Summary
Dieses Protokoll stellt einen Ansatz für die ganze Transkriptom-Analyse von Zebrafisch-Embryonen, Larven, oder Zellen sortiert. Wir gehören Isolierung von RNA, Pathway-Analyse von RNASeq Daten und qRT-PCR-basierte Validierung von Veränderungen der Genexpression.
Abstract
Die Analyse der Veränderungen der globalen Genexpression ist ein wertvolles Instrument zur Identifizierung von neuartige Wege beobachteten Phänotypen zugrunde liegen. Der Zebrabärbling ist ein hervorragendes Modell für schnelle Beurteilung der ganze Transkriptom vom ganzen Tier oder einzelne Zellpopulationen wegen der Leichtigkeit der Isolierung der RNA aus große Zahl von Tieren. Hier ist ein Protokoll für globale gen Expressionsanalyse in den Zebrafish Embryos mit RNA Sequenzierung (RNASeq) vorgestellt. Wir beschreiben Vorbereitung der RNA aus ganzen Embryonen oder Zell-Populationen mit Zelle Sortierung bei transgenen Tieren erzielt. Wir beschreiben auch einen Ansatz zur Analyse von RNASeq Daten, angereicherte Wege und Gene Ontology (gehen Sie) Begriffe im globalen gen Ausdruck Datensätze zu identifizieren. Zu guter Letzt bieten wir ein Protokoll für die Validierung von Veränderungen der Genexpression mit quantitative Reverse Transkriptase PCR (qRT-PCR). Diese Protokolle können für die vergleichende Analyse der Steuerung und experimentellen Gruppen von Zebrafisch verwendet werden, um Veränderungen der neuartigen Genexpression zu identifizieren und molekulare Einblick in Phänotypen von Interesse.
Introduction
Vergleichende Analyse der globalen Genexpression ist ein wertvolles Werkzeug, neuartige Gene zur beobachteten Phänotypen zu identifizieren. Solche Analysen in der Regel verlassen sich auf quantitative Bewertung der Abschrift Fülle im Vergleich zwischen experimentellen und Kontrollproben. Gezielte Ansätze, wie z. B. qRT-PCR sind relativ schnelle und genaue Untersuchung der Veränderungen der einzelnen Genexpression. RNA-Sequenzierung (RNASeq) bietet einen breiten, Hypothese-freie Ansatz um wesentliche Änderungen in der Genexpression zwischen Proben, so dass es nun den Standard für solche Untersuchungen über experimentelle Systeme zu identifizieren.
Zebrafisch entstanden als prominente Modell in vielen Bereichen der Krankheit. Ursprünglich entwickelt für ihre Nützlichkeit in Entwicklungsbiologie Studien aufgrund ihrer hohen Fruchtbarkeit und relativ geringen Kosten für Wartung, experimentellen Einsatz von Zebrafisch entwickelt hat, um umfassen eine Vielzahl von Phänotypen aus embryonalen bis adulten Stadien als auch als ein Vielzahl von molekularen Tests1,2,3. In der Tat, diese Vorteile machen die molekularen mechanistische Studien schnelle und kostengünstige wegen der Leichtigkeit des Erwerbs von großen Mengen an Material kombiniert mit der Leichtigkeit des genetischen und umweltbedingten Manipulation in allen Phasen des Lebens. Darüber hinaus die transparente Art der Zebrafisch-Embryonen und Larven machen es ideal für die Erzeugung von Zell- und gewebespezifische transgenen Reporter Linien in Vivo Visualisierung von diskreten Zelle Bevölkerungen4ermöglicht. Ausbeutung von solchen Linien ermöglicht globale gen Expressionsanalyse in bestimmten isolierten Zelle Arten basierend auf Reporter-gen-Expression.
Hier präsentieren wir Ihnen ein umfassendes Protokoll für globale Genanalyse Ausdruck mit RNASeq nach der Kultur der Zebrafisch-Embryonen. Genetischen experimentelle Manipulationen, einschließlich Morpholino (MO)-aufgrund vorübergehender gen-Knockdown oder CRISPR-vermittelten Genom-Bearbeitung, wurden präsentiert an anderer Stelle5,6,7. Wir daher konzentrieren sich auf ein detailliertes Protokoll zur Isolierung von RNA aus ganzen Embryonen oder transgene Reporter exprimierenden Zellen, gefolgt von einfachen numerischen Analyse der RNASeq Ergebnisse mit Weg-Tools und gen Ontology (gehen Sie) Begriffe sortiert. Zu guter Letzt haben wir eine Strategie für die Validierung von Veränderungen der Genexpression durch quantitative Reverse Transkriptase PCR (qRT-PCR) aufgenommen. Diese Protokolle sind für Zebrafisch-Embryonen, die eine Vielzahl von experimentellen Bedingungen, auch im Vergleich der genetische Mutanten oder Umweltbedingungen ausgesetzt.
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Protocol
alle tierischen Protokolle, die unten beschrieben sind in Übereinstimmung mit und genehmigt von der University of Maryland institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC).
1. Embryo Vorbereitung
- Generierung von Embryonen durch natürliche Paarung
- Kultur Embryonen bis 3 Monate alt, reproduktive Reife 5 , 8 .
- Erwachsenen männlichen und weiblichen Fische aus die gewünschte Belastung in geteilten Paarung Panzern am Vorabend Embryo Sammlung zu trennen, und jeder Tank 2 Rüden und 3 Hündinnen hinzu.
Hinweis: Verwendung der transgenen Insulin2a:mCherry fluoreszierenden Reporter Belastung erlaubt die Analyse der β-Zellen der Bauchspeicheldrüse. - Transfer Fisch, dass die Paarung tank mit frischem Wasser und die Trennwand zu entfernen, sofort nachdem die Lichter am nächsten Morgen kommen.
- Ermöglichen die Fische natürlich Paaren bis Embryonen im Bodentank eingehalten werden. Sammeln Sie Embryonen im 30 min Takt, bis die gewünschte Menge gesammelt werden. Jeweils Markt gesammelt Zeitpunkt in separaten Petrischalen im Embryo Media bei 28,5 ° c
- Mikroinjektion der Erbsubstanz oder Platzierung in experimentellen Nährmedien 6, durchführen, falls gewünscht, und Kultur der Embryonen in frischen Hank ' s Embryo mittlere 8 in 10 cm Petrischalen bei 28,5 ° C.
Hinweis: gen Expressionsanalyse in Morpholino (MO) injiziert oder mutierte Tiere, beachten Sie, dass jede Manipulation auf die Genexpression Nebenkosten auswirken kann. Mutanten ausstellen können genetische Entschädigung auf der Ebene der Transkription, die nicht durch MO-basierte Gene targeting- 9 beobachtet wird.
- Embryonen
- Kultur der Embryonen in Gruppen von 50 – 75 Embryonen pro 10 cm Petrischale, konsequente Entwicklung Timing aller Embryonen zu fördern.
- Überwachen die Entwicklung Morphologie sezierenden Mikroskop in Blastomere, Epiboly und Somiten Stadien Entwicklung Fortschreiten 10 sicherzustellen.
Hinweis: Entfernen Sie alle sterben oder missgebildeten Embryonen um Entwicklungsverzögerung in der Schale zu verhindern. - Trennen die Embryonen basierend auf dem Entwicklungsalter. Messen der Embryo Alter Somiten Anzahl nach Segmentierung (Post-Gastrulation 10,33 h Post Düngung (hpf)) mit bis zu ca. 24 hpf. Stufe der Embryonen und Larven mit Körperlänge nach 24 hpf.
Hinweis: Die Somiten sind die Chevron-förmigen mesodermalen Gewebes auf der dorsalen Teil des Embryos vorhanden. - Legen Sie die sortierten Embryonen in einem Brutkasten 28,5 ° C und erlauben die Entwicklung kommen, um das gewünschte Alter.
2. Einzelne Zelle Dissoziation: Gesamte Embryo und sortiert Zellpopulationen
- gesamte Embryo Dissoziation
- einschläfern der Zebrafisch-Embryonen zum gewünschten Zeitpunkt durch die Platzierung der Petrischale für 5-15 min auf Eis, bis keine Bewegung festgestellt wird .
- Transfer einen Pool von 20 Embryonen zu einem beschrifteten 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Entfernen Sie alle überschüssige Embryonen Medien vom Microcentrifuge Schlauch.
- Fügen Sie 200 µL Lyse-Reagenz (siehe Tabelle der Materialien), die Röhrchen mit Embryonen. Die Embryonen in Lyse-Reagenz mechanisch mit einem Stößel zu homogenisieren. Fügen Sie 800 µL-Lyse-Reagenz, das Gesamtvolumen zu 1 mL zu bringen. Shop bei-80 ° C bis RNA Extraktion.
- Flow sortiert Zelle isoliert 11
- Transfer der Embryonen aus der Petrischale zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und entfernen so viel Embryo Mittel wie möglich.
Hinweis: Je nach Alter Embryo mechanische Dissoziation bei diesem Schritt möglicherweise erforderlich. Mit Embryonen > 48 hpf, empfehlen wir die Verwendung von einem Stößel, Embryo Integrität, bevor Sie fortfahren zu stören. - Brüten die Embryonen mit 1 mL der Dissoziation Puffer 1 (siehe Tabelle der Materialien) in 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. 15-30 min bei Raumtemperatur inkubieren. Genannte Lösung durch Pipettieren sanft nach oben und unten mit einer P1000 Spitze, um alle 3 bis 4 Minuten während der Inkubationsschritt zu mischen. TUN nicht VORTEX.
- Sammeln die Embryonen durch Zentrifugation für 3 min bei 300 X g und den Überstand zu entfernen. Wieder aussetzen der Embryonen in 1 mL Dissoziation Puffer 2 (siehe Tabelle der Materialien). 15-30 min bei Raumtemperatur mit regelmäßigen Pipettieren Verreibung inkubieren.
- Bewerten die Verdauung durch eine Verdünnung von 1-2 µL der Aussetzung in Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) Puffer unter Mikroskop.
Hinweis: Komplette Verdauung stattgefunden hat, wenn die untersuchten aliquoten Einzelzellen mit minimalen Zellcluster und Stücke von embryonalem Gewebe zeigt. - Sammeln die Zellen durch Zentrifugation bei 300 X g für 5 min. entfernen überstand. Neu suspendieren die Zellen in 1 mL FACS-Puffer und Schwerkraft Filter durch ein 40 µm Zelle Sieb unverdaute Gewebe aus der Probe entfernen.
- Zählen die Zellen mit einem Hemocytometer und mit FACS Puffer auf ca. 1 x 10 6 Zellen/mL in ein FACS-Rohr verdünnen.
Hinweis: Für Zelltypen mit einer relativ kleinen Anzahl pro Embryo (weniger als 5 % der Gesamtmenge), wie z. B. β-Zellen der Bauchspeicheldrüse, verwenden Sie ein Minimum von 1.000 Bühne abgestimmt Embryonen. - Bieten die FACS Sortieranlage mit FACS-Röhrchen mit 1 mL der Suspension Zellproben sowie FACS-Röhrchen mit nur Lyse-Reagenz oder FACS-Puffer. Tor der FACS Fluss-Sorter nur einzelne Zellen zu sammeln, die die fluoreszierende Reporter zum Ausdruck bringen.
- Die FACS-Fluss-Sortierung durchführen, bis die gewünschte Zelle Zahlen gesammelt wurden.
Hinweis: Um RNASeq durchzuführen, ist eine Gesamt-RNS erforderliche Minimum. Wir haben festgestellt, dass 3.000-5.000 Zellen ausreichen, um qualitativ hochwertige, hoher Konzentration RNA isoliert sind. - Speichern Sie die erfassten Zellen auf Eis und gehen Sie sofort zu RNA Vorbereitung.
- Transfer der Embryonen aus der Petrischale zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und entfernen so viel Embryo Mittel wie möglich.
3. RNA-Vorbereitung
- RNA extrahieren
- die gesammelten Probe (aus Schritt 2) mit Lyse-Reagenz für 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Add 0,2 mL Chloroform für je 1,0 mL Lyse-Reagenz verwendet und die Rohre per hand für 15 S. Inkubation für 2-3 min bei Raumtemperatur zu invertieren. Zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 x g für 15 min bei 4 ° c
- Getrennte, wässrige Phase zu einem frischen Schlauch übertragen und 0,5 mL Isopropanol für je 1,0 mL Lyse-Reagenz verwendet. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren. Zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 x g für 10 min bei 4 ° c
- Waschen mit 75 % Ethanol und Zentrifugieren Sie die Proben bei 7.500 x g für 5 min bei 4 ° c den Überstand vollständig zu entfernen und an der Luft bei Raumtemperatur trocknen lassen. Wieder aussetzen die RNA in 15-30 µL Diethyl Pyrocarbonate (DEPC)-behandeltem Wasser.
- Purify qualitativ hochwertige RNA
- kombinieren die RNA-Aufhängung mit 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat (pH 5,5) und 1 Volumen von Isopropanol. 20 min bei Raumtemperatur inkubieren und Zentrifugieren Sie die Proben bei 12.500 x g für 10 Minuten bei 4 ° c
- Das Pellet mit eiskalten 70 % Ethanol in DEPC-behandeltem Wasser waschen und Zentrifugieren Sie die Proben bei 10.000 x g für 5 min bei 4 ° C. Repeat einmal der Waschschritt.
- Entfernen den Überstand und bei Raumtemperatur trocknen lassen. Neu in DEPC-behandeltem Wasser auszusetzen.
- Assay die extrahierte RNA für die Konzentration (ng/µL) und Reinheit (260/230 Verhältnis) mit einem Aufnahme-Spektrometer. Sicherzustellen, dass die 260/230 Wert ~ 2.0 bevor mit RNASeq. Bis uns bei-80 ° C lagerne (bis zu 6 Monate).
- Senden die RNA-Proben an einen Kreditor oder Kern für RNASeq und Genexpression Analyse anhand der Quantifizierung der Sequenzierung liest ändern. Vom Anbieter zurückgegebenen Ergebnisse sind in der Regel als eine Liste von Genen ausstellenden Falte Veränderung in Abschrift liest zwischen Proben zur Verfügung gestellt.
Hinweis: Eine Spalte kann verwendet werden, wenn die oben beschriebene Methode schlechter Qualität RNA ergibt. Menge, Konzentration und RNA Integrität Anzahl (RIN) für RNA-Proben sollten mit dem Verkäufer oder Kern bestätigt werden. Der Lieferant oder der Kern wird in der Regel auch RIN bewerten.
4. Weg und gehen Begriff Analyse
Hinweis: siehe Abbildung 1 für repräsentative Ausgabe der gen Ausdruck Analyse nach RNASeq seitens der Kern oder Kreditor.
- Offenen Vergleich einer einzigen Versuchsbedingung versus Kontrolle Sortierung differenziell ausgedrückt Gene Daten (Ergebnisse) in einer Tabellenkalkulation-Management-Software (siehe Tabelle der Materialien ).
- Wählen Sie den Dropdown Pfeil neben dem ' Art ' und wählen Sie " Custom Art " in der Tabelle mit den differentiell exprimierten Genen in der experimentellen versus Kontrollbedingung.
- Aktivieren Sie die Kontrollkästchen unter ' Spalte ' in das Fenster, das erscheint oben und wählen Sie sortieren nach die ' LFC ' Spalte. Stellen Sie sicher ' Werte ' im ausgewählt ist die ' Art auf ' Spalte. Wählen Sie zum Sortieren von ' größten zum kleinsten ' in der ' Ordnung ' Spalte und klicken Sie auf " OK ".
Hinweis: Dies wird die differentiell exprimierten Gene so sortieren, dass diejenigen mit erhöhten Ausdruck (positive LFC) am oberen Rand der Liste angezeigt werden, während diejenigen mit verringerter Ausdruck (negative LFC) am unteren Rand der Liste angezeigt werden.
- Mehreren experimentellen Bedingungen für ein einzelnes Steuerelement wie folgt zu vergleichen.
- Wählen Sie die erste Zelle in einer leeren Spalte auf dem experimentellen 1 versus Kontrolle Tabellenkalkulation differentiell bestimmen ausgedrückt Gene in zwei Versuchsbedingungen gefunden. Geben Sie die folgende Formel in die Zelle:
Hinweis: diese Gleichung ist eine Kombination aus der IF ISERROR, und Spiel-Funktionen. (i) die Funktion MATCH, MATCH (A1, Experimental2_vs_Control! A:A, 0), wird der Wert in A1 suchen (die ENSEMBL-ID) in die A-Säule (A:A) der Tabelle namens Experimental2_vs_Control (Experimental2_vs_Control!). Die " 0 " gibt an, dass um nach einer genauen Übereinstimmung zu suchen, und wenn eine exakte Übereinstimmung gefunden wird, kehrt die Funktion einen Wert von " 1 ", wenn keine Übereinstimmung gefunden wird, wird die Funktion einen Fehler zurück " N/A ". (Ii) das Ergebnis des MATCH-Funktion ist dann Eingang in die ISERROR Funktion, ISERROR (MATCH (A1, Experimental2_vs_Control! A:A, 0)), wo, wenn der Eingang " 1 " zeigt eine Übereinstimmung gefunden wurde, kehrt " falsche ", und wenn die Eingabe ist " N/A " zeigt eine Übereinstimmung nicht gefunden wurde, kehrt " wahr ". (Iii) die " wahre " oder " falsche " ergibt dann Eingang in die IF-Funktion, wenn (ISERROR (MATCH (A1, Experimental2_vs_Control! A:A, 0)), " ", " doppelte "), wo, wenn die Eingabe ist " wahr " zeigt eine Übereinstimmung nicht gefunden wurde, wird den Wert zwischen den ersten Satz von Anführungszeichen zurückgegeben (" ") die leer ist, und daher die Zelle leer. Wenn der Eingang " falsche " zeigt eine Übereinstimmung gefunden wurde, wird den Wert zwischen der zweite Satz von Anführungszeichen zurückgegeben (" doppelte "), und die Zelle wird sagen " duplizieren ". - Presse " Enter " oder " zurück " die Gleichung ausgeführt. Wählen Sie die Zelle mit der Formel und klicken Sie auf das Feld in der rechten unteren Ecke der Zelle. Halten Sie die Maustaste geklickt und ziehen Sie den ausgewählten Bereich ganz nach unten in der Spalte bis zum letzten ' Feature-ID ', um die Gleichung in jede Zelle in der Spalte kopieren.
- Select " Custom Art " wieder, fügen Sie eine zweite Ebene der sortieren durch Klicken auf die " + "-Symbol in der linken unteren Ecke. In der ersten Ebene " sortieren, ", unter Spalte auswählen " duplizieren ", unter Art auf Select ' Werte ', und unter Bestellung auswählen ' Z bis A '. In der zweiten Ebene " dann nach ", unter Spalte auswählen ' LFC ', unter Art auf Select ' Werte ', und unter Bestellung auswählen ' größten zum kleinsten ' und wählen Sie " "OK" ".
Hinweis: Dies wird die Liste von Genen in 4 Gruppen je nach Ausrichtung des Ausdrucks ändern sortieren. Es ist wichtig, die Gene gefunden in beiden experimentellen Bedingungen zu gewährleisten, dass die Änderung im Ausdruck in die gleiche Richtung in beiden oder in entgegengesetzte Richtungen überprüfen. - Klammern aus der gen-Symbole-Spalte entfernen, bevor Sie fortfahren oder die Ergebnisse nicht in der Datenbank gefunden werden. Wählen Sie die gesamte Spalte, gen-Symbole enthält. Wählen Sie " bearbeiten " dann " ersetzen " in der Dropdown-Liste ' Datei ' Menü. Typ " (*) " in der " was zu finden: " Bar des ersetzen-Fenster und lassen die " ersetzen durch: " bar leer. Wählen Sie ' ersetzen alle ', alle Instanzen der Klammern zu entfernen.
Hinweis: Die * steht für beliebig viele Zeichen, indem man dieses Zeichen zwischen zwei Klammern, die das Programm aufgefordert wird, jede Instanz in den markierten Zellen zu finden und eine Instanz der Klammern mit dem nichts, so entfernen sie ersetzt werden.
- Wählen Sie die erste Zelle in einer leeren Spalte auf dem experimentellen 1 versus Kontrolle Tabellenkalkulation differentiell bestimmen ausgedrückt Gene in zwei Versuchsbedingungen gefunden. Geben Sie die folgende Formel in die Zelle:
- Bestimmung angereichert Wege
- Kopie der gen-Symbole des Satzes für die man will die angereicherten Pfade in die Zwischenablage zu bestimmen. Gehen Sie zu ConsensusPathDB 12. Wählen Sie " gen set Analyse " in der linken Seitenleiste der Webseite, gefolgt von " Überrepräsentation Analyse ".
- Fügen Sie die Liste von Genen in der " eine Liste von gen/Protein-IDs einfügen " Feld. Wählen Sie gen-Symbol in der " gen/Protein-ID Typ " box und klicken Sie auf " weiter ". Aktivieren Sie das Kontrollkästchen neben dem " Wege definiert durch Weg Datenbanken " unter dem Pfad-basierte setzt Abschnitt.
Hinweis: Eine Reihe von Optionen für die Analyse wird angezeigt, einschließlich der Liste der verfügbaren Datenbanken zu suchen. Es wird empfohlen, de-Auswahl alle Datenbanken mit Ausnahme der Kegg und Reactome Datenbanken sind etablierte und umfassend. Die minimale Überlappung mit Liste und p-Wert cutoff Eingabeeinstellungen kann auch je nach Bedarf angepasst werden. Wir empfehlen, diese Einstellungen auf die Standard 2 gen minimale Überlappung und ein 0,01 p-Wert Cutoff. - Select " finden angereicherten " erhalten die Liste der Pfade mit Genen in der Eingabeliste.
Hinweis: Die Ausgabe werden im Tabellenformat, einschließlich des Namens des jeder Pfad gefolgt von " Größe " (d. h. die Anzahl der insgesamt Gene im Weg), " Kandidaten enthalten " (d. h. die Anzahl der Gene in der Eingabeliste, die in diesem Pfad ), sowie der p-Wert und Q-Wert (FDR) und der Datenbank, aus denen der Pfad identifiziert wurde.
- Generation Weg Netze
- angereicherten Wege zu bestimmen, wie oben beschrieben.
- Wählen Sie alle der angereicherten Bahnen in einem Weg-Netzwerk zu visualisieren, indem entweder jedes Kontrollkästchen neben den Pfad-Namen angezeigt werden oder auf " alle " unter " wählen Sie " in der Spaltenüberschrift über die Auswahlfelder wählen Sie dann " Visualisieren Sie Auswahlmengen ".
Hinweis: Wir empfehlen, alle Wege zu visualisieren, gibt es weniger als 30; gibt es mehr als 30 Wege empfehlen wir die Top 30 am meisten bereichert Wege zu wählen (solche mit der größten Anzahl von Genen aus der Eingabeliste). - Anpassen der " relative Überlappung " und " geteilt Kandidaten " Filter, wenn entweder das Kontrollkästchen oben in der Mitte der Seite und Eingabe desirEd Prozent relative überlappen oder Anzahl der gemeinsamen Kandidaten zu strenger um mehr zu machen sein Überschneidungen innerhalb der Netze der Weg klarer, und wählen Sie " gelten ".
Hinweis: Wir empfehlen eine minimale relative Überschneidung von 0,2, Angabe einer 20 % gen Überlappung zwischen 2 Wege, sie zu verbinden und ein Minimum von 2 gemeinsamen Kandidaten. Die Diagramm-Legende kann gesehen werden, indem Sie auf das Diagramm-Legende im linken oberen Bereich der Seite.
- Bestimmung der angereicherten GO Begriffe
- Kopieren der gen-Symbole der Gruppe wofür man die angereicherten gen Ontologien in die Zwischenablage zu bestimmen will. Gehen Sie auf die ' GO Anreicherung Analyse-Tool ' Gene Ontology Konsortium 13. Fügen Sie die Liste der gen-Symbole in der Box auf der linken Seite der Seite unter " hier Ihre gen IDs … "
- Wählen Sie welches Set GO Begriffe zu verwenden, unter Feld gen IDs aufgeführt: biologischer Prozess, molekulare Funktion oder zellulären Komponenten. Auswählen (empfohlen) ' biologischen Prozess '. Wählen Sie ' Danio Rerio ' unter dem Sprung Begriffe box und klicken Sie auf " senden ".
Hinweis: Wir empfehlen die Verwendung des Standard-p-Wert-Grenzwertes 0,05.
5. Überprüfung durch qRT-PCR
Hinweis: einzelne Gene identifiziert, die mit Veränderungen der bedeutenden Genexpression in RNASeq durch gezielte qRT-PCR in wiederholte Experimente überprüft werden.
- cDNA Synthese
- Auszug die RNA aus Embryonen, die mit der in Abschnitt 3.1 beschriebenen Methode. RNA-Extraktion.
- Konvertieren 1 µg RNA in cDNA cDNA Konvertierung kit (siehe Tabelle der Materialien). Kombinieren Sie RNA, dNTPs und Enzym Reverse Transkriptase. Führen Sie die Thermocycler Reaktion nach Angaben des Herstellers ' s Spezifikationen.
- Verdünnen cDNA 1:3 in DEPC-behandeltem Wasser. Shop bei 4 ° C bis zu 1-2 Monate.
- qRT-PCR-Nachweis
- Wählen Sie Gene, durch qRT-PCR aus RNA Sequenzierung Ergebnissen zu überzeugen. Gene zu identifizieren, mit hohen Falte Änderungen im Ausdruck. Bestimmen welche diese Gene auch hohe lesen Sie zählt, enthalten, da dies reichlich Ausdruck angibt.
- Wählen Sie 10-12 Ziele aus der hohen Falte Veränderung, hohe lesen Sie Zählliste Gene. Design-Primer an die Zielgene zu verstärken, die mindestens 1 Intron-Exon-Grenzen erstrecken.
- Geben Sie das Gen oder die gezielte Region des Gens in qPCR Primer Design Seite 14. Wählen Sie die " design 2 qPCR Primer " und fordert die Website Grundierung erstellen.
Hinweis: Achten Sie darauf, die interne Kontrolle Primer, wie β-Aktin, einschließen, um Vergleiche zwischen den Proben zu normalisieren. Die β-Aktin-Primer sind F: 5 ' - TCGAGCTGTCTTCCCATCCA - 3 ' und R: 5 ' - TCACCAACGTAGCTGTCTTTCTG - 3 '. - Verbinden die cDNA, forward Primer, rückwärts-Primer und Polymerase. Führen Sie qRT-PCR-Amplifikation um festzustellen, die relative Expression von Genen 15.
- Analysieren die relative mRNA Expression von Genen des Interesses durch relative Quantifizierung Entschlossenheit 15.
- Vergleichen die qRT-PCR zu RNASeq Ergebnissen zu gewährleisten, dass die Direktionalität differentielle Expression entspricht.
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Representative Results
Sortierung der differenziell ausgedrückt Gene:
Wir gezielte Ermittlung differentiell exprimierten Gene im Larvenstadium von Zebrafisch-Modellen von Alström-Syndrom und Bardet-Bardet-Syndrom (BBS), entweder alms1 oder bbs1 Abschriften durch die Injektion von zuvor validiert Spleiß-blocking MOs in Wildtyp Zebrafish Embryos16,17. 5 Tage nach Befruchtung (Dpf), zwei Wiederholungen der RNA wurden aus jeder Zustand als auch die Embryonen injiziert mit Steuerung MO, extrahiert, wie in Abschnitt 3 oben beschrieben. RNA von jeder Probe wurde sequenziert, bis zu einer Tiefe von ~ 120 Millionen liest mit ~ 107 Millionen liest das Zebrafish Genom ausgerichtet. Zwischen 85-90 % des ausgerichteten lautet exonic Regionen des Genoms zugeordnet.
1.348 total Gene wurden deutlich im Alström-Modell und 471 total Gene waren deutlich in der BBS-Modell geändert. Freigegebene Änderungen in der Genexpression zwischen den Modellen oder Änderungen nur für eines der Modelle wurden identifiziert, wie in Abschnitt 4.2 beschrieben. 1.084 total Gene waren eindeutig in der Alström-Modell verändert, 612 bis geregelt und 472 nach unten reguliert, und 207 Gene waren eindeutig in der BBS Modell 176 bis geregelt und 31 nach unten geregelt (Abbildung 2, Tabelle S1und S2 Tabelle) geändert. 264 Gene fanden sich bei beiden Modellen erheblich geändert werden, 73 bis geregelt wurden 182 wurden nach unten geregelt und 9 zeigten gegenüber Veränderungen im Ausdruck zwischen den beiden Modellen (Abbildung 2, Tabelle S1und S2 Tabelle (siehe Ergänzende Tables.xlsx)). Die abweichenden Zahlen differentiell exprimierten Gene zwischen den beiden Modellen zufolge bbs1 und alms1 verschiedene Phasen in der Entwicklung auswirken kann.
Interessant ist, empfehlen die große Zahl der differentiell exprimierten Gene im Alström Modell, dass alms1 spielt eine wichtige Rolle in der Entwicklung bei der 5 Dpf-Bühne, während die kleinere Zahl von gen-Veränderungen in der BBS-Modell, dass vorschlagen die Rolle des BBS1 möglicherweise nicht so prominent zu diesem Zeitpunkt. Im Gegensatz dazu schlug früheren transkriptomischen Analysen bei 2 Dpf die umgekehrte18.
Bestimmung der angereicherten Wege und gen Ontologien im Zebrafisch-Modell Alström-Syndrom:
Um die molekularen Profil des Modells Alström deutlicher zu erhellen, wurden die Wege und gen Ontologien bereichert die differentiell exprimierten Gene identifiziert. Angereicherte Wege wurden durch Abfragen der ConsensusPathDB und angereicherten gen Ontologien wurden durch Abfragen der Gene Ontology Konsortium wie in Abschnitte 4.3-4.5 beschrieben bestimmt. Die meisten hochangereichertem unter den Genen, die bis in die Alström geregelt zu modellieren, durch die Anzahl der Gene oder Falten Bereicherung, wurden analysiert. 31 total Wege waren bis in das Alström Modell geregelt. Neben der breiten Gruppierung von "Stoffwechsel", waren die am meisten betroffenen Wege der angeborenen und der adaptiven Immunsystems mit 32 und 20 Gene bzw. (Abb. 3A). Nachgeschalteten β-Zell Rezeptor Signalisierung Veranstaltungen waren auch bereichert Immun System Up-Verordnung in diesem Modell vorschlagen. Mehrere Signalwege waren auch unter den Up-regulierten Genen im Einklang mit dem Verband der Alström-Syndrom mit primären Zilie Dysfunktion, eine Signalisierung Hauptmitte der Zelle (Abbildung 3A) Alström Modell bereichert. Darüber hinaus drei Wege mit Insulin-Sekretion verbunden waren bis geregelt: Fettsäuren gebunden, GPR40, freie Fettsäuren und Acetylcholin (Abb. 3A). Dies steht im Einklang mit der sehr hohe Insulin Widerstand und Typ 2-Diabetes Phänotypen bei Alström Patienten. Sechs Semester gehen waren unter den Up-regulierten Genen im Alström Modell, einschließlich Erythrozyten Differenzierung, Erythrozyten Homöostase, myeloische Zellen Homöostase und homöostatische Prozesse (Abb. 3 b) angereichert. Um die Vernetzung der Up-regulierten Bahnen zu beurteilen, erzeugt ein Weg-Netz von den Alström Modell Up-regulierten Bahnen wurde (Abbildung 3). Die wichtigsten Knoten miteinander verbundenen Wege offenbart ein hohes Maß an Konnektivität unter die Wege das Immunsystem zugeordnet und Signaltechnik, während eines der kleineren Knoten Verbindungen zwischen den drei Insulin regulatorischen Pfaden offenbart. Schließlich überprüft wir die Veränderungen der Genexpression durch Bewertung der 5 gen Ziele, die entweder Up - oder Down-reguliert im Alström Modell waren durch RNASeq identifiziert. Die Richtwirkung von Veränderungen der Genexpression durch qRT-PCR in Aste, Gck, Bmb, btr26, und ifi35, relativ zum Steuerelement, rekapitulierte, die von RNASeq (Abbildung 4A–B) beobachtet.
Abbildung 1: Repräsentative Ausgabe des Gens Expressionsanalyse nach RNASeq vom Kern oder Händler zur Verfügung gestellt. Objekt-ID zeigt die ENSEMBL gen ID-Nummer. Lesen zählt gibt die Anzahl der Lesevorgänge in Kontrolle oder experimentelle Beispiele, an denen dieses Gen in das Genom ausgerichtet. Falte ändern und das Protokoll der Falte Änderung zeigen den Grad der Veränderung der Expression von Genen zwischen experimentellen und Einfluss auf Probe entweder positiv (Erhöhung) im Ausdruck in Pfeilrichtung experimentelle Probe, oder negativ (Abnahme) im Ausdruck in Pfeilrichtung experimentelle Probe. Der p-Wert und FDR sind statistische Tests, um die Bedeutung der Ergebnisse bestimmen; für RNASeq Experimente ist ein strengerer FDR-Wert von 0,05 verwendet, um die Bedeutung zu bestimmen. Gene_symbol gibt die NCBI gen ID und Gene_name listet den vollständigen Namen des Gens. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Differenziell ausgedrückt Gene in die BBS und Alström Modelle. Anzahl der Gene bis geregelt (rot) oder nach unten geregelt (gelb) in alms1 MO (grün) injiziert Embryonen, bbs1 MO (Orange) injiziert Embryonen oder beides im Vergleich zu standard-Steuerelement MO injiziert Embryonen. * Bezeichnet die Anzahl von Genen in beiden geändert aber mit gegenüber Änderungen im Ausdruck. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
FIgure 3. Hochreguliert Wege und angereicherte GO Begriffe in das Alström-Modell. (A) hochreguliert Wege durch die Anzahl der Gene. (B) hochreguliert gehen Begriffe durch Falten Bereicherung. (C) Weg Konnektivität hochreguliert Wege in das Alström-Modell. Bahn Verbindungen von mindestens 20 % bestimmt teilte Genen zwischen den Bahnen und mindestens 2 Gene überlappen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4. qRT-PCR-Validierung von Veränderungen der Genexpression. Änderungen in der Genexpression durch RNASeq identifiziert wurden in Alter und Behandlung abgestimmt 5 Dpf Embryonen, injiziert mit Kontrolle, alms1 oder bbs1 MO. (A) Teil der Gene zeigt mRNA Expression von Genen mittels qRT-PCR bestätigt. (B) gleichwertige Daten zeigen lesen zählt aus dem RNASeq-Dataset. Alle Daten beziehen sich auf Kontrolle und qRT-PCR wurden auf Actin normalisiert. Aste, Asteroiden Homolog 1; GCK, Glukokinase; BMB, Brambleberry; btr26, im Zusammenhang mit blutrünstigen Genfamilie Mitglied 26; ifi35, Interferon-induzierte Protein 35. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
In diesem Protokoll beschriebene Ansatz bietet eine relativ schnelle und kostengünstige Strategie für Transkriptom-Level-Analyse der ganze Tiere oder bestimmte sortierte Zellpopulationen. Der Zebrabärbling bietet eine vorteilhafte Modell für diese Art der Studie wegen der Leichtigkeit und Schnelligkeit beim generieren großer Mengen an Material, die einfache Implementierung von genetischen oder experimentelle Umweltbedingungen und die Verfügbarkeit eines großen ab Spektrum an transgenen Reporter Linien zur Isolation von Zelltyp spezifisch und Gewebe-spezifische Bevölkerungen ermöglichen.
Während hier nicht weiter beschrieben, könnte diese Methode problemlos Gewebeschnitte von juvenilen oder adulten Fische als Alternative zu FACs und Sammlung gesammelt. Wir auch eine Basisanalyse Follow-up-Strategie entwickelt, die nur stützt sich auf die Verwendung von grundlegenden Tabelle Befehle und bereits vorhandene Weg und GO-Datenbanken. Der große Vorteil dieses Ansatzes ist die einfache Zugänglichkeit ohne hochrangige Expertise in Computer-Programmierung oder Datenbank-Management. Als solche ist diese Strategie für Ermittler aller Hintergründe für informative Analyse von großen gen-Ausdruck-Datensätzen.
Unser Ansatz kombiniert grundlegende Zebrafish Embryos und Larven Kultur mit RNA-Extraktion Standardtechniken gefolgt von RNASeq. RNASeq erfordert eine große Menge an qualitativ hochwertige Ausgangsmaterial; Einige Anbieter verlangen 2 µg Gesamt-RNA. Infolgedessen ist selten/seltene Zelltypen oder einzelnen Embryo Analyse außer Reichweite. Aber die letzten fünf Jahren zeigten deutliche Verbesserungen bei ertragsschwachen Analysen, Datasets aus kleineren Proben und geringere RNA-Mengen erzeugt und wir erwarten, dass diese Anwendungen in naher Zukunft möglich sein werden. Genaue Ergebnisse, die Zugabe von beiden technischen Wiederholungen, d.h., dafür eignet sich zwei RNA-Bibliotheken aus einer einzigen Probe und biologische Wiederholungen, d.h., sammeln von Embryonen aus mehrere Paarungen zu generieren. Mit diesen Schritten können die Forscher Steuern für Variation in Proben und Sequenzen identifiziert in allen Proben sind eher true ergibt, mit der reduzierten Wahrscheinlichkeit der fehlenden unteren lesen-Zählergebnis.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch R01DK102001 (N.A.Z.), P30DK072488 (N.A.Z.) und T32DK098107 (T.L.H. und J.E.N).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Commercial Reagents | |||
| TriZol | Thermo Scientific | 15596026 | lysis reagent |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | dissociation buffer 1 |
| FACSMax | Genlantis | T200100 | dissociation buffer 2 |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| FirstStrand cDNA conversion | Thermo Scientific | K1621 | cDNA conversion kit |
| 2X SYBR Green Master Mix | Roche | 4707516001 | qRT-PCR Master Mix |
| FACS buffer | Fisher Scientific | 50-105-9042 | |
| chloroform | Sigma Aldrich | 288306 | |
| sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Strains | |||
| Tuebingen | ZIRC | ZL57 | |
| ins2a:mCherry | ZIRC | ZL1483 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 40 micron cell strainer | Sigma | CLS431750 | |
| FACS tube | BD Falcon | 352063 | |
| hemocytometer | Sigma | Z359629 | |
| Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Inverted Microscope | Zeiss | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Illumina HiSeq | Illumina | ||
| LightCycler 480 | Roche | ||
| Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set | Aquaneering | ZHCT100 | |
| FACS tube 5 mL polypropylene tube | BD Falcon | 352063 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | ||
| Consensus Path DB | http://cpdb.molgen.mpg.de/ | ||
| GO Enrichment Analysis | http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis |
References
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. (2002).
- Detrich, H. W., Zon, L., Westerfield, M. The Zebrafish: Disease Models and Chemical Screens. , 4th ed, Academic Press. (2017).
- Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. The Zebrafish: Genetics, Genomics, and Transcriptomics. , 4th ed, Academic Press. (2016).
- Detrich, H. W. The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , 3rd ed, Academic Press. (2011).
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- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
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- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J Vis Exp. (109), (2016).
- MPIMG. ConsenusPathDB. , Available from: http://cpdb.molgen.mpg.de/ (2017).
- Consortium, G. O. Enrichment analysis Tool. , Available from: http://www.geneontology.org/ (2017).
- IDT. IDT Primerquest Tool. , Available from: https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index (2017).
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- Lodh, S., Hostelley, T. L., Leitch, C. C., O'Hare, E. A., Zaghloul, N. A. Differential effects on beta-cell mass by disruption of Bardet-Biedl syndrome or Alstrom syndrome genes. Hum Mol Genet. 25 (1), 57-68 (2016).
- Hostelley, T. L., Lodh, S., Zaghloul, N. A. Whole organism transcriptome analysis of zebrafish models of Bardet-Biedl Syndrome and Alstrom Syndrome provides mechanistic insight into shared and divergent phenotypes. BMC Genomics. 17, 318 (2016).
