Summary
Ce protocole présente une approche pour l’analyse du transcriptome ensemble des embryons de poisson-zèbre, larves, ou trier des cellules. Nous incluons l’isolement de l’ARN, la voie analyse des données RNASeq et qRT-PCR-based validation des modifications de l’expression génique.
Abstract
L’analyse des modifications de l’expression génique global est un outil précieux pour identifier les nouvelles voies qui sous-tendent les phénotypes observés. Le poisson-zèbre est un excellent modèle pour une évaluation rapide du transcriptome entier de populations cellulaires de tout animal ou individuels en raison de la facilité d’isolement de l’ARN du grand nombre d’animaux. Un protocole pour l’analyse de l’expression génique global chez les embryons de poisson-zèbre RNA séquençage (RNASeq) est présenté ici. Nous décrivons la préparation de l’ARN d’embryons entiers ou de populations de cellules obtenues à l’aide de cellules tri chez les animaux transgéniques. Nous décrivons également une approche pour l’analyse des données RNASeq pour identifier les voies enrichis et termes de Gene Ontology (aller) dans les ensembles de données d’expression génique global. Enfin, nous fournissons un protocole pour la validation des modifications de l’expression génique à l’aide de la transcriptase inverse quantitative PCR (qRT-PCR). Ces protocoles peuvent être utilisés pour une analyse comparative du contrôle et de coffrets de poisson zèbre pour identifier les modifications de l’expression des gènes nouveaux et donnent un aperçu moléculaire de phénotypes d’intérêt.
Introduction
Analyse comparative de l’expression génique global est un outil précieux pour identifier de nouveaux gènes qui contribuent à des phénotypes observés. Ces analyses s’appuient généralement sur l’évaluation quantitative de l’abondance de transcription comparé entre expérimental et échantillons de contrôle. Des approches ciblées, telles que qRT-PCR sont relativement rapide et précis pour l’étude des modifications de l’expression génique unique. Séquençage de RNA (RNASeq) propose une approche large et exempt d’hypothèse pour identifier des changements significatifs dans l’expression génétique entre les échantillons, ce qui en fait désormais la norme pour de telles enquêtes à travers des systèmes expérimentaux.
Poisson zèbre sont apparus comme un modèle important sur de nombreux domaines de la maladie. Développé à l’origine pour leur utilité dans les études de biologie du développement, en raison de leur forte fécondité et relativement faible coût d’entretien, utilisation expérimentale du poisson-zèbre a évolué pour inclure un large éventail de phénotypes d’embryonnaire au stade adulte aussi bien comme un large éventail de moléculaire dosages1,2,3. En effet, ces atouts font des études mécanistes moléculaires rapide et rentable en raison de la facilité d’acquisition de grandes quantités de matériel combiné avec la facilité des manipulations génétiques et environnementale à tous les stades de la vie. En outre, le caractère transparent des embryons de poisson-zèbre et des larves le rendent idéal pour générer les lignes de journaliste transgéniques spécifiques aux cellules et tissus permettant en vivo visualisation des cellules discrètes des populations4. L’exploitation de ces lignes permet analyse d’expression génique global dans les types spécifiques de cellules isolées, basés sur l’expression du gène rapporteur.
Nous présentons ici un protocole complet pour l’analyse d’expression de gène global à l’aide de RNASeq après la culture d’embryons de poisson-zèbre. Des manipulations expérimentales génétiques, y compris morpholino (MO)-base de gène transitoire ou génome induite par CRISPR édition, ont été présentés ailleurs5,6,7. Nous donc se concentrer sur un protocole détaillé pour l’isolement de l’ARN d’embryons entiers ou trier des cellules transgéniques exprimant le journaliste suivies par simple analyse computationnelle des résultats RNASeq à l’aide d’outils de voie et termes de gene ontology (GO). Enfin, nous avons inclus une stratégie pour la validation des modifications de l’expression génique par transcriptase inverse quantitative PCR (qRT-PCR). Ces protocoles sont applicables aux embryons de poisson-zèbre soumis à un large éventail de conditions expérimentales, y compris la comparaison des mutants génétiques ou des conditions environnementales.
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Protocol
tous les protocoles animaux décrits ci-dessous sont conformes et agréés par l’Université de Maryland animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC).
1. préparation de l’embryon
- Generating embryons par accouplement naturel
- embryons de Culture à 3 mois d’âge, reproduction maturité 5 , 8 .
- Séparer les poissons adultes mâles et femelles de la souche désirée dans les réservoirs d’accouplements divisés la veille de la collecte des embryons et ajouter 2 mâles et 3 femelles à chaque citerne à.
Remarque : Utilisation de la souche de journaliste fluorescent transgénique insulin2a:mCherry permet l’analyse des cellules β pancréatiques. - Transfert de poisson à l’accouplement du réservoir avec de l’eau douce et supprimer le séparateur immédiatement après les feux de venir le lendemain matin.
- Laisser le poisson s’accoupler naturellement jusqu'à ce que les embryons sont observés dans le réservoir inférieur. Recueillir les embryons dans des intervalles de 30 min jusqu'à ce que la quantité désirée est collectée. Recueillies de magasin chaque point dans le temps en Pétri distinct dans les médias d’embryon à 28,5 ° C.
- Effectuer microinjection de matériel génétique ou de placement dans les milieux de culture expérimentale 6, si vous le souhaitez et de la culture des embryons au frais Hank ' s embryon moyen 8 à 10 cm de Pétri à 28,5 ° C.
Remarque : pour l’analyse de l’expression génique dans morpholino (MO) injecté ou animaux mutants, Notez que chaque manipulation peut avoir des effets indirects sur l’expression génique. Mutants peuvent montrer compensation génétique au niveau de la transcription qui n’est pas respecté par génique à base MO ciblage 9.
- Embryons au stade
- Culture des embryons dans les groupes de 50 – 75 embryons par 10 cm boîte de Pétri pour promouvoir cohérente du développement calendrier de tous les embryons.
- Surveiller le développement morphologique en utilisant le microscope à dissection aux stades blastomère épibolie et somite afin d’assurer la progression du développement 10.
Remarque : Retirez les embryons décèdent ou sont mal formés afin d’éviter un retard de développement dans le plat. - Séparer les embryons selon l’âge du développement. Mesurer l’âge embryonnaire à l’aide de nombre somite après segmentation (après gastrulation, 10,33 h après la fécondation (hpf)) jusqu'à environ 24 hpf. Stade des embryons et des larves à l’aide de longueur totale du corps après 24 hpf.
Remarque : Les somites sont les tissus mésodermiques en forme de chevrons sur la partie dorsale de l’embryon. - Placer les embryons triées dans un incubateur à 28,5 ° C et permettre le développement d’évoluer vers l’âge désiré.
2. Dissociation de cellule unique : Tout embryon et tri des Populations de cellules
- dissociation tout embryon
- euthanasier les embryons de poisson-zèbre à l’étape désirée en plaçant la boîte de Pétri sur glace pendant 5-15 min jusqu'à ce qu’aucun mouvement n’est observé .
- Transférer un pool de 20 embryons dans un tube de microcentrifuge de marqué 1,5 mL. Retirer n’importe quel média embryons excédentaires du tube microcentrifuge.
- La lyse d’ajouter 200 µL de réactif (voir Table des matières) dans le tube contenant des embryons. Homogénéiser les embryons dans le réactif de lyse mécaniquement à l’aide d’un pilon. Ajouter 800 µL de réactif de lyse pour porter le volume total à 1 mL. Conserver à-80 ° C jusqu'à l’extraction de l’ARN.
- Isolement des cellules d’écoulement-tri 11
- transférer les embryons de la boîte de Pétri dans un tube de microtubes de 1,5 mL et enlever autant milieu embryon possible.
Remarque : Selon l’âge de l’embryon, dissociation mécanique peut aussi être nécessaire à cette étape. Avec les embryons > 48 hpf, nous recommandons l’utilisation d’un pilon pour perturber l’intégrité d’embryon avant de procéder. - Incuber les embryons avec 1 mL de tampon de dissociation 1 (voir la Table des matières) dans le tube de microtubes de 1,5 mL. Incuber pendant 15 à 30 min à température ambiante. Triturer la solution en pipettant également doucement et descendre en utilisant un embout P1000 à mélanger toutes les 3-4 min au cours de l’étape d’incubation. NE pas vortexer.
- Recueillir les embryons par centrifugation pendant 3 min à 300 x g et éliminer le surnageant. Remettre en suspension les embryons dans 1 mL de tampon de dissociation 2 (voir la Table des matières). Incuber pendant 15 à 30 min à température ambiante avec trituration pipette ordinaire.
- Évaluer la digestion en diluant 1-2 µL de suspension dans la cellule activée par fluorescence tri tampon (FACS) sous microscope.
NOTE : Digestion complète s’est produite lorsque l’aliquote interrogée montre des cellules individuelles avec des agrégats cellulaires minimal et des morceaux de tissu embryonnaire. - Recueillir les cellules par centrifugation à 300 g pendant 5 min. Enlever le surnageant. Remettre en suspension les cellules dans le tampon de 1 mL FACS et un filtre à gravité à travers un tamis de cellule de 40 µm pour éliminer les tissus non digérée de l’échantillon.
- Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et diluer avec un tampon à environ la 1 x 10 6 cellules/mL dans un tube de FACS FACS.
Remarque : Pour les types de cellules avec un nombre relativement restreint par embryon (moins de 5 % du total), comme les cellules β du pancréas, utiliser un minimum de 1 000 embryons appariés selon l’étape de. - Fournissent les FACS tri facilité avec les FACS tubes contenant 1 mL d’échantillons de suspension cellulaire ainsi que tube FACS seulement réactif de lyse ou tampon de FACS. Porte la trieuse-flux de FACS pour collecter uniquement les cellules individuelles qui expriment le journaliste fluorescent.
- Effectuer le débit de FACS-tri jusqu'à ce que le nombre de cellules désirées ont été collecté.
Remarque : Pour exécuter RNASeq, il y a un minimum requis de l’ARN total. Nous avons trouvé que 3 000-5 000 cellules ne suffisent pas à isoler l’ARN haute concentration, qualité. - Stocker les cellules recueillies sur la glace et de procéder immédiatement à la préparation d’ARN.
- transférer les embryons de la boîte de Pétri dans un tube de microtubes de 1,5 mL et enlever autant milieu embryon possible.
3. Préparation d’ARN
- de l' ARN extrait
- Incuber l’échantillon prélevé (de l’étape 2) avec le réactif de lyse pendant 5 min à température ambiante.
- Ajouter 0,2 mL de chloroforme pour chaque 1,0 mL de réactif de lyse utilisé et inverser les tubes à la main pour 15 s. Incuber pendant 2-3 min à température ambiante. Centrifuger les échantillons à 12 000 g pendant 15 min à 4 ° C.
- Transférer la phase aqueuse séparée dans un nouveau tube et ajouter 0,5 mL d’isopropanol pour chaque 1,0 mL de réactif de lyse utilisé. Incuber pendant 10 min à température ambiante. Centrifuger les échantillons à 12 000 g pendant 10 min à 4 ° C.
- Lavage avec 75 % d’éthanol et centrifuger les échantillons à 7 500 g pendant 5 min à 4 ° C. éliminer le surnageant complètement et laisser sécher à température ambiante à l’air. Remettre en suspension l’ARN en 15-30 µL diéthyl pyrocarbonate (DEPC)-traitement de l’eau.
- Purifier qualité RNA
- allient la suspension RNA acétate de sodium 3M volume 1/10 (pH 5,5) et 1 volume d’alcool isopropylique. Incuber pendant 20 min à température ambiante et centrifuger les échantillons à 12 500 g pendant 10 min à 4 ° C.
- Laver le culot avec glacee 70 % d’éthanol dans l’eau traitée DEPC et centrifuger les échantillons à 10 000 g pendant 5 min à 4 ° C. répéter une fois l’étape de lavage.
- Enlever le surnageant et laisser pour sécher à température ambiante. Remettre en suspension dans l’eau traitée DEPC.
- Dosage de l’ARN extrait pour la concentration (ng/µL) et de la pureté (ratio 260/230) à l’aide d’un spectromètre d’absorption. Assurez-vous que la valeur de 260/230 est ~ 2.0 avant de procéder à la RNASeq. Stocker à-80 ° C jusqu'à ce que nouse (jusqu'à 6 mois).
- Envoyer les échantillons d’ARN à un vendeur ou un noyau pour RNASeq et l’expression des gènes changement analyse basée sur la quantification du séquençage lectures. Les résultats renvoyés par le vendeur sont généralement fournis sous forme de liste de gènes présentant un pli-changement significatif en transcription lectures entre échantillons.
Remarque : Une colonne peut être utilisée si la méthode ci-dessus donne RNA de mauvaise qualité. La quantité, la concentration et la RNA intégrité nombre (RIN) des échantillons d’ARN doivent être confirmées avec le vendeur ou le noyau. Le vendeur ou le noyau évaluera également généralement RIN.
4. Voie et aller à terme analyse
Remarque : Voir la Figure 1 pour une sortie représentatif de l’analyse d’expression de gène après RNASeq fournie par le noyau ou le fournisseur.
- Tri des gènes différentiellement exprimés
- comparant une seule condition expérimentale / contrôle
- Open data (résultats) dans un logiciel de gestion de feuille de calcul (voir Table des matières ).
- Sélectionner la flèche déroulante à côté de la ' tri ' le bouton et sélectionnez " tri personnalisé " dans la feuille de calcul contenant les gènes différentiellement exprimés dans l’expérimental versus condition contrôle.
- Activez la case à ' colonne ' dans la fenêtre qui s’affiche en hausse et choisir de trier par la ' CFT ' colonne. Assurer la ' valeurs ' est sélectionné dans le ' sorte sur ' colonne. Sélectionnez cette option pour trier des ' plus grand au plus petit ' dans le ' ordre ' colonne, puis cliquez sur " OK ".
NOTE : Ceci va trier les gènes différentiellement exprimés alors que ceux avec l’augmentation de l’expression (CFT positif) apparaîtra en haut de la liste, tandis que celles avec une diminution expression (CFT négatif) apparaîtra au bas de la liste.
- Comparer les conditions expérimentales multiples à un seul contrôle comme suit.
- Sélectionner la première cellule dans une colonne vide sur l’expérimental 1 contre tableur de contrôle afin de déterminer de façon différentielle exprimée gènes découverts dans deux conditions expérimentales. Tapez la formule suivante dans la cellule :
Remarque : cette équation est une combinaison de l’IF, ISERROR et fonctions MATCH. (i) la fonction MATCH, MATCH (A1, Experimental2_vs_Control ! En-tête, 0), va chercher la valeur en A1 (l’ENSEMBL ID) dans la colonne A (en-tête) de la feuille de calcul nommée Experimental2_vs_Control (Experimental2_vs_Control !). Le " 0 " indique qu’il faut pour rechercher une correspondance exacte, et si une correspondance exacte est trouvée, la fonction retournera une valeur de " 1 ", alors que si aucune correspondance n’est trouvée, la fonction renvoie une erreur " N/D ". (ii) le résultat de la fonction EQUIV est ensuite entré dans la fonction ISERROR, fonction ESTERREUR (match de football (A1, Experimental2_vs_Control ! En-tête, 0)), où, si l’entrée est " 1 " indiquant une correspondance a été trouvée, elle retournera " faux ", et si l’entrée est " N/D " indiquant un match n’a pas été trouvé, il sera de retour " vrai ". (iii) les " vrai " ou " fausse " résultat est ensuite entrée dans la fonction si, si (ISERROR (match de football (A1, Experimental2_vs_Control ! En-tête, 0)), " ", " double "), où, si l’entrée est " vrai " indiquant une correspondance est introuvable, il retournera la valeur entre le premier jeu de guillemets (" ") qui est vide, et par conséquent la cellule sera vide. Si l’entrée est " fausse " indiquant une correspondance a été trouvée, il retournera la valeur entre le deuxième jeu de guillemets (" double "), et la cellule dira " dupliquer ". - Presse " Enter " ou " retour " pour exécuter l’équation. Sélectionnez la cellule qui contient l’équation, puis cliquez sur la case dans le coin inférieur droit de la cellule. Gardez la clic sur la souris et faites glisser la zone sélectionnée vers le bas la colonne jusqu'à la dernière ' ID de fonction ', pour copier l’équation dans chaque cellule de la colonne.
- Select " Custom tri " encore une fois, ajoutez un deuxième niveau de tri en cliquant sur le " + " icône dans le coin inférieur gauche. Dans le premier niveau, " Trier par ", sous sélectionnez colonne " double ", sous trier sur sélectionnez ' valeurs ' et sous sélectionnez ordre ' Z à A '. Au deuxième niveau, " puis de ", sous sélectionnez colonne ' CFT ', sous trier sur sélectionnez ' valeurs ' et sous sélectionnez ordre ' le plus grand au plus petit ' et sélectionnez " OK ".
NOTE : Ceci va trier la liste des gènes en 4 groupes basés sur la directivité des changements d’expression. Il est important de vérifier les gènes retrouvés dans deux conditions expérimentales afin d’assurer que le changement dans l’expression est dans le même sens dans les deux ou dans des directions opposées. - Supprimer les parenthèses de la colonne de symboles de gène avant d’instance ou les résultats ne seront pas trouvées dans les bases de données. Sélectionnez la colonne entière contenant des symboles de gène. Sélectionnez " modifier " puis " remplacer " dans le menu déroulant ' fichier ' menu. Type " (*) " dans le " trouver quoi : " bar de la fenêtre remplacer et laisser le " remplacer par : " bar vide. Sélectionnez ' remplacer tout ' pour supprimer toutes les instances de parenthèses.
Remarque : Les * représente un nombre quelconque de caractères, en plaçant ce caractère entre deux parenthèses, le programme est invité à trouver n’importe quelle instance dans les cellules en surbrillance et de n’importe quelle instance de parenthèses sera remplacé par rien, et ainsi les retirer.
- Sélectionner la première cellule dans une colonne vide sur l’expérimental 1 contre tableur de contrôle afin de déterminer de façon différentielle exprimée gènes découverts dans deux conditions expérimentales. Tapez la formule suivante dans la cellule :
- comparant une seule condition expérimentale / contrôle
- Détermination enrichi voies
- copie les symboles du gène de l’ensemble pour que l'on souhaite déterminer les voies enrichis dans le presse-papiers. Allez à la ConsensusPathDB 12. Sélectionnez " Gene série d’analyses " sur la barre latérale gauche de la page Web, suivi par " analyse de surreprésentation ".
- Coller la liste des gènes dans le " coller une liste d’identificateurs de gènes/protéines " boîte. Symbole de certains gènes dans le " type d’identificateur de gènes/protéines " zone, puis cliquez sur " continuer ". Activez la case à côté de " voies telle que définie par les bases de données de voie " dans le cadre de la voie-basée fixe section.
Remarque : Un certain nombre d’options pour l’analyse s’affiche notamment la liste des bases de données disponibles à la recherche. Nous vous recommandons désélectionnant toutes les bases de données à l’exception des bases de données Kegg et Reactome car ils sont les plus établis et les plus complets. Le chevauchement minimal avec des paramètres d’entrée de coupure liste et p-value peut également être réglé selon les exigences. Nous recommande de laisser ces réglages dans le chevauchement minimal de 2 gènes par défaut et un seuil de valeur 0,01 p. - Select " trouver des ensembles enrichis " pour obtenir la liste de parcours contenant des gènes dans la liste d’entrée.
Remarque : La sortie sera sous forme de tableaux, y compris le nom de chaque voie suivie " taille " (indiquant le nombre de gènes totales dans la voie), " candidats figurant " (indiquant le nombre de gènes dans la liste d’entrée dans cette voie ), ainsi que la valeur de p et q-valeur (FDR) et la base de données dont la voie a été identifiée.
- Génération de réseaux voie
- déterminer les voies enrichis comme décrit ci-dessus.
- Sélectionner l’ensemble des voies enrichis à visualiser dans un réseau de sentiers en sélectionnant chaque case les noms de voie à visualiser ou en cliquant sur " tous les " sous " sélectionnez " dans l’en-tête de colonne au-dessus des cases de sélection, puis sélectionnez " Visualiser les jeux sélectionnés ".
Remarque : Nous recommandons de visualiser toutes les voies, s’il y a moins de 30 ; s’il n’y a plus de 30 voies nous vous recommandons de sélectionner les voies plus enrichis 30 albums (ceux contenant le plus grand nombre de gènes dans la liste d’entrée). - Régler la " chevauchement relative " et " partagés candidats " filtres, en sélectionnant soit boîte en haut au centre de la page, puis saisit desir% Ed relative se chevauche ou nombre de candidats partagés, à être plus rigoureuse afin de rendre les plus pertinents se superpose au sein des réseaux de voie plus claires et sélectionnez " s’applique ".
Remarque : Nous recommandons un chevauchement relatif minimal de 0,2, indiquant un chevauchement de gène de 20 % entre 2 voies pour les relier et un minimum de 2 candidats communs. La légende du graphique peut être considérée en cliquant sur la légende du graphique en haut à gauche de la page.
- Détermination de la durée GO enrichie
- Copiez les symboles du gène du groupe pour lequel on souhaite déterminer les ontologies de gène enrichi dans le presse-papiers. Aller à la ' outil d’analyse de l’enrichissement de GO ' dans le Gene Ontology Consortium 13. Coller la liste des symboles de gène dans la boîte sur le côté gauche de la page sous " votre gène IDs ici … "
- choisir quel ensemble de termes GO à utiliser, figurant sous la zone ID de gène : processus biologique, fonction moléculaire ou composant cellulaire. Choisissez (recommandée) ' procédé biologique '. Sélectionnez ' Danio rerio ' sous le pouce termes zone, puis cliquez sur " Submit ".
Remarque : Nous vous recommandons d’utiliser le seuil par défaut de valeur p de 0,05.
5. Vérification par qRT-PCR
Remarque : gènes individuels identifiés avec les modifications de l’expression génique importante dans RNASeq doivent être vérifiées par ciblées qRT-PCR dans des expériences répétées.
la synthèse de cDNA de- extraire l’ARN d’embryons à l’aide de la méthode décrite à la Section 3.1. Extraction de l’ARN.
- Convertir 1 µg d’ARN de cDNA utilisant cDNA conversion kit (voir Table des matières). Combiner les ARN, dNTPs et transcriptase inverse. Effectuer la réaction de thermocycleur selon le fabricant ' spécifications de s.
- Diluer cDNA 1:3 dans l’eau traitée DEPC. Conserver à 4 ° C pendant 1 à 2 mois.
- vérification qRT-PCR
- Sélectionner les gènes pour vérifier par qRT-PCR à partir des résultats de séquençage RNA. Identifier les gènes avec pli haut changements dans l’expression. Déterminer lequel de ces gènes contiennent aussi le nombre élevé de lecture, car cela indique une expression abondante.
- Sélectionnez 10-12 cibles dans le changement de pli haut, liste de compter de lecture haut de gènes. Concevoir des amorces pour amplifier les gènes cibles qui s’étendent sur au moins 1 frontière intron-exon.
- Conclure le gène ou la région ciblée du gène qPCR apprêt conception site 14. Sélectionnez le " conception 2 qPCR amorces " et invite le site pour créer des amorces.
Remarque : Veillez à inclure des amorces de contrôle interne, tels que les β-actine, pour normaliser les comparaisons entre les échantillons. Les amorces de β-actine sont F: 5 ' - TCGAGCTGTCTTCCCATCCA - 3 ' et r : 5 ' - TCACCAACGTAGCTGTCTTTCTG - 3 '. - Combiner le cDNA, apprêt avant, inverse de l’apprêt et polymérase. Effectuer l’amplification qRT-PCR pour déterminer l’expression relative des gènes 15.
- Analyser l’expression des gènes d’intérêt ARNm relative de quantification relative détermination 15.
- Comparer le qRT-PCR RNASeq résultats pour s’assurer que la directivité de l’expression différentielle correspond.
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Representative Results
Tri de façon différentielle des gènes exprimés :
Pour identifier les gènes différentiellement exprimés dans le stade larvaire des modèles de poisson-zèbre de Syndrome d’Alström et Syndrome de Bardet-Biedl (BBS), nous avons ciblé soit alms1 ou bbs1 transcriptions en injectant déjà validés MOs en bloquant d’épissage embryons de poisson-zèbre sauvage16,17. 5 jours après la fécondation (dpf), deux répétitions d’ARN ont été extraites de chaque condition, ainsi que les embryons injectés avec contrôle MO, comme décrit dans la Section 3 ci-dessus. L’ARN à partir de chaque échantillon a été séquencé à une profondeur de ~ 120 millions lit avec ~ 107 millions lit aligné sur le génome du poisson-zèbre. Entre 85 et 90 % des lectures alignés mappé à silenceur régions du génome.
1 348 totales gènes ont été considérablement changés dans le modèle d’Alström et 471 totales gènes ont été sensiblement modifiées dans le modèle BBS. Partagé des changements dans l’expression des gènes entre les modèles ou les changements propres à un des modèles ont été identifiés comme décrit à la Section 4.2. 1 084 totales gènes ont été modifiés uniquement dans le modèle d’Alström, 612 régulée et 472 diminuées et 207 gènes ont été modifiés uniquement dans le modèle BBS, 176 régulée et 31 diminuées (Figure 2, Tableau S1et S2 de Table). 264 gènes se sont avérées être considérablement changé dans les deux modèles, 73 ont été régulée et 182 ont été diminuées et 9 ont montré opposé des changements dans l’expression entre les deux modèles(Figure 2, Tableau S1et S2 de la Table (voir Supplemental Tables.xlsx)). Le nombre de discordants de gènes différentiellement exprimés entre les deux modèles suggère que bbs1 et alms1 peuvent avoir une incidence différents stades de développement.
Fait intéressant, le grand nombre de gènes différentiellement exprimés dans le modèle d’Alström suggère alms1 joue un rôle important dans le développement à l’étape 5 dpf, tandis que le plus petit nombre de changements dans le modèle BBS suggère que le rôle de BBS1 peut ne pas être aussi important à ce point dans le temps. En revanche, les analyses transcriptomiques antérieures à dpf 2 a suggéré l' inverse18.
Détermination des voies enrichis et Gene Ontologies dans modèle Zebrafish de Syndrome d’Alström :
Pour mieux élucider le profil moléculaire du modèle Alström, les voies et les ontologies de gène enrichis dans les gènes différentiellement exprimés ont été identifiés. Enrichi de voies ont été déterminées en interrogeant le ConsensusPathDB et enrichi Gene Ontologies ont été déterminés en interrogeant le Gene Ontology Consortium tel que décrit dans les Sections 4.3 et 4,5. Le plus hautement enrichi parmi les gènes dans la Alström modèle, par le nombre de gènes ou plier l’enrichissement, ont été analysé. 31 totales voies ont été régulée dans le modèle d’Alström. Mis à part le regroupement large du « métabolisme », les voies plus fortement touchés ont été le système immunitaire inné et adaptatif avec gènes 32 et 20, respectivement (Figure 3 a). Récepteur des cellules β en aval signalisation événements ont également étaient enrichis suggérant une régulation du système immunitaire dans ce modèle. Plusieurs voies de signalisation sont également enrichis parmi les gènes de régulation dans le modèle d’Alström, cohérent avec l’association entre le Syndrome d’Alström et dysfonction cil primaire, un centre majeur de signalisation de la cellule (Figure 3 a). En outre, trois voies associées à la sécrétion d’insuline ont été régulée : acides gras liés à GPR40, acides gras libres et l’acétylcholine (Figure 3 a). Cela est compatible avec les phénotypes très pénétrant insuline résistance et le type 2 diabète Alström patients. Six termes GO ont été enrichies parmi les gènes de régulation dans le modèle d’Alström, y compris la différenciation de l’érythrocyte, érythrocytes homéostasie, homéostasie cellulaire myéloïde et processus homéostatiques (Figure 3 b). Pour évaluer l’interconnectivité des voies de régulation, un réseau de sentiers de la Alström voies de régulation du modèle a été généré (Figure 3). Le nœud majeur de voies interconnectés a révélé un haut degré de connectivité entre les voies associées au système immunitaire et de signalisation, tandis qu’un des nœuds du mineurs a révélé une connectivité entre les voies réglementaires trois insuline. Enfin, nous avons vérifié les changements d’expression de gène identifiés par RNASeq en appréciant 5 gènes cibles, qui ont été soit up - ou diminuées dans le modèle d’Alström. La directionnalité des modifications de l’expression génique par qRT-PCR dans aste, gck, bmb, btr26 et ifi35, par rapport au témoin, récapitulé celle observée par RNASeq (Figure 4 a–B).
Figure 1. Sortie représentatif de l’analyse d’expression de gène après RNASeq fournie par le noyau ou le fournisseur. ID de fonction indique le numéro d’identification de gènes ENSEMBL. Comtes de lecture indique le nombre de lectures dans contrôle ou échantillons expérimentaux qui alignement sur ce gène dans le génome. Changement de pli et le journal de la modification de pli indiquent le degré de changement dans l’expression du gène entre l’expérimental et contrôlent échantillon soit dans le positif (augmentation) dans l’expression dans la direction de l’échantillon expérimental ou négatif (diminution) dans expression dans la direction de l’échantillon expérimental. La p-valeur et RAD sont des tests statistiques pour déterminer l’importance des résultats ; pour des expériences de RNASeq, une valeur plus stricte de la FDR de 0,05 est utilisée pour déterminer l’importance. Gene_symbol indique l’ID de gène NCBI et gene_name répertorie le nom complet du gène. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2. Exprimés de gènes dans les modèles BBS et Alström. Nombre de gènes régulée (rouge) ou diminuées (jaune) dans alms1 MO (vert) injecté embryons, embryons MO (orange) injecté bbs1 ou les deux par rapport aux embryons MO injecté de contrôle standard. * Désigne le nombre de gènes modifiés dans les deux, mais ayant en face des changements dans l’expression. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
FFigure 3. Voies surexprimées et enrichi GO termes du modèle Alström. (A) des voies par nombre de gènes surexprimés. (B) augmentée de descendre des termes par un enrichissement en pli. (C) connectivité de voie des voies surexprimés dans le modèle d’Alström. Connexions de voie déterminées par un minimum de 20 % partagent gènes entre les voies, et au moins 2 gènes se chevauchent. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4. validation qRT-PCR des modifications de l’expression génique. Changements dans l’expression des gènes identifiés par RNASeq ont été confirmés chez les embryons dpf 5 appariés selon l’âge et le traitement, injectés avec contrôle, alms1 ou bbs1 Mo. (A) sous-ensemble de gènes montrant l’expression de l’ARNm de gènes par qRT-PCR. (B) les données équivalentes montrant lire compte à partir du dataset RNASeq. Toutes les données sont relatives au contrôle et qRT-PCR ont été normalisées à l’actine. Aste, astéroïde homologue 1 ; GCK, glucokinase ; BMB, brambleberry ; btr26, famille de gènes liés sanguinaire, membre 26 ; ifi35, protéine induite par l’interféron 35. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
L’approche décrite dans le présent protocole offre une stratégie relativement rapide et rentable pour l’analyse du transcriptome-niveau des animaux entiers ou des populations spécifiques de cellules triées. Le poisson-zèbre est un modèle avantageux pour ce type d’étude en raison de la facilité et la rapidité dans la production de grandes quantités d’à partir de matériau, la facilité de mise en œuvre de génétique ou environnementales conditions expérimentales et la disponibilité d’une grande spectre des lignées transgéniques journaliste permettant l’isolement des populations spécifiques et tissu-spécifique de type cellulaire.
Tout en étant ne pas détaillé ici, cette méthode pourrait facilement accueillir des sections de tissu prélevées des poissons juvéniles ou adultes comme une alternative aux FACs et collection. Aussi, nous avons développé une stratégie de base analyse de suivi qui ne repose que sur l’utilisation des commandes de base de feuille de calcul et voie préexistante et bases de données GO. L’avantage majeur de cette approche est la facilité d’accessibilité sans nécessiter de compétences de haut niveau en gestion de base de données ou de la programmation de l’ordinateur. Par conséquent, cette stratégie est applicable pour les chercheurs de tous horizons pour analyse instructive des ensembles de données d’expression génique grand.
Notre approche combine embryon de poisson zèbre base et de la culture larvaire avec des techniques d’extraction standards RNA suivies de RNASeq. RNASeq nécessite une grande quantité de matière première de qualité ; certains fournisseurs exigent 2 µg d’ARN total. En conséquence, types de cellules rares/peu fréquents ou analyse chaque embryon est hors de portée. Cependant, au cours des cinq dernières années ont démontré des améliorations spectaculaires dans les analyses de faible rendement, ensembles de données produit d’échantillons plus petits et de faibles quantités de RNA, et gageons que ces demandes sera possibles dans un proche avenir. Pour garantir des résultats précis, l’ajout de deux réplicats techniques, c'est-à-direla génération deux bibliothèques de RNA à partir d’un seul échantillon et les réplicats biologiques, c'est-à-dire, collecte d’embryons de croisements multiples, est idéal. Ces étapes permettent aux chercheurs de contrôle pour la variation dans les échantillons, et les séquences identifiées dans tous les échantillons sont plus susceptibles d’être de véritables résultats, avec la probabilité réduite de rater un résultat inférieur de lecture-comte.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par R01DK102001 (N.A.Z.), P30DK072488 (N.A.Z.) et T32DK098107 (T.L.H. et J.E.N.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Commercial Reagents | |||
| TriZol | Thermo Scientific | 15596026 | lysis reagent |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | dissociation buffer 1 |
| FACSMax | Genlantis | T200100 | dissociation buffer 2 |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| FirstStrand cDNA conversion | Thermo Scientific | K1621 | cDNA conversion kit |
| 2X SYBR Green Master Mix | Roche | 4707516001 | qRT-PCR Master Mix |
| FACS buffer | Fisher Scientific | 50-105-9042 | |
| chloroform | Sigma Aldrich | 288306 | |
| sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Strains | |||
| Tuebingen | ZIRC | ZL57 | |
| ins2a:mCherry | ZIRC | ZL1483 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 40 micron cell strainer | Sigma | CLS431750 | |
| FACS tube | BD Falcon | 352063 | |
| hemocytometer | Sigma | Z359629 | |
| Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Inverted Microscope | Zeiss | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Illumina HiSeq | Illumina | ||
| LightCycler 480 | Roche | ||
| Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set | Aquaneering | ZHCT100 | |
| FACS tube 5 mL polypropylene tube | BD Falcon | 352063 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | ||
| Consensus Path DB | http://cpdb.molgen.mpg.de/ | ||
| GO Enrichment Analysis | http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis |
References
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. (2002).
- Detrich, H. W., Zon, L., Westerfield, M. The Zebrafish: Disease Models and Chemical Screens. , 4th ed, Academic Press. (2017).
- Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. The Zebrafish: Genetics, Genomics, and Transcriptomics. , 4th ed, Academic Press. (2016).
- Detrich, H. W. The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , 3rd ed, Academic Press. (2011).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J Vis Exp. (109), (2016).
- MPIMG. ConsenusPathDB. , Available from: http://cpdb.molgen.mpg.de/ (2017).
- Consortium, G. O. Enrichment analysis Tool. , Available from: http://www.geneontology.org/ (2017).
- IDT. IDT Primerquest Tool. , Available from: https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index (2017).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M.
- Leitch, C. C., Lodh, S., Prieto-Echague, V., Badano, J. L., Zaghloul, N. A. Basal body proteins regulate Notch signaling through endosomal trafficking. J Cell Sci. 127 (Pt 11), 2407-2419 (2014).
- Lodh, S., Hostelley, T. L., Leitch, C. C., O'Hare, E. A., Zaghloul, N. A. Differential effects on beta-cell mass by disruption of Bardet-Biedl syndrome or Alstrom syndrome genes. Hum Mol Genet. 25 (1), 57-68 (2016).
- Hostelley, T. L., Lodh, S., Zaghloul, N. A. Whole organism transcriptome analysis of zebrafish models of Bardet-Biedl Syndrome and Alstrom Syndrome provides mechanistic insight into shared and divergent phenotypes. BMC Genomics. 17, 318 (2016).
