at du bruker standard p-verdien cut-off av 0,05.
5. Bekreftelse av qRT PCR
Merk: enkelte gener identifisert med betydelig gene expression endringer i RNASeq må bekreftes av målrettet qRT PCR Repliker eksperimenter.
- cDNA syntese
- ekstra RNA fra embryo med metoden beskrevet i avsnitt 3.1. RNA utvinning.
- Konverterer 1 µg av til cDNA ved hjelp av cDNA konvertering kit (se Tabell for materiale). Kombinere RNA, dNTPs og revers transkriptase enzym. Utføre thermocycler reaksjonen ifølge produsenten ' s spesifikasjoner.
- Fortynn cDNA 1:3 i DEPC-behandlet vann. Butikken på 4 ° C i opptil 1-2 måneder.
- qRT PCR bekreftelse
- Velg gener kontrollere av qRT PCR RNA sekvensering resultater. Identifisere tilblivelse med høy kaste endringer i uttrykk. Bestemmer hvilken av disse genene også inneholde høy Les teller, som angir rikelig uttrykk.
- Velg 10-12 mål høy kaste endringen, høye Les teller liste over gener. Utforme primere å forsterke målet gener som dekker minst 1 intron-ekson grensen.
- Angi genet eller målrettingsområde av genet til qPCR primer design nettstedet 14. Velg den " design 2 qPCR primere " og ber området for å opprette primer sett.
Merk: Husk å inkludere intern kontroll primere, som β-utgangen, for å normalisere sammenligninger mellom eksempler. Β-utgangen grunning er F: 5 ' - TCGAGCTGTCTTCCCATCCA - 3 ' og R: 5 ' - TCACCAACGTAGCTGTCTTTCTG - 3 '. - Kombinerer den cDNA frem primer, omvendt primer og utvalg. Utføre qRT PCR forsterkning for å fastslå det relative uttrykket av gener 15.
- Analyserer relative mRNA uttrykket av gener av interesse ved relative kvantifisering besluttsomhet 15.
- Sammenligne qRT-PCR RNASeq resultater å sikre at retningen av differensial uttrykk er konsistent.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sortering av ulikt uttrykt gener:
For å identifisere ulikt uttrykt gener i larvestadiet sebrafisk modeller av Alström syndrom og Bardet-Biedl syndrom (BBS), rettet vi enten alms1 eller bbs1 utskrifter ved å injisere tidligere godkjent skjøte-blokkerende MOs i vill-type sebrafisk embryo16,17. 5 dager post befruktning (dpf), to gjenskapninger av RNA var utdraget fra hver tilstand, samt embryo injisert med kontroll MO, som beskrevet i § 3 ovenfor. RNA fra hver prøve ble sekvensert til en dybde på ~ 120 millioner leser med ~ 107 millioner leser justert etter sebrafisk genomet. Mellom 85-90% i justert lyder tilordnet exonic regioner i genomet.
1,348 totalt gener ble betydelig endret i Alström modellen og 471 totale gener ble betydelig endret i BBS modellen. Delte endringer i genuttrykk mellom modeller eller endringer unik for én av modellene ble identifisert som beskrevet i delen 4.2. 1,084 totalt gener ble unikt endret i Alström modellen, 612 opp-regulert og 472 ned-regulert og 207 gener ble unikt endret i BBS-modellen 176 opp-regulert og 31 ned-regulert (figur 2, Tabellen S1og S2 tabell). 264 gener fant endres vesentlig i begge modeller, 73 var opp-regulert og 182 var ned-regulert og 9 viste motsatt endringer i uttrykket mellom de to modellene (figur 2, Tabellen S1og S2 tabell (se Supplerende Tables.xlsx)). Discrepant antall ulikt uttrykt gener mellom de to modellene foreslår at bbs1 og alms1 kan virke inn på ulike stadier i utviklingen.
Interessant, foreslår det store antallet ulikt uttrykt gener i Alström modellen at alms1 spiller en viktig rolle i utviklingen på 5 dpf scenen, mens mindre antall genet endringer i BBS modellen antyder at rollen som bbs1 kan ikke være så fremtredende på dette tidspunkt. I kontrast, foreslo tidligere transcriptomic analyser på 2 dpf omvendt18.
Fastsettelse av beriket veier og Gene Ontologies i sebrafisk modell av Alström syndrom:
For å klarere belyse molekylær profilen av Alström modellen, ble stier og gene ontologies beriket i narkotikalovgivningen uttrykt genene identifisert. Beriket veier ble fastsatt av spørring i ConsensusPathDB og beriket Gene Ontologies var bestemt av spørring Gene ontologi konsortiet som beskrevet i avsnitt 4.3-4.5. Den mest høyanriket blant genene opp-regulert i Alström modell, antall gener eller kaste berikelse, ble analysert. 31 totalt veier var opp-regulert i Alström modellen. Bortsett fra bred gruppering av "metabolisme", de mest berørte veiene var medfødte og adaptive immunsystemet med 32 og 20 gener, henholdsvis (figur 3A). Nedstrøms β-celle reseptor signalisering hendelser var også beriket foreslå immun system opp-regulering i denne modellen. Flere signalveier var også beriket blant opp-regulert genene i den Alström modellen, samsvar med tilknytningen Alström syndrom primære Flimmerhår dysfunksjon, en viktig signalnettverk senter i cellen (figur 3A). I tillegg tre stier assosiert med insulinsekresjon var opp-regulert: fettsyrer bundet til GPR40, frie fettsyrer og acetylkolin (figur 3A). Dette stemmer overens med svært penetrant insulin resistens og type 2 diabetes fenotyper i Alström pasienter. Seks gå vilkårene ble beriket blant opp-regulert genene i Alström modellen, inkludert røde blodlegemer differensiering, røde blodlegemer homeostase, myelogen celle homeostase og homøostatisk prosesser (figur 3B). For å vurdere forhaldet av opp-regulert veier, generert et pathway nettverk av Alström modellen opp-regulert veier ble (Figur 3 c). Den store noden av sammenkoblede avslørte en høy grad av tilkobling blant veier knyttet til immunsystemet og signalnettverk, mens en av de mindre avslørt tilkobling mellom tre insulin regulatoriske veier. Til slutt, vi bekreftet gene expression endringene identifisert ved RNASeq vurdering av 5 genet mål, som var enten opp eller ned-regulert i Alström modellen. Retningen av gene expression endringer ved qRT PCR aste GCK Stim: bmb, btr26, og ifi35, i forhold til kontroll, recapitulated som observert av RNASeq (figur 4A-B).
Figur 1. Representant produksjon av gene expression analyse etter RNASeq gitt av kjernen eller leverandøren. Funksjons-IDen angir ENSEMBL gene ID-nummeret. Les teller angir antall leser i kontrollen eller eksperimentelle prøver som justert til det genet i genomet. Fold endring og loggen over fold endringen angir graden av endring i uttrykket av genet mellom den eksperimentelle og kontroll prøve enten positive (økning) i uttrykk i eksperimentell eksempel retning eller negativ (reduksjon) i uttrykk i eksperimentelle eksempel retning. P-verdien og FDR er statistiske tester for å fastslå betydningen av resultater; for RNASeq eksperimenter brukes strengere FDR verdien 0,05 til å bestemme betydningen. Gene_symbol angir NCBI gen-IDen, og gene_name viser det fullstendige navnet på genet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Ulikt uttrykt gener i BBS og Alström modeller. Antall gener opp-regulert (rød) eller ned-regulert (gul) i alms1 MO (grønn) injisert embryo, bbs1 MO (oransje) injisert embryo eller begge sammenlignet standardkontrollen MO injisert embryoer. * Angir antall gener endret i begge men har overfor endringer i uttrykket. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figure 3. Upregulated veier og beriket gå vilkår i Alström modellen. (A) Upregulated veier av gener. (B) Upregulated gå vilkår av Brett berikelse. (C) Pathway tilkobling av upregulated i Alström modellen. Pathway tilkoblinger etter minimum 20% delt gener mellom stier og minst 2 gener overlappe. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. qRT PCR valideringen av genet uttrykk endringer. Endringer i genuttrykk identifisert av RNASeq ble bekreftet i alder - og behandling-matchet 5 dpf embryoer, injisert med kontroll, alms1 eller bbs1 Mo (A) delsett av gener viser mRNA uttrykket av gener bruker qRT PCR. (B) tilsvarende data som viser lese teller fra RNASeq datasettet. Alle data er forhold til kontrollen qRT PCR var normalisert til utgangen. Aste, asteroide homolog 1; GCK Stim:, glucokinase; BMB, brambleberry; btr26, blodtørstige-relaterte genet familie, medlem 26; ifi35, interferon-indusert protein 35. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fremgangsmåten som er beskrevet i denne protokollen gir en relativt rask og kostnadseffektiv strategi for transcriptome-nivå analyse av hele dyr eller bestemte sorterte celle populasjoner. Sebrafisk gir en fordelaktig modell for denne typen studier letthet og hurtighet generere store mengder materiale, enkel implementering av genetiske eller miljømessige eksperimentelle forhold, og tilgjengeligheten av en stor spekteret av transgene reporter linjer slik at isolering av celle-type bestemt og vev-spesifikke populasjoner.
Mens ikke detaljert her, kan denne metoden lett romme vev inndelinger samlet fra juvenile eller voksen fisk som et alternativ til FACs og samling. Vi har også utviklet en grunnleggende oppfølging analyse strategi som bare baserer seg på bruk av grunnleggende regneark kommandoer og eksisterende gangsti og gå databaser. Den store fordelen med denne tilnærmingen er enkel tilgjengelighet uten høyt nivå kompetanse i datamaskinen programmering eller database management. Som sådan, gjelder denne strategien for etterforskere fra alle bakgrunner for informativ analyse av store gene expression datasett.
Vår tilnærming kombinerer grunnleggende sebrafisk embryoet og larver kultur med standard RNA utvinning teknikk etterfulgt av RNASeq. RNASeq krever et stort antall høykvalitets utgangsmaterialet; noen leverandører krever 2 µg av totalt. Som et resultat, er sjeldne/sjeldne celletyper eller personlige embryoet analyse utilgjengelig. Men de siste fem årene har vist dramatiske forbedringer i lav-yield analyser, datasett fra mindre eksempler og lavere RNA mengder, og vi forventer at disse programmene vil være mulig i nær fremtid. For å sikre nøyaktige resultater, tillegg av både tekniske gjentak, dvser genererer to RNA bibliotek fra en enkelt prøve og biologiske gjentak, dvs, samle embryoer fra flere parring, ideelt. Følgende tillater forskerne å kontrollere variasjon i prøvene, og sekvenser identifisert i alle prøvene er mer sannsynlig å være sant resultater, med redusert sannsynligheten for mangler et lavere antall leste resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av R01DK102001 (N.A.Z.), P30DK072488 (N.A.Z.) og T32DK098107 (T.L.H. og J.E.N.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Commercial Reagents | |||
| TriZol | Thermo Scientific | 15596026 | lysis reagent |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | dissociation buffer 1 |
| FACSMax | Genlantis | T200100 | dissociation buffer 2 |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| FirstStrand cDNA conversion | Thermo Scientific | K1621 | cDNA conversion kit |
| 2X SYBR Green Master Mix | Roche | 4707516001 | qRT-PCR Master Mix |
| FACS buffer | Fisher Scientific | 50-105-9042 | |
| chloroform | Sigma Aldrich | 288306 | |
| sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Strains | |||
| Tuebingen | ZIRC | ZL57 | |
| ins2a:mCherry | ZIRC | ZL1483 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 40 micron cell strainer | Sigma | CLS431750 | |
| FACS tube | BD Falcon | 352063 | |
| hemocytometer | Sigma | Z359629 | |
| Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Inverted Microscope | Zeiss | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Illumina HiSeq | Illumina | ||
| LightCycler 480 | Roche | ||
| Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set | Aquaneering | ZHCT100 | |
| FACS tube 5 mL polypropylene tube | BD Falcon | 352063 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | ||
| Consensus Path DB | http://cpdb.molgen.mpg.de/ | ||
| GO Enrichment Analysis | http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis |
References
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. (2002).
- Detrich, H. W., Zon, L., Westerfield, M. The Zebrafish: Disease Models and Chemical Screens. , 4th ed, Academic Press. (2017).
- Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. The Zebrafish: Genetics, Genomics, and Transcriptomics. , 4th ed, Academic Press. (2016).
- Detrich, H. W. The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , 3rd ed, Academic Press. (2011).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J Vis Exp. (109), (2016).
- MPIMG. ConsenusPathDB. , Available from: http://cpdb.molgen.mpg.de/ (2017).
- Consortium, G. O. Enrichment analysis Tool. , Available from: http://www.geneontology.org/ (2017).
- IDT. IDT Primerquest Tool. , Available from: https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index (2017).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M.
- Leitch, C. C., Lodh, S., Prieto-Echague, V., Badano, J. L., Zaghloul, N. A. Basal body proteins regulate Notch signaling through endosomal trafficking. J Cell Sci. 127 (Pt 11), 2407-2419 (2014).
- Lodh, S., Hostelley, T. L., Leitch, C. C., O'Hare, E. A., Zaghloul, N. A. Differential effects on beta-cell mass by disruption of Bardet-Biedl syndrome or Alstrom syndrome genes. Hum Mol Genet. 25 (1), 57-68 (2016).
- Hostelley, T. L., Lodh, S., Zaghloul, N. A. Whole organism transcriptome analysis of zebrafish models of Bardet-Biedl Syndrome and Alstrom Syndrome provides mechanistic insight into shared and divergent phenotypes. BMC Genomics. 17, 318 (2016).
