Biology

التحضير للثقافات ماوس العصبية القشرية نأت

Published: December 19, 2007 doi: 10.3791/562

Lutz G. W. Hilgenberg¹, Martin A. Smith¹

¹Department of Anatomy and Neurobiology, University of California, Irvine (UCI)

Summary

هذا الفيديو يظهر الداخلي لتوليد الخلايا العصبية من الثقافات الجنين في وقت متأخر وأوائل القشرة الماوس بعد الولادة. ويمكن استخدام هذه الثقافات للكيمياء سيتولوجية مناعية ، والكيمياء الحيوية ، الفيزيولوجيا الكهربية والكالسيوم والصوديوم والتصوير ، وتوفير منبر لدراسة تطور الخلايا العصبية من الحيوانات المعدلة وراثيا التي تحمل بعدها طفرة جينية قاتلة.

Abstract

وهذا الفيديو دليل لكم من خلال عملية لتوليد الخلايا العصبية الثقافات القشرية من جنين في وقت متأخر ومخ الفأر في وقت مبكر بعد الولادة. ويمكن استخدام هذه الثقافات لمجموعة متنوعة من التطبيقات بما في ذلك كيمياء سيتولوجية مناعية والكيمياء الحيوية والكهربية ، والتصوير الكالسيوم والصوديوم والبروتين و / أو RNA العزلة. هذه الثقافات كما توفر منبرا لدراسة تطوير الخلايا العصبية من الحيوانات المعدلة وراثيا التي تحمل الجنين في وقت متأخر بعد الولادة أو طفرة جينية قاتلة. هذا الإجراء هو نسبيا على التوالي إلى الأمام ، ويتطلب بعض الخبرة في مجال تقنية زراعة الأنسجة ، وينبغي ألا يستغرق وقتا أطول من ساعتين الى ثلاث ساعات إذا كان قد أعد عليك بشكل صحيح. والفصل الدقيق للقشرة القشرية من السبيل المهادي القشري الألياف تقلل من عدد الخلايا العصبية غير المرغوب فيها. لزيادة الغلة من الخلايا العصبية متمزج قطعة من نسيج قشري بلطف بعد خطوة حضانة الانزيم. هذا أمر حتمي لأنه يمنع الاصابة لا لزوم لها على الخلايا المبكرة وموت الخلايا العصبية. لأن الحفاظ على هذه الثقافات في غياب الخلايا الدبقية المغذية ، كما أنها توفر ميزة إضافية للثقافات النمو المخصب في الخلايا العصبية.

Protocol

الاستعدادات قبل يوم من زراعة :

تحضير محلول معقم تشريح (DS).
إعداد NBM/B27 (Mediom Neurobasal مع ملاحق B27).
الأوتوكلاف DDH ₂ O وتعقيم coversilps الزجاج ، وإذا لزم الأمر.
أطباق معطف أو زراعة الأنسجة coverslips الزجاج مع بولي يسين - D.

بولي - D - يسين طلاء :

إعداد قبل يوم زراعة تحت ظروف معقمة.

قسامة ذوبان PDL 10X ومكان على الجليد.
إضافة 9 مل العقيمة فائقة تصفية المياه إلى 1 مل من PDL وتخلط جيدا (1X).
معطف السطوح مع 1X PDL بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة على النحو التالي :
- coverslips الزجاج (زجاج Bellco ، وشركة كات # 1943-00012) : 75 ميكرولتر / ساترة
  OR
- 24 لوحة الثقافة جيدا : 300 ميكرولتر / جيد
  OR
- 35mm صحن الثقافة : 1ml/dish
5X شطف مع الماء المعقم (استخدام ماصات باستور العقيمة لنضح السائل).
إزالة المياه السطحية حتى تجف تماما.

إجراء زراعة (هود عمله في التدفق الصفحي تحت ظروف معقمة)

قطع كتلة من أجار والغراء وضعها على دعم كتلة Vibraslicer مشراح (Campden صكوك المحدودة) باستخدام الغراء عظمى.
عند استخدام المرحلة الجنينية المتأخرة (E17 - 18) الأجنة الماوس ، السد euthanise ، إزالة الرحم والجنين فردية خالية من الكيس الجنيني. الأجنة مكان في طبق بتري معقمة وتستمر على النحو المبين أدناه.
قطع رأس الجنين الماوس أو الجرو (اتبع المبادئ التوجيهية التي وافقت عليها رعايتك الحيوان المؤسسية واللجنة الاستخدام)
إزالة الجلد والجمجمة والدماغ مكان على القرص Whatman رقة الترشيح في طبق بتري 60mm مليئة DS الباردة.
قطع المخيخ باستخدام شفرة حلاقة معقمة.
يلتقط الدماغ باستخدام ملعقة واستنزاف السوائل الزائدة على ورق التصفية ، ثم نقل إلى كتلة دعم الدماغ والمخ Vibraslicer الغراء في مكان (حتى الجانب الذيلية وجزء بطني تواجه آغار).
ملء الغرفة مع DS الباردة. تعيين محدد السرعة ل8-9.
قص الأجزاء 200-400 ميكرون ، ابتداء من البصلة الشمية. بمجرد أن نصل للVibraslicer يدخل القشرة ، تبدأ خفض المقاطع 600μm الاكليلية. والدماغ E17 - 18 الماوس غلة عادة صالحة للاستعمال شرائح 3-4 ، في حين أن دماغ الفأر P0 غلة 4-5 شرائح قابلة للاستخدام.
نقل شرائح الدماغ إلى 35 مم طبق بتري المسمى DS 2 باستخدام نهاية عكس برنامج الأمم المتحدة للتوصيل 10 مل الماصة باستور الزجاج.
تشريح خارج القشرة وإزالة السحايا باستخدام الإبر الزجاج سحبها من الانابيب الشعرية.
خفض القشور القشرية الى قطع صغيرة ، 0،5-1 ملم في الطول.
مرشح وفاق من خلال تصفية 0.2 ميكرومتر تعلق حقنة 5 سم في طبق بتري 35 مم.
نقل قطعة نسيج القشرية إلى طبق بتري تحتوي على وفاق تصفيتها.
احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

في هذه الأثناء :

تنظيف غطاء محرك السيارة ، وأدوات تشريح Vibraslicer.
إضافة 5 مل من NBM/B27 الدافئ في طبق بتري 60 مم.

بعد 30 دقيقة. الحضانة :

نقل الأنسجة لDS 10 مل. السماح لتسوية 1 دقيقة.
نقل الأنسجة لأول أنبوب مرحبا الدوامات وترك تسوية لمدة 2-3 دقيقة.
مرحبا نقلها إلى الثانية. كرر النحو المبين أعلاه.
نقل لى الأولى. كرر النحو المبين أعلاه.
نقل لى الثانية. كرر النحو المبين أعلاه.
نقل لى ثالثة. كرر النحو المبين أعلاه.
نقل الأنسجة لالطبق 60 مم مع وسائل الاعلام.

تشريح تحت المجهر :

تنظيف الحطام من الأنسجة ومتمزج كل قطعة عن طريق تمرير بلطف عن طريق سحب الزجاج الماصة (استخدام تناقص أحجام تتحمل) للتخفيف عن الأنسجة.
تعليق نقل الخلية إلى أنبوب 15 مل المخروطية التي تحتوي على بقية NBM + B27 (اصنع ما مجموعه 13 مل لوحة جيدا أو 24 مل لمدة 5 11 -- 35 ملم الأطباق ميكس برفق وانتظر قطعة كبيرة من الأنسجة لتسوية).
تعليق نقل الخلية (0.5 مل / بشكل جيد لوحة جيدا أو 24 2 مل / 35 طبق الثقافة ملم).
عند استخدام coverslips الزجاج ، إضافة تعليق 80 خلية لكل ميكرولتر ساترة والسماح 1 ساعة في أنسجة خلايا حاضنة للثقافة الالتزام قبل الفيضانات الغرفة مع وسائل الإعلام أكثر NBM/B27.
الحفاظ على الثقافات في 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO _2.

يوم تال

24 لوحة جيدا : تغذية كل خلية بشكل جيد مع 0.5 مل العصبية غير مشروطة NBM/B27 المتوسطة (cNBM/B27 ؛ لإعداد بروتوكول cNBM/B27 المتوسط تبدو أدناه)

أطباق 35mm : استبدال 0.5 مل مع cNBM/B27 المتوسط.

الحفاظ على الثقافة من خلال استبدال 0.5ml المتوسطة مع cNBM/B27 جديدة كل 2-3 أيام.

على الرغم من أن وسائل الإعلام ثقافة لا تعزز انتشار الخلايا الدبقية ، ويمكن أن يعامل مع الثقافات FDU 5μM (5 - الفلورية 2' - deoxyuridine ، سيغما F0503) في يوم 05/03 في الثقافة لمواصلة تخفيض عدد الخلايا الدبقية إذا لزم الأمر.

SET - UP للتشريح والثقافة

تعقيم الأدوات في تشريح EtOH 70 ٪ أو الأوتوكلاف لهم :

المقص (med. والصغيرة) ملاعق (med. والصغيرة)
ملاقط شفرة حلاقة (med. والصغيرة)
شفرة للحمام الاحتياطي vibraslicer
وتد معدني صغير لدعم شفرة للمخ

مواد أخرى :

أطباق بتري (60 ملم)
أطباق بتري (35 ملم)
ورق الترشيح
الزجاج الماصة 10 مل
المتاح pipets عقيمة ، 5،10 و 25 مل
حقنة التصفية ، و 0.2 ميكرومتر
حقنة 5 سم
أنابيب الطرد المركزي ، و 15 مل
معقمة باستور الزجاج pipets
PDL الأطباق الثقافة الزجاج المطلي أو coverslips

التسمية six 15 مل أنابيب الطرد المركزي ومتابعة التحضير :

أنبوب # 1 : حل أنزيم :

إضافة 50 U من غراء (رثينجتون LS 03126) لDS 5 مل تحتوي على :

100μl من L - سياستين (0.8mg)
7 ميكرولتر 0.1N هيدروكسيد الصوديوم
50 ميكرولتر APV (5mM)

ترك الحل في درجة حرارة الغرفة واضحة. علما أن هذا الحل سوف تظهر انزيم "غائم" في البداية ، وتحتاج إلى واضحة قبل الاستخدام.

أنبوب # 2 & # 3 : مرحبا مثبط الإنزيم :

3 مل س + 300 ميكرولتر BSA / تي + 30 ميكرولتر APV (5mM).

المزيج برفق لتجنب الفقاعات ، ثم تقسم إلى قسمين aliquots 1.5ml.

أنبوب # 4 -- # 6 : قليلة مثبط الإنزيم :

8 + 80 مل DS ميكرولتر BSA / تي + 80 ميكرولتر APV (5mM).

المزيج برفق لتجنب فقاعات ، والانقسام الى ثلاث aliquots 2.6 مل.

ترقيم الأنابيب من خلال مكان # 2 # 6 في الجليد. ترك الأنبوب رقم 1 (محلول أنزيم) في درجة حرارة الغرفة.

حلول وALIQUOTS

الحل (التخزين المؤقت مالحة) سيغما الفورمولا وزن 500 مل [اضرب.]
كلوريد الصوديوم كلوريد الصوديوم S - 9625 58.45 80.0g 137mM
كلوريد البوتاسيوم بوكل P - 4504 74.56 4.0g 5.4mM
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة اللامائية نا ₂ هبو ₄ S - 0876 142.0 0.24g 0.17mM
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة اللامائية KH ₂ PO ₄ 5379 136.09 ف 0.3g 0.22mM

تزن خارج جميع المكونات حتى يذوب ويخلط مع 400 مل من الماء جدا التي تمت تصفيتها. يصل حجم النهائية الى 500 مل. مكان في زجاجة نظيفة وتعقيم. مخزن عند 4 درجة مئوية ، وتسمية "الحل DS A".

الحل B (Hepes) سيغما الفورمولا وزن 250 مل [اضرب.]
Hepes Hepes H - 3375 283.3 20.97g 9.9mM

إضافة فائقة تصفية المياه يصل الى 200 مل. مزيج حتى حل وجلب الحجم النهائي إلى 250 مل. مكان في زجاجة نظيفة وتعقيم. مخزن عند 4 درجة مئوية ، وتسمية "DS B الحل".

عمل محلول 500 مل [اضرب.]
المياه المفلترة 400 مل
محلول المخزون A 25 مل
الأسهم ب 14 مل من محلول
D (+) - G - الجلوكوز سيغما 8270 3.0 ز 33.3mM
السكروز سيغما S - 0389 7.5 ز 43.8 ملي

ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم 1N. يصل حجم النهائية الى 500 مل مع فائق الماء المصفى. صب في زجاجة نظيفة وتعقيم. المحل في 4 درجات مئوية. تسمية "الحل تشريح".

بولي - D - يسين التحضير :

إعداد 10X حل سهم بولي - D - يسين (PDL ؛ سيغما P - 7280) في العقيمة O ₂ H في 1mg/ml.
جعل aliquots 1.0 مل. ويمكن تخزين هذا الحل في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.

MEDIA

إضافة 10ML من B - 27 الملحق (Gibco 17504-044) إلى 500 مل زجاجة NBM (متوسطة Neurobasal ، Gibco 21103-049).
جعل 40 مل aliquots وتخزينها في 4 درجات مئوية.

APV

إضافة 10 مل العقيمة H ₂ O لقنينة من APV 10 ملغ (2 - 5 - الأمينية phosphonopentanoic حامض ، سيغما A - 5282) ومزيج دقيق.
إعداد 180 aliquots ميكرولتر وتخزينها في -20 درجة مئوية.

جيش صرب البوسنة / تي

1 ز حل جيش صرب البوسنة (الزلال البقري. سيغما A - 7030) و 1 غرام التربسين المانع (سيغما T - 9253) في 10 مل س.
ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم 1N.
تعقيم بواسطة الترشيح من خلال فلتر 0.2 ميكرومتر المحاقن.
تقسيمها إلى 400 aliquots ميكرولتر وتخزينها في -20 درجة مئوية.

L - السيستين

في أنبوب إيبندورف حل L - 0.6 ملغ سيستين (سيغما C - 7755) في 200 DS ميكرولتر.

AGAR (4 ٪)

وحل 4 غرام من Bacto آجار (Difco 0140-01) في الماء المعقم 100 مل. تبقي على 4 درجات مئوية لحين الحاجة إليها للثقافة.
آجار الميكروويف لإذابة وملء طبق بتري 35 مم. دعونا نجلس ليبرد وتتبلمر.

غراء (رثينجتون LS 03126)

e_title "> NON - العصبية الثقافات في ثقافة BOTTLES نونك

طلاء القمقم الثقافة (4 زجاجات نونك)

إضافة 9 مل من الماء المعقم إلى كل من أنابيب من 3 PDL 10X لجعل PDL 1X.
نقل 30 مل 1X PDL في الزجاجة أولا.
تحرك قليلا حتى يتم تغطية جميع السطوح النمو. اسمحوا الجلوس لمدة 1 دقيقة.
نقل 1X PDL لزجاجة الثانية. اسمحوا الجلوس لمدة 1 دقيقة.
كرر مع زجاجات الثالث والرابع.
شطف جميع زجاجات four 2X مع 150 مل العقيمة O. ₂ H

تستعد الحل انزيم (ES) :

في وزنها 0.6 مل أنبوب الطرد المركزي من 0.8 ملغ L - سيستين (سيغما C7755) ، إضافة DS 150ml ودوامة حتى تذوب بلورات.
نقل DS 5 مل إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل ، ثم تضاف 150ml L - سيستين.
إضافة 50 وحدة غراء. (03126 ليرة سورية ورثينجتون)
إضافة 7ml 0.1N هيدروكسيد الصوديوم.

تستعد MEM (GIBCO # 11090-081)

إزالة 65 مل زجاجة من 500 مل MEM. انقاذ 10 مل لإعداد الجلوكوز.
إضافة 5 مل القلم / بكتيريا (Gibco # 15070-063).
إضافة 10 مل من الجلوكوز 1M (سيغما G - 8270) (1.8 جم / 10 مل MEM)
إضافة 50 مل مصل بقري جنيني (Gibco # 16140-071) أو مصل العجل البقري (أوميغا BC - 04).
المزيج جيدا ، وتخزينها في قسامة 4 درجات مئوية.

NEUROBASAL MEDIUM/B-27 الملحق (NBM/B27)
NBM ، 500 مل (Gibco # 21103-049) B - 27 (50X) ، و 10 مل (Gibco # 17504-044)

إضافة المحتوى بأكمله B - 27 قارورة في زجاجة NBM والمزيج.
قسامة وتخزينها في 4 درجة مئوية.

تشريح أنسجة المخ

أدوات تشريح الجاف من 70 ٪ قبل EtOH تشريح.
نقل 10 مل DS في كل من أنبوب مل 15/03.
تحديد الجراء الماوس (P0 -- P3) ، وسوف تحتاج إلى ثلاثة أدمغة لمدة 4 زجاجات.
إضافة DS الباردة إلى 35 مم طبق بتري.
قطع رأس الفأر وتشريح الجرو من العقول.
أدمغة مكان في طبق بتري تحتوي على DS الباردة.
ختم الأنسجة الى قطع صغيرة بما يكفي لتمر من خلال ماصة الزجاج.

انزيم تفارق

كما DS إزالة أكبر قدر ممكن من الطبق مع ماصة باستور.
مرشح وفاق من خلال حقنة 0.2 ميكرومتر وتصفية 5cc.
ES مكان في الطبق مع الأنسجة.
احتضان الأنسجة عند 37 درجة مئوية الحاضنة (CO ₂ الحرة) لمدة 30 دقيقة.

WASHING TISSUE

نقل الأنسجة مع ماصة الزجاج لأنبوب DS أولا ، التأكد من الحصول على أكبر قدر ممكن من وفاق قليلا.
أجهزة الطرد المركزي لمدة 30 ثانية عند 1500 دورة في الدقيقة.
نقل الأنسجة وكرر الإجراء مرتين أخريين.

سحن

38 مل من مكان MEM / FBS في أنبوب الطرد المركزي 50ml
أضف 3 مل من MEM / FBS على طبق 35 ملم والأنسجة لنقل هذا الطبق بتري.
فصل الأنسجة من قبل الطحن برفق خلال قمة 1000μl الماصة إيبندورف.
تعليق نقل الخلية في أنبوب يحتوي على 38ml من MEM / FBS وتخلط جيدا.

طلاء

تقف منتصبة الزجاجات الثقافة للحصول على كميات متساوية من تعليق الخلايا وسائل الإعلام في كل زجاجة.
وضع 90 مل من MEM / FBS في كل زجاجة الثقافة.
إضافة 10 مل من تعليق خلية في كل زجاجة.
التسمية : عدم العصبية ، بالاحرف الاولى والتاريخ. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO _2.

FEEDING

في اليوم 3 أو 4 خلايا خدمة دافئة مع MEM / FBS (صب كل وسائل الاعلام واستبدالها مع 100 مل من MEM / FBS). قد يستغرق أياما الثقافات 70-10 لتصبح متموجة.
في يوم 10/07 وسائل الإعلام لتغيير NBM/B27.
اليوم التالي ، وجمع وسائل الاعلام. فلتر مع 0.22μm
جعل aliquots من 40 مل وتغذية الثقافة مع MEM / FBS.
القادم 2 أو 3 أيام ، وتغير وسائل الاعلام عن NBM/B27
اليوم التالي ، وجمع وكرر هذا الإجراء.
إبقاء وسائل الإعلام لجمع تقريبا. 2 اسابيع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Fluoro-2’-deoxyuridine	Sigma-Aldrich	F0503
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9625
Vibraslicer	Campden Instruments
Potassim Chloride	Sigma-Aldrich	P4504
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma-Aldrich	S0876
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma-Aldrich	P5379
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375
D (+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Poly-D-Lysine	Sigma-Aldrich	P7280
B27 Supplement	Invitrogen	17504-044
Neurobasal Media (NBM)	Invitrogen	21103-049
2-Amino-5-phosphonopentanoic acid	Sigma-Aldrich	A5282
Bovine Albumin	Sigma-Aldrich	A7030
Trypsin Inhibitor	Sigma-Aldrich	T9253
Sodium Hydroxide, 1N solution	Fisher Scientific	SS266-1
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	C7755
Bacto Agar	Difco Laboratories	0140-01
Papain	Worthington Biochemical	LS 03126
Sterile 0.2 μm Syringe Filter	Fisher Scientific	DDA02025S0
Glass Coverslips, No1, 12mm	Bellco Glass	1943-00012
Minimum Essential Media (MEM)	Invitrogen	11090-081	with Earle’s saltswithout L-glutamine, needed for growing non-neuronal cultures
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15070-063	for non-neuronal culture
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	16140-071	needed for non-neuronal cultures
Nunclon "Triple Flask" Tissue Culture Bottle	Fisher Scientific	12-565-25	Use for non-neuronal cultures. these flasks are very convenient when producing "conditioned Neurobasal Media/B27", but any other tissue culture flasks or dishes can be used instead.
Glass bottom "Imaging dishes"	MatTek Corp.	P35G-1.5-10-C	Glass bottomed, 35mm culture dishes ideal for Calcium or Sodium Imaging when using an inverted imaging setup. But expensive!