Summary
Questo protocollo presenta un approccio per l'analisi del trascrittoma intero da embrioni di zebrafish, larve, o ordinato cells. Includiamo isolamento di RNA, analisi dei percorsi dei dati RNASeq e convalida qRT-PCR-basata di cambiamenti di espressione genica.
Abstract
L'analisi dei cambiamenti di espressione genica globale è uno strumento prezioso per identificare nuove vie sottostanti fenotipi osservati. Zebrafish è un eccellente modello per la valutazione rapida dell'intero trascrittoma da popolazioni di cellule intero animale o singoli a causa della facilità di isolamento di RNA da un gran numero di animali. Qui è presentato un protocollo per l'analisi di espressione genica globale negli embrioni di zebrafish mediante sequenziamento di RNA (RNASeq). Descriviamo la preparazione di RNA da interi embrioni o da popolazioni di cellule ottenute mediante cella ordinamento negli animali transgenici. Inoltre descriviamo un approccio per l'analisi dei dati di RNASeq per identificare percorsi arricchiti e termini di Ontology del Gene (vada) in insiemi di dati di espressione genica globale. Infine, forniamo un protocollo per la convalida dei cambiamenti di espressione genica utilizzando quantitativi d'inversione di transcriptase PCR (qRT-PCR). Questi protocolli possono essere utilizzati per l'analisi comparativa di controllo e set sperimentali di zebrafish per identificare i cambiamenti di espressione del gene novello e forniscono la comprensione molecolare nei fenotipi di interesse.
Introduction
Analisi comparativa dell'espressione genica globale sono uno strumento prezioso per identificare nuovi geni che contribuiscono ai fenotipi osservati. Tali analisi in genere si basano sulla valutazione quantitativa dell'abbondanza di trascrizione rispetto tra sperimentale e campioni di controllo. Approcci mirati, ad esempio qRT-PCR sono relativamente rapida ed accurata indagine dei cambiamenti di espressione del singolo gene. Sequenziamento di RNA (RNASeq) offre un approccio ampio, privo di ipotesi per identificare i cambiamenti significativi nell'espressione genica tra campioni, rendendo ora lo standard per tali indagini attraverso sistemi sperimentali.
Zebrafish sono emersi come un modello prominente in molte aree di malattia. Originariamente sviluppato per la loro utilità negli studi di biologia dello sviluppo, grazie alla loro alta fecondità e relativamente basso costo di manutenzione, uso sperimentale di zebrafish è evoluto per includere una vasta gamma di fenotipi da embrionali a stadi adulti pure come un vasta gamma di molecolare dosaggi1,2,3. Infatti, questi vantaggi rendono molecolari studi meccanicistici rapido e conveniente a causa della facilità di acquisizione di grandi quantità di materiale combinato con la facilità di manipolazione sia genetica che ambientale in tutte le fasi della vita. Inoltre, la natura trasparente di zebrafish embrioni e le larve lo rendono ideale per la generazione di linee transgeniche reporter cellula - e tessuto-specifico permettendo visualizzazione in vivo di cella discreti popolazioni4. Lo sfruttamento di tali linee permette analisi di espressione genica globale in tipi di cellule isolate specifico basati sull'espressione del gene reporter.
Qui presentiamo un protocollo completo per l'analisi di espressione genica globale utilizzando RNASeq dopo la coltura degli embrioni di zebrafish. Manipolazioni genetiche sperimentali, tra cui morpholino (MO)-atterramento base gene transitoria o editing genomico CRISPR-mediata, sono state presentate altrove5,6,7. Abbiamo pertanto concentrarsi su un protocollo dettagliato per l'isolamento di RNA da interi embrioni o ordinato transgenici esprimenti reporter cells seguita da semplici analisi computazionale di RNASeq risultati utilizzando strumenti di percorso e termini di gene ontology (GO). Infine, abbiamo incluso una strategia per la validazione dei cambiamenti di espressione genica di quantitativi d'inversione di transcriptase PCR (qRT-PCR). Questi protocolli sono applicabili agli embrioni di zebrafish sottoposti a una vasta gamma di condizioni sperimentali, compreso il raffronto di mutanti genetici o condizioni ambientali.
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Protocol
tutti i protocolli animali descritti qui di seguito sono conformi e approvato dall'Università del Maryland istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC).
1. embrione preparazione
- generazione embrioni attraverso accoppiamento naturale
- embrioni di cultura a 3 mesi di età, riproduttiva maturità 5 , 8 .
- Segregare i pesci adulti di sesso maschile e femminile dal ceppo desiderato in serbatoi di accoppiamento divisi la sera prima di raccolta degli embrioni e aggiungere 2 maschi e 3 femmine per ogni cisterna.
Nota: Uso del ceppo reporter fluorescente transgenici insulin2a:mCherry ha permesso l'analisi delle cellule β pancreatiche. - Trasferimento pesci per l'accoppiamento del serbatoio con acqua fresca sistema e rimuovere il divisore immediatamente dopo le luci si accendono la mattina seguente.
- Consentire il pesce ad accoppiarsi naturalmente fino a quando gli embrioni sono stati osservati in fondo vasca. Raccogliere gli embrioni in intervalli di 30 min fino a quando la quantità desiderata è raccolti. Conserva ogni raccolto tempo punto di Petri separata in media di embrione al 28,5 ° C.
- Eseguire microinjection di materiale genetico o il collocamento in terreni di coltura sperimentale 6, se lo si desidera e coltura gli embrioni in fresco Hank ' s embrione medio 8 a 10 cm di Petri a 28,5 ° C.
Nota: per l'analisi dell'espressione genica in morpholino (MO) iniettato o animali mutanti, si noti che ogni manipolazione può avere impatti accidentali sull'espressione genica. Mutanti possono esibire compensazione genetica a livello della trascrizione che non è osservato da MO-basata gene targeting 9.
- Embrioni in fase
- coltura gli embrioni in gruppi di 50 – 75 embrioni a 10 cm di Petri per promuovere la tempistica dello sviluppo coerenza di tutti gli embrioni.
- Monitorare la morfologia dello sviluppo utilizzando microscopio da dissezione in blastomeri, epiboly e somite fasi per garantire la progressione inerente allo sviluppo 10.
Nota: Rimuovere eventuali embrioni morente o non validi per evitare il ritardo inerente allo sviluppo nel piatto. - Separare gli embrioni in base all'età dello sviluppo. Misurare l'età di embrione utilizzando somite numero dopo la segmentazione (post-gastrulazione, 10,33 h post la fecondazione (hpf)) fino a circa 24 hpf. Tappa le embrioni e le larve utilizzando la lunghezza totale del corpo dopo 24 hpf.
Nota: I somiti sono il tessuto mesodermal a forma di chevron presente sulla parte dorsale dell'embrione. - Posizionare gli embrioni ordinati in un'incubatrice di 28,5 ° C e consentire lo sviluppo di progredire verso l'età desiderata.
2. Cella singola dissociazione: Intero embrione e ordinato di popolazioni di cellule
- dissociazione intero embrione
- Euthanize gli embrioni di zebrafish nella fase desiderata inserendo la capsula di Petri in ghiaccio per 5-15 minuti fino a quando non si osserva nessun movimento .
- Trasferire un pool di 20 embrioni una microcentrifuga da 1,5 mL con etichetta. Rimuovere eventuali supporti di embrioni in eccesso dal tubo del microcentrifuge.
- Lisi di aggiungere 200 µ l di reagente (Vedi Tabella materiali) nella provetta contenente gli embrioni. Omogeneizzare gli embrioni nel reagente di lisi meccanicamente con un pestello. Aggiungere 800 µ l di reagente di lisi per portare il volume totale a 1 mL. Conservare a-80 ° C fino all'estrazione di RNA.
- Isolamento delle cellule di flusso ordinato 11
- trasferire gli embrioni da di Petri in una microcentrifuga da 1,5 mL e rimuovere quanto più medio di embrione come possibile.
Nota: A seconda dell'età dell'embrione, dissociazione meccanica può anche essere richiesto in questa fase. Con embrioni > 48 hpf, si consiglia l'uso di un pestello di disturbare l'integrità dell'embrione prima di procedere. - Incubare gli embrioni con 1 mL di tampone di dissociazione 1 (Vedi Tabella materiali) in provetta per microcentrifuga da 1,5 mL. Incubare per 15-30 min a temperatura ambiente. Triturare la soluzione pipettando delicatamente su e giù utilizzando una punta di P1000 per mescolare ogni 3-4 minuti durante la fase di incubazione. Centrifugare.
- Raccogliere gli embrioni mediante centrifugazione per 3 min a 300 x g e rimuovere il surnatante. Risospendere gli embrioni in 1 mL di tampone di dissociazione 2 (Vedi Tabella materiali). Incubare per 15-30 min a temperatura ambiente con triturazione dispensare regolari.
- Valutare la digestione diluendo 1-2 µ l di sospensione in fluorescenza-attivato delle cellule ordinamento buffer (FACS) sotto il microscopio.
Nota: Digestione completa si è verificato quando l'aliquota esaminato Mostra singole cellule con aggregati di cellule minimal e pezzi di tessuto embrionale. - Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 300 x g per 5 min. Remove surnatante. Risospendere le cellule in 1 mL FACS buffer e filtro di gravità attraverso un colino di cella di 40 µm per rimuovere il tessuto non digerito dal campione.
- Contare le celle utilizzando un emocitometro e diluire con buffer di FACS per circa 1 x 10 6 cellule/mL in una provetta di FACS.
Nota: Per i tipi di cellule con un numero relativamente piccolo per embrione (meno del 5% del totale), come β-cellule pancreatiche, utilizzare un minimo di 1.000 fase-abbinato embrioni. - Fornire l'impianto con i tubi di FACS contenente 1 mL di campioni così come tubo di FACS contenente solo reagente di lisi o FACS Buffer di smistamento di FACS. Cancello il flusso-sorter FACS per raccogliere solo singole cellule che esprimono il reporter fluorescente.
- Eseguire il FACS flusso-ordinamento fino a quando sono stati raccolti i numeri di cellulare desiderato.
Nota: Per eseguire RNASeq, c'è un minimo richiesto di RNA totale. Abbiamo trovato che le cellule di 3.000-5.000 sono sufficienti per isolare RNA di alta qualità, ad alta concentrazione. - Conservare le cellule prelevate sul ghiaccio e procedere immediatamente alla preparazione di RNA.
- trasferire gli embrioni da di Petri in una microcentrifuga da 1,5 mL e rimuovere quanto più medio di embrione come possibile.
3. Preparazione di RNA
- Estrarre RNA
- Incubare il campione prelevato (dal passaggio 2) con reagente di lisi per 5 min a temperatura ambiente.
- Aggiungi 0,2 mL di cloroformio per ogni 1,0 mL di reagente di lisi utilizzato ed invertire i tubi a mano per 15 s. Incubare per 2-3 min a temperatura ambiente. Centrifugare i campioni a 12.000 x g per 15 min a 4 ° C.
- Trasferire la fase acquosa, separata in una nuova provetta e aggiungere 0,5 mL di isopropanolo per ogni 1,0 mL di reagente di lisi utilizzato. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare i campioni a 12.000 x g per 10 min a 4 ° C.
- Lavaggio con etanolo al 75% e centrifugare i campioni a 7.500 x g per 5 min a 4 ° C. eliminare il surnatante completamente e asciugare all'aria a temperatura ambiente. Risospendere il RNA in 15-30 µ l dietil pirocarbonato (DEPC)-acqua trattata.
- Purificare alta qualità RNA
- combinare la sospensione di RNA con acetato di 1/10 di volume 3M sodio (pH 5,5) e 1 volume di isopropanolo. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente e centrifugare i campioni a 12.500 x g per 10 min a 4 ° C.
- Lavare il pellet con etanolo 70% ghiacciata in acqua trattata con DEPC e centrifugare i campioni a 10.000 x g per 5 min a 4 ° C. Ripetere la fase di lavaggio una volta.
- Rimuovere il supernatante e lasciare per asciugare a temperatura ambiente. Risospendere in acqua trattata con DEPC.
- Analisi il RNA estratto per la concentrazione (ng / µ l) e la purezza (rapporto di 260/230) utilizzando uno spettrometro di assorbimento. Assicurarsi che il valore di 260/230 ~ 2.0 prima di procedere con RNASeq. Conservare a-80 ° C fino a noie (fino a 6 mesi).
- Inviare i campioni di RNA a un fornitore o un nucleo per RNASeq e modificare l'espressione genica analisi basata sulla quantificazione del sequenziamento letture. I risultati restituiti dal fornitore sono in genere forniti come una lista di geni che esibiscono un cambiamento significativo di piega in trascrizione letture tra campioni.
Nota: Una colonna può essere utilizzata se il metodo sopra descritto produce RNA di scarsa qualità. La quantità, la concentrazione e il numero di integrità di RNA (RIN) per campioni di RNA dovrebbe essere confermate con il fornitore o il nucleo. Il fornitore o il nucleo valuterà anche in genere RIN.
4. GO termine analisi e percorso
Nota: vedere la Figura 1 di uscita rappresentativo, l'analisi di espressione genica dopo RNASeq forniti dal fornitore o core.
- Ordinamento differenzialmente espressi geni
- confrontando una sola condizione sperimentale contro controllo
- Open dati (risultati) in un software di gestione di fogli di calcolo (Vedi tabella materiali ).
- Selezionare la freccia a discesa accanto alla ' specie ' pulsante e selezionare " ordinamento personalizzato " all'interno del foglio di calcolo contenente i geni differenzialmente espressi in sperimentale contro la condizione di controllo.
- Selezionare la casella in ' colonna ' nella finestra che si apre e scegliere di ordinare per la ' LFC ' colonna. Garantire ' valori ' è selezionata nella ' sorta su ' colonna. Selezionare questa opzione per ordinare da ' più grande al più piccolo ' alla ' ordine ' colonna e fare clic su " OK ".
Nota: Questo ordinerà i geni differenzialmente espressi in modo che quelli con l'espressione aumentata (positivo LFC) apparirà nella parte superiore dell'elenco, mentre quelli con ridotta espressione (negativo LFC) apparirà nella parte inferiore dell'elenco.
- Confrontare le condizioni sperimentali multipli per un singolo controllo come segue.
- Selezionare la prima cella in una colonna vuota sul 1 sperimentale rispetto al foglio di calcolo di controllo per determinare differenzialmente espressi geni trovati in due condizioni sperimentali. Digitare la seguente formula nella cella:
Nota: questa equazione è una combinazione di IF, ISERROR e funzioni MATCH. (i) la funzione MATCH, MATCH (A1, Experimental2_vs_Control! A:A, 0), andrà a cercare il valore nella cella A1 (l'ID di ENSEMBL) nella colonna (A:A) del foglio di calcolo denominato Experimental2_vs_Control (Experimental2_vs_Control!). Il " 0 " indica per cercare una corrispondenza esatta, e se viene trovata una corrispondenza esatta, la funzione restituirà un valore di " 1 ", mentre se viene trovata alcuna corrispondenza, la funzione restituirà un errore " N/A ". (ii) il risultato della funzione MATCH viene quindi immesso nella funzione ISERROR, ISERROR (MATCH (A1, Experimental2_vs_Control! A:A, 0)), dove, se l'input è " 1 " è stato trovato che indica una corrispondenza, verrà restituito " FALSE ", e se l'input è " N/A " che indica una corrispondenza non trovata, verrà restituito " vero ". (iii) i " vero " o " FALSE " risultato è quindi input nella funzione se, se (ISERROR (MATCH (A1, Experimental2_vs_Control! A:A, 0)), " ", " duplicare "), dove, se l'input è " vero " che indica una corrispondenza non trovata, verrà restituito il valore tra il primo set di virgolette (" ") che è vuota, e quindi la cella sarà vuota. Se l'input è " FALSE " che indica una corrispondenza è stata trovata, verrà restituito il valore tra il secondo set di virgolette (" duplicare "), e la cella dirà " duplicare ". - Press " invio " o " restituire " per eseguire l'equazione. Selezionare la cella contenente l'equazione e fare clic sulla casella nell'angolo inferiore destro della cella. Tenere il mouse cliccato e trascinare l'area selezionata tutto il senso giù la colonna fino all'ultima ' ID funzionalità ', copiare l'equazione in ogni cella nella colonna.
- Selezionare " ordinamento personalizzato " ancora, aggiungere un secondo livello di ordinamento cliccando il " + " sull'icona nell'angolo inferiore sinistro. Nel primo livello, " Ordina ", in selezionare colonna " duplicare ", in genere su selezionare ' valori ' e in selezionare ordine ' dalla Z alla A '. Nel secondo livello, " poi di ", in selezionare colonna ' LFC ', in genere su selezionare ' valori ' e in selezionare ordine ' più grande al più piccolo ' e selezionare " OK ".
Nota: Questo ordinerà l'elenco dei geni in 4 gruppi basati sopra direzionalità del cambiamento di espressione. È importante controllare i geni trovati in entrambe le condizioni sperimentali per garantire che il cambiamento nell'espressione è nella stessa direzione in entrambi o in direzioni opposte. - Rimuovere qualsiasi parentesi dalla colonna di simboli di gene, prima di procedere o i risultati non verranno trovati nei database. Selezionare l'intera colonna contenente simboli di gene. Selezionare " modificare " quindi " sostituire " a discesa ' File ' menu. Tipo " (*) " alla " trovare cosa: " barra della finestra Sostituisci e lasciare il " sostituire con: " bar vuoto. Selezionare ' Sostituisci tutto ' per rimuovere tutte le istanze di parentesi.
Nota: Il * rappresenta un numero qualsiasi di caratteri, inserendo questo personaggio tra due parentesi, il programma viene richiesto di trovare qualsiasi istanza in celle evidenziate e qualsiasi istanza di parentesi verrà sostituito con niente, quindi rimuoverli.
- Selezionare la prima cella in una colonna vuota sul 1 sperimentale rispetto al foglio di calcolo di controllo per determinare differenzialmente espressi geni trovati in due condizioni sperimentali. Digitare la seguente formula nella cella:
- confrontando una sola condizione sperimentale contro controllo
- Determinazione arricchita vie
- copia i simboli di gene dell'insieme per cui si desidera determinare le vie arricchite negli Appunti. Andare a ConsensusPathDB 12. Selezionare " Gene impostata analisi " nella sidebar di sinistra della pagina Web, seguita da " analisi di sovrarappresentazione ".
- Incollare l'elenco dei geni nella " incollare un elenco di identificatori di proteina/del gene " casella. Sigla del gene seleziona nel " tipo di identificatore di proteina/del Gene " e fare clic su " procedere ". Selezionare la casella accanto a " vie come definito dal database via " sotto il Pathway-based imposta sezione.
Nota: Un numero di opzioni per l'analisi verrà visualizzato compreso l'elenco dei database disponibili per ricerca. Si consiglia di-selezionare tutti i database ad eccezione del database di Kegg e Reactome come sono i più affermati e completa. La sovrapposizione minima con impostazioni di taglio input elenco e p-valore può essere regolata anche sulla base delle esigenze. Si consiglia di lasciare queste impostazioni presso la sovrapposizione minima di 2 gene predefinito e un cut-off valore 0,01 p. - Selezionare " trovare arricchito set " per ottenere l'elenco delle vie contenenti geni nell'elenco degli input.
Nota: L'uscita sarà in formato tabella, incluso il nome di ciascun percorso seguito da " impostare dimensione " (che indica il numero di geni totale nella via), " candidati contenuti " (che indica il numero di geni nell'elenco di input che sono in quella via ), così come il valore di p e q-valore (FDR) e il database da cui è stato identificato il pathway.
- Generazione di via reti
- determinare percorsi arricchiti come descritto sopra.
- Selezionare tutte le vie arricchite da visualizzare in una rete via selezionando ogni casella accanto ai nomi di percorso da visualizzare oppure facendo " tutti i " sotto " selezionare " nell'intestazione di colonna sopra le caselle di selezione, quindi selezionare " Visualizzare set selezionati ".
Nota: Si consiglia di visualizzare tutti i percorsi, se ci sono meno di 30; Se ci sono superiori a 30 vie si consiglia di scegliere le vie più arricchite 30 top (quelli che contengono il maggior numero di geni da elenco di input). - Regolare la " sovrapposizione relativo " e " ha condiviso i candidati " filtri, selezionando delle caselle in alto al centro della pagina e l'immissione di desirper cento ed relativo si sovrapporre o si sovrappone a numero di candidati condivisi, per essere più severe al fine di rendere il più pertinente nell'ambito delle reti di percorso più chiare e selezionare " applicare ".
Nota: Si consiglia una sovrapposizione minima relativa di 0.2, che indica una sovrapposizione genica 20% tra 2 vie per collegarli e un minimo di 2 candidati condivisi. La legenda del grafico può essere visto cliccando sulla legenda grafico in alto a sinistra della pagina.
- Determinazione di arricchito va termini
- copiare i simboli del gene del gruppo per il quale si vuole determinare le ontologie arricchito genica negli Appunti. Vai al ' strumento di analisi di arricchimento GO ' del Consorzio di Ontology del Gene 13. Incollare l'elenco dei simboli del gene nella casella sul lato sinistro della pagina sotto " il gene IDs qui … "
- selezionare il set di termini GO da utilizzare, elencati sotto la casella di IDs gene: processo biologico, funzione molecolare o componente cellulare. Scegliere (consigliato) ' processo biologico '. Selezionare ' Danio rerio ' sotto il GO termini casella e fare clic " invia ".
Nota: Si consiglia di utilizzare il cutoff di p-valore predefinito pari a 0,05.
5. Verifica mediante qRT-PCR
Nota: singoli geni identificati con cambiamenti di espressione genica significativo in RNASeq devono essere verificati mediante qRT-PCR mirati a replicati esperimenti.
- sintesi del cDNA
- estrarre il RNA da embrioni usando il metodo descritto nella sezione 3.1. Estrazione del RNA.
- Convertire 1 µ g di RNA in cDNA mediante cDNA conversione kit (Vedi Tabella materiali). Combinare RNA, dNTPs ed enzima trascrittasi inversa. Eseguire la reazione di termociclatore secondo il produttore ' specifiche s.
- Diluire 1:3 di cDNA in acqua trattata con DEPC. Conservare a 4 ° C fino a 1-2 mesi.
- Verifica qRT-PCR
- selezionare geni per verificare mediante qRT-PCR dai risultati del sequenziamento di RNA. Identificare i geni con piega alta cambiamenti nell'espressione. Determinare quale di questi geni contengono anche alta lettura conta, come questo indica espressione abbondante.
- Selezionare 10-12 bersagli dalla variazione piega alta, elenco di alto conteggio lettura dei geni. Disegnare primers per amplificare i geni bersaglio che abbracciano almeno 1 introne-esone limite.
- Inserire il gene o la regione di destinazione del gene in qPCR primer design sito 14. Selezionare il " 2 qPCR primer di design " e richiedere il sito per creare set di primer.
Nota: Assicurarsi di includere il primer di controllo interno, come β-actina, per normalizzare i confronti tra i campioni. I primers di β-actina sono 5 f: ' - TCGAGCTGTCTTCCCATCCA - 3 ' e r: 5 ' - TCACCAACGTAGCTGTCTTTCTG - 3 '. - Combinare il cDNA, forward primer, primer inversa e polimerasi. Eseguire l'amplificazione di qRT-PCR per determinare l'espressione relativa dei geni 15.
- Analizzare l'espressione relativa di mRNA di geni di interesse di quantificazione relativa determinazione 15.
- Confrontare il qRT-PCR RNASeq risultati per assicurarsi che la direzionalità dell'espressione differenziale è coerenza di.
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Representative Results
L'ordinamento di differenzialmente espressi geni:
Per identificare geni differenzialmente espressi nella fase larvale di zebrafish modelli di sindrome di Alström e sindrome di Bardet-Biedl (BBS), siamo presi di mira sia alms1 o trascrizioni di bbs1 iniettando convalidato in precedenza della giuntura-blocco MOs in selvaggio-tipo zebrafish embrioni16,17. 5 giorni dopo fertilizzazione (dpf), due repliche di RNA sono stati estratti da ogni condizione, così come gli embrioni iniettati con controllo MO, come descritto nella sezione 3 precedente. RNA da ogni campione è stato sequenziato ad una profondità di ~ 120 milioni legge con ~ 107 milioni legge allineati al genoma di zebrafish. Tra 85-90% del legge allineati mappato a regioni exonic del genoma.
1.348 totale geni sono stati cambiati significativamente nel modello Alström e 471 totale geni sono stati cambiati significativamente nel modello BBS. Condivise cambiamenti nell'espressione genica tra i modelli o i cambiamenti unici a uno dei modelli sono stati identificati come descritto nella sezione 4.2. 1.084 totale geni sono stati modificati in modo univoco nel modello Alström, 612 geni up-regolati e 472 down-regolato e 207 sono stati cambiati in modo univoco nel modello BBS, 176 up-regolato e 31 down-regolato (Figura 2, Tabella S1e S2 di tabella). 264 geni sono stati trovati per essere significativamente modificato in entrambi i modelli, 73 erano up-regolato e 182 erano giù-regolato e 9 hanno mostrato variazioni di segno opposto nell'espressione tra i due modelli(Figura 2, Tabella S1e S2 tabella (vedere Tables.xlsx supplementare)). I numeri discrepanti dei geni differenzialmente espressi tra i due modelli suggeriscono che bbs1 e alms1 possa urtare diverse fasi di sviluppo.
Interessante, il gran numero di geni differenzialmente espressi nel modello Alström suggerisce che quel alms1 svolge un ruolo importante nello sviluppo nella fase 5 dpf, mentre il più piccolo numero di cambiamenti del gene nel modello BBS suggerisce che il ruolo di BBS1 potrebbe non essere più prominente in questo momento. Al contrario, analisi trascrittomica precedenti alle 2 dpf ha suggerito l' inverso18.
Determinazione delle vie arricchite e Gene ontologie in Zebrafish modello di sindrome di Alström:
Per delucidare più chiaramente il profilo molecolare del modello Alström, le vie e le ontologie gene arricchite nei geni differenzialmente espressi sono stati identificati. Arricchite le vie erano risolute eseguendo il ConsensusPathDB e arricchito Gene ontologie sono stati determinati mediante una query il Consorzio di Ontology del Gene come descritto nelle sezioni 4.3-4.5. Il più altamente arricchito tra i geni up-regolati nel Alström modello, dal numero di geni o piega arricchimento, sono stato analizzato. Totale 31 vie erano up-regolato nel modello Alström. A parte l'ampio raggruppamento di "metabolismo", le vie più altamente interessate erano il sistema immunitario innato e adattivo con 32 e 20 geni, rispettivamente (Figura 3A). Segnalazione eventi erano anche del ricevitore a valle della β-cellula arricchita suggerendo sistema immunitario up-regolazione in questo modello. Diverse vie di segnalazione sono state arricchite anche tra i geni up-regolati nel modello Alström, coerenza con l'associazione di sindrome di Alström con disfunzione del cilio primario, un importante centro di segnalazione della cellula (Figura 3A). Inoltre, tre vie connesse con la secrezione dell'insulina erano up-regolato: acidi grassi associato a GPR40, acidi grassi liberi e acetilcolina (Figura 3A). Ciò è coerente con i fenotipi di diabete 2 altamente penetranti insulino resistenza e tipo in pazienti di Alström. Sei vai termini sono stati arricchiti tra i geni up-regolati nel modello Alström, compreso differenziazione dell'eritrocito, l'omeostasi dell'eritrocito, l'omeostasi delle cellule mieloidi e processi omeostatici (Figura 3B). Per valutare l'interconnessione delle vie up-regolato, una rete di pathway di Alström vie di up-regolato di modello è stato generato (Figura 3). Il principale nodo di percorsi interconnessi ha rivelato un alto livello di connettività tra i percorsi associati al sistema immunitario e di segnalazione, mentre uno dei nodi del minori ha rivelato la connettività tra le vie regolarici di tre insulina. Infine, abbiamo verificato i cambiamenti di espressione di gene identificati da RNASeq da valutazione dei 5 geni bersaglio, che erano entrambi up - o down-regolato nel modello Alström. La direzionalità dei cambiamenti di espressione genica mediante qRT-PCR in aste, gck, bmb, btr26 e ifi35, relativo al controllo, si ricapitola che osservate da RNASeq (Figura 4A–B).
Figura 1. Rappresentante output di analisi dell'espressione genica dopo RNASeq forniti dal fornitore o core. ID caratteristica indica il numero di identificazione del gene ENSEMBL. Conteggi di lettura indica il numero di letture in controllo o campioni sperimentali che allineato a quello gene nel genoma. Cambiamento di piega e il registro del cambiamento piega indicano il grado di cambiamento nell'espressione del gene tra la sperimentale e controllo campione in entrambi il positivo (aumento) nell'espressione in direzione campione sperimentale o negativo (diminuzione) nell'espressione in direzione di campione sperimentale. Il p-valore e FDR sono test statistici per determinare il significato dei risultati; per esperimenti di RNASeq, un valore FDR più rigoroso di 0.05 viene utilizzato per determinare il significato. Gene_symbol indica l'identificazione del gene NCBI e gene_name elenca il nome completo del gene. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Differenzialmente espressi geni nei modelli BBS e Alström. Numero di geni up-regolati (rosso) o down-regolato (giallo) in embrioni di MO (verde) iniettato alms1, bbs1 MO (arancione) iniettato embrioni o entrambi rispetto agli embrioni iniettato MO controllo standard. * Denota il numero di geni modificati in entrambi ma avendo di fronte cambiamenti nell'espressione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
FIGURA 3. Vie di sovraregolati e arricchito va termini nel modello Alström. (A) vie di sovraregolati da numero di geni. (B) sovraregolati andare in termini di arricchimento di piega. (C) connettività via delle vie sovraregolati nel modello Alström. Connessioni via determinate da un minimo di 20% condiviso geni tra le vie e almeno 2 geni si sovrappongono. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. convalida qRT-PCR dei cambiamenti di espressione genica. Cambiamenti nell'espressione genica identificata da RNASeq sono stati confermati in trattamento-abbinato e dell'età dpf 5 embrioni, iniettati con controllo, alms1 o bbs1 MO (A) sottoinsieme dei geni mostrano espressione di mRNA di geni mediante qRT-PCR. (B) dati equivalenti risultati lettura contano dal dataset RNASeq. Tutti i dati sono relativi al controllo e qRT-PCR sono stati normalizzati all'actina. aste: asteroide omologo 1; GCK, glucokinase; BMB, bacca; btr26, famiglia genica correlate a assetati di sangue, membro 26; IFI35, proteina indotta da interferone 35. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'approccio descritto in questo protocollo offre una strategia relativamente rapida ed economica per livello transcriptome analisi di animali interi o popolazioni di specifiche cellule ordinato. Zebrafish fornisce un modello vantaggioso per questo tipo di studio per la facilità e la rapidità nel generare grandi quantità di avvio materiale, la facilità di implementazione genetico o ambientale condizioni sperimentali e la disponibilità di un grande spettro delle linee transgeniche reporter consentendo per isolamento di tipo delle cellule tessuto-specifiche e popolazioni.
Mentre non dettagliate qui, questo metodo potrebbe facilmente ospitare sezioni tissutali raccolte da pesce giovanile o adulto come alternativa al FACs e raccolta. Abbiamo anche sviluppato una strategia di analisi di follow-up base che solo si basa sull'uso di comandi di base di foglio di calcolo e via pre-esistente e GO database. Il principale vantaggio di questo approccio è la facilità di accessibilità senza richiedere competenze ad alto livello nella gestione di database o di programmazione di computer. Come tale, questa strategia è applicabile per i ricercatori di tutte le provenienze per analisi informativo del set di dati di espressione di gene di grandi dimensioni.
Il nostro approccio unisce embrione di zebrafish base e cultura larvale con tecniche di estrazione di RNA standard seguite da RNASeq. RNASeq richiede una grande quantità di materiale di partenza di alta qualità; alcuni fornitori richiedono 2 µ g di RNA totale. Di conseguenza, tipi di cellule rare/infrequente o analisi di embrione sono fuori portata. Tuttavia, negli ultimi cinque anni hanno dimostrato notevoli miglioramenti nelle analisi di basso rendimento, set di dati generati dai più piccoli campioni e minori quantità di RNA, e ci aspettiamo che queste applicazioni sarà possibile nel prossimo futuro. Per garantire risultati accurati, l'aggiunta di entrambi replicati tecnici, vale a dire, generando due librerie di RNA da un singolo campione e replicati biologici, cioè, raccolta embrioni da accoppiamenti multipli, è l'ideale. Questi passaggi consentono ai ricercatori di controllo la variazione nei campioni, e sequenze identificati in tutti i campioni sono più probabili essere risultati veri, con ridotta probabilità di mancare un risultato di lettura-conteggio inferiore.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da R01DK102001 (N.A.Z.), P30DK072488 (N.A.Z.) e T32DK098107 (T.L.H. e J.E.N.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Commercial Reagents | |||
| TriZol | Thermo Scientific | 15596026 | lysis reagent |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | dissociation buffer 1 |
| FACSMax | Genlantis | T200100 | dissociation buffer 2 |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| FirstStrand cDNA conversion | Thermo Scientific | K1621 | cDNA conversion kit |
| 2X SYBR Green Master Mix | Roche | 4707516001 | qRT-PCR Master Mix |
| FACS buffer | Fisher Scientific | 50-105-9042 | |
| chloroform | Sigma Aldrich | 288306 | |
| sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Strains | |||
| Tuebingen | ZIRC | ZL57 | |
| ins2a:mCherry | ZIRC | ZL1483 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 40 micron cell strainer | Sigma | CLS431750 | |
| FACS tube | BD Falcon | 352063 | |
| hemocytometer | Sigma | Z359629 | |
| Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Inverted Microscope | Zeiss | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Illumina HiSeq | Illumina | ||
| LightCycler 480 | Roche | ||
| Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set | Aquaneering | ZHCT100 | |
| FACS tube 5 mL polypropylene tube | BD Falcon | 352063 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | ||
| Consensus Path DB | http://cpdb.molgen.mpg.de/ | ||
| GO Enrichment Analysis | http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis |
References
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